（遗传学专业论文）fe65l2全长基因及其多种剪接体的克隆鉴定及功能的初步研究.pdf

a m p b s a c d n a s d s d e p c d n t p s d 1 t e b e d l a e m b l t e m e d 0 d p a g e p c r a d a b a p p p l d l r p 英文缩写词表 b o v i n es e r u ma l b u m i n c o m p l e m e n t a r y d n a s o d i u md o d e c y ls u l f a t e d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d a t p , d c t p , d g t p , d t t p d i t h i o t h r e i t 0 1 e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n d i a m i n e t e t r a - a c e t i ca c i d e u r o p e a nm o l e c u l a rb i o l o g yl a b o r a t o r y n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e o p t i c a ld e n s i t y p o l y a c r y l a m i d eg e le l e t r o p h o r e s i s p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n a l z h e i m e r sd i s e a s e 1 3 - a m y l o i dp e p t i d e b a m y l o i dp r e c u r s o rp m t e i n p h o s p h o t y r o s i ni n t e r a c t i o nd o m a i n l o w d e n s i t yl i p o p r o t e i nr e c e p t o r r e l a t e dp r o t e i n 摘萤 l ，一 f 老年痴呆症的主要病理特征是脑部有不溶性的老年斑的形成。老年斑的主 要成份是b 淀粉样肽( 8 a m y l o i d p r e c u r s o rp r o t e i n ，ab ) ，它的前体是a p p 蛋白。a 1 3 是在a p p 的内化剪切过程中产生的。f e 6 5 基因家族的三个成员，f e 6 5 、f e 6 5 l 1 和f e5 驼都能和 的胞内区结合，因此可能在a p p 的内化过程中起一定的6 a p p 、 作用。， ， 首先，我们采用s m a r t 试剂盒构建了高质量的人胎脑c d n a 文库，从文 库中克隆得到了一条编码4 9 1 个氨基酸的全长e d n a 。通过序列比较发现该 c d n a 是人的f e 6 5 l 2 基因的一个新的剪接异构体。接下来，我们在原核系统 中表达了该基因，并通过蛋白质n 端氨基酸测序验证了该基因的表达。用这个 重组表达的蛋白为抗原免疫家兔得到了抗f e 6 5 l 2 的多克隆抗体。，我们在接下 去的工作中就可以利用抗体做免疫荧光和免疫组化试验来将f e 6 5 l 2 在组织中 和细胞内定位。 另一方面，通过r t p c r 又找到了f e 6 5 l 2 基因的其余三种剪接异构体。生 物信息学分析显示f e 6 5 l 2 的四种剪接体是由在一个内含子中的两个长度分别 为6n t 和2 1n t 的d , p t - 显子按不同的方式拼接而成。不同组织的r t p c r 的结 果表明四种f e 6 5 l 2 的剪接体在不同组织中的表达存在差异。、四种剪接体的氨 基酸序列的差异存在于磷酸酪氨酸作用结构域( p i d i ) 。通过酵母双杂交试验， 我们证明了p i d l 和低密度脂蛋白受体相关蛋白( l i 心) 的结合。最后，酵母双 杂交的结果还显示，四种不同的f e 6 5 l 2 剪接体的p i d l 与l r p 的结合力是不 同的，提示这种可变剪接可能参与调节a p p 的内化和加工过程。厂 鬻嚣，；耋鬻嚣舶弋陀6 5 也朝，c d n a文库，p i d 圩升联￥w w 名 构域可变剪接 中图分类号：q 7 5 3 a b s t r a c t a l z h e i m e r sd i s e a s ei sc h a r a c t e r i z e db yt h ep r o g r e s s i v ef o t i n a t i o no fi n s o l u b l e a m y l o i dp l a q u e sc o n s i s t i n g o f a m y l o i db - p e p t i d e ( ab ) i nt h e b r a i n 1 1 1 e f o r m a t i o no fabo c c u r si nt h ei n t e r n a l i z a t i o na n dt h ep r o c e s s i n go fh e b a m y l o i d p r e c u r s o rp r o t e i n ( a p p ) f e 6 5 ，f e 6 5 l l a n df e 6 5 l 2 ，t h et h r e em e m b e r so ff e 6 5 f a m i l y , i n t e r a c tw i t ht h ei n t r a c e l l u l a rd o m a i no fa p p , a n dm a yp l a ys o m er o l eo nt h e i n t e m a l i z a t i o no fa p e t oc l o n ea n dr e s e a r c ho ng e n e s ，ah i g h q u a l i t yh u m a nf e t a lc d n a l i b a r a r yw a s c o n s t r u c t e db yu s i n gs m a r tk i tf i r s t l y a sar e s u l t af u l l - l e n g t hc d n a e n c o d i n ga p r o t e i nw i t h4 9 la m i n oa c i d sw a sc l o n e df r o mt h ec d n al i b r a r y s e q u e n c ea n a l y s e s i n d i c a t et h ec d n ai san o v e lv a r i a n to fh u m a nf e 6 5 l 2g e n e t h ef e 6 5 l 2v a r i a n t w a se x p r e s s e di np r o k a r y o t i cs y s t e m ，c o n f i r m e db yd e t e r m i n a t i o no ft h en t e r m i n a l a m i n oa c i d ss e q u e n c e 1 1 1 ea n t i f e 6 5 l 2p o l y c l o n a la n t i b o d yw a sp r e p a r e db yu s i n g t h er e c o m b i n a n tf e 6 5 l 2 p r o t e i n a st h e a n t i g e n f o r f u r t h e r s t u d y , t h e i m m u n o c y t o c h e m i s t r ya n d i m m t m o f l u r e s c e n c e e x p e r i m e n t s c a nb e p e r f o r m e dt o l o c a l i z et h ef e 6 5 l 2w i t h i nt i s s u e sa n dc e l l s o nt h eo t h e rh a n d ，o t h e r3s p l i c i n gv a r i a n t so ff e 6 5 l 2w e r ei d e n t i f i e db vi u p c r b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s e ss h o wt h a tt h e4s p l i c i n gv a r i a n t sr e s u l tf r o mt h e4 f o l d c o m b i n a t i o no f2m i n i e x o n sw i t h i nas i n g l ei n t r o nw h o s el e n g t hi s6 n ta n d2 i n t r e s p e c t i v e l y r t p c rb yu s i n gm r n a i s o l a t e df r o mv a r i o u st i s s u e si n d i c a t e st 1 1 a tt h e f o u rf e 6 5 l 2s p l i c i n gv a r i a n t sa r ee x p r e s s e dd i f i e r e n t l yi nv a r i o u st i s s u e s t h e v a r i a t i o no ft h ea m i n oa c i ds e q u e n c ea m o n gt h e4v a r i a n t si si nt 1 1 ep h o s p h o t y r o s i n i n t e r a c t i o nd o m a i n ( p i d l ) b yu s i n gt h ey e a s tt w o h v b r i d ，w eh a v ed e m o n s t r a t e dt h e i n t e r a c t i o no fp i d lw i t hl o w d e n s i t yl i p o p r o t e i nr e c e p t o r - r e l a t e dp r o t e i n ( l r p ) f i n a l l y , t h ei n t e n s i t yo f t h ei n t e r a c t i o no ft h e4v a r i a n t s 、v i t l ll r pw a ss h o w nt ob e d i f f e r e n t ，s u g g e s t i n gt h a tt h ea l t e r n a t i v es p l i c i n gm a yr e g u l a t et h ei n t e r n a l i z a t i o na n d p r o c e s s i n go f a p r k e y w o r d s ：a l z h e i m e r sd i s e a s e ( a d ) ，f e 6 5 l 2g e n e ，b a m y l o i d p r e c u r s o r p r o t e i n ，e d n al i b a r a r y ，p i d i ，p i d 2 ，w wd o m a i n ，a l t e r n a t i v es p l i c i n g 3 前言 一、老年痴呆症发生的分子机理的研究进展 1 老年痴呆症概述 老年痴呆症( a l z h e i m e r sd i s e a s e ，a d ) 是当今1 5 大生物热点研究之一。 该病在1 9 0 7 年由a l o i sa i z h e i m e r 首次描绘。近一个世纪的研究已取得很大的 进展，己发现了许多与之相关的因子，但其发病机理至今尚不明确。 从多年来的研究来看，a d 表现出一些基本特征。主要症状表现为思维及 记忆功能先受累，随之发展为感情及行为异常，日常生活不能自理，后期卧床 不起，自然病程3 - 1 5 年。a d 的病理学改变，主要表现为大脑皮层及海马有广 泛的神经元减少或丢失；细胞内神经纤维缠绕( n e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e s ，n f t ) ： 细胞外老年斑( s e n i l ep l a q u e ，s p ) ：淀粉样脑血管病变。其中s p ，n f t 是a d 确诊依据之一。 a d 可分为两种类型，一种是家族性a d ( f a d ) ，包括s w e d i s hm u t a n t ，b r i t i s h m u t a n t 等等很多种类，它的发病年龄较早；另一种是晚发型a d ，他的发病年 龄一般较晚，在6 0 岁以后，晚发型a d 约占所有a d 的9 5 。 2 a d 发生的生理生化研究 目前有关a d 发病机制主要有三种学说： ( 1 ) t a u 蛋白异常学说：该学说认为，a d 患者t a u 蛋白被异常磷酸化， 同时产生异常糖基化和泛蛋白化修饰。t a u 蛋白功能是促进微管组装和维持微 管的稳定性，从而维持神经纤维的稳定性。而异常修饰的t a u 蛋白失去上述生 物学功能。 ( 2 ) 神经细胞调亡学说：该学说认为，a d 患者的脑中存在典型的核调亡小 体，表现出染色质浓缩，梯形d n a 损伤及特征性调亡基因表达。这可能与a1 3 过量表达，p s 一1 突变等有关。 ( 3 ) 淀粉样蛋白( a b ) 学说：该学说认为，由于ab 是a p p 异常转录产物， 其表达的过量，使之产生强自聚性，在神经细胞间聚合沉淀形成老年斑。 对a d 病理学改变的生化方面的研究显示，细胞外老年斑的主要成分是一 种b 淀粉样肽( ab ) 的物质。ab 是在细胞内产生而后分泌到胞外的。它包括两 种形式，一种是含4 0 个氨基酸残基的a1 34 0 ，一种是含4 2 个氨基酸残基的a 4 b4 2 。分泌到胞外的ab 中，ab4 0 占约9 0 ，a b4 2 只占约1 0 ，但沉积形成 老年斑的是ab4 2 这种形式 2 。 ab 的氨基酸序列公布之后，一些研究小组克隆得到了a 1 3 的前体蛋白 a p p ( ba m y l o i dp r e c u r s o rp e p t i d e ) 基因。a p p 是一种典型的i 型跨膜糖蛋白， 含一个n 末端信号肽，一个含n 糖基化位点的e c t o d o m a i n ，一个k p i 结构域， 个ab 区，一个单个穿膜螺旋和一个很短的胞内区 1 。a p p 基因组基因约 4 0 0 k b ，含有1 8 个外显子。其信号肽部分由外显子i 编码；跨膜区域由7 外显 子构成；a ( a p p 剪接产物) 由外显子1 6 ，1 7 部分剪接而成。a p p 基因具有看家 基因的结构特征，主要表现在启动子区富含g c ，有6 个g c 盒，无典型的t a t a 盒及c a t a 盒。比较独特的是a p p 基因存在多个转录起始位点，这些特点与其在 多种组织中表达相一致。a p p 基因转录产物的不同剪接产生不同的亚型，最常 见的亚型分布于不同的组织，正常人脑中以a p p 6 9 5 为主。 3 a d 发生的遗传学研究 家族性a d 往往是形成家系的，通过对一些f a d 家系进行遗传学分析，发现 四种基因是a d 相关的，它们的突变或多态性会导致a d 的发生。 第个确定的a d 相关基因就是a p p ，虽然a p p 的错义突变，只是小部分a d 的病因，但是它能为a d 发病机理的研究提供很多线索。例如，a p p 突变的转 基因小鼠就为我们提供了很好的动物模型 2 1 。 第二种是早老素一l 基因( p r e s e n i l i n e l ，p s 1 ) ，它是于1 9 9 2 年通过定位 克隆策略在1 4 号染色体上找到的。基因结构研究证实，该基因由l o 个外显子 组成，转录产物3k b 。其5 非翻译区g c 含量较高。p s l 编码4 6 7 氨基酸。其 结构类似于整合膜蛋白( 如膜受体，通道蛋白) ，n - 端含v r s o 氨基酸序列，缺 乏信号肽和糖化部分。p s l 至少有7 个疏水跨膜结构区( t m ) ，其中6 个连接t m 亲水环。目前的研究证实，p s 1 能在多种组织中表达，其中在中枢神经系统， 主要是在海马和小脑中表达。 在研究p s 一1 基因与a d 发生的关系中发现，p s 一1 基因突变与a d 发生联系 密切。通过研究f a d 家系发现p s 一1 基因有超过5 0 个错义突变。其特点是突变 发生在p s - 1 高度保守的结构域。在不同种族4 0 多个家系的研究中，发现2 0 多 个发生突变，主要集中于5 个跨膜区和3 个亲水环。 第三种是早老素一2 基因( p r e s e n i l i n 一2 ，p s 一2 ) 。它于1 9 9 5 年发现。p s 一2 位 于1 q 染色体上，含4 4 6 氨基酸，结构与p s 一1 相似，与p s 一1 有6 7 同源性，其 中跨膜区8 4 与p s l 相同。p s 一2n 一端8 0 多个氨基酸残基与p s l 区相比较大， 是明显区另之。p s 一2 可在多种组织中表达，转录物有两个，即2 4 k b 和2 8 k b 。 2 4 k b 转录物主要在心、脑、骨骼中表达，2 8 k b 转录产物主要在心，胎盘，骨 骼肌中表达。与p s i 相比，p s 一2 在f a d 家系中找到的错义突变较少，目前只 有二到三种。p s 基因( 包括p s l ，p s 一2 ) 的生物功能还不是很清楚。但是近来的 研究显示他们在发育过程中的n o t c h 信号途径起作用 1 。 第四种是载脂蛋白e ( a p o e ) 。载脂蛋白在脂质代谢中，在维持胆固醇平衡 方面起重要作用。目前已确证a p o e 参与神经系统正常生长和损伤修复过程。正 因如此，a d 病理学变化与s p 、n f t ，脑血管淀粉样变性都发现与a p o e 相关。a p o e 基因位于1 9 号染色体上，其基因组基因为3 7k b ，含有4 个外显子，其c d n a 为1 1 6 3 k b 。3 1 7 氨基酸残基构成a p o e 前体，含有1 8 氨基酸残基的信号肽。a p o e 的作用主要与周围神经损伤，中枢神经损伤有关。在a p o e 与a d 的关系上，a p o e 主要与b 一淀粉样蛋白有关。s p ( 细胞外老年斑) 是a p p 异常剪接产生的。在分 离s p 蛋白中，发现都有a p o e 带出现。a p o e 有三种等位基因型：a p o e 2 、a p o e 3 、 a p o e 4 ，它们的分布频率不一样，中西方人差异很大。在患a d 的人群中，带有a p o e 4 频率明显高正常人群。在正常人群中，a p o e 4 也以一定比例存在，因此，a o p e 4 这种多态性被认为是影响患a d 的危险性上升的个因素。这种影响是剂量依赖 性的，两个拷贝的a o p e 与一个拷贝的a o p e 相比，带来更大的患a d 的危险性 1 。 此外，有些研究表明，低密度脂蛋白受体相关蛋白( 1 0 w d e n s i t y 一1i p o p r o t e i n r e c e 口t o r r e l a t e dp r o t e i n ，l r p ) 与晚发型a d 具有遗传相关性，a 一大珠蛋白 ( q z - m a c r o g b u l i n ，a z m ) 第二外显子剪接位点的缺失也与晚发型a d 相关联。 尽管t a u 蛋白的堆积和神经性纤维缠结也是a d 的主要病理特征，但是却没 有发现任何t a u 基因的突变与家族性a d 有关联。现在，在另一种较不常见的 d e m e n t i a ：f r o n t o t e m p o r a ld e m e t i a 的家族中发现了t a u 基因的突变，在这种 疾病中，t a u 蛋白的结构特征发生了改变，有神经性纤维缠结产生，但却没有 淀粉样肽的沉积，另一方面，a p p 基因、p s 基因和a o p e 基因的突变都带来了a 0 的沉淀，并同时引起a d 的其他病理特征，这些都说明，t a u 蛋白的变化更可 能是a b 沉淀所引起的，而a b 的产生和沉淀是a d 发生的中心事件。 2 1 。 4 a b 的形成过程 a b 的前体是a p p 蛋白，它是一种广泛表达于各个组织的l 型跨膜蛋白， 有一个很大的n 端膜外区，一个很小的c 端膜内区。a p p 经过内化和几种蛋白 酶的剪切后形成a 9 。 为了起始a b 的形成，b 一分泌酶( b s e c f e t a s e ) 首先在a p p 的ab 区的 n 端进行酶切释放出a p p sb ，一个1 0 0k d 的可溶性n 端片段和c 9 9 ，一个仍然结 合在膜上的1 2k d 的c 端片段。a p p 还可以通过另一条途径进行剪切，即a 一分 泌酶的途径，它阻止了a p 的形成。0 【一分泌酶的剪切产生了一个大的可溶性的n 端片段a p p s 仪，以及一个1 0 k d 的膜结合的c 端片段c 8 3 。然后，c 9 9 和c 8 3 再 进一步被y 一分泌酶酶切，分别释放和分泌出a p 及非病理性的p 3 肽段 2 。 寻找。【一，b 一和y 一分泌酶的工作已有很大进展，有两种金属蛋白酶，a d a m i o 和t a c e 参与a p p 的q 一剪切的过程，因此应当是属于q 一分泌酶 2 。近来的证 据显示早老素直接参与了y 一分泌酶剪切a p p 的过程，很有可能p s i 和p s 2 自身 就是y 一分泌酶【1 。然而，p s 多次跨膜的结构特征使得它并不象一个蛋白水解 酶。要证明p s 就是y 一分泌酶，还需更可靠证据。 对于b 一分泌酶的功能特性，人们进行了较为深入的研究。口一分泌酶是广泛 性分布的，但是它在脑中要比外周组织分布多，在神经元中的活性要强于星形 胶质细胞。细胞生物学的研究显示b 一分泌酶的活性主要存在于溶酶体，高尔基 体和内质网中，它在酸性p h 条件下活性最高，已经确定b 一分泌酶在a p p 上剪 切的准确位点是a p s l ，它的剪切是高度序列特异性的。】9 9 9 年s c je n c e ) 上 一篇论文报道了条具有多种已知的b 一分泌酶特征的跨膜天冬氨酸蛋白酶 b a c e ，并认为b a c e 就是人们一直在寻找的d 一分泌酶。由于b 一分泌酶，y 一分 泌酶剪切a p p 产生a b 的过程是发生在膜泡，高尔基体和内质网中的，因此，a p p 作为一个膜蛋白是怎么内化到胞内的，也是a b 产生过程中的重要环节。a p p 的 膜内区能与多种蛋白质相互作用。如四聚体g 蛋白g 。、x 1 1 蛋白、f e 6 5 基因家 族等。这些相互作用形成的一个较复杂的网络在a p p 的内化过程中可能扮演一 个重要角色。 二 f e 6 5 基因家族及其在a p p 内化中的可能作用。 i f e 6 5 家族基因的克隆 1 9 9 1 年，意大利的一个研究小组在鼠脑中分离得到了一段1 7 8 b p 长的c d n a 片段，然后用它到鼠脑c d n a 文库中钓出了一个全长为2 3 0 0 b p 的c d n a ，命名为 f e 6 5 。f e 6 5 的m r n a 主要在脑和神经系统的一些区域中特异表达，而在肝和其 它一些组织中不表达 3 。f e 6 5 的c d n a 包含一个开放读框( o r f ) ，编码4 9 9 个 氨基酸。通过同源比较发现这4 9 9 个氨基酸中有1 4 3 个与哺乳动物免疫缺陷病 毒编码的整合酶的d n a 结合区域有高度同源性，其余部分与整合酶相应部分无 同源性。另外，f e 6 5 基因o r f 的前2 0 6 个残基带大量负电荷，这段序列是j u n 基因家族转录反式激活因子实现功能必不可少的保守顺序。 在从鼠脑文库中得到f e 6 5 基因后，人们期望从人脑文库中得到这个基因。 一个实验室利用a p p 上与f e 6 5 结合位点的序列从入胎脑文库中钓得了一个鼠 f e 6 5 基因的同源基因，它们蛋白读框的同源性有5 6 。他们把这个新基因在基 因文库查找相似基因，找到了两个e s t ，其中一个与鼠f e 6 5 基因的同源性更高， 另一个则偏低。他们把自己找到的新基因命名为h f e 6 5 l 1 ( f e 6 5 一“k ei ) ，两个 e s t 命名为h f e 6 5 及h f e 6 5 l 2 。研究表明h f e 5 l 1 是在各种组织中广泛表达的， 7 这点与鼠f e 6 5 不同。 与此同时，另一家实验室采用酵母杂交系统证明人的a p p 可以同鼠f e 6 5 蛋 白结合。然后他们从人胎脑文库中克隆到了人的f e 6 5 的m r n a ，这段m r n a 有 2 8 5 9 b d 长，与鼠的f e 6 5m r n a 有8 8 相似性。它们的蛋白读框有9 5 同源。他 们还采用荧光原位杂交将h f e 6 5 基因定位于染色体l l p l 5 上。 以f e 6 5 和f e 6 5 l 1 的保守序列为探针，从鼠脑c d n a 文库中又得到了f e 6 5 l 2 基因，它编码5 0 k d a 的蛋白。与f e 6 5 不同，f e 6 5 l 2 不是脑特异性表达的，它 的m r n a 在鼠许多组织中表达，特别是在脑和睾丸中丰富表达。通过实验证明， f e 6 5 l 2 在体外和体内均可与a p p 的胞内区相作用。 1 9 9 9 年人的f e 6 5 1 2 基因也被克隆得到，它编码4 8 6 个氨基酸，比鼠的f e 6 5 l 2 基因短1 8 个氨基酸，并与之有9 0 以上的同源性。人的f e 6 5 l 2 基因在各个组 织中均有表达，但它的长2 2k b 的转录产物主要在脑中表达。通过r h 定位， 此基因定位在5 号染色体上的遗传标记s h g c 一9 8 2 4 ( d 5 8 2 3 7 4 ) 与8 h g c 一8 4 8 9 ( d 5 8 2 5 2 9 ) 之间。f e 6 5 l 2 的三个重要结构域与f e 6 5 具有较高同源性，通过体 外结合实验，它的p i d 2 与a p p 的结合已经得到证明 9 ，1 0 。f e 6 5 l 2 基因的基 因组结构也已清楚，它由跨度6k b 的1 3 个外显子组成。通过引物延伸分析， 在c p g 岛上找到了此基因的两个转录起始位点。将f e 6 5 、f e 6 5 l 1 、f e 6 5 l 2 的序 列进行比较，发现它们都有三个重要结构域p i d ，、p i d 。和w w 区域，因此三者具 有许多共同的结构和功能特征。我们可以得出结论f e 6 5 、f e 6 5 l 1 、f e 6 5 l 2 基因 是一个基因家族。 2 f e 6 5 基因的转录及其调控 哺乳动物中枢神经系统( c n s ) 的生理复杂性在于其大量基因仅限于在c n s 的器官中表达。事实上，在脑中存在的约3 0 0 0 0 种m r n a 中有2 0 0 0 0 种不在其它 组织中表达。f e 6 5 基因就是这样一种基因，在神经系统的一些区域内表达，而 在别的组织中不表达，这主要是由于f e 6 5 基因转录的特异性调控造成的。 f e 6 5 蛋白有两个转录起始位点，从基因文库中分离得到了含有其中个转 录起始位点的染色体片段。在两个神经组织细胞系中，这个启动子可以有效地 引导报告基因c a t 的高效转录，而在非神经细胞系中，则不具有引导转录的作 用。 通过构建一系列的突变，找到了这个启动子的两个功能区域，一个是一1 6 3 到一5 5 区。这是一个顺式元件，它包含了一段富含g c 的序列，是s p l 或其它g c 结合蛋白的结合位点。这个区域的缺失会导致转录活性大大下降，但是不具有 组织特异性 7 。 第二个功能区域是一1 3 到+ 4 4 区，也是个顺式元件。这是一个t a t a l e s s 启动子，并包含了转录起始位点。这段序列携带了在神经细胞中高效表达的信 息，因此引导神经特异性转录。通过对这段区域的点突变分析可以证明鼠脑中 有好几种蛋白因子可与这个区域形成d n a 一蛋白质复合物，其中主要有三种d n a 一 蛋白复合物：b i 、b i i 、b i i i 。b i 和b i i 复合物中的蛋白与单链结合蛋白p u r d 很相似，在脑中丰富表达。( p u rd 是一种与d n a 嘌呤密集区相作用的蛋白，在 鼠脑中d n a 结合活性很高。) 在c h o ( 中国仓鼠卵巢细胞) 中，f e 6 5 启动子的效 率原本很低，p u rc le d n a 的瞬时表达可以提高f e 6 5 启动子的效率。转录因子y y l 与b i i i 复合物的形成有关。( y y l 的作用机制有三种，一是y y l 与别的因子相 作用，二是y y l 诱导别的因子与d n a 特异结合，三是y y l 是与其它转录因子竞 争结合位点。对于f e 6 5 基因启动子，y y l 作用可能是与起始因子序列相作用， 但也不排除前面所说三种机制的可能性。) 在c h o 细胞中，y y l c d n a 的瞬时表达 也可导致f e 6 5 的转录增加。这表明p u rq 与y y l 两种因子都能使f e 6 5 启动子 的转录效率提高但并不具有协同效应，因为它们是通过两种不同途径对基因表 达起作用的f 9 。 3 f e 6 5 家族的功能研究 f e 6 5 家族的蛋白包括有三个蛋白一蛋白相互作用区：两个磷酸酪氨酸作用 区( p i d ) 或磷酸酪氨酸结合区( p t b ) 和一个含有两个保守色氨酸残基的w w 区。 采用酵母双杂交系统，将f e 6 5 蛋白c 末端的p i d p t b 区域( p i d 2 ) 去人脑 的文库中查找与之相作用的蛋白，得到几种蛋白，其中一个便是a p p 。这证明 在体外f e 6 5 蛋白的p i d 2 区域可与a p p 结合。通过免疫共沉淀实验，又证明在 体内情况下f e 6 5 也可与a p p 结合。 进一步研究表明，f e 6 5 蛋白的p i d p t b 区域在生长因子受体s h c 蛋白、i r s l 蛋白上同样具有 2 ，但f e 6 5 蛋白与a p p 的结合与别的一些含有p i d p t b 区域 的蛋白( 如s h c 蛋白和i r s l 蛋白) 有所不同：与s h c 和i r s l 分子的p i d p t b 区域结合的蛋白均含有结合活性中心x n p x y 特征序列；而a p p 与f e 6 5 蛋白结合 的特征序列远比这要长。结合竞争实验表明，人工合成的含有x n p x y 特征序列 的肽段，只有长度超过3 2 个氨基酸才可以竞争a p p 与f e 6 5 的结合，而小于3 2 氨基酸的肽段则不行。另一方面，s h c 和i r s l 蛋白的p i d p t b 区与含有特征序 列x n p x y 的蛋白的结合依赖于这个特征序列中酪氨酸的磷酸化，而f e 6 5 的p i d 2 与a p p 的结合则不依赖于酪氨酸的磷酸化 5 。 f e b 5 的另一个p i d p t b 区，即n 末端的p i d 。区域，它与低密度脂蛋白受体 相关蛋白( l r p ) 相作用。这个相互作用已通过酵母双杂交和免疫沉淀试验得以 证明。l r p 是载脂蛋白e 的神经特异受体，因此，可能通过f e 6 5 蛋白构成了一 个复杂的细胞内运输过程 5 。l r p 蛋白有两个x n p x y 的特征序列，其中第二个 9 是与f e 6 5 结合所必需的。同p i d 2 一样，p i d 与l r p 的结合也不依赖于酪氨酸 的磷酸化。 f e 6 5 还有另一个区域w w 区域。之所以称之为w w 区域，是因为这个区 图1 ：f e 6 5 及f e 6 5 l 2 在a p p 内化加工过程中的可能作用模式： 根据j o a e h h uh e r z 等提出的关于f e 6 f 孀a p p 和l r p 连接形成复合 物的模型，推援i 皿硒l 2 也有类似作用= f e 6 $ j y c l z e 6 $ l 2 的p i d l 与l r p 结合，p i d 2 与a p p 结合，从而将l r p 与a p p 相连接：载腊蛋白e 的内 吞可导致a p p 被内吞：w w d o m a i n 与m e m a 蛋白结合，可瞻与麓后的 内吞膜泡运输过程有关；在膜泡、内质同和商尔基件中a p p 在 b “a - s e c r e t a s e 和g a m a - s e a e t a s e 作用下生成a - b e t a 域的四个高度保守的氨基酸中有两个是色氨酸( w ) 。w w 区域为一个由3 8 个半 保守氨基酸组成的特征序列。这个序列同样存在于一些看似无关的蛋白中，如 d y s t t o p h i n 、y e s a s s o c i a t e dp r o t e i n ( y a p ) 及转录调节因子r s p 一5 8 。它们 的共同点是均与包括富含脯氨酸的核心序列p p x y 或p p l p 的蛋白结合。如y a p 可以与y e sp r o t o n c o 基因产物的s h 。区域的一段富含脯氨酸的区域相结合，从 而介入一系列复杂的细胞内信号传递作用。f e 6 5 的w w 区域与鼠脑中5 个蛋白 有亲和性，分子量分别为6 0 k d a 、7 5 k d a 、8 0 k d a 、1 4 0 k d a 、2 0 0 k d a 。其中8 0 k d a 和1 4 0 k d a 的两段蛋白组成了m e n a 蛋白 6 。m e n a 的结合区也是一段富含脯氨 酸的p p l p 特征序列。有人推测m e n a 蛋白作为f e 6 5 的伴随分子调节f e 6 5 与a p p 的结合作用。 综上所述，f e 6 5 蛋白除了p i d 2 能与a p p 的膜内区结合以外， w wd o m a i n 能与一种与细胞骨架组装有关的蛋白m e n a 结合，p i d i 结构域能与载脂蛋白e 的受体l r p 结合 4 ，7 ，8 。因此人们推测f e 6 5 作为一种衔接分子，使l r p 能 够调节a p p 的内化和运输过程 8 ( 图1 ) 。已经有研究表明，l r p 蛋白可以调节 a p p 的内吞：而且实验也显示，在培养细胞中加入l r p 的拮抗剂可使ad 的合成 大量减少，在l r p 缺陷型细胞中恢复l r p 的功能可使a 1 3 的合成增加，这说明 这种l r p 介导的a p p 内化过程能调节a p p 的加工和ab 的产生。l r p 介导a p p 的 内化很可能是通过某种衔接分子来实现，这种衔接分子很可能就是f e 6 5 蛋白。 f e 6 5 在细胞中的过量表达会导致a 1 7 , 分泌的增加；r t - p c r 的结果表明，在a d 患者的大脑皮层中f e 6 5 两种剪接体的表达都上调了。这些证据都支持f e 6 5 作 为一种衔接分子，使l r p 能够调节a p p 的内化和运输过程这个假浣。f e 6 5 基因 家族的三个成员都包括有三个同样的蛋白一蛋白相互作用结构域，因此可能扮 演这相似的角色。最近的研究已经证明f e 6 5 l i 可以通过参与a p p 在内化运输过 程来影响a p p 的剪切加工。由于f e 6 5 l 2 的三个结构域与f e 6 5 有较高同源性， 并且f e 6 5 l 2 的p i d 2 与a p p 的结合也已经得到证明，所以f e 6 5 l 2 也可能以类似 于f e 6 5 的方式介导了a p p 的内化( 图1 ) 4 在f e 6 5 家族中的可变剪接 在发现f e 6 5 基因的同时，还找到f e 6 5 基因的一种剪接异构体，两种剪接 形式相差一个6 n t 的小外显子，而这6 n t 的小外显子编码的氨基酸位于p i d l 上。 并且这种可变剪接是神经元特异性的，带有这个小外显子的m r n a 只在神经元中 出现，而在胶质细胞和其它组织中不出现 5 。后来在f e 6 5 l 1 和f e 6 5 1 。2 中也 找到了这种保守的可变剪接 6 ，9 。对大鼠m r n a 做的核酸保护实验表明f e 6 5 1 2 基因的带有6 n t 小外显子的剪接形式只在脑中出现，而别的组织中只有那种不 带这6 n t 的剪接形式 6 。在高等真核生物中，可变剪接的现象普遍存在。在不 同发育阶段和细胞类型中，可变剪接作为一种基因表达调控方式，可以使同一 基因产生不同功能的蛋白，从而调节细胞的发育和生理功能。目前，有越来越 多的关于同一基因多种剪接体的报道被发表，这体现了这一现象的普遍性和对 功能研究的重要意义。 f e 6 5 l 2 基因在老年痴呆症相关蛋白a p p 的内化和加工过程中可能某种重要 的角色，这是我们选择它进行研究的原因。全长的f e 6 5 l 2 基因从c d n a 文库中 克隆得到。我们将它进行了蛋白的表达和初步纯化，并制备了多克隆抗体。利 用抗体将进行进一步的功能研究。另一方面，由于我们所得到的f e 6 5 l 2e d n a 是f e 6 5 l 2 的新的剪接形式，我们对该基因的可变剪接作了分析和研究，证明了 在该位点存在四种剪接体，且这四种剪接体的组织分布有差异性，它们以不同 的强度与l r p 结合。 实验部分 第一部分人f e 6 5 l 2 全长基因的克隆表达及抗体制备 c l o n i n g ，p r o t e i ne x p r e s s i o n a n da n t i b o d y p r e p a r a t i o n o fh u m a n f e 6 5 l 2g e n e 引言 本实验构建了人1 8 周胎脑c d n a 文库。用一步法从胎脑组织中提取总r n a 后经o l i g o ( d t ) 纤维素柱分离纯化得到m r n a ，利用c l o n t e c h 公司的s m a r t p c r e d n al i b r a r yc o n s t r u c t i o n 试剂盒构建文库。从构建的e d n a 文库中我们克隆 到全长的新基因，然后利用这条全长e d n a 进行了蛋白表达和抗体制备等工作， 并打算在此基础上对新基因的功能进行研究。 1 材料和试剂 1 1 实验材料： 正常人1 8 周胎脑：健康汉族人，按计划生育政策施行水囊法引产之1 8 周胎儿，取全脑组织，用生理盐水洗去血污后液氮罐中冻存。胎儿由上海市第 一人民医院提供。 健康的新西兰大白兔 1 2 主要试剂、酶类 o l i g o ( d t ) 纤维素：美国g i b c o 公司产品。 t 4d n a 多聚核苷酸激酶( t 4d n ak i n a s e ) ，英国b i o l a b s 公司产品 t 4 d n a 连接酶( 1 4d n al i g a s e ) ，英国b i o l a b s 公司产品 t 4d n a 聚合酶( t 4d n a p o l y m e r a s e ) ，英国b i o l a b s 公司产品 1 - k bd n a 分子量m a r k e r ，美国g b i c o 公司产品 n o t 限制性内切酶，英国b i o l a b s 公司产品 e c o r ，限制性内切酶，德国b o e h r i n gl d a n n h e i m 公司产品 b a m h l 限制性内切酶，德国b o d t r i n gm a n n h e i m 公司产品 t a q p l u sid n a 聚合酶，上海生工生物工程公司产品 羊抗兔1 2g 辣根过氧化酶交联物，华美生物工程公司产品 s u p e r s c r i p ti i 逆转录试剂盒，美国g i b c o 公司产品 s m a r tc d n a 建库试剂盒，美国c l o n t e c h 公司产品 b i g - d y ep r i m e r 和b 晤d y et e r m i n a t o r 测序试剂盒，美国p e r k i ne l m e r 公司产品 r e a l p r e p9 6 质粒抽提试剂盒，德国q i a g e n 公司产品 q i a q u i c kp c r 纯化试剂盒，德国q i a g e n 公司产品 q i a q u i c kp c r 胶回收试剂盒，德国q i a g e n 公司产品 弗氏完