（遗传学专业论文）斑马鱼翻译延伸因子ef2的克隆、表达谱分析及功能研究.pdf

复旦大学硕士学位论文斑马鱼翻译延伸因子e f 2 的克隆，表达谱分析及功能碲f 究 摘要 翻译延伸因子2 ( t r a n s l a t i o ne l o n g a t i o n f a c t o r2 ，e f 一2 ) ，催化了蛋白质合成 过程中的核糖体的移动，使肽基- t r n a 从核糖体的a 位点移动到p 位点，从而 释放出a 位点以接收一个新的三重复合物( e f l a m i n o a c y l t r n a g t p ) 。 关于e f 一2 ，目前所知的只有磷酸化以及a d p 核糖基化等修饰调控作用，而 与发育调控相关的e f 2 至今还鲜有报道。斑马鱼胚胎发育过程中e f 2 基因还从未 有人报道过，因此，我们克隆并通过整胚原位杂交分析了斑马鱼e f 2 基因的表达 模式。 通过大规模c d n a 测序，斑马鱼e f 2 全长c d n a 从成鱼肾脏c d n a 文库中克隆 得到。斑马鱼e f 2 基因全长2 8 2 6b p ，其开放阅读框跨越从第5 5 个核苷酸到第2 6 3 1 个核苷酸，编码了一个长8 5 8 个氨基酸、分子量为9 5 5 k d 的蛋白质。斑马鱼e f 2 蛋白高度保守，与人、小鼠、中国仓鼠以及g a l l u s 的e f 2 蛋白存在着分别为9 2 、 9 3 、9 3 和9 2 亨列一致性。通过对斑马鱼e f 2 所编码的8 5 8 个氨基酸的分析表 明它含有1 6 个保守结构域。与其它e f 2 蛋白一样，斑马鱼e f 2 蛋白的g t p 结合结 构域位于氨基末端，a d p 核糖基化作用结构域则位于羰基末端。 原位杂交结果显示e f 2 转录物在胚胎发育的早期就大量出现，并且在5 体 节期表现为全身都有强烈的表达。随着胚胎的发育，其表达逐渐特异。从2 2 体 节期开始，体节( 肌肉组织) 上的表达逐渐清晰。随后，表达大多集中在眼睛、 脑部以及体节。在p r i m 1 5 时期，染色的细胞主要集中在晶体、视网膜、中脑、 小脑，而且身体后端的体节表达特别明显。但是从p r i m 2 5 时期开始，e f 一2 表达 只出现在晶体以及小脑的前部。 整胚原位杂交结果显示斑马鱼e f 2 基因可能是个受发育调控的基因，并且 在斑马鱼胚胎的早期发育过程中起到了非常重要的作用，因此我们进一步研究了 e f 2 的功能。在本论文中，我们采用了过量表达和反义技术这两种方法，来研 究e f 一2 在斑马鱼胚胎发育过程中的作用。将表达载体p c d n a 3 e f 2 以及体外转 录的e f 一2m r n a 注射到斑马鱼胚胎中，没有观察到畸形现象，表明e f 2 的过 量表达对斑马鱼胚胎的发育没有明显的影响。通过m o r p h o l i n o 反义抑制实验， 证实e f 2 m o 确实可以抑制内源e f 2 的表达，并对胚胎的发育造成了明显的影 响。同时，我们选取了一个位点尝试了由s i r n a 介导的反义抑制实验，结果证 明，e f 2 s i r n a 对内源e f 2 的表达以及胚胎的发育产生了一定的影响。 关键词：斑马鱼，翻译延伸因子2 ，整胚原位杂交，m o r p h o l i n o ，过量表达，s i r n a 中图分类号：q 3 4 复旦大学硕+ 学位论文 斑马鱼翻译延伸因子e f - 2 的克隆、表达谱分析及功能研究 a b s t r a c t t r a n s l a t i o ne l o n g a t i o nf a c t o r2 ，e f 一2 ，a c tt oc a t a l y z et h et r a n s l o c a t i o no f t h e r i b o s o m ed u r i n gp r o t e i ns y n t h e s i s ，t oa l l o wt h ep e p t i d y l - t r n at om o v ef r o m a m i n o a c y ls i t et ot h ep e p t i d y ls i t eo nar i b o s o m e ，l i b e r a t i n gt h ef o r m e rs i t et oa c c e p ta n e wm r n a t r i p l e ta n di t sc o g n a t et e r n a r yc o m p l e x ( e f l - a m i n o a c y l - t r n a g t p ) r e g u l a t i o no f e f - 2i sw e l lk n o w nt oi n v o l v i n gi np h o s p h o r y l a t i o na n d a d p - r i b o s y l a f i o n ，b u td e v e l o p m e n t a l l yr e g u l a t e de f 2i s o f o r m sh a v er a r e l yb e e n r e p o r t e da n di t se x p r e s s i o np a t t e r nd u r i n ge m b r y o g e n e s i si nz e b r a f i s h ( d a n i or e r i o ) h a sn o tb e e nr e p o r t e d s o ，w ef i r s tc l o n e dz e b r a f i s he f - 2g e n ea n de x a m i n e di t s e x p r e s s i o np a t t e r nb yw h o l e - m o u n t 加s i t uh y b r i d i z a t i o n t h ez e b r a f i s he f - - 2f u l l - l e n g t he d n aw a sc l o n e da n ds e q u e n c e df r o mt h e c o n s t r u c t e da d u l tz e b r a f i s hk i d n e ye d n a l i b r a r y t h e2 8 2 6b pe d n as p a n sa no p e n r e a d i n gf r a m ef r o mn u c l e o t i d e5 5t o2 6 31 ，e n c o d i n gap r o t e i no f8 5 8a m i n oa c i d s t h e 8 5 8a m i n oa c i d se f - 2p r o t e i ni sh i g h l yc o n s e r v e ds h a r i n go v e r a l l9 2 ，9 3 ，9 3 a n d 9 2 i d e n t i t yi na m i n oa c i ds e q u e n c ei nh u m a n ，m o u s em u s e u l u s ，c h i n e s eh a m s t e r a n dg a l l u sg a l l u se f - 2 ，r e s p e c t i v e l y z e b r a f i s he f 一2p r o t e i nh a s1 6c o n s e r v e d d o m a i n s ，g t p b i n d i n gd o m a i ni sf o u n di nt h ea m i n o t e r m i n a lr e g i o n ，a n dt h e a d p - r i b o s y l a t i o nd o m a i nl o c a t e sa tt h ec o o h t e r m i n u s t h er e s u l t so f w h o l e m o u n ti ns i t uh y b r i d i z a t i o ns h o w e dt h a tal a r g ea m o u n to f e f 一2t r a n s e r i p t sw e r ed e t e c t e dd u r i n gs o m i t o g e n e s i sa n d o r i g i n a l l ye m e r g e ds t r o n g l y t h r o u g h o u tt h ee m b r y oa t5 - s o m i t es t a g e f r o m2 2 一s o m i t es t a g et h es t a i n e dc e l l si nt h e s o m i t e s ( m u s c l et i s s u e ) w e r el e g i b l e t h e nt h es t a i n e dc e l l sc o n c e n t r a t e ds t r o n g l yi n t h ee y e s ，b r a i na n ds o m i t e sw i t hl i g h t l ys p r e a d i n gt h r o u g h o u tt h ee m b r y o w i t ht h e d e v e l o p m e n to f t h ee m b r y o ，t h ee x p r e s s i o no f e f - 2w a ss i g n i f i c a n ta n dc o n c e n t r a t e d a t p r i m - 1 5s t a g e ，t h es t a i n e dc e l l sc o n c e n 仃a t e d m a i n l y i n t h e l e n s ，r e t i n a ，m i d b r a i n a n dc e r e b e l l u m ，a n dp o s t e r i o rs o m i t e se x p r e s s i o ni se s p e c i a l l ye v i d e n t b u ta f t e r p r i m 。2 5s t a g et h ee x p r e s s i o no f e f 一2o n l ya p p e a r e di nt h el e n sa n dt h ea n t e r i o r p o r t i o no f t h ec e r e b e l l u m ( i n c l u d i n gt h ep r o l i f e r a t i o nz o n ea tt h em i d b r a i n - h i n d b r a i n b o u n d a r y ) w h o l e - m o u n ti ns i t uh y b r i d i z a t i o ns h o w e dt h a tz e b r a f t s he f 一2p o s s i b l yw a sa d e v e l o p m e n t a l l yr e g u l a t e dg e n ea n dm a yp l a yv e r yi m p o r t a n tr o l e sd u r i n gt h ee a r l y d e v e l o p m e n to f z e b r a f i s he m b r y o s ow es t u d i e dt h ef t l r t h e rf u n c t i o no f e f 2d u r i n g e a r l ye m b r y o g e n e s i s i nt h i sr e p o r t ，w ei n c r e a s e de f 一2e x p r e s s i o nw i t h o v e r e x p r e s s i o nv e c t o rb u to b s e r v e dn oo b v i o u sm o r p h o l o g yc h a n g e s t h e nw e 2 复旦大学硕士学位论文 斑马鱼翻译延伸因子e f ，2 的克隆、表达谱分析及功能研究 s u p p r e s s e di t se x p r e s s i o nw i t ha n t i s e n s em o r p h o l i n oo l i g o n u c l e o t i d e ，a n do b s e r v e d h i g l l l yc o n s i s t e n td i s t i n c tm o r p h o l o g yc h a n g e s a tt h es a m et i m e ，w et r i e dt os u p p r e s s i t se x p r e s s i o nw i ms i r n at e c h n o l o g y a n df o u n dt h a te f 2 一s i r n ac o u l da l s oa f f e c t m o r p h o l o g y k e y w o r d s ：z e b r a i i s h ，e f - 2 ，w h o l e - m o u n ti ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，m o r p h o l i n o o v e r e x p r e s s i n g ，s i r n a 中图分类号：q 3 4 复旦大学硕士学位论文斑马鱼翻译延伸因子e f - 2 的克隆、表达谱分析及功能研究 英文缩略词 b l a s t ：b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l ，同源性检索工具 d t t ：d i t h i o t h r e i t o l ，二硫苏糖醇 e f 2 ：t r a n s l a t i o ne l o n g a t i o nf a c t o r2 ，翻译延伸因子2 e s t ：e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ，表达序列标签 h p f h o l l r sp o s tf e r t i l i z a t i o n ，受精后小时数 h y b ：h y b r i d i z a t i o nb u f f e r ，杂交缓冲液 m o ：m o r p h o l i n om o d i f i e da n t i s e n s eo l i g o n u c l e o t i d e ，吗啉修饰的反义寡核苷酸 m a b ：m a l e i ca c i db u f f e r ，马来酸缓冲液 n c b i ：n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o m e d i c a li n f o r m a t i o n ，美国国立生物医学信息中心 o r f o p e nr e a d i n gf r a m e ，开放阅读框 p b s ：p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e ，磷酸缓冲液 p c r ：p o l y m e m s ec h a i nr e a c t i o n ，多聚酶链式反应 p f a ：p a r a f o r m a l d e h y d e ，多聚甲醛 4 复旦大学硕士学位论文斑马鱼翻译延伸因子e f - 2 的克隆、表达谱分析及功能研究 一前言 翻译延伸因子2 ( e f 2 ) ，与其在细菌体中的同源物e f g ，作用于e e f l a e f t u 之后，催化了蛋白质合成过程中依赖g t p 水解的核糖体的移动，使得 p e p t i d y l t r n a 从核糖体的a 位点移动到p 位点，从而释放出a 位点以接收一个 新的三重复合物( e e f l a m i n o a c y l t r n a - g t p ) ( k o h n oke ta 1 ，1 9 8 6 ；m e n d o z a ae ta 1 1 9 9 9 ) 。 e f 2 是一个g t p 水解酶，只有在结合了g t p 的情况下才具有活性。它结合 并水解g t p ，与g t p 和核糖体共同组成了一个三重复合物。如果核糖体缺失， e f 一2 将不会水解g t p 。e f 2 利用g t p 水解所产生的构象变化调节p e p t i d y l t r n a 从核糖体的a 位点移动到p 位点( r a ose ta 1 ，1 9 9 6 ) 。因此，e f 一2 至少存在两 个保守的功能结构域：一个是g t p 结合结构域，它参与结合g t p 并起了g t p 水解酶的作用；另一个是a d p 一核糖基化作用结构域，它与核糖体相互作用 ( k o h n okc ta 1 ，1 9 8 6 ；t o d a s bke ta 1 ，1 9 8 9 ) 。e f 一2 的g t p 结合结构域位于氨 基末端，它含有一个保守的苏氨酸残基，正是这个唯一的特异位点，e f 一2 可以被 依赖c a 2 + 的e f 2 激酶所磷酸化，这是个可逆的过程( p e r e n t e s i s s jj p e ta 1 ，1 9 9 2 ) 。 被磷酸化的e f 2 不具有翻译活性，这意味着c a 2 + 可以通过磷酸化e f 2 来调控蛋 白质合成( r y a z a r l o va ge ta 1 ，1 9 9 0 ) ，并且通过提高其磷酸化水平来降低延伸 速率( c a r l b e r gu e ta 1 ，1 9 9 0 ) 。相反的，胰岛素可以促使e f 2 的去磷酸化，因 此通过胰岛索的处理，可以提高延伸速率( l e v e n s o n r me ta 1 ，1 9 8 9 ) 。e f 一2 a d p 一 核糖基化作用结构域位于羰基末端，它含有一个a d p 一核糖基化的保守位点，据 推测，这个位点参与了与核糖体的相互作用( k o h n ok e ta 1 ，1 9 8 6 ) 。e f 一2 蛋白 质可以被a d p 糖基化作用进行翻译后修饰。白喉毒素和假单胞菌外毒索a 都可 以通过a d p 糖基化作用抑制真核蛋白质合成( f e n d r i c ke ta 1 ，1 9 9 2 ) 。 根据以上所述，关于e f 2 ，目前所知的只有磷酸化以及a d p 一核糖基化等修 饰调控作用，而与发育调控相关的e f 2 至今还鲜有报道。果蝇中含有两个几乎相 同的e f 2 基因，但是从来没有人报道过它们在表达上的差异( l a s k ope ta 1 ， 2 0 0 0 ) 。然而，在多细胞真核生物中却报道了很多有关翻译延伸因子l a ( e f l a ) 的家族成员。果蝇含有两个e f 1 a 基因，分别为f 1 和f 2 ，它们在早期的发育过程 中有着不同的表达模式，只有f 1 可以持续表达，而f 2 则受发育的调控( h o v e m a n n be ta 1 ，1 9 8 8 ) 。爪蟾与果蝇情况类似，现在已发现了三个e f 一1 a 基因，分别是 4 2 s p 5 0 、e f 1 a o 和e f 1 a s ，所有的基因在胚胎发育的早期均表现为非常活跃，但 是只有e f l a s 可以在神经胚形成之后以及成体中表达，其它两个则受发育调控 ( k r i e g pe t a l 。1 9 8 9 ；d j e m k e ta 1 ，1 9 9 0 ) 。哺乳动物中，e f 1 a 2 基因在心脏以 及肌肉组织中表达，并且最终成为在这些组织中表达的唯一的e f 一1 a 异构体 复旦大学碗七学位论文斑马鱼翻译延伸因子e f 2 的克隆、表达谱分析及功能研究 ( k n u d s e ns me ta 1 ，1 9 9 3 ) 。如果刚出生几周的小鼠的e f 1 0 2 遭到破坏，将会导 致肌肉和神经功能上的缺陷( c h a m b e r s d m e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。最近t a n i a m m a l a v e 等人报道了四膜虫的e f 2 与发育调控相关( m a l a v et me t a l ，2 0 0 4 ) ，这给了我 们很好的启迪。 斑马鱼体型小、胚胎透明、体外受精发育、产卵量大、性成熟时间短，是研 究发育调控相关的e f 一2 功能的理想模式生物( j ube ta 1 ，1 9 9 9 ) 。整胚原位杂交 是斑马鱼基因功能研究中重要的研究手段。整胚原位杂交技术通过体外合成地离 辛、荧光素、生物素等标记的非放射性标记的探针，反义r n a 探针与目的m r n a 相结合然后通过抗体上耦联的碱性磷酸酶或过氧化物酶催化显色底物生成不溶 性有色沉淀，从而直观的反映出目的基因在斑马鱼胚胎发育中的时空表达情况。 因此它常常是研究斑马鱼发育相关基因功能的第一个步骤，广泛应用于发育相关 基因表达、功能研究、基因相互关系、突变体筛选等各个领域。 斑马鱼胚胎发生过程中e f 2 基因还从未有人报道过。在这篇文章中，我们克 隆并通过整胚原位杂交分析了斑马鱼e f 2 基因的表达模式。整胚原位杂交结果显 示斑马鱼e f 2 基因可能是个受发育调控的基因，并且在斑马鱼胚胎的早期发育过 程中起到了非常重要的作用，因此我们进一步研究了e f 2 的功能。研究斑马鱼基 因功能可以揭示其在斑马鱼发育过程中所起的作用，方法主要有人工诱变、过量 表达、反义技术等。 通过人工诱变产生突变个体，然后通过杂交筛选获得纯合体斑马鱼，再克隆 得到其相关基因，这是研究基因功能最经典的方法。但是，人工诱变需要的周期 长，耗资大，一般实验室无法完成( d r i e v e r we t a l ，1 9 9 6 ；h a f f t e r pe t a l ，1 9 9 6 ) 。 过量表达是指通过将外源基因导入到斑马鱼胚胎中，观察该基因过量表达对 于胚胎发育的影响，从而间接了解它的功能( y a ny le ta 1 ，1 9 9 8 ) 。过量表达的 方法有两种：一种是构建携带该基因的表达载体，然后将表达载体直接显微注射 到斑马鱼胚胎；另一种就是利用t 7 、s p 6 或t 3r n a 聚合酶体外转录获得该基因 的m r n a ，再通过显微注射方法将m r n a 注射到斑马鱼胚胎。两种方法各有优缺 点：前一种方法可以利用不同的启动子，比如利用组织特异性的启动子可以来研 究该基因对于某组织或器官发育所造成的影响；后一种方法比较直接，并且操作 方便( r e n u c c iae ta 1 ，1 9 9 6 ；r o m a nb le ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 反义技术就是通过抑制基因的表达，降低甚至是消除了基因在组织中的表 达，从形态、组织以及分子等水平来研究它对胚胎发育的影响，从而解析它的功 能。目前，因为“k n o c k o u t ”技术在斑马鱼上尚未取得成功，而通过随机突变获 得斑马鱼突变体又非常费时费力，因此反义技术成为一个非常好的选择( j e s s e n j re ta 1 ，1 9 9 9 ) 。目前采用的反义技术主要有s i r n a 、核酶以及m o r p h o l i n o 等技 复旦大学硕士学位论文斑马鱼翻译延伸因子e f - 2 的克隆、表达谱分析及功能研究 术。其q b m o r p h o l i n o 被证明具有很好的特异性，目前在斑马鱼上应用较多。 m o r p h o l i n o 在2 0 0 0 年首先被证明在斑马鱼上有很好的抑制作用，它的骨架结构与 r n a 相似，与r n a 的结合能力也很强，可以有效的抑制r n a 的翻译( s c h o l p pse t a 1 ，2 0 0 1 ：s u m m e r t o nje ta 1 ，1 9 9 9 ) 。s i r n a 技术是将靶向特定基因的大约2 1 个碱 基长短的双链s i r n a 或者是4 5 5 0 - m e r 的发夹结构r n a ( s h r n a ) 导入到细胞。 s h r n a 在细胞内会自动被加工成为s i r n a ，切断靶向特定基因，从而引发基因沉默 或者表达抑制( e l b a s h i rsme ta 1 ，2 0 0 1 ) 。在哺乳动物细胞基因功能的研究中，通 常用s i r n a 基因调控技术阻断特定基因的表达从而研究细胞结构及相关基因的 功能。虽然s i r n a 技术在斑马鱼上尚未获得成功，但我们仍然进行了尝试。 在本文中，我们采用了过量表达和m o r p h o l i n o 、s i r n a 介导的r n a 干扰这两 种反义技术，来研究e f 2 在斑马鱼胚胎发育过程中的功能。 复旦人学硕士学位论文斑马鱼翻译延伸因子e f 2 的克隆、表达谱分析及功能研究 二材料与方法 1 材料 l 、实验材料 a b 品系斑马鱼( z e b r a f i s h ) ，由清华大学生物技术系孟安明教授惠赠，本实 验室繁殖培育。 2 、菌株、质粒： 质粒转化受体菌d h 5 t x 、t o p l 0 由本实验室提供 质粒p c d n a 3 由本实验室提供： 质粒p t z u 6 + i 由j o h nj r o s s i 教授提供； p g e m te a s yv e c t o r 购自p r o m e g a 公司： 3 、实验试剂 1 ) 常用试剂： 各种限制性内切酶、t 4 d n a 连接酶为n e we n g l a n db i o l a b s 和t a k a r a 公司产 品； t a q 酶购自上海生工生物公司； d n t p 购自p r o m e g a 公司； 溴化乙锭( e b ) 为f u l k a a g c h 公司产品； c a c l 2 购自s i g m a 公司； 色素抑制剂n - p h e n y l t h i o u r e a ( p t u ) 购自s i g m a 公司； i p t g 、x g a l 购自p r o m e g a 公司； 1 0 0 b p 与l k bd n al a d d e rm a r k e r 购自p r o m e g a 公司： 质粒大量抽提试剂盒：p r o m e g aw i z a r dp l u sm a x i p r e p sd n a p u r i f i c a t i o nk i t ， 购自p r o m e g a 公司； 胶回收试剂盒购自北京博大泰克； 质粒小量抽提试剂配方：溶液i ：5 0mm o l 1 葡萄糖，2 51 1 1m o l 1t r i s - h c l ( p h 8 0 ) ，1 0m m o l 1e d t a ( p h 8 o ) ；溶液i h0 2 nn a o h ，1 ( m v ) s d s ； 溶液i i h5m o l lk a e ，冰醋酸，h 2 0 ；酚：购自上海华舜生物有限公司。 h o l t e r f r e t e r ：称取3 5 9n a c l 、0 2 9n a h c 0 3 、0 1 9c a c l 2 、o 0 5 9k c l 溶于d dh 2 0 中，最后定容至1 0 0 0 m l ，调p h 至7 2 。 2 ) 探针制备试剂： s p 6r n a p o l y m e r a s e 、t 7r n a p o l y m e r a s e 、t 3r n a p o l y m e m s e 、r i b o n u c l e a s e 复日大学颂卜学位论文斑马鱼翻译延伸冈了e f 2 的克隆、表达谱分析及功f j u 0 1 究 i n h i b i t o r 、r n a s e f r e ed n a s e 、d t t 、r n t pm i x 、c a pa n a l o g 购自p r o m e g a 公丌_ ； d i g r n al a b e l i n gm i x 购自r o c h e 公司。 3 ) 原位杂交试剂： b l o c kr e a g e n t 、a n t i d i g o x i g e n i n u a pf a bf r a g m e n t s 、b mp u r p l ea ps u b s t r a t e 购 自r o c h e 公司；y e a s tr n a 、h e p a r i n ( d e a m i n a t e d ) 、p r o t e i n a s ek 、m a l e i ca c i d 、 s e r u m ( 1 a m b ) 、d e p c 、l e v a m i s o l 购自s i g m a 公司；甲酰胺购自上海华舜! l ：物 有限公司。 4 ) 构建s i r n a 质粒的p c r 引物由博哑公司合成，序列如下： 上游引物：5 g a a g a t c t t c a a g c t tg g a t c c a a g g t c g g g3 下游引物： s i e f 2s e n s e 5 - g a ag a tc t aa a aa ag g t g 髓c g a t g c c a t c a t gg g tg t tt c gt c ct t tc c ac 3 s i e f 2a n t i s e n s e 5 - c a ag c tt g aa a aa a c a t g a t g g c a t c g a a c a c c g g tg t tt c gt c ct t tc c ac - 3 5 ) m o r p h o l i n o 由g e n et o o l s 公司设计并合成，序列如下： e f 2 m o 5 c a c c a t t t t g a c a g a t g t t c t t g g 一3 ： 4 、原位杂交试剂配方： l i c i ：配4 ml i c i1 0 0 m l 需要l i c i h 2 02 5 6 9 ，配好后加入千分之一的d e p c 火 菌。 1 p b s ：n a c l0 1 3 7 m ，k c l0 0 0 2 7 m ，n a 2 h p 0 40 0 1 m ，k h 2 p 0 4o 0 0 2 m ； 定容至1 l ，调p h 7 4 。高压灭菌。 4 多聚甲醛：多聚甲醛溶于1 p b s ，终浓度为4 ，2 0 保存。 p b s t 溶液：t w e e n 一2 0 与l p b s 的混合液，t w e e n 一2 0 的浓度为0 1 。 2 0 x s s c ：用8 0 0 m l h 2 0 溶解1 7 5 3 9 n a c l 和8 8 2 9 柠檬酸钠，用儿滴1 4 n h c l 调p h 值至7 0 ，用水定容至l l 。分装后高压灭菌。该试剂的终浓度为3 0 m o l l n a c i 和o 3m o l l 柠檬酸钠。 s s c t ：t w e e n 2 0 与1 s s c 的混合液，t w e e n 2 0 的浓度为0 1 。 h y b ( 一) 预杂交液：5 0 甲酰胺，5 s s c ( 用2 0 s s c 母液稀释) ，0 1 t w e e n - 2 0 ，d d h 2 0 。 h y b ( + ) 杂交液：在h y b ( 一) 预杂交液的基础卜加入y e a s tr n a 与h e p a r i n ， 使其终浓度分别为o 5 m g m l 、5 0 u g m l 。 m a b ：l o o m mm a l e i ca c i d ，1 5 0 m mn a c l ，p h 7 5 。 m a b t ：m a b 中加入t w e e n 2 0 使其终浓度为o 1 。 复旦大学硕士学位论文 斑马鱼翻译延伸因予e f - 2 的克隆、表达谱分析及功能研究 1 0 b m b ：1 0 9 b l o c k i n gr e a g e n t 加入到1 0 0 m l m a b 中，加热溶解，高温灭 菌后，一2 0 保存。 b l o c k i n gs o l u t i o n ：m a b 、灭活羊血清、i o b m b 以7 ：1 ：2 的比例混合， 同时加入t w e e n - 2 0 ，使其浓度为0 1 。 s t a i n i n gb u f f e r ：1 0 0 r a mt r i s ，5 0m mm g c l 2 ，1 0 0m m n a c i ，0 1 t w e e n 2 0 ， 1 m mi e v a m i s o l 。 5 、仪器： p c r 仪为e p p e n d o r f 公司m a s t e r c y c l e r 产品； 紫外分光光度计购自e p p e n d o r f 公司n o 6 1 3 1 2 0 7 1 6 ： 电泳仪购自h o e f e rs c i e n t i f i ci n s t r u m e n t s 公司，型号p s 5 0 0 x 、$ 2 5 0 2 5 a m p 凝胶成像仪购自u v pu p l a n d 公司，型号c a 9 1 7 8 6 ： 解剖镜购自n i k o n 公司； 数码相机购自n i k o n 公司； 显微注射仪购自n a r i s h i g e 公司( i m 3 0 0 ) ； 台式高速离心机购自e p p e n d o r f 公司； 高速冷冻离心机购自h i t a c h i 公司； 大容量冷冻离心机购自h i t a c h i 公司； 电子天平购自o h a u s 公司； 6 、计算机软件及数据库 w w w n c b i n l m n i h g o v ：o r f 的鉴定和蛋白质翻译、同源基因的搜索、保守 结构域的分析； w w w a m b i o n c o m ：s i r n a 靶序列的设计； w w v v z f i n o r g ：胚胎切片信息； w w w e b i a c u k c l u s t a l ：多序列比对软件； g e n e d o c ：多序列比对绘图软件； v e c t o rn t i ：d n a 及氨基酸序列分析软件； d n a s t a r ：d n a 序列及酶切位点分析软件； o l i 9 0 6 0 ：引物设计软件； p l a s m i d ：质粒画图软件； 复旦大学硕上学位论文斑马鱼翻译延伸因子e f 2 的克隆、表达谱分析及功能研究 2 方法 1 、碱裂解法小量抽提质粒 1 ) 将培养物倒入1 5 m l 离心管中，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 s ，弃去上层培养液，使菌 体沉淀尽可能干燥。 2 ) 将沉淀重悬于l o o p l 预冷的溶液i 中，剧烈震荡。加2 0 0 1 溶液，盖紧管口， 温和颠倒3 5 次。加1 5 0 p 1 预冷溶液i i i ，温和混匀，置冰上l o m i n 后1 2 0 0 0 r p m 离心l o m i n 。 3 ) 将上清转入另一离心管，加等体积酚氯仿异戊醇混合溶液，剧烈振荡混合， 1 2 0 0 0r p m 离心l o m i n 。 4 ) 小心将上清转移到另一灭菌的1 5 m l 离心管，加入l m l 无水乙醇，室温放置 1 0 m i n ，然后1 2 0 0 0 r p m 离心l o m i n 。弃上清，向沉淀中加入l m l 预冷的7 0 乙 醇，室温放置5 m i n ，1 2 0 0 0 r p m 离一1 1 , 5 r a i n 。 5 ) 最后完全弃去上清，将沉淀置于5 5 c 烘干，最后加2 5 dt e 溶解，储存于2 0 。 2 、质粒大量制备 1 ) 离心1 0 0 - - - 5 0 0 m l 菌体，5 0 0 0 r p m 室温离心1 0 m i n ，弃干净上清，加入1 5 m lc e l l r e s u s p e n s i o ns o l u t i o n 重悬，彻底打散菌块。 2 ) 加入15 m lc e l ll y s i ss o l u t i o n ，轻轻地彻底混合，直至溶液澄清，置于冰浴约 2 0 r a i n ( 不要超过2 0 m i n ) 。 3 ) 加入1 5 m l n e u t r a l i z a t i o ns o l u t i o n ，3 7 水浴1 5 r a i n ( 目的：去r n a ) ，迅速轻 轻颠倒混匀。大管( 1 5 0 m 1 ) 5 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n ；小管( 5 0 m 1 ) 1 4 0 0 0 r p m 离一1 1 , 1 5 m i n ，均在2 2 。2 5 下进行。 4 ) 用m i r a c l o t h ( c a l b i o c h e mc o r p ) 、滤纸( w h a t m a n f l l ，g f ao rg f c ) 或咖啡滤 纸过滤上清转移至5 0 m l 离心管。量滤液体积，加0 5 倍体积室温的异丙醇，颠 倒数次混匀，静置 1 0 m i n ，1 4 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n ，5 5 烘干。 5 ) d n a 沉淀用2 m lt e 重悬，沉淀不可见，彻底洗管回收所有的d n a ( 5 0 放 置1 0 m i n ，同时不断取出转动离心管，使管壁附着的质粒接触t e ，略用力来回 甩动离心管，使质粒从管壁脱落，1 0 0 0 0 r p m 离心l m i n ，使得质粒溶液汇集到管 底) 。注：质粒是否完全溶解、收集决定质粒的得率。 6 ) 加l o m lw i z a r dp l u sm a x i p r e p sd n ap u r i f i c a t i o nr e s i n ，旋转悬浮。如果r e s i n 中出现沉淀，3 7 水温中1 5 2 0 m i n ，冷却到3 0 以下再用。 7 ) 加入到m a x i c o l u m n 柱中抽干，立停。加入2 0 m lc o l o m n w a s hs o l u t i o n ，抽干 立停。加入5 m l8 0 乙醇，抽干后继续抽i m i n 。 复旦大学硕士学位论文斑马鱼翻译延伸因子e f - 2 的克隆、表选谱分析及功能硝f 究 8 ) 将m a x i c o l u m n 置于5 0 m l 自供旧螺盖管中，吊桶式转子，2 5 0 0 r p m 离心5 m i n 。 再抽5 m i n ，抽干r e s i n 。将m a x i c o l u m n 柱子置于新的5 0 m l 螺盖管中，加1 5 m l 6 5 7 0 n u e l e a s e f r e e 水，静置lm i n 。吊桶式转子2 5 0 0 r p m 离心1 0 m i n 。再加入 1 5 m l6 5 7 0 n u e l e a s e f r e e 水，静置lm i n ，吊桶式转子2 5 0 0 r p m 离心5 m i n 。 9 ) 最终洗下的d n a 溶液可能存在可见或不可见的r e s i n 残留物。用0 2 u ms y r i n g f l i t e r 过滤到1 5 m l 离心管中，1 4 0 0 0 r p m 离心l m i n 。可去除所有r e s i n 残留物。 迅速将上清转至新的离心管中，加入1 3 体积4 mn a e l 、2 倍体积的无水乙醇， 混匀，一2 0 放置1 0 2 0 m i n ，同时轻轻颠倒，1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 。去上清，再 用7 0 乙醇洗。质粒干燥后用无菌水溶解，储于- 2 0 。 3 、用c a c l 2 制备感受态 1 ) 将3 7 。c 培养1 2 h 的母液，取l m l 转到到一个含有1 0 0 m l l b 培养基的1 l 烧瓶 中，3 7 剧烈震荡培养至o d 6 0 0 = 0 4 。 2 ) 将菌液转移至己灭菌的、预冷的5 0 m l 离心管中，置冰上1 0 m i n 冷却至0 。c 。 3 ) 4 4 1 0 0 r p m 离心1 0 m i n 。 4 ) 弃掉培养液，将离心管倒置l m i n ，以使最后的痕量培养液流尽。 5 ) 每5 0 m l 培养液用3 0 m l 预冷的0 1 m o l 1 c a c l 2 重悬，置冰上2 0 m i n