（遗传学专业论文）果蝇属mrpl11和ase基因的进化与分子系统学研究.pdf

摘要 本研究通过p c r 扩增和克隆测序的方法获得了果蝇属二十多个种的序列。序列分析 表明：m r p l l l 基因的转换数多于颠换数，比值约为1 2 ；a s e 基因的颠换数略大于转 换数，比值约为o 9 5 。m r p l l l 基因的同义替换异义替换( 融依a ) 值远大于l o ，低的 k a 值说明果蝇属的m r p l l l 基因在进化过程中可能承受着较强的选择压力。a s e 基因的 研究发现d m e l a n o g a s t e r ，d s i m u l a n s , d s e c h e l l i a ，d m a u r i t i a n a ，d e r e c t a 这五个种相 对于黑腹果蝇种亚组( m e l a n o g a s t e r s u b s p e c i e s ) 的其他种少了一段编码谷氨酰胺的序列， 数据表明片段丢失可能发生在d m e l a n o g a s t e r ，d s i m u l a n s , d s e c h e l l i a ，d m a u r i t i a n a ， d e r e c t a 这五个种的a s e 基因的进化过程中。 以a e d e s a e g y p t i 做为外群，分别用最大简约( m p ) 法、邻接( n j ) 法、最大似然 ( m l ) 法和贝叶斯法根据每个分子标记的序列构建果蝇属系统发生树，探讨果蝇属的 系统演化以及种间进化关系。两个基因的构树结果都显示：果蝇属分为两大支，一支是 果蝇亚属，另一支是水果亚属。在果蝇亚属中首先分化的是h a w a i i a n 种组，接着是v i r i 凰 种组和r e p l e t e 种组。在水果亚属中，o b s c u r a 种组( d p e r s i m i l i s 和d p s e u d o o b s c u r a ) 最先分化，接着是m e l a n o g a s t e r 种组。m e l a n o g a s t e r 种组中a n a n a s s a e 种组最先分化， m o n t i u m 种组次之，东方种亚组m e l a n o g a s t e r - s u z u k i i t a k a h a s h i i - f i c u s p h i l a - e u g r a c i l i s - e l e g a n s 最后分化。另外m e l a n o g a s t e r 复合种中，d s i m u l a n s 和d m a u r i t i a n a 亲缘关系最 近。 关键词：果蝇属；m r p l l l 基因；a s e 基因；分子进化；种系发生 a b s t r a c t 18n u c l e o t i d es e q u e n c e si nm r p l l lg e n ea n d19n u c l e o t i d es e q u e n c e si na s eg e n eo f d r o s o p h i l af a l l e nw e r ea c q u i r e db yp c ra n dc l o n es e q u e n c i n gm e t h o d s t h et r a n s v e r s i o n s a r em o r et h a nt h et r a n s i t i o n si nt h em r p l l lg e n e ；t h et o t a lr a t eo ft r a n s v e r s i o nt ot r a n s i t i o ni s 1 2 t h et r a n s i t i o n sa r em o r et h a nt h et r a n s v e r s i o n si nt h ea s eg e n e ；t h et o t a lr a t eo f t r a n s v c r s i o nt ot r a n s i t i o ni so 9 5 t h er a t eo fs y n o n y m o u s ( k s ) t on o n - s y n o n y m o u s ( k a ) i n m r p l l lg e n ei sf a rh i g h e rt h a n 10 t h el o wk av a l u ei n d i c a t et h a tt h em r p l l lg e n eo f d o s o p h i l af a l l e nh a v eu n d e r g o n es e l e c t i o np r e s s u r ei nt h ee v o l u t i o n s e q u e n c i n ga n a l y s i s s h o w e dt h a td m e l a n o g a s t e r ，d s i m u l a n s , d s e c h e l l i a ，d m a u h t i a n a ，d e r e c t ad e l e t e da n a b o u t3 6b po fd n a f r a g m e n tr e l a t i v et oo t h e rd r o s o p h i l as p e c i e s t h i sf r a g m e n tt r a n s l a t e dt o g l u t a m i n e t h ed a t as u g g e s t e dt h a tn u c l e o t i d es e q u e n c e sl o s sm i g h th a v eo c c u r r e di nt h ea s e g e n ee v o l u t i o n a r yp r o c e s so fd m e l a n o g a s t e r ，d s i m u l a n s , d s e c h e l l i a ，d m a u r i t i a n a ， d e r e c t a a e d e s a e g y p t iw a ss e l e c t e da st h eo u t g r o u p p h y l o g e n e t i ct r e e sa r ec o n s t r u c t e db a s e do n t h e s e q u e n c ed a t ao fm r p l l la n da s eg e n e sw i t hn e i g h b o u r - j o i n i n g ( n j ) ，m a x i m u m l i k e l i h o o d ( m l ) ，m a x i m u mp a r s i m o n y ( m p ) a n db a y e s i a nm e t h o d t h er e s u l ts h o w e dt h a t d r o s o p h i l ai s l o c a t e da tt h eb a s eo fm o l e c u l a rt r e e s ；t h es e c o n dc l a d ei s s o p h o p h o r a h a w a i i a ns p e c i e sd i v e r g e df i r s ti nd r o s o p h i l a ，t h es e c o n di sv i r i l i ss p e c i e s ，a n dt h et h i r di s r e p l e t es p e c i e s o b s c u r as p e c i e sd i v e r g e d f i r s ti ns o p h o p h o r a ( d p e r s i m i l i sa n d d p s e u d o o b s c u r a ) ，t h es e c o n di sd r o s o p h i l as p e c i e s i nd r o s o p h i l am e l a n o g a s t e rs p e c i e s ，t h e f i r s tc l a d ei sa n a n a s s a e s p e c i e s ，t h e s e c o n di sm o n t i u m s p e c i e s ，m e l a n o g a s t e r - s u z u k i i t a k a h a s h i i - f i c u s p h i l a - e u g r a c i l i s e l e g a n ss p e c i e si st h el a s td i v e r g e dc l a d e d s i m u l a n s a n dd m a u r i t i a n aa r et h em o s tc l o s e l yr e l a t e ds p e c i e si nt h em e l a n g a s t e rs u b g r o u p k e yw o r d s ：d r o s o p h i l af a l l e n ；m r p l l lg e n e ；a s eg e n e ；m o l e c u l a re v o l u t i o n ；p h y l o g e n y 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 论文作者签名： 日期：年月日 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以允 许采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以公开学位论文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 作者签名： 指导教师签名： 日期： 日期： 刖吾 月l 】吾 1 分子系统学的研究概况 分子系统学( m o l e c u l a rs y s t e m a t i c s ) 是近3 0 年发展起来的- - i 0 综合性前沿学科，它 在分子水平上对生物遗传多样性、分类、种系发生和进化等方面进行研究，其研究结果 对于保护生物多样性( 尤其是遗传多样性) ，揭示生物进化历程及机理具有十分重要的意 义。 分子系统学是通过检测生物大分子包含的遗传信息，定量描述、分析这些信息在分 类、种系发生和进化上的意义，从而在分子水平上解释生物的多样性、种系发生及进化 规律的一门学科。它以分子生物学、系统学、遗传学、分类学和进化论为理论基础，以 分子生物学、生物化学和仪器分析技术的最新发展为研究手段，是一门交叉性很强的学 科。分子系统学使得种系发生和进化的研究深入到对演化机制的本质进行探讨的阶段， 其发展历史根据研究方法的发展大致可分为三个阶段。 2 0 世纪5 0 - 一6 0 年代，分子系统学的研究主要在蛋白质的水平上进行。5 0 年代以 免疫学方法为主，并在脊椎动物亲缘关系的研究上取得了一定成果。19 5 5 年s m i t h i e s 发 明了淀粉凝胶电泳技术。6 0 年代中期h u b b y 等应用同功酶电泳证明了动物自然群体中 存在着大量的遗传变异。随后，等位酶、同功酶电泳技术开始成为分子系统学的热点技 术。 7 0 年代，分子系统学研究进入了核酸水平的研究时期。7 0 年代中期，m t d n a 的 限制性片段长度多态性技术开始在脊椎动物和无脊椎动物的种群结构研究中应用( 何正 权，张亚平等，1 9 9 9 ) 。 8 0 年代以来，以多聚酶链式反应( p c r ) 和s o u t h e r n 杂交为基础发展了一系列衍生 技术，如随机扩增多态性d n a 技术、d n a 指纹图谱技术和扩增片段长度多态性技术等， 近几年来又发展了微卫星d n a 指纹图谱技术及核酸序列测定技术，分子系统学在d n a 水平的研究飞速发展并取得了大量的成果。 1 1 分子系统学研究方法与应用 1 1 1 蛋白质水平的分子系统学研究 2 0 世纪6 0 年代，蛋白质水平的分子系统学研究以组织匀浆液中可溶性蛋白质的免 疫学方法为主，以后又发展了纯蛋白的微量补体技术。7 0 年代产生了单克隆抗体技术， 使免疫( 血清) 系统学方法更加准确可靠。7 0 - - 一8 0 年代主要以等位酶电泳为主，以后蛋白 湖北大学硕十学位论文 质序列和立体结构数据也用于系统学研究中。到目前为止，蛋白质分子系统学研究方法 可归为三类：免疫学( 血清学) 方法、等位酶电泳、蛋白质的立体结构分析方法。 ( 1 ) 免疫学( 血清学) 方法 血清系统学( s y s t e m a t i cs e r o l o g y ) 是应用抗体、抗原反应特征来研究蛋白质之间或 有机体之间进化关系的学科。n u t t a l l 等首先采用沉淀实验方法比较动物界主要门中科级 阶元之间的亲缘关系；s t e p h e n 等、b r o w n 和l a r g l e y 、s p i c e r 等采用免疫沉淀法对昆 虫纲的部分昆虫进行系统发育研究；f i n k 和b r o e m e r 、c o l l i e r 和m a c i n t a y r e 、b e e r l e y 和 w i l l s o n 用微量补体固定技术对昆虫纲部分昆虫的亲缘关系进行研究。 ( 2 ) 等位酶电泳 酶电泳始于5 0 年代，通过分析酶的电泳谱带可以间接达到在基因水平上研究遗传变 异的目的，同功酶和等位酶是应用最多的两类酶。由于等位酶谱带与等位基因之间关系 更加明确，因而以等位酶电泳的应用更为广泛。可用于酶检测的电泳主要有淀粉凝胶电 泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和醋酸纤维素膜电泳等，不同的电泳方法或同一方法中不同条 件的组合，对同一样品的分离效果也是不同的，多数研究表明，改变电泳条件能检测出 更多的变异。 酶电泳方法可以在相对短的时间内检测出大量样本中许多座位上的遗传变异，在种 群水平上检测遗传变异快速有效，方便节省。但它的缺点是可利用的遗传位点数量较小， 只能检测编码酶蛋白的基因位点，对非编码基因的变异则无能为力；同时，密码子同义 突变的广泛存在使之无法检测全部的d n a 变异，因而低估遗传变异水平，而且等位基因 位点易受选择压力的影响( p o t e a u x ，c e ta l ，1 9 9 8 ) ，进一步降低了它用于估计遗传变异 的精确性，因而用等位酶数据实现系统发育重建说服力较弱( s e m e r i k o v ，v le ta l ，1 9 9 9 ) 。 在采用酶蛋白电泳方法时，检测尽可能多的位点和样本，以提高数据的可信度。 迄今为止，酶电泳在分子系统学中的应用已积累了丰富的资料，如在种内遗传多样 性分析( 聂龙等，1 9 9 5 ) 、系统发育重建( s e m c r i k o v ，v l c ta l ，1 9 9 9 ) 、遗传变异与地理分 布关系研究( g o o d m a ，m ，1 9 6 3 ) 方面都取得了有意义的成果。由于酶极易失活，不易运输， 有活性的酶只能从活体动物获得，因此，酶电泳方法的应用有一定的限制，无法应用于 濒危动物、古生物和生物标本。 ( 3 ) 蛋白质立体结构 蛋白质的立体结构是指蛋白质在一级结构基础上，经过空间盘旋折叠成为具有生物 活性和功能的大分子。生物太分子的功能主要是在其三维结构上体现的，分子间的相互 2 前言 作用也依赖于三维结构及其附近的环境。b a j a j 等( 1 9 8 4 ) 通过对蛋白质三级结构的比较 研究表明，在细菌和哺乳动物的丝氨酸蛋白酶中，除s e r1 9 5 、s e r 2 1 4 、h i s5 7 、a s p1 0 2 和a s p1 9 4 这几个位点上的氨基酸外，其余位于活性部位的所有氨基酸都是保守的，且 其中有5 个甘氨酸残基和2 个半胱氨酸残基是不变的。黄京飞等测定计算了从低等到高 等1 1 种动物的血红蛋白和肌红蛋白三维结构的分维数据的相似性，并以此建立了分子 系统进化树，其结果与来自一级结构的研究结果是一致的。对蛋白质立体结构的研究方 法分成两类：一类是应用计算机图象识别将己知三维结构的同源蛋白质进行比较分析， 再根据三维结构间的异同程度来确定相互间的亲缘关系；另一类是根据与确定蛋白质三 维构象有关的氨基酸的物理、化学性质，将其进行聚类分析，从而得出其相互间的进化 关系。目前立体结构的研究主要集中在某些蛋白质分子上，如细胞色素c 、免疫球蛋白、 血红蛋白。由于蛋白质高级结构的进化比一级结构要保守，因此根据高级结构建立的系 统发育关系更加可靠，但高级结构的研究必须在一级结构清楚的情况下进行，纯结晶蛋 白样品获得的程序复杂，序列分析仪器精密昂贵，非一般生化或分子生物学实验室所能 完成。然而生物大分子序列和空间立体结构最能准确反应系统演化关系，随着技术的不 断进步，蛋白质立体结构分析在分子系统学上必将得到广泛的应用。 1 1 2 核酸水平的分子系统学研究 ( 1 ) 限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 分析 r f l p 是8 0 年代中期发展起来的一种d n a 多态分析技术，它将目标d n a 序列经 定数目和种类的限制性内切酶( r e ) 进行酶切，由于不同的目标d n a 的序列结构( 遗传 信息) 有差异，r e 在其上的识别位点的数目和距离就发生了改变，因而产生相当多的大 小不等的d n a 片段。然后通过s o u t h e r n 杂交可以把与被标记d n a 相关的片段检测出 来，从而构建出多态性图谱( 较简单的靶序列，如m t d n a 可以省却杂交直接用电泳方法 检测) ，进行系统进化和亲缘关系的分析。目前大多数m t d n a 的r f l p 研究都是在种 内或近缘种进行，高级阶元的分析较少( 如c o l g a n ，1 9 9 1 ) 。r f l p 方法优点是稳定性高， 重复性高，但需用放射性探针检测，耗资较大。另外，r f l p 需要的d n a 量较大( 较 r a p d 方法而言) ，多态性出现率低，只能检测内切酶识别位点上的变异，能提供的信 息有限。 s o l l e r 和b e c k m a n 于1 9 8 3 年最先应用于品种鉴别和品系纯度的测定，这是第一个被 应用于遗传研究的d n a 分子标记技术。c o l g a n ( c o l g a nd je ta l ，1 9 9 1 ) m t d n a 用r f l p 研究蝗科和蜢科高级阶元的系统发育关系。邢连喜等( 邢连喜等，1 9 9 9 ) 用6 种限制性内 3 湖北大学硕士学位论文 切酶对4 种白蚁的线粒体d n a 做r f l p 分析，根据限制性片段差异计算了4 种白蚁之 间的遗传距离。徐广等( 徐广等，2 0 0 2 ) 利用棉铃虫不同地理种群对其进行种群间基因 流动的r f l p 分析。由这些可以看到利用r f l p 技术可以测定近缘种的遗传距离，显示 昆虫的d n a 多样性，为昆虫分类和昆虫进化提供可靠的证据。 ( 2 ) 染色体原位杂交( c h r o m o s o m ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ) 染色体原位杂交是细胞学方法和分子杂交技术相结合的产物，是指利用特异性核酸 片段作探针，直接同染色体的d n a 片段杂交，在染色体上显示特异的d n a 或r n a 。最 初是采用同位素标记探针，杂交后通过放射性自显影显示出杂交信号。以后发展了以非 放射性大分子如生物素、地高辛等标记特异性核苷酸片段，杂交信号经酶联显色荧光显 示的杂交技术，特别是荧光原位杂交技术( f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 。 原位杂交的优点是准确直观，在用整个基因组d n a 或基因组特异重复序列作探针时，可 以明显区分不同物种的染色体组成，在鉴定远缘杂种染色体构型和结构变异，物种起源 演化方面有重要作用，但原位杂交技术复杂，对操作要求较高。 应用这种方法鉴定出亲缘关系远近的有双翅目的蚊子，牛玲玲等( 19 9 0 ) 从中华桉蚊 基因库中筛选出一特异d n a 片段，可检测任何发育时期的中华桉蚊，而不与嗜人血桉 蚊杂交，类似的在蚊子方面的研究还有c o c k b u m ( 1 9 9 0 ) 、h i l l 等( 1 9 9 1 ) 和j o h n s o n 等 ( 1 9 9 3 ) ；还有鞘翅目的昆虫( p e t i t p i e r r e s ，1 9 9 6 ) 。 ( 3 ) d n a 指纹( d n af i n g e r p r i n t ，d n a f p ) 图谱技术 d n a 指纹图谱技术是用标记的探针( 小卫星探针、串联重复序列探针) 同基因组 d n a 杂交，通过放射自显影得到的杂交信号如同人的指纹一样具有高度特异性。因其 在个体和群体间具有高度特异性和丰富的多态性，许多研究者利用指纹图谱进行物种的 鉴定和亲缘关系远近的分析。 1 9 9 2 年，b l a n c h e t o t ( b l a n c h e t o t ，1 9 9 5 ) 用d n a 指纹谱研究苜切叶蜂( m e g a c h i l e r o t u n d a t a ) 生殖策略，发现每巢中的后代基本上来自单一雌性，而且在多数情况下雌性只 与单一雄性交配。h e i n z ee ta l ( h e i n z ee ta l ，1 9 9 4 ) 对佛罗里达弓背蚁的线粒体d n a 进 行了指纹图谱分析，检测了社群内遗传多样性。d eb a r r o ( d eb a r r o ，1 9 9 5 ) 对澳大利 亚麦长管蚜( s i t o b i o na v e n a e ) 用多位点探针进行指纹图研究。程道军等( 程道军等，2 0 0 0 ) 构建了家蚕9 个品种的标准d n a 指纹图谱。此外，此技术还应用研究了美洲棉铃虫、澳 洲棉铃虫及烟芽夜蛾及各自地理种群的d n a 指纹谱等分子生物学特征( 吴孔明等) 。 ( 4 ) 随机扩增多态性d n a 的聚合酶链式反应( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a 一 4 前言 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，r a p d - p c r ) 技术 r a p d 技术是9 0 年代发展起来的建立在p c r 技术基础上的一种分子标记手段。它 利用一系列不同的随机排列的1 0 个碱基组成的寡核苷酸单链为引物，以生物的基因组 d n a 为模板进行p e r ( 与常规p c r 相比，退火温度较低，一般为3 6 c ) 扩增，当模板上 有引物的结合位点，并且一定范围内有与引物互补的反向重复序列时，此范围内的d n a 片段就可以被扩增出。r a p d 带的多态性是由引物与模板的结合位点数及可扩增区域片 段的长度决定的，基因组的遗传变异通过琼脂糖凝胶电泳检测r a p d 产物的多态性获 得。r a p d 分析可以在对物种没有任何分子生物学了解的情况下对物种的基因组进行 d n a 片段多态性分析，并结合其他方法，通过统计分析，确定其在系统演化中和分类 中的地位；r a p d 技术的引物种类很多，可以对整个基因组进行地毯式多态分析，两个 基因组之间的微小差异也能被反应出来；r a p d 技术所需材料的量很少，便于对大量的 小型昆虫进行研究；r a p d 技术不需大型仪器，操作较方便，可以在一般实验室开展。 但是，r a p d 标记为显性标记，不能有效地鉴定出杂合子，结果分析中的序列同源假设 ( 长度相等的扩增片段视为同源性片段) 可能会高估不同样本间的亲缘关系；此外r a p d 还极易受反应条件的影响，不同实验室和不同实验条件下的结果难以统一，而且r a p d 的单带有可能是多个分子的混合物，这是r a p d 技术目前在应用上存在争议的原因。 在分子系统学中，r a p d 方法已广泛应用于种群间系统亲缘关系、分类和系统发生 等方面的研究，并表现了一定的优越性。最早在昆虫中应用的是由b l a c ke ta l ( b l a c ke t a l ，1 9 9 2 ) 应用于蚜虫的种和种群进行鉴定和区分，检测了种内不同生物型之间以及同 一生物型内不同个体扩增产物的多态性、种内不同个体之间扩增产物的多态性，另外， 他们还用r a p d 技术检测和鉴定了蚜虫体内的两种寄生蜂。随后，r a p d 在按蚊( b a l l e ta l ，1 9 9 2 ) 、寄生蜂( e d w a r d se ta l ，1 9 9 3 ) 、蚜虫( p u t e r k a ，1 9 9 3 ) 、舞毒蛾( g a r n e rk l e ta l ，1 9 9 6 ) 、蝗虫( c h a p c ow e ta l ，1 9 9 2 ) 、果蝇( 陈燕茹，1 9 9 7 ) 、棉铃虫( 雷仲仁 等，1 9 9 7 ) 、蜜蜂( 苏松坤等，1 9 9 7 ) 、粉虱( q u b l ，2 0 0 3 ) 等昆虫中均有应用到。目前 r a p d 技术已成为昆虫遗传图谱构建中的一种普遍方法。 ( 5 ) 扩增片段长度多态。i 生( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o p h i s m ，a f l p ) a f l p 是由v o s p 和z e b e a um 等将r f l p 分析法和p c r 法结合起来，发展的一 种新的基因组d n a 多态性分析技术。靶d n a 经可产生黏性末端的r e 酶切，产生的 片段被连接上通用接头( a d a p t e r ) ，连接产物作为p c r 扩增的模板，引物是在接头互补顺 序和r e 识别位点的基础上增加1 3 个选择性核苷酸设计而成的，这样，只有那些与引 5 湖北人学硕十学位论文 物的选择性碱基严格配对的酶切片段才被扩增出，通过调整引物3 端选择碱基的数目 可获得丰富的多态性，典型的a f l p 实验一次可获得5 0 , - - 1 0 0 条谱带。v o s 进行1 0 x 1 0 6 次的实验，充分证实了这项技术的可靠性。该技术的优点是：所需的d n a 量少，不需 s o u t h e r n 杂交，实验结果稳定，重复性较好，表现孟德尔遗传，每个a f l p 反应可以检 测的位点5 0 - 1 0 0 个，多态性强，适宜于遗传多样性分析、种质鉴定、分子系统学研究， 但实验条件要求严格，耗资大。 p a r s o n se ta l ( p a r s o n s ，e ta l ，2 0 0 1 ) 应用a f l p 标记技术对蟋蟀的5 个夏威夷采集地 亲缘关系较近的种群进行了种间鉴定；k a k o u l i d u a r t ee ta l ( k a k o u l i d u a r t ee ta l ，2 0 0 1 ) 对实蝇科的地中海实蝇( c e r a t i t i sc a p i t a t a ) 和纳塔耳小条实蝇( c r o s a ) 进行了分离和鉴定。 l ie ta l ( l ie ta l ，2 0 0 2 ) 通过a f l p 分析技术把蛛螨( t e t r a n y c h u su r t i c a ek o c h ) 的d e f - 1 基因 定位于第3 号染色体的长臂上，且与已知的j a 的生物合成基因相分离。 ( 6 ) d n a 的序列分析 核酸序列分析是指通过测定核酸序列来比较同源分子之间的相互关系的方法。比较 不同类群个体的同源的核酸的核苷酸序列，据此建立分子系统发育树，并推断类群间的 演化关系，是目前分子进化和系统发育研究的热点。d n a 序列分析可以保证使某一区 段每个核苷酸位置上出现的变异都被发现。近年来测序与p c r 及r f l p 技术相结合，可 以快速经济地测量大量个体，是今后有发展前途的方法。现有的研究结果表明，每个基 因均能以其自身特有的平均进化速率，可用于不同水平的系统发育研究；不同基因间的 进化速率不同，同一基因不同区段的核苷酸的保守程度也不一样，这种保守性与编码蛋 白质或r n a 的二级结构有关。快速进化的基因或核苷酸区段( 如m t d n a 、r r n a 的i t s 区 域) 适合于种内或近缘种的系统发育分析；慢速进化的基因( 女h r d n a 及其产物r r n a ) 适 合于远缘种类或高级阶元的系统发育。 核酸序列分析在系统发育分析中有独特的优势，能够检测出基因组的插入、缺失、 点突变和转座。通过d n a 序列分析研究生物的进化过程，确立物种间的进化关系具有许 多优越性。d n a 仅仅由4 种碱基基本结构单位组成，其序列的异同是明确无误的，因而 易于分析；d n a 序列含有丰富的进化信息，如有些物种含有1 0 1 1 个碱基对：d n a 序列相 对易于获得，特别是随着近年来p c r 技术的应用以及人类基因组计划的实施，d n a 序列 正以爆炸性的速度积累起来。因此，基于d n a 序列的分子进化树的构建已成为生物系统 研究中最重要的工具之一。 李明等( 李明等，1 9 9 9 ) 通过测定其序列对4 种鹿属动物的系统进化关系进行了研 6 前言 究，王义权等( 王义权等，1 9 9 9 ) 对几种游蛇的演化关系进行了分析。另外，m t d n a 的其它一些序列区段( k e l l y e ta l ，1 9 9 7 ) 以及核d n a 的某些序列( 王建波等，1 9 9 9 ) 在系统进化研究上也得到了较广泛的应用。目前植物c p d n a 的m a 基因和r b c l 基因序列 以及n r d n a 的i t s 区序列已作为重要的分子形状被广泛用于不同分类阶元上的植物分子 进化与系统发生研究，其核苷酸置换速率及用于估计物种分歧时间对研究特定类群的起 源与演化也具有重要的意义( h i l u ，1 9 9 7 ) 。 1 2 分子系统学研究中涉及到的几个重要议题 1 2 1 基因树和物种树 分子系统学的目的就是通过基因树来推测物种树。基因树是根据生物大分子的序 列数据( 主要为d n a 序列数据) 构建的谱系树，物种树则是反映物种实际种系发生的谱系 树。人们期待着得到的基因树和物种树相一致，然而实际情况往往并非如此。n e i ( 1 9 8 7 ) 描绘了二种谱系树之间所有可能的关系，认为二种谱系树之间至少存在二个方面的差 异：一是基因树的分化时间早于物种树，二是基因树的拓扑结构可能与物种树不一致( 二 个或多个基因树之间存在着差异) ，如何将由多个基因或基因组建立的基因树综合成一 个物种树，是分子系统学面临的一个主要难题。m a d d i s o n ( 1 9 9 7 ) 认为：基因重复所导致 的并源而非直源关系的产生，不同生物类群间基因的水平转移，系统演化分歧事件发生 后产生的分子性状的多型性引起的谱系选择等生物学因素是造成二者不一致的主要原 因。相应地，分子系统学研究中一定要选择直源基因而非并源基因，选择水平转移事件 较少的树，采用基于大量独立进化的基因位点进行分析等等，都不失为一种行之有效的 方法，更有利于获得一个可靠的树。 1 2 2 分类群的选择 分类群包括内类群和外类群，分子系统学研究中如何选择所研究的对象内类 群的选择是一个非常值得注意的题。内类群选择( 内类群的数目及选择依据等) 的科学性 与否直接影响到所得结论的可靠性。关于内类群的数目，目前大多数分子系统学家认为， 当所分析的序列长度一定时，尽量选择较多的分类群有助于获得更准确的结论，而内 类群选择的依据主要体现在：( 1 ) 结合古生物学，形态学等各方面证据，尽量保证所选择 的分类群确为一个单系发生的类群；( 2 ) 分类群的选择并非是随机的，尽量使其在所研究 的生物类群中具有代表性；( 3 ) 在某些因具有明显长枝效应( 或短枝效应) 而导致的系统关 系不确定的分支间增加分类群有助于减弱或消除这种效应。 另外，在构建分子系统树中，同样需要选择外类群以确定系统发生树的基部位置， 7 湖北人学硕十学位论文 从而确定进化的方向。外类群的选择可以是单个( 单一外类群) ，也可以是多个( 复合外类 群) 。在所研究的内类群数目不多且二者之间的极性关系十分确定的情况下，单个外类 群足以说明问题。而在较为复杂的分析中，通常选择复合外类群以保证所得结论的可靠 性。随机选择的外类群，极有可能因为亲缘关系较远，导致所得结果的不确定性增大。 因此，在选择外类群时，必须结合其它分类学上的证据，或者在做详细的系统发育研究 之前，首先对所研究的内、外群的关系进行初步探讨，以便于选择较为理想的外类群。 最理想的外类群应该是该内群的姐妹群，因为二者间拥有较多的共近裔性状。 1 2 3 目的基因的选择 分子系统学研究中目的基因的选择也是一个至关重要的问题。一般来说，要根据所 研究的具体分类群选择适宜的基因：在高级分类阶元( 科级及其以上) 间的系统发生分析 中，选择一些在进化中较为保守的基因或基因片段( 如核编码的蛋白质( 酶) 基因、核糖体 基因( 1 8 sr r n a 基因、2 8 sr r n a 基因) 等) ；在较低级的分类阶元间( 科级以下) ，可以选 择进化速率较快的基因或基因片断( 如某些核编码基因的内含予或转录间隔区( i t s ) 以及 一些细胞器基因( 线粒体基因和叶绿体基因) 等) 。当然，每一个具体的研究对象，可以选 择的基因数目可以是多个的，至于哪些是最有效的，这通常要依据具体情况做比较分析 后才能得出结论。条件允许的话，可以作多基因或多基因组合分析后寻求一致树来加以 解决。有时针对某些涉及到多种层次分类阶元的复杂分类群时，还可以采取组合分析的 方法：即推断位于系统树基部的深层次的谱系发生时，运用较保守的基因作为目的基因； 推断位于系统树中段的谱系发生时，采用进化速率较为适中的基因；在系统树顶端的终 端分类单元时，采用进化速率较快的基因。这样可以在不同阶层的演化关系中都获得可 信的结果。 1 2 4 基因树的构建方法 目前，构建基因树的方法很多，常用的主要有二大类：即距离法( d i s t a n c em e t h o d ) 、 和具体性状法( d i s c r e t ec h a r a c t e rm e t h o d ) 。前者是将序列数据转变成数据( 遗传距离) 矩阵， 然后通过此数据矩阵构建系统树：后者直接分析序列上每个核苷酸位点所提供的信息构 建系统树，它又包括最大简约法( m p ) 和最大似然法( m l ) 以及由m l 法延伸的贝叶斯法 ( b a y e s i a nm e t h o d ) 。 ( 1 ) 距离法 该方法基于这样一种假设，即只要获得一组同源序列间的进化距离( 遗传距离) ，那 么就可以重建这些序列的进化历史。距离法中以邻接法( n j ) 最为常用n j 法是s a i t o u 前言 n e i 提出，其原理是逐步寻找新的近邻种类( 序列) ，使最终生成的分子树的遗传距离总长 度为最小。该法虽并不检验所有可能的拓扑结构，但在每阶段诸物种( 序列) 聚合时都要 应用最小进化原理，故而被认为是m e 的一种简化方法。由于分析程序大大简化，费时 较少，适于分析较大的数据集，目前已成为距离法分析中最通用的一种方法。n j 法不包 含速率一致的假设，通过采用“校正”距离矩阵来减少各分支速率的影响，因而系统树的 正确与否依赖于校正距离系数的准确性。当序列较短时，计算仍可能有较大的统计误差。 n j 法由于仅限于数据矩阵的统计值，相对于后述的具体位点的分析方法，其最大优势是 运算十分简便而快捷。但是该法的不足之处是，由于不考虑各个位点的具体情况而丢失 了一些有用的遗传信息，另外，通过这一方法得出的枝长估算值不具有确定的进化意义。 ( 2 ) 最大简约法 该方法源于形态学的分支系统学研究，而最早被f i t c h 用于核苷酸数据研究。它是一 种最优化标准，遵循“奥卡姆剃刀( o c k h a m s r a z o r ) ”原理，即假设由一祖先位点替换 为另一位点时，发生的替换数目最少的事件为最可能发生的事件。在实际应用中，由于 m p 法只考虑所谓的“信息位点”，所得的进化树是最短的、也是变化最少的进化树。因 而，简约法的“最小核苷酸替换数目 原则也意味着“异源同型事件( h o m o p l a s t i ee v e n t ) ” ( 即平行替换、趋同替换、同时替换和回复突变等) 最少。就序列上的位点来说，它没有 明确的假设，无须估计核苷酸替换时所用的各种数学模型，且当序列问的分化程度较小、 序列长度较大且核苷酸替换率较稳定的情况下，该法能获得更为真实的拓扑结构。反之， 当序列较短且序列间的进化速率差异较大或替换形式不同时，异源同型事件出现的概率 就大，产生所谓的“长枝吸引”或“短枝吸引 效应，而得出错误的拓扑结构。另外， 由于m p 法需要比较大量的拓扑结构，当序列数目和长度较大时，运算过程非常耗时。 ( 3 ) 最大似然法 该法最早由f e l s e n s t e i n 提出，其原理是以一个特定的替代模型分析一组既定的序列 数据，使获得的每一个拓扑结构的似然率均为最大，再挑出似然率值最大的拓扑结构作 为最终树。这里所分析的参数是每个拓扑结构的枝长，并对似然率的最大值来估算枝 长。迄今的研究表明，在分类群数目较大、序列长度较长的复杂分析中，m l 法的分析 结果优于其它任何方法。但由于该法涉及到全部序列的所有核苷酸位点的替换数，加之 假设的替换模型包含一组可变参数( 如转换颠换比等) 。所以该法和m p 法一样，当序列 数目和长度较大时，构建m l 树是极其耗时的，同时当序列数目足够大而序列长度很小 时，和m p 法样，它也容易给出错误的拓扑结构( 王莹等，2 0 0 5 ) 。 9 湖北人学硕士学何论文 1 3 分子系统学研究意义 生物大分子蕴涵着极其丰富的生物进化信息，随着分子生物学的诞生及其技术的不 断发展，分子系统学一这门通过对生物体内大分子的异同分析，来推测生物类群间系统 发生关系的学科，也随之应运而生并呈现出勃勃生机。相对于传统的根据形态来对物 种进行系统分类研究，由于生物大分子本身就是遗传信息的载体，含有庞大的信息量， 且趋同效应弱，因而其结论更具可比性和客观性。尤为重要的是，一些缺乏形态性 状的生物类群( 如微生物和某些低等动、植物) 中，它几乎成为探讨其系统演化关系的 唯一手段。由于分子系统学的上述特点，自其诞生之日起，就逐渐在各种生物类群的 系统发生研究中得到了广泛的应用。总的说来迄今分子系统学的研究所获得的生物类群 间亲缘关系的结果，大多都和经典的形态系统树相吻合。但是，在一些生物进化谱系不 明或模糊关键环节上，它得出的结果却往往和形态系统学的推测大相径庭。 随着分子生物学理论、方法和技术不断的普及和提高，昆虫分子生物学的研究将有 广阔的应用前景：( 1 ) 昆虫分类地位的研究。从分子水平上对昆虫进行分类和辨别，并与 昆虫的形态特征相结合，可以更科学、更准确地研究昆虫的分类地位，推断昆虫的演化 过程；( 2 ) 昆虫生命活动的基本规律的研究。从分子水平上研究昆虫生活状态及其与环境 之间关系，研究昆虫的遗传变异、生态适应和成灾规律、研究昆虫的基因组，破译昆虫 生命的密码；( 3 ) 害虫防治的研究。从分子水平来解释某种对昆虫致病的细菌、病毒、代 谢产物杀死或入侵昆虫的原理，筛选出更有效的防治害虫的微生物。研究昆虫激素在分 子水平上的作用机制，可获得更多物质作为引诱剂；( 4 ) 转基因昆虫的研究。利用现代技 术改造的转基因昆虫更好地为人类服务。 2 黑腹果蝇种组( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) 的分子系统学研究进展 黑腹果蝇种组属于双翅目、果蝇科、果蝇属、水果果蝇亚属，最早由s t u r t e v a n t 于 1 9 4 2 年建立。1 9 4 9 年h s u 将黑腹果蝇种组分为5 个种亚组( a n a n a s s a e ，m e l a n o g a s t e r ， m o n t i u m ，s u z u k i i ，t a k a h a s h i i ) ；1 9 5 4 年o k a d a 又增加了2 个种亚组( n i p p o n i c a t g f i c u s p h i l a ) ； 1 9 7 2 年b o c k 和w h e e l e 描述了黑腹果蝇种组2 7 个新种并新增了5 个种亚组( d e n t i c u l a t a ， d e n t i s s i m a ，e l e g a n s ，e