（遗传学专业论文）植物病毒沉默抑制子p25的原核表达及多克隆抗体制备.pdf

摘要 马铃薯x 病毒( p o t a t ov i r u sx ，p v x ) 的p 2 5 蛋白是参与病毒在细胞和细胞之间运动 的一个重要蛋白，它在转录后水平的基因沉默中起到抑制作用，能够提高p v x 病毒侵 染植物的成功率。本研究对植物病毒沉默抑制子p 2 5 进行原核表达、纯化并制各该抑制 子的多克隆抗体，为下一步研究抑制子在基因沉默中的分子机理奠定基础。通过体外 d n a 重组技术，将来源于p b i n 6 1 - p 2 5 质粒上的目的基因p 2 5 片段在t 4d n a 连接酶的 作用下，插入到原核表达载体p e t - 2 8 a ( + ) 的b 鲫hi 和勋ci 酶切位点之间，构建重组 质粒p e t 2 8 a ( + ) - p 2 5 。经p c r 扩增、酶切鉴定以及d n a 序列分析，插入的目的基因p 2 5 的序列正确，n 端与6 h i s 标签形成融合蛋白，无移码现象。将重组质粒p e b 2 8 a ( 十) - p 2 5 转化到大肠杆菌b l 2 l ( d e 3 ) ，加入终浓度为1 om m 的异丙基- 且一d 一硫代半乳糖苷 ( i s o p m p y l 0 d “o g a l a c t o s i d e ，i p t g ) 进行诱导，诱导后表达出分子量大约为2 8 6k d a 的p 2 5 融合蛋白。该p 2 5 融合蛋白以可溶形式存在，扩大培养按1 ：4 0 的比例浓缩后在 变性条件下经n i 离子亲和层析得到纯品p 2 5 融合蛋自。用b r a d f b r d 法测定给该融合蛋 白含量达】8 0p g m l 。用纯化的p 2 5 融合蛋白免疫三只6 8 周龄的b a l b c 小鼠( 1 5 只，次) 三次后，进行e l i s a 检测，获得的p 2 5 融合蛋白的多克隆抗体以1 ：1 2 0 0 0 的 比例稀释后仍可检测到0 2 5u g 左右的抗原( 融合蛋白p 2 5 ) 。p 2 5 融合蛋白与其多克隆 抗体的w e s t e m - b l o t 经a e c 化学显色后，在硝酸纤维素膜上显示出单一的特异性条带。 以上结果表明通过原核表达系统在大肠杆菌中表达出了p 2 5 融合蛋白，并且该蛋白具有 良好的抗原性和免疫原性。获得的这种植物病毒沉默抑制子p 2 5 的多克隆抗体，可以进 一步用于基因沉默机理的研究。 关键词：沉默抑制子；p 2 5 蛋白：原核表达系统 a b s t r a c t t h e2 5k d am o v e m e n tp m t e i n ( p 2 5 ) o fp o t a t ov i n l sx ( p v x ) ，as u p p r e s s o ro f p o s t 仃a n s c r i 面o n a lg e n es i l e n c i n g ，w h i c hc a l lh e l pp v x t os u c c e e di ni 1 1 f 配t i n gp l a n t ，w a s e s s e n t i a lf o rt h ec e 儿- t o c e l lm o v e m e n to fp v xmi t sh o s t p m t e 血p 2 5w a se x p r e s s e db y p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e m ，p u r i f i e d 加v 加访，a n db eu s e da sa n t i g e nf o rm a k i n gi t s p o l y c l o 蹦觚t i b o d i e s t h ep 2 5g e n e 丘o mt h ep l a s n l i dp 2 5 ，啪si n s c n e d i r l t om ep e t - 2 8 a ( + ) v e c t o rb e t w e e nm es i t eo fb 口珑hia n d ，铴ci ，t oc r e a t eat e c o m b i n a n tp l a s m i d p e t - 2 8 a ( + ) - p 2 5 t h e nt h er e c o n l b i n a n tp e t - 2 8 a ( + ) - p 2 5w a sc o 瓶蛐c db yp c r ，r e s t r i c t i o n e n 珂m ed i g e s t i o na n dd n as e q u c n c i n g ，s h o 砸n gm a tt h ep 2 5g e n e 、v a sf i 鹪e d 埘m6 h i s t a ga n de x p r e s s e da s 如s i o np r o t e i n t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a l l s f e r r e di n t o 也e c o m p e t c n tb l 2 1 ( d e 3 ) c e l l s 锄d 印p r o x i m a l _ e l ya2 8 6k d a f u s i o np r o t e i nw a si n d u c e db yt h e a d d i t i o no fi s o p r o p y l - 一d - m i o g a l a c t o s i d e ( 口t g ) ( 1 0m m ) d l l r i n gc u l t i v a t i o n n l es o l u b l e 如s i o n p m t e i n p 2 5w a sp l l r m e da 腑 e x p c n d i n g c u l t i v a t i o n b y n i - n r i a a 伍r 母 c l l r o m a t 0 鲫h yu n d e rt h ed e n a t u r i n gc o n d i t i o n n l ec o n c e n 订a t i o no ft h em s i o np r o t e i np 2 5 w a sa b o u t18 0 “g r n ld e t e m i n e db yb m d f o r da s s a y s t h ep 血f i e df i l s i o p r o t e i np 2 5w a s 蝎e c t e di n t ot h r e e6t o8w e e k so l db a l b cm i c e ( 15p m o u s e ，t i n l e ) t l l r _ e et i i i l e st om a k e p 0 1 y c l o n a la n t i b o d y n l e 删i b o d y 栅a t i o nw a su pt ol ：1 2 0 0 0d e t e 加i n e db ye l i s aa s s a y s w e s t e mh y 嘶d i z a t i o no fa 1 1 曲o d ya n dp 2 5s h o w e das i i l 百eb a n di nt 1 1 en i t r o c e l l l l l o s e ( n c ) m e m b r a i l e t h e s er e s u l t ss h o w e dt l l a tw eh a v eo b t a i n e dt h ep 2 5p r o t e i nb y 加v 所0e x p r e s s i o s y s 储na n dt l l ee x p r e s s e dp 2 5s h o w e dt l l ee x p e c t e d 锄t i g e n i c 毋a 1 1 di 衄蚰o g e l l i c i 够t h e p 0 1 y c l o n a la n t i b o d ya g a i n s t 仕【er n as i l e n c i n gs u p p r c s s o r ( p 2 5 ) h a sb e e no b 诅i n e d ，a i l d 、j l ，i l l b eu s e di nt h er e s e a r c ho f t h em e c h a n i s mo f g e n es i l e n c i n g k e yw o r d s ：r n as i l e n c i n gs u p p r e s s o r ，p 2 5p r o t e i n ，p r o k a r y 胡ce x p r e s s i o ns y s t e m i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东 北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示 谢意。 学位论文作者签名：泰邀日期：尘堕空垒旦! 望 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的 规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论 文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：窟童堡二指导教师签名：肇墼筻! 日 期：巡：垒：! 日期；巫嫂6 ：f 学位论文作者毕业后去向： 工作单位 通讯地址 电话： 邮编： 1 1 基因沉默的研究状况 1引言 基因沉默现象最早在1 9 9 0 年由j o r g c n s c 等在矮牵牛妒e m 曲) 中发现的。j o 增e 1 1 s e n 等人试图将查耳酮合成酶基因转入紫色矮牵牛花中以加深它的颜色，但有些转基i 习植株 中紫色矮牵牛花的颜色不但没有加深反而表现出花斑色，有的甚至成为白色。后柬发现 这是因为转入的外源查耳酮合成酶的基因不但没有加强表达，反而将外源的及相应内源 基因的表达同时抑制了，因此他们把这种现象称为共抑制( c o s u p p r e s s i o n ) ，也叫正义抑 制( s e i l s es u p p r e s s i o n ) ”。随后在很多植物和其它生物中都有相关的报道。 1 9 9 4 年，意大利科学家m a c i l o 和c o g o n i 等人在真菌粗糙脉孢霉中也发现了类似 的现象嘲，将其称为基因压制( q u e l l i n g ) 口4 。他们将类胡萝h 素合成途径中某个基i 习拷贝 导入受体并使其过量表达时，发现有1 ，3 的粗糙脉孢霉颜色变浅了，说明导入受体中额 外拷贝强表达的基因有抑制相应的内源基因的活性的作用。1 9 9 5 年，g u o 等人在利用 反义r n a 技术试图阻断秀丽线虫( c g f p g 口m ) 中的卵i ，基因的表达时发现在对照实验中 给线虫注射正义r n a ( s e n s e r n a ) 不但不增加该基因的表达，反而向反义r n a ( t i s e n s e r n a ) 一样，也能特异性的阻断该基因的表达 ”。1 9 9 s 年，f 打e 和m e l l o 等发现g u o 等 发现的正义r n a 对基因表达的抑制实际上是由体外转录制各的r n a ( s e n s e0 ra 嘶s e n s e i a 1 中污染的微量双链r n 州d o u b l e s 啪d r n a ，d s r n a ) 所引起的。他们将线虫中r n a 介导的基因沉默现象称为r n a 干涉( r n a i n t e r f e r e n c e ，r n a i ) ”1 。2 0 0 0 年，i a 诱导沉 默复合物( r n a i n d u c e ds i l e n d n gc o m p l e x ，r l s c ) 被发现。r j s c 是一种核糖核蛋自复台 体，是序列特异的多组分的核酸酶 7 j 大约5 0 0 l o a ，其中一个成分最近在果蝇中被确 定，它是a r g o n a u t 家族中4 个成员之一a 增0 1 1 a m 2 口j 。2 0 0 1 年，在随后的研究中发现产 生转录后水平的基因沉默的植物中存在与被降解的r r l i a 互补的有义和反义r n a ，不 发生转录后水平的基因沉默的植物中没有这类r n a ，这些r n a 大小一致都是约为2 1 2 3 个核苷酸( n t ) ，称为小片段干涉r n a ( s m a l l 硫e 疵r i n gr n a ，s i r n a ) “。此外，在景蝇中 分离得到了r n a s e 家族的一种蛋白d i c e r ，它能将d s r n a 切割成2 1 - 2 3 m 的小片段。 这种酶的氨基端具有一个螺旋酶结构，羧基端则有结合d s r n a 的序列。将d i c e r 的基 因序列与其它生物基因组比较发现在秀丽新小杆线虫、拟南芥、裂殖酵母 触m s d c c ，w e s 口6 p ) 等生物中都有这种酶的同源序列”q 。2 0 0 2 年，人们开始将 r n a i 应用于对艾滋病病毒h 】v 的基因沉默之中【l “。 目前，基因沉默作为一种基因表达敲除工具正用于功能基因组学领域的研究。如果 能轻易有效地任意删除植物或动物的某一基因，将是深入研究植物或动物基因功能的非 常有价值的方法。 常有价值的方法。 1 2 基因沉默的分类和特点 外源基因进入受体细胞核后，会受到多种因素的作用，因此可以将基因沉默可分为 三种不同水平：位置效应o s i t i o ne 艉c t ) 、转录水平的基因沉默( t 眦s 商p t i o n a lg e n c s i l e n c 抽g ，t g s ) 和转录后水平的基因沉默( p o s t t m s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n p 1 g s ) 【1 2 】，也 就是r n a 沉默。 1 2 1 位置效应q ) o s i t i o ne 仃e c t ) 位置效应是指基因在基因组中的位置对其表达的影响。外源基因进入受体细胞核 后，首先整合到染色质上，其整合位点与表达有密切的关系。如果整合到甲基化程度高、 转录活性低的异染色质上，一般不能表达：如果整合到甲基化程度低、转录活性高的常 染色质上，其表达受两侧d n a 序列的影响。植物基因组常是由具有相似g c 含量d n a 的片段相互嵌合在起的，外源基因的插入打乱了它们正常的组合。例如，玉米中a j 基因的g c 含量为5 2 5 ，而在转a j 基因沉默的矮牵牛中，硝基因两侧d n a 序列的 g c 含量分别为2 6 和2 3 ，明显低于5 2 5 。另外，舭基因是超甲基化的，但其两侧 序列的甲基化程度则不高。在许多其他转基因沉默的植株中也发现了类似现象。这表明 生物体可以通过外源基因与其两侧序列g c 含量的差别来识别外源基因，激活甲基化 酶，使外源序列甲基化而降低其转录活性。 1 2 2 转录水平的基因沉默( t g s ) 转录水平的基因沉默是d n a 水平上基因调控的结果，主要是由启动子甲基化或导 入基因异染色质化所造成的。二者都和转基因重复序列有密切关系。 重复序列可导致自身甲基化。外源基因如果以多拷贝的形式整合到同一位点上，形 成首尾相连的正向重复( d i r e c tr e p e a t ) 或头对头、尾对尾的反向重复( i n v e r t e dr e 】) ，则 不能表达。而且拷贝数越多，基因沉默现象越严重。这种重复序列诱导的基因沉默 ( r 印e a t i n d u c e dg e n es i l e n c i n g ，融g s ) 与在真菌中发现的重复序列诱导的点突变 ( r e p e a t 抽d u c e dp o i n tm u t a t i o n ，r i p ) 相类似，均可能是重复序列间自发配对，甲基化酶 特异性地识别这种配对结构而使其甲基化，从而抑制其表达。此外，重复序列间的相互 配对还可以导致自身的异染色质化。其机理可能是异染色质化相关蛋白质识别重复序列 间配对形成的拓扑结构，与之结合，并将重复序列牵引到异染色质区，或直接使重复序 列局部异染色质化u 。 1 2 3 转录后水平的基因沉默( p t g s ) r n a 沉默是一种r n a 水平上的真核基因调节机制，通过r n a 介导的序列特异性 作用来降解病毒r n a 、转基因r n a 和内源m r n a ，从而抑制基因表达【1 5 。1 ”。双链 r n a f d s r n a ) 的积累引发r n a 沉默，r n a 沉默降解d s r n a 并抑制同源基因的表达。 d s r n a 先形成小片段r n a 这种沉默系统的特异性决定予。小片段r n a 整和到不同的 沉默启动复合物上，然后引导这些复合物降解同源核苷酸来进行抑制。d s r n a 被一种 类似r n a s e 的核酸酶d i c e r 剪切成功能不同的微片段鼢舱( l i r n a ) 和小片段干涉 r n a ( s i r n a 一8 1 ，它们是由切割内源发卡r n a 前体而形成的。s i r n a 由长渊a 产生， 以3 端多出2 个核苷酸的2 1 2 6 个核苷酸的双链分子形式积累【1 9 ，2 。s i r n a 主要参与到 对分子寄生物，诸如转座子、转基因、和病毒的抑制【 ”。这已经表明s i 脒a 在基因控 制中也起作用【2 2 】。m i r n a 和s i r n a 介导的途径享有共同的元件。这两种小片段r n a 联合引导一个r n a 诱导沉默复合物( r j s c ) 使同源m r n a 失活。对s c 如果在m r n a 和 小片段引导r n a 之间有完整的或接近完整的碱基对的话，r j s c 会把r i l i 斟a 切开，这 一步如果时是部分互补的话，它介导转录后抑制【2 ”6 1 。s i r n a 也调控其他沉默启动复合 物，例如，它们诱导一种r n a 依赖的r n a 聚合酶( i a - d 印e n d e n tr n ap o l y m e r a s e ， r d r p ) 把靶m r n a 转变成d s r n a ，这就扩大了沉默【2 7 之9 】。因此，s i r n a 因指导同源d n a 的d n a 甲基化或组蛋白的甲基化在转录沉默中起作用【3 0 3 3 】。 植物r n a 沉默可以发生在单细胞水平( 细胞自发沉默) 和整体植株水平( 系统沉默) 。 细胞自发沉默抑制含有d s r n a 积累的细胞内的同源基因，并产生移动的沉默信号。这 些信号确保在邻近细胞( 短距离) 或一定距离细胞内( 长距离系统沉默) 的同源m r n a 的沉 默f 3 2 l 。 上述三种机制并不是独立的，而是相互关联的。基因沉默机制在核酸水平上均是 d n a d n a ，d n a r n a ，r n a r n a 相互作用的结果，所以人们认为对基因沉默机制的 研究开启了认识d n a 水平及r n a 水平上调节基因表达的新纪元。 1 3 基因沉默的生物学功能 越来越多的研究表明，r n a 沉默在植物【3 4 】、昆虫【3 5 1 和其它真核生物【3 印中起到抗病 毒的作用。在侵染过的植物中，病毒r n a 的积累诱发r n a 沉默，这种沉默产生病毒 特异性s i r n a ( 病毒s i r n a ) 。这些s i r n a 编码沉默启动复合物进行抗病毒应答。对于植 物病毒引发r n a 沉默以及哪一沉默途径参与了抗病毒反应还不很清楚。 病毒s i r n a 引导r i s c 靶定病毒m r n a 【3 7 ”】。砌s c 介导的病毒m 对叮a 失活被认为 在对应多数并非全部的病毒的对抗反应中起到重要作用。其它s i r n a 引导的途径可能 也参与了抗病毒防御。在r d r p 介导的沉默扩增中的植物突变体对黄瓜花叶病毒( c m v l 更敏感，但对其它病毒不敏感，这表明s i r n a 引导的途径仅仅对特殊的病毒有作用口9 ， ”j 。病毒诱导的沉默作为系统防御起作用。 1 4 基因沉默的抑制及抑制机理 鉴于r n a 沉默是植物本身固有的一种抗病毒的防御机制4 0 ，4 1 ，4 2 4 3 1 ，侵染植物的病 毒必须逃避或战胜植物的沉默防御机制才能完成它在宿主植物中的侵染复制，并进而完 成对植物的成功侵染。所以某些植物病毒为了完成对植物的成功侵染，对新的植物宿主 防御反应产生适应性，在进化过程中通过编码一种蛋白( 病毒抑制子) 来抑制r n a 沉 默这一防御机制h 4 ，4 5 1 。目前，从不同的病毒类型，如( + ) 、( - ) s s r n a 病毒和s s d n a 病 毒，已经发现了十多个病毒沉默抑制子，如黄瓜花叶病毒( c m v ) 2 b m 、和马铃薯y 病毒( p 岫v i r u sy ，p v y 饵c i p r o 3 4 4 6 4 8 1 、马铃薯x 病毒( p o t a t ov i n l s x ，p v x ) p 2 5 【4 9 】等。 理论上，病毒通过以下三种方式来抑制沉默介导的抗病毒防御：抑制病毒s i r n a 增殖： 防止s i r n a 整和到启动复合物上；通过沉默启动复合物来干涉。目前没有发现可以抑 制病毒s i r n a 增殖的抑制子。 一些抑制子结合r n a 【5 0 ，5 1 。57 1 ，这表明靶定r n a 在抑制沉默的策略中广泛应用。抑 制子可能通过与沉默体系中不同的d s r n a 复合物或s s r n a 复合物相互作用来抑制沉 默。d s r n a 结合蛋白可能通过螯合长的d s r n a 或s i r n a 抑制r n a 沉默。马铃薯x 病 毒的p 2 5 就是其中一种【4 9 ，5 0 ，”】。 抑制子也可以靶定沉默体系中的s s i 矾a 复合物。c m v 2 b 是一种定位于核内的抑制 子，它可以适度的影响细胞自发性沉默。此外，它有效地靶定系统信号的传播和抑制 鼬妊沉默控制的d n a 甲基化【5 。一种模型表明沉默的多种作用是基于c m v 2 b 抑制子 的r n a 结合活性。有报道称c m v 2 b 确实结合s s r n a 。 抑制子也可以靶定沉默机制中的蛋白复合物。例如，马铃薯y 病毒组的h c p r o 有 效的抑制s i i 斟a 介导的转基因沉默和病毒诱导的沉默m 4 ”，h c p m 介导的沉默抑制可 能基于能导致r j s c 失活的蛋白一蛋白的相互作用。 尽管已经发现了许多抑制子，但也仅局限于清楚口1 9 【5 0 j 和h c p r 0 【圳的沉默抑制的 分子基础。其它的抑制子可能通过靶定沉默机制中的r n a 元件或蛋白元件，或者可能 通过修饰参与沉默的内源基因的表达来起作用。 沉默抑制子成为分子生物学中有价值的工具。抑制子的发展边缘和组织特异性表达 使r n a 沉默的发展边缘和组织特异性作用的鉴定成为可能。我们相信随着研究的不断 深入，基因沉默的机制也终将被揭示。 1 5p 2 5 蛋白与基因沉默 马铃薯x 病毒的p 2 5 是马铃薯x 病毒( p v ) ( ) 参与病毒细胞和细胞之间移动的一个 非常必要的蛋白，与病毒的侵染作用有关，它可以特异性抑制系统沉默信号的产生。起 初人们只是把p v x 作为一种病毒载体，并没有发现p 2 5 在转录后水平的基因沉默中起 到抑制作用。而是以p v x 作为一个有效的病毒载体鉴定出h c p r 0 和c m v2 b 均具有 抑制子的作用。后来，在v o i i l n e t 等人做的转绿色荧光蛋白 r e e nn u o r e s c e mp r o t e i n ， g f p ) 基因的烟草的相互嫁接实验和p v x 病毒移动蛋白缺陷的侵染实验中，发现p 2 5 是 4 沉默的抑制子。通过在含有g f p 转基因烟草植株的叶片局部注射含重组病毒p v x g f p 的农杆菌或带3 5 s g f pt d 州a ( 3 5 s g f p ) 的农杆菌进行侵染，结果烟草植株被侵染的叶 片或未被侵染的叶片均发生了g f p 基因沉默的现象【4 9 】。利用农杆菌侵染植株是研究抑 制子的功能的很好的策略。通常使用的农杆菌包含两种菌种：一种菌用于诱发报告基因 ( 如g f p ) 的基因沉默；另一种菌用于表达相应的抑制子来抑制沉默的发生。然后将两 种菌( 一种诱发沉默，一种抑制沉默) 混合侵染烟草植株的叶片以检测报告基因的表达 情况。当p 2 5 ( 抑制沉默) 与p v x g f p 或3 5 s g f p ( 诱发沉默) 一起被注射入植株底 部叶片侵染时，植株顶部叶片的g f p 基因沉默被抑制了。也就是说在p v x g f p 或 3 5 s g f p 侵染的同时也侵染p 2 5 ，可以抑制系统沉默的发生。侵染3 5 s g f p 的同时也侵 染p 2 5 ，植株被侵染的叶片的g f p 沉默( 局部沉默) 被抑制。但侵染p v x g f p 的同时 也侵染p 2 5 ，局部沉默现象却不发生。这表明有两种途径肩动局部沉默。而其中的一条 途径可以导致系统沉默。一条途径可通过注射g f p 基因( 或g f p 的m r n a ) 和p v x 饼、p 病毒r n a 而被激活，这是产生系统沉默的必要途径，可以被p 2 5 抑制。同时注射g f p 基因和p 2 5 ，转基因植株的局部、系统都沉默，表明p 2 5 抑制了沉默信号的上游。另一 条途径只引起局部沉默，通过单独注射p v x g f p 病毒r n a 而被激活，却不被p 2 5 抑 制，也不引起系统信号的产生。因此，对p v x g f p 病毒而言，系统信号产生途径对p 2 5 敏感，局部沉默发生在对p 2 5 不敏感的途径。换句话说，以上两种途径都产生了2 5 个 核苷酸r n a 与其目的i n a 发生反应。一种仅被病毒诱发，并不受p 2 5 。的影响。另一 种即可被病毒诱发又可被转基因诱发，能够产生系统沉默信号，可被p 2 5 阻断。进一步 研究表明p 2 5 可以有效地结合s i r n a ，但不能抑带9 病毒s i r n a 的增殖【1 7 1 9 1 。 可以利用p 2 5 来研究很多问题，比如基因沉默系统信号的本质是什么，信号的产生 途径是什么，信号传导及其诱导系统基因沉默的机制是什么等等。 本实验主要是利用原核表达系统将基因沉默抑制子p 2 5 以融合蛋白形式表达，并制 备其多克隆抗体，以便进一步研究p 2 5 在基因沉默中的作用。 2 1 材料 2 1 1 质粒和菌种 2 材料与方法 工程菌e c o 疗d h 5n 、b l 2 1 ( d e 3 ) 及质粒p e t 2 8 a ( + ) 为本实验室保存；含p 2 5 基因 的p b 玳6 1 - p 2 5 质粒由英国j o h n1 1 1 i l e sc e m r es a i 璐b l l r y 实验室的d a v i dc b a l l l c o m b e 博 士惠赠。 2 1 2 化学试剂 d n a 凝胶回收试剂盒购自上海生工生物工程公司。 异丙基一b d 一硫代半乳糖苷( i s o p r o p y l 0 d t h i o g a l a c t o s i d e ，1 p t g ) 、卡那霉素 ( k 啪y c m ，k a n ) 、低分子量标准蛋白( 1 4 4 9 7 4k d a ) 和预染的低分子量标准蛋白 ( 1 4 4 - 9 7 4m a ) 购自北京鼎国生物工程公司。 n i - n t aa g a r o s e 亲和层析介质购自q i a g e n 公司。 t 4 d n a 连接酶，预混，i 的酶，核酸限制性内切酶曰册mi ，勋ci ，胁删，d n a 分子量m a r k e rd l 2 0 0 0 和d n a 分子量m a r k e rd l 15 0 0 0 购自大连宝生物公司。 其余常规试剂为国产分析纯试剂。 2 1 3p c r 引物 根据质粒p b i n 6 l p 2 5 中p 2 5 基因序列设计一对引物( 引物f o n v a r d 和引物黜v e r s e l ， 由上海生物工程公司合成。 序歹0 为：f ：5 一t t g g l = a g t a c a t g c a g t a g c c ，3 ， r ：5 - t c a c c t t r g a c c t g g t ( 3 2 2 实验方法 2 2 1 原核表达载体p e t - 2 8 a ( + ) p 2 5 的构建 2 2 1 1 目的基因p 2 5 的制备 6 将p b i n 6 1 - p 2 5 质粒用限制性核酸内切酶且口m hi ，ci 消化。 总体积( 2 5u 1 ) p b i n 6 1 一p 2 51 5 “l ( 约3 ”g ) 5 b u f r e r ( k )1 5 肛l 占 册hi1u 1 如ci1u l d d h 2 0 1 1 5u l 3 7 温浴8h ，1 o 琼酯糖凝胶电泳，在长波紫外光下用手术刀片切下约为6 8 0b p 的亮带，以d n a 凝胶回收试剂盒回收目的基因p 2 5 片段，溶于1 5 斗l d d h 2 0 中。 2 2 1 2 p e t - 2 8 a ( + ) 载体片段制各 将p e t - 2 8 a ( + ) 质粒用限制性核酸内切酶b d m hi ，ci 消化。 总体积( 2 5u 1 ) p e t 2 8 a ( + ) 1 0 l ( 约1 5 g ) 5 b u 毹r 哔)1 5 “l 肋研hi 1u l 勋cilu l d d h 2 0 1 6 5u l 3 7 温浴8h ，1 0 琼酯糖凝胶电泳，在长波紫外光下用手术刀片切下大片段，以 d n a 凝胶回收试剂盒回收载体片段，溶于2 5 “ld d h 2 0 中。 2 2 1 3 目的基因p 2 5 片段与载体p e t _ 2 8 a ( + ) 连接 建立以下连接反应体系： 总体积( 2 5u 1 ) t 4 翻q a 连接酶1 山 t 4 d n a 连接酶b u 胁r2 5l l l 制备的p e p 2 8 + ) 载体片段 1 5m ( 约5n g ) 制备的目的基因p 2 5 片段6 5 肛1 ( 约2 0 n g ) 1 6 反应过夜，将连接反应液转化大肠杆菌感受态细胞d h 5n ，将转化菌液涂于 l b 平板上( 含5 0i l g m l ，k a i l 锄y c i n ) ，3 7 过夜培养。 2 2 1 4 重组质粒p e t - 2 8 a ( + ) 巾2 5 的鉴定 a ) p c r 鉴定 从过夜培养的卡那霉素抗性的平板上取菌落，放入2 0 “l 无菌双蒸水中，9 0 1 0 0 7 煮1 0m i i l ，以所得的溶液为模板进行p c r 扩增。建立以下反应体系： 总体积( 2 5 “1 ) 弓f 物f1 弘l 引物r1 山 模板1 “l 预混t a q 酶1 2 5 皿 d d h 2 09 5 肛l p c r 反应条件： 9 5 ，4 m m 9 5 ，4 0s、 5 2 ，5 0s i3 0 个循环 7 2 ，1i i l i nj 7 2 ，1 0 m i n 1 o 琼酯糖凝胶电泳分析结果。 b 1 酶切鉴定 挑取p c r 阳性的菌落，接种于3i n ll b 培养液中( 含5 0 肛g ，m l ，k 嘞m y c i n ) ，3 7 振荡培养过夜，碱裂解法小量制备质粒，以所”d i 和勘m hi 双酶切鉴定重组质粒t 建 立以下反应体系： 总体积( 2 5 m ) p e t 2 8 + ) - p 2 5 2 0m ( 约8 0 0 n g ) 1 0 b u “k )2 5 l 的聊h 10 5 m 觑h d o 5u 1 d d h 2 01 5 肛l 3 7 温浴4h ，1 0 琼酯糖凝胶电泳分析结果。重组质粒p e t - 2 8 a ( + ) p 2 5 的序列分 析测定由上海生工生物工程公司完成。p 2 5 序列插入p e t 2 8 a ( + ) 载体后与n 端的6 h i s 标签融合，p 2 5 将以融合蛋白形式表达。 2 2 2 p 2 5 基因在大肠杆菌中的诱导表达 挑取含重组质粒p e 2 8 “+ ) p 2 5 的表达菌株b l 2 1 ( d e 3 ) 的单菌落，接种于3m 1l b 培养液中( 含5 0u m 1 ，k 蚰锄y c i n ) ，3 7 振荡培养过夜，取过夜培养液按1 ：1 0 0 的 比例扩大培养。在不同o d 6 0 0 值范围( o 4 - o 5 ，0 5 一o 6 ，o 6 - o 7 ，o 7 一o 8 ，o 8 0 9 ，0 9 1 o ) 加入i p t g 至终浓度1 0m m 0 1 l 进行诱导，4h 后取1m l 培养物收集菌体，进行 s d s p a g e 电泳检测融合蛋白表达情况。在o d 6 0 0 值为o 6 0 7 范围内，加入i p t g 至终 浓度1 0 m m o l 几进行诱导，经不同的诱导时间( 1h ，2 h ，3h ，4 h ，5 h ，6 h ) 后取lm l 培养物收集菌体，进行s d s p a g e 电泳检测融合蛋白表达情况。 挑取含重组质粒p e t _ 2 8 + ) - p 2 5 的表达菌株b l 2 1 ( d e 3 ) 的单菌落，接种于3m 1l b 培养液中( 含5 0 肛咖1 ，k a n 踟y c i n ) ，3 7 振荡培养过夜，取过夜培养液按1 ：1 0 0 的 比例扩大培养至4 0 0m ll b 培养基中( 含5 0 “g ，m 1 ，k 趴a m y c i l l ) 。在o d 6 0 0 值为o 6 一o 7 范围内，加入i p t g 至终浓度1 o m m o l l 进行诱导，诱导4 h 后取1m 1 培养物收集菌体， 进行s d s p a g e 电泳检测融合蛋白表达情况，余下培养物备用。 2 2 3p 2 5 融合蛋白的分离纯化 收集诱导后菌体，在变性条件下按q i a g e n 公司n i 栅aa g a r o s e 试剂操作方法进 行表达融合蛋白的纯化【6 0 】，具体步骤如下： 1 ) 4 ，1 0 0 0 0g ，离心收集菌体，去上清。 2 ) 加入2 0m l 磷酸盐缓冲液p b s ( 1 3 7m m n a c l ，2 7m mk c l ，1 0m m n a 2 h p 0 4 - 1 2 h 2 0 ， 2 m m k h 2 p 0 4 ，p h8 o ) 重悬菌体沉淀，4 ，1 2 0 0 0 9 离心1 0 m i n ，去上清。 3 ) 加入2 0m lb u 妇 e rb 溶液( 1 0 0m m n a h 2 p 0 4 ，1 0m m t r i s c 1 ，8m u r e a ，p h8 0 ) ，重 悬菌体沉淀，冰浴搅拌3 0m i n 。 4 ) 7 0 功率超声破碎6 次，每次3 0s ，间隙3 0s ，均在冰上操作。 5 ) 4 ，1 0 0 0 0g 离心2 0 3 0 m i n ，取上清。 6 ) 上清液加入n i - n t aa g j r o s e 介质4 0 0 l 悬浮液，冰浴搅拌1h 。 7 ) 先用2m lb 硼f e rb 溶液平衡n i n r aa g a m s eb u 岱e r 柱，然后加入步骤( 6 ) 中的混合液 至n i - n t a a g a r o s e b u 丘旨柱中。收集流出液，记为“收集液b ”。 8 ) 加入81 1 1 lb 调f e rc 溶液( 1 0 0m mn a h 2 p 0 4 ，1 0m mt r i s c l ，8mu r e a ，p h6 3 ) 冲洗， 收集流出液，记为“收集液c ”。 9 ) 加入o 5 m l b u 疏r d 溶液( 1 0 0 m m n 址1 2 p 0 4 ，1 0 m m t r i s c l ，8 m u r e a ，p h5 9 ) ，重 复四次，收集流出液，分别记为“收集液d 管l ，收集液d 管2 ，收集液d 管3 ，收集 液d 管4 ”。 1 0 ) 加入o 5m lb u 鼢e 溶液( 1 0 0m mn a h 2 p 0 4 ，1 0m m 喇s c 1 ，8mu r e a ，p h4 5 ) ， 重复四次，收集流出液，分别记为“收集液e 管1 ，收集液e 管2 ，收集液e 管3 ，收 集液e 管4 ”。 1 1 ) 所有流出液4 保存，取5 l 样品加5 “l 蛋白上样缓冲液( o 2 5m 0 1 lt r i s h c l p h 6 8 ，o 5m o l l 二硫叔糖醇，1 0 s d s ，o 5 溴酚蓝，5 0 甘油) 进行s d s p a g e 电 泳检测融合蛋白的纯化效果。 用p b s ( p h7 4 ) 于4 透析8h ，去除尿素、t r i s 等离子，得到的蛋白样品用b r a d f o r d 比色法经分光光度计分析蛋白质浓度。 2 2 4 p 2 5 融合蛋白抗体的制各及抗体效价的检测 2 2 4 1 p 2 5 融合蛋白免疫b a l b c 小鼠 1 1 第一次免疫6 8 周龄的b a l b c 小鼠3 只，按1 5 峙纯品蛋白只用量，抗原与等体 积弗氏完全佐剂充分混匀，腹腔注射，注射前用酒精棉球擦一下腹部。 2 ) 第一次免疫1 4 天后对b a l b ，c 小鼠进行第二次免疫。按1 5u g 纯品蛋白只用量，抗 原与等体积弗氏不完全佐剂充分混匀，腹腔注射。 3 ) 第二次免疫2 1 天后对b a l b c 小鼠进行第三次免疫。按1 5p g 纯品蛋白，只用量，抗 原与等体积弗氏不完全佐剂充分混匀，腹腔注射。第三次免疫后7 天，取鼠尾血做e l i s a 检测。 4 、饲养免疫后的小鼠，每7 天更换一次垫料。取出垫料后清洗鼠笼，晾干。每3 天更 换一次水瓶中的饮水，如水瓶内有杂物出现或藻类生长应立即处理。每3 天添加一次鼠 粮。添加时应本着之多不少的原则。 2 2 4 2 p 2 5 融合蛋白抗体的e l i s a 检测 1 ) 将纯化后的p 2 5 融合蛋白溶液按梯度稀释成1p 1 0 0 l ，o 7 5 1 0 0 “l ，0 5 1 0 0 斗l ，0 2 5 斗g 1 0 0 斗l ，0 1 斗g 1 0 0 斗l ，0 0 5u g ，1 0 0 “l ，0 0 1 1 0 0 l ，0 0 0 5u g 1 0 0 仙l ， 0 0 0 1 肚1 0 0u l ，与包被缓冲液混匀，按浓度由高至低的顺序加入到9 6 孔聚苯乙烯板 中，4 包被过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液冲洗3 次，每次4m i n 。 2 ) 加o 1 “封闭液于已包被的反应孔中，置于3 7 孵育1h 。然后弃去孔内溶液，用 洗涤缓冲液冲洗3 次，每次4 m i n 。 3 ) 将p 2 5 融合蛋白的抗体血清以封闭液按1 ：4 0 0 ，1 ：8 0 0 ，1 ：1 6 0 0 ，1 ：3 2 0 0 ，1 ：6 4 0 0 ，l ：1 2 8 0 0 的比例稀释后加入到每个反应孔中( 0 1 5i i l l 孑l ) ，置3 7 孵育lh 。弃去孔内溶液，用 洗涤缓冲液冲洗3 次，每次4 m i n 。 4 ) 加入用封闭液按1 ：5 0 0 0 的比例新鲜稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠i g g ( 第二 抗体) 0 1m l 于各反应孔中，3 7 孵育1h 。弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液冲洗3 次， 每次4 m i n 。 5 ) 加底物工作液o 1m l 于各反应孔中，轻摇，室温避光反应1 5i n 血。 6 ) 于各反应孔中加入0 0 5m l 反应终止液终止反应。于4 9 2 衄在e u s a 酶标检测仪测 量o d 值。 e l i s a 溶液配制： 1 ) 包被缓冲液：o 8 5m o l l 碳酸缓冲液p h9 6 ，1 0 0m l n a 2 c 0 3 ( m w1 0 5 9 9 ) o 1 5 9g n a h c 0 3 ( m w8 4 0 1 ) 0 2 9 3g 2 ) 洗涤缓冲液：磷酸盐缓冲液( p b s t ) p h7 4 ，1 0 0 0m l n a c l ( m w5 8 4 4 ) 8g k c l ( m w7 4 5 5 ) 0 _ 2g k h 2 p 0 4 ( m w13 6 + 0 9 ) o 2g 1 n n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ( m w3 5