（遗传学专业论文）蚕豆estssr分子标记的建立及其应用.pdf

月 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别 加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同 志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名： 缉亟 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 及学校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅 和借阅。本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：。丛豳 指导教师签名：蚴 签名日期： 汐 年厂月g 日 ， 辽宁师范大学硕l ：学位论文 摘要 蚕豆是世界上重要的豆科植物之一，是人类饮食中淀粉和蛋白质的重要来 源，中国和欧洲是蚕豆主要的生产地。由于其部分交叉授粉，蚕豆具有高度异质 性，因此品种间以及地方品种间包含了广泛的遗传变异，使保护种质资源变得更 加昂贵和困难。尽管其种植历史悠久并且有很高的经济价值，但是对蚕豆分子标 记仍然稀少。因此，在发展蚕豆更可靠更有效的分子标记将在多样性分析和资源 保护中起重要作用。 e s t s s r 分子标记在植物遗传分析和育种研究中已成为一个有力的工具。 由于它从转录本推导，这些标记基因的s s r 标记比传统的分子标记占有优势t e s t - s s r 分子标记的开发更简捷更廉价，相关物种具有较高的通用性，并更紧密 地连接已知功能基因。 我们下载了n c b i 数据库中公布的蚕豆5 0 3 l 条e s t 序列，通过对5 0 3 1 条 e s t 序列进行拼接，得到u n i g e n e l1 4 8 条，通过s s r 搜索软件搜索到1 0 7 个s s r 位点，s s r s 的出现频率为9 3 2 。其中三核苷酸在1 0 7 个s s r 重复序列中是最 为丰富的重复类型，占4 4 8 6 。而在三核菅酸中a a g 是最丰富的重复基元，占 有1 2 5 。a g 和t c 是二核苷酸中最丰富的，各占3 3 。其它s s r 重复类型所 占比例相差不大。我们首次分离和鉴定了1 1 个蚕豆e s t s s r 分子标记其等位 基因变异数为每个位点2 3 ，各多态性引物的p i c 值变化范围为o 0 6 到o 4 3 ，平 均p i c 值为0 2 9 1 9 。在此基础上，我们利用已开发的l1 个e s t s s r 分子标记对 来自中国和欧洲的2 9 个品种进行主成分分析和聚类分析，结果表明，这些品种 可明显分为两个类群，我国蚕豆品种的遗传多样性较低，需要引入外源种质以拓 展遗传基础。因此表明，利用e s t s s r 标记对蚕豆种质资源评价是有效的。 进一步对这1 1 个蚕豆e s t - s s r 分子标记在豌豆上的通用性进行检测发现 7 2 7 3 在豌豆上具有通用性，其中7 5 0 0 通用性引物具有多态性。可见，新开 发标记具有对豌豆进行进一步遗传研究的潜力。 关键词：蚕豆；e s t ；s s r ：分子标记 2 l 螽豆e s t - s s r 分了标记的建讧及j e 心用 a b s t r a c t f a b ab e a n ( v i c i af a b al ) i so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tl e g u m e si nt h ew o r l d i t p r o v i d e s a r ti m p o r t a n ts o u r c eo fp r o t e i na n ds t a r c hf o rh u m a nd i e t si nm a n y c o u n t r i e s t h em a i nf a b ab e a np r o d u e e lso ft h ew o r l di nc h i n aa n de u r o p e d u et oi t s p a r t i a lc r o s s p o l l i n a t i o n , f a b ab e a ni sh i g h l yh e t e r o g e n e o u sa n dc o n s e q u e n t l yc o n t a i n s b r o a dg e n e t i cv a r i a t i o nw i t h i nv a r i e t i e sa n dl a n d r a c e s ，w h i c hm a k et h ec o n s e r v a t i o n o fg e r m p l a s mr e s o u r c e sm o r ee x p e n s i v ea n dd i f f i c u l t h o w e v e r , d e s p i t ei t sl o n g h i s t o r yo fc u l t i v a t i o na n de c o n o m i ci m p o r t a n c e ，t h en u m b e ro fm o l e c u l a rm a r k e r s a v a i l a b l ef o rf a b ab e a ni ss t i l ls c a r c e t h e r e f o r e ，d e v e l o p i n gm o r er e l i a b l ea n d e 伍c i e n tm o l e c u l a rm a r k e r sw o u l db ev a l u a b l ei nd i v e r s i t ya n a l y s i sa n dr e s o u r c e c o n s e r v a t i o nf o rf a b ab e a n e s t d e r i v e dm i c r o s a t e l l i t em a r k e r s ( a l s ok n o w na se s t - s s rm a r k e r s ) h a v e b e c o m eap o w e r f u lt o o li np l a n tg e n e t i ca n a l y s i sa n db r e e d i n gr e s e a r c h d u et ot h e i r d e r i v a t i o nf r o mt r a n s c r i p t s ，t h e s em a r k e r sh a v es o m ei n t r i n s i cb e n e f i t so v e rg e n o m i c s s rm a r k e r s ：t h e ya r ee a s i e ra n dl e s se x p e n s i v et od e v e l o p ，p o s s e s sh i g h e r t r a n s f e r a b i l i t yt or e l a t e ds p e c i e s ，a n da r em o r ec l o s e l yc o n n e c t e dw i t hk n o w n f u n c t i o n g e n e s 5 0 3le s t sf r o mg e n b a n kd a t a b a s ei nn c b i 114 8w e r eo b t a i n e df r o m5 0 3 l b r o a db e a ne s t s w ef o u n d10 7e s t sb ys o f t w a r e a c c o u n t i n gf o r9 3 2 o fe s t s w e r em i n e do u t t r i n u c l e o t i d er e p e a t sw e r et h em o s ta b u n d a n tr e p e a tc l a s s ，a n d a c c o u n t e df o r4 4 8 6 o fa l lf o u n ds s r s a n da a ga r et h em o s tf r e q u e n tm o t i f si n t r i n u c l e o t i d e , a c c o u n t i n gf o r 12 5 a ga n dt ca r et h em o s tf r e q u e n tm o t i f si n d i n u c l e o t i d e ，a c c o u n t i n gf o r3 3 e a c ho t h e r h o w e v e r ，t h e r ew e r en os i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e sa m o n go t h e rt y p e s i nt h i sr e s e a r c h ，w er e p o r tf o rt h ef i r s tt i m et h e i s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fe s t s s r si nf a b ab e a n ，i n c l u d i n gt h e i rp o t e n t i a lf o r d i v e r s i t ya n a l y s i si nd i f f e r e n ti n d i v i d u a l sa n dt h e i rt r a n s f e r a b i l i t yt o ar e l a t e dp e a s p e c i e s ( p i s u ms a t i v u ml ) at o t a lo f1 1 n o v e le s t s s rl o c iw e r eg e n e r a t e da n d c h a r a c t e r i z e dw h e nt e s t e do nf o u rp o p u l a t i o n so f2 9f a b ab e a ni n d i v i d u a l sf r o mc h i n a a n de u r o p ew i t ht w ot ot h r e ea l l e l e sp e rl o c u s 1 1 1 ep o l y m o r p h i s mi n f o r m a t i o nc o n t e n t v a l u er a n g e df r o mo 0 6t o0 4 3w i t ha na v e r a g eo f0 2 919 g e n e t i cs i m i l a r i t ye s t i m a t e s f r o m1 ls s r ss h o w e dt w om a i nc l u s t e rt h a tc o m p r i s e da l lc h i n e s eg e n o t y p e sa n d e u r o p e a ng e n o t y p e s ，r e s p e c t i v e l y a na v e r a g eg e n e t i cs i m i l a r i t yo f7 3 5 2 a m o n gt h e c h i n e s ei n d i v i d u a l s 1 h er e s u l t so ft h i ss t u d yp r o v e dt h a tt h ee s t - s s rm a r k e ri sv e r y e f f e c t i v ei ne v a l u a t i o no ff a b ab e a ng e r m p l a s m f u r t h e r m o r e t r a n s f e r a b l ea n a l y s i sr e v e a l e dt h a t7 2 7 3 a m p l i f i e di np i s u m s a t i v u ml ，7 5 0 0 d e t e c t e dp o l y m o r p h i s m t h e s er e s u l t si n d i c a t et h ep o t e n t i a l o ft h e s en e w l yd e v e l o p e dm a r k e r sf o rf u a - h e rg e n e t i ci n v e s t i g a t i o n so fp e a k e yw o r d s ：b r o a db e a n ；e s t ；s s r ；m o l e c u l a rm a r k e r s i i 辽宁师范大学硕一 ：学位论文 目录 摘要i a b s t i 认c t i i l 引言1 1 1e s t 研究背景及现状1 1 1 1e s t 研究背景1 1 1 2 国内外研究现状2 1 2 蚕豆分子标记研究背景及现状3 1 3e s t 标记的开发策略5 1 3 1e s t 数据的取得与前期处理5 1 3 2e s t 聚类5 1 4e s t - s s r 标记的优势5 1 4 1e s t 标记类型5 1 4 2e s t - s s r 标记的优势6 1 5e s t s s r s 的获得7 1 5 1e s t - s s r s 的获得7 1 5 2e s t s 中s s r 的分布频率及特点7 1 6 毛细管电泳检测e s t s s r 8 1 7e s t - s s r s 的应用9 1 7 1e s t - s s r s 与遗传连锁图构建9 1 7 2e s t s s r s 的通用性9 1 7 3e s t s s r s 与多念性9 1 7 4e s t s s r s 与遗传多样性1 0 1 8 蚕豆e s t s s r s 的研究目的和意义1 0 2 材料与方法1 1 2 1 植物材料1 1 2 2 蚕豆e s t s s r s 的获取1 1 2 3 蚕豆基因组总d n a 的提取l l 2 4 蚕豆p c r 反应体系1 2 2 5 蚕豆p c r 反应程序：1 2 2 6 蚕豆e s t 的功能注释1 3 2 7 蚕豆遗传多样性1 3 3 结果与分析1 5 3 1 蚕豆e s t - s s r 信息和频率1 5 3 2 蚕豆e s t - s s r 的特点1 5 3 3 蚕豆e s t - s s r 荧光标记毛细管电泳检测1 7 3 4 蚕豆e s t s s r s 的开发1 9 3 5 蚕豆的遗传多样性分析1 9 3 6 蚕豆e s t 的功能注释2 2 3 7 蚕豆e s t - s s r 标记的通用性2 3 i i i 螽豆e s t - s s r 分了标记的建靛及j 应用 4 讨论2 5 4 1 蚕豆e s t - s s r 分子标记的特点2 5 4 2 蚕豆e s t - s s r 标记的遗传多样性2 5 4 3 蚕豆e s t - s s r 分子标记的通用性2 6 5 结论2 7 参考文献2 9 致谢3 5 附表3 7 l r 辽宁师范大学硕j ：学位论文 缩略语 英文缩写中墓塞鱼整 a f l p 扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s ) b c 回交( b a c kc r o s s ) b l a s t基本的局部对准检索工具( b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht 0 0 1 ) b p碱基对( b a s ep a i r ) b s a分离群体混合分析法( b u l k e ds e g r e g r a n t sa n a l y s i s ) c a p s 酶切扩增多态性( c l e a v e da m p l i f i e dp o l y m o r p h i cs e q u e n c e ) c d s 编码序列( c o d i n gs e q u e n c e ) e s t 表达序列标签( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ) e s t s s r 表达序列标签s s r ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ss s r ) g l i p欧洲豆类谷物综合计划( g r a i nl e g u m e si n t e g r a t e dp r o j e c t ) g s s r基因组s s r ( g e n o m i cs i m p l es e q u e n c er e p e a t s ) h g p人类基因组计划( h u m a ng e n o m ep r o j e c t ) n c b i美国国家生物技术中心( n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t ) p c r聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h i nr e a c t i o n ) p i c 多态信息含量( p o l y m o r p h i s mi n f o r m a t i o nc o n t e n t ) q t l数量性状位点( q u a n t i t a t i v et r a i tl o c u s ) r a p d随机扩增多念性d n a ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ) r f l p 限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) r i l 重组近交系( r e c o m b i n a n ti n b r e dl i n e s ) s c a r序列特异性扩增区域( s e q u e n c e c h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i n o s ) s n p 单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ) s s c p 单链构象多态性( s i n g l e - s t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m ) s s r 简单序列重复( s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ) s t r 短串联重复序列( s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ) s t s 序列标签位点( s e q u e n c et a g g e ds i t e ) 非翻译区( u n t r a n s l a t e dr e g i o n ) 非加权算术平均配对法( u n w e i g h t e dp a i r - g r o u pm e t h o du s i n g 一a 璺些丝! 垒塑型2一 _ _ 。- - i 。_ _ _ ；- _ 。_ _ 。1 一一一 v 蚕豆e s t s s r 分了标记的建眭及j e 应用 v i l 辽宁师范人学硕上学位论文 1 引言 1 1e s t 研究背景及现状 1 1 1e s t 研究背景 随着人类基因组计划( h g p ) 以及其他模式生物基因组计划的相继启动，基因 组的研究也从结构基因组学( s t r u c t u r a lg e n o m i c s ) 发展到如今的功能基因组学 ( f u n c t i o n a l i t yg e n o m i e s ) 。以结构基因组学为代表的基因组分析的初期阶段，是以 建立生物体高分辨遗传和物理图谱为主。如今的功能基因组学则代表了基因组分 析的新阶段，主要任务是利用结构基因组学提供的信息，采用新的方法和手段， 从对单一基因或蛋白质的研究发展到向多个基因或蛋白质同时进行系统研究，又 称为后基因组学( p o s t g e n o m i e s ) 2 j 。在生物技术飞速发展的今天，如何快速并高 效地从基因组学中获得有用的生物信息已经成为一个具有挑战性的课题。在这种 不断发展的环境下，分子标记技术飞速发展，已经成为结构基因组学和功能基因 组学的重要研究方法与手段【l 】。 为了对基因的功能进行研究，研究者通过各种技术和方法来获得未知基因的 e d n a 部分序列，进而克隆到其全长e d n a 序列，从而进行信息发掘。1 9 9 1 年， a d a m sm d 等提出表达序列标签( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ，e s t s ) ，e s t 是长度约 为2 0 0 7 0 0 b p 的基因表达序列片段。e s t 的产生过程是，首先从样品组织中提 取m r n a ，在逆转录酶的作用下合成e d n a ，再选择合适的载体构建e d n a 文库，对各菌株加以整理，将每一个菌株的插入片段进行5 端和3 端一步法 测序。e s t 是从一个随机选择的e d n a 克隆进行测序获得的短的c d n a 部 分序列，代表一个完整基因的一小部分，在数据库中其长度般从2 0 到 7 0 0 0 b p 不等，平均长度为3 6 0 士1 2 0 b p 。e s t 来源于一定环境下一个组织总 m r n a 所构建的e d n a 文库，因此e s t 也能说明该组织中各基因的表达水 平，我们可以把所获得的e s t 序列和基因数据库中序列进行比较，从而获 得生物生长状态等一系列的生理生化数据。另外，通过e s t 序列能够直接获 得批量的基因表达信息，然后通过生物信息学等方法延伸e s t s 序列来获得部分 或是全部的e d n a ，因此人们可以用比e d n a 测序更低的费用而得到等量的表达 数据，同时利用e s t 序列所引申出来的技术在寻找基因、基因识别、基因图谱 的绘制上被广泛应用，并且成效显掣3 1 。 随着e s t 测序研究的大规模开展，世界上的许多数据库积累了大量的e s t 序列信息，这些序列为新的基因研究提供帮助的同时，也成为各种新型分子标记 的宝贵信息资源。传统上所采用的分子标记，如r f l p ( r e s t r i e t i o nf r a g m e n t l e n g t hp o l y m o r p h i s m ) ，需要使用放射性物质，工作量大，耗费时间长，并且成 本高，已经无法满足现研究的快速、高效、节约的要求【4 ，5 1 。新近发展起来的 蚕豆e s t - s s r 分了标记的建p 及】应用 e s t s s r 分子标记，能够与其他物种进行基因对比从而确定该物种的起源，以 及与其他物种的亲缘关系。e s t s s r 标记与其他标记方法相比较，更能够对品 种及物种间的亲缘关系进行鉴定与辨别，所揭示的生物多态性具有非常好的特 性，能够作为品种鉴定以及新品种开发的依据。 1 1 2 国内外研究现状 由于分子标记可以辅助常规育种并提高选择效率，并且分子标记的开发相比 传统的表型选择的优点在于筛选过程简单、可靠，可早在苗期进行，从而节省了 时间和资源，同时也节省用间检测时问( f f l 问试验可能需要在一年中特定时间特 定地理位置进行，很难掌握) 。此外，分子标记不受该植物生长条件的影响，因 此，对d n a 分子标记进行选择更为可靠，比传统的目标性状的筛选更为有效而 且成本廉价。但是，分子标记的应用取决于几个关键因素，包括性状的遗传基础， 侧翼标记与目标基因之间的距离，个体性状的分析，已经转录的目标基因等。因 此，分子标记大多考虑简单的遗传因素，而不是基因性状，基因验证相对比较简 便，因此在许多情况下，分子标记可能无法在所有的目的群体显示多态性。 另外，在多基因调控性状的情况下，有很多的因素影响数量性状位点精度 ( q t l ) 定位，例如数据大小和类型，表型数据的重复水平，环境影响及基因分 型错误。这些因素对复杂的数量性状产生重要影响，而每个q t l 影响相对较小 ( 如抗病，抗旱性或产量) 。因此，q t l 的验证或其他标记检测已被广泛接受。 这些步骤包括：( 1 ) 测试q t l 在不同环境中的图谱研究结果的准确性，( 2 ) 核查 的q t l 在不同遗传背景的有效性( 3 ) 标记的最紧密连锁标记( 如s c a r s ) 基因分 型分子标记的可靠性。 目前研究表明，分子标记与基因控制的生长习性，或对种子的营养价值选 育等连接紧密。通过使用分子标记，间接选择目的性状已经应用几十年了【i o l ， 目前，不同类型的分子标记，可根据不同的方法检测，如杂交，聚合酶链式反 应( p c r ) 和d n a 测序等。从早期的限制性片段长度多态性( r f l p ) ，随机扩增多 态性d n a ( r a p d ) ，扩增片段长度多态性( a f l p s ) ，简单重复序n ( s s r s 或微卫 星) ，序列特征扩增区( s c a r s ) ，序列标签位点( s t s ) ，单链构象多态性( s s c p ) 到单核苷酸多态性( s n p s ) 等都已应用到现代植物育种中。同时，分子标记的广 泛使用，也大大增强了我们对许多植物物种的遗传多样性认识，并极大地促进 了基因组图谱的构建和品种多样化的开发。l i 等人利用1 4 对引物对2 0 个乌梅 品种扩增检测s s r 位点和多态性条带，并用1 4 对e s t s s r 引物检测对桃和李 子的通用性，结果显示，近8 9 的引物对两个物种产生目的条带，在李子中多 态性较高( 6 5 ) 而在桃子中多态性较低蛳) ；三个品种聚类分析显示，这些s s r 标记在李属亲缘关系的评价和遗传多样性分析中发挥重要作用 6 1 。x i e 等对7 4 个鸭茅品种进行多态性检测，共产生1 9 0 个多态性条带，平均每个s s r 位点有 2 辽宁师范大学硕l ：学位论文 6 3 个等位基因，物种的平均多态性为8 4 6 3 ，显示了高度的遗传多样性【7 1 。 h u 等利用2 6 对标记引物对2 1 个黄瓜品种的检测，结果显示存在多态性，平均 每个位点3 7 7 个等位基因，多态信息含量( p i c ) 值平均为0 3 8 8 。另外，用2 8 个e s t s s r 标记引物检测其它四个瓜类，甜瓜，西瓜，南瓜和葫芦的多态性， 表明分别有9 2 9 ，5 7 1 ，5 3 6 和6 0 7 的多态性，结果说明e s t - s s r 标记 的发展将有助于补充现有的基因组s s r 标记，并有可能在黄瓜和相关物种的遗 传研究发挥作用【8 】。s i j u 等人通过对2 0 个姜黄品种的多态性标记进行开发，产 生了1 7 个多态的e s t s s r 标记，检测到每个位点为3 8 个等位基因，利用所 开发的标记检测了1 3 种姜黄，物种间通用性达到1 0 0 ，如把这项研究产生的 多态性s s r s 标记用于遗传多样性分析可以解决目前姜黄属分类的混乱问题p j 。 1 2 蚕豆分子标记研究背景及现状 目前，通过分子标记辅助育种，并在一些豆类作物上成功地进行了遗传改 良，如大豆，菜豆，豌豆等，而蚕豆分子标记仍然处于丌发阶段。 蚕豆是全球重要的四大豆类作物之一，与大豆相比是一个相对较少的作物。 种植面积( 2 6 0 万公顷年) 在豆类食品豌豆，鹰嘴豆以及扁豆之后( h t t p ：f a o s t a t f a o o r g ) 。在地中海笳地，尼罗河流域，埃塞俄比亚，中亚，东亚，拉美，北欧， 北美和澳大利亚，超过8 0 种植在发展中国家，而这些地区科研经费有限，导 致新的分子育种方法的丌发滞后。分子标记的使用和优质的f 2 代近交系群体 的开发，对蚕豆遗传改良发挥重要作用。 目前，对蚕豆基因组认识取得了重大进展( 2 n = 1 2 ；x = 6 ) ，拥有豆类作物中最 大的基因组( 1 c = 1 3 3 3 p g 1 3 0 0 0 m b p ) 1 2 1 。对于单基因性状豆科植物，如大豆、 菜豆和豌豆结合q t l 研究单基因抗性已经丌展【i3 1 ，而蚕豆的分子标记成功转 录单基因的报告甚少，因此开发分子标记的研究对提高蚕豆优良性状品系的育 种具有重要意义【1 4 j 。 目前，由于对蚕豆的多个基因编码的复合性状研究较少，更多的关注了基 因简单性状，许多研究主要集中在对植物抗性的分子标记开发上。近年来，分 子育种对抗蚕豆褐斑病，锈病和蚕豆赤斑病的研究也正在进行中，并取得了可 喜的成果。相信在不久的将来，通过比较基因组学及同线性分析，开发具有抗 病基因类似物( r g a s ) 豆类图谱，就会发现新的候选基因，并进行分子标记。为 蚕豆作物改良提供理论依据。 迄今为止，分子辅助标记已被证明是更适合检测虫害和疾病控制相关特性 的简便方法，并已经在谷物，块根和块茎进行了检测。蚕豆容易受多种真菌病 害影响，在地区间发病率和严重程度有所不同，最常见的是蚕豆褐斑病，锈病 和蚕豆赤斑病，霜霉病和基腐病。抗病性如果通过传统的方式操纵这些性状， 一般达到预期目标是十分困难的，但采用分子标记辅助选择育种可以取得很好 3 蚕豆e s t s s r 分了标记的建证及j e 应用 的效果。如蚕豆分子育种的抗锈，抗列当科植物o r o b a n c h ec r e n a t a 和蚕豆褐斑 病已经在不同的f 2 高级近交群体进行了广泛的分析，并取得了很好的进展。 。植物病害体系生理分化的数据也显示，品种单一抗性基因的使用是不可能 产生持久的抗性的，增加耐久性的一种方法是把不同抗性基因整合到一个目的 农艺品种，这一过程也称为基因聚合。如a v i l a 等( 2 0 0 3 ) 所使用的批量分离分析 ( b s a ) 识别了分子标记相关的基因u v f - 1 ，u v f - 1 显示耐药基因型2 n 5 2 同时抵 抗病原体，以此为基础开发了抗锈蚕豆【”】。在研究中发现，一些抗锈病蚕豆的 主要来源很有可能是由不同的基因控制的，目前j 下在进行不同抗性基因型的种 间杂交研究l l 酬，取得的初步数据表明，定量分析是最合适的方法。因此，基因 控制抗性的遗传标记的开发大大缩短了蚕豆培育的过程，避免繁重耗时的接种 和疾病评价。 相对于分子标记对生物胁迫的应用，分子标记对非生物胁迫的应用非常匮 乏。其中包括多种非生物因素，需要专业育种和辅助标记技术的支持。蚕豆是 干旱最敏感的豆类之一，水在蚕豆开花结荚和灌浆的缺乏会降低生物质含量和 产量，因此耐旱品种的开发亟待解决，但抗旱性状通常是数量性状，常规领域 抗旱性评价耗费大量时间和财力，往往由于季节变化得不到可靠的结果。早期 研究主要通过近交系蚕豆耐旱基因型的筛选来提高抗旱性能，但通过这种方式 取得耐旱性品种非常繁琐，若是以基因组为基础的方法来提高作物抗旱性可以 大大方便耐旱性品种的获得【1 1 7 1 。因此，耐旱品种的选育，首先必须确定遗传性 状以提高适应干旱环境，如在不稳定降雨地区选择提前开花和成熟品种，并对 营养物质分配，生殖结构和表型可塑性进行改造可以提高豆科作物产量。研究 结果表明，相对较小的叶面积，较大的根系可以使作物增加对土壤水分的吸收 效率和减少水的损失。利用气孔导度，叶片温度和蒸腾效率的差异选育蚕豆品 种，使其生理特性适应水分匮乏的条件。最近，利用表达序列标签位点( e s t s ) ， 在鹰嘴豆，豌豆和模式苜蓿品种中鉴别出抗旱的品种【1 8 】。通过测定这些基因的 遗传变异并整合到蚕豆目前的图谱，利用比较基因组学和同线性研究可以进行 有针对性的分子育种，更有效的提高蚕豆种质资源的利用率。此外，已经完成 的欧洲豆类谷物综合项目( g l i p ) ，对蒺藜苜蓿在环境胁迫时转录和代谢水平发 生的生理变化进行了研究( h t t p ：w w w g r a i n l e g u m e s c o r n i n d e x p h p a e p s p e c i a l r e p o r t s ) ，在豆科植物中也已经鉴别出响应胁迫的几个基因，这些基因在干旱胁 迫豌豆和盐胁迫蒺藜苜蓿时普遍存在。从g l i p 项目所得出的资料很容易推断 蚕豆中的抗旱基因，并通过耐旱性q t l 的定位这些基因，有助于筛选在逆境胁 迫中起到调控作用的相关基因，并通过分子辅助标记来开发耐旱蚕豆品种。 另外，根据蚕豆自交系群体目的性状的分离，正在绘制新的高密度图谱，为 有针对性的开发分子标记提供依据。但该方法将需要具有通用性的分子标记，如 $ s r s ，虽然目前已有蚕豆s s r s 的相关报道，但仍需对s s r 进行进一步的开剔1 9 j 。 4 辽宁师范人学硕：i ：学位论文 1 3e s t 标记的开发策略 1 3 1e s t 数据的取得与前期处理 通过公共e s t 数据库就可以下载到目的e s t 数据，但是下载的e s t 数据中 存在一些低质量的片段( 长度小于1 0 0 b p ) ，而且还存在一些带有少量载体或木端 存在p o l y a t 的序列，这些因素会影响相关信息的分析，所以在标记之前需要去 除这些影响因素。通过一些软件可以对e s t 序列进行处理，可以将带有载体的 序列和p o l y a t 序列去除或屏蔽，例如e s t t r i m m e r ，c t o s s m a t c h 掣2 0 1 。 1 3 2e s t 聚类 e s t 被随机选取进行测序会导致同一基因重复测序，出现冗余现象。因此必 须通过软件( 如p h r a p 等) 处理，这些冗余的e s t 序列经过拼接和聚类被去除，从 而避免同一基因位点的分子标记的重复建立，避免时问以及成本上的浪费。对于 e s t - s n p 的开发而言，通过聚类来剔除冗余e s t 序列，得到多序列聚类簇 ( m u l t i m c m b c rc l u s t e r ) ，进而发掘出多态性位点。 1 4e s t s s r 标记的优势 1 4 1e s t 标记类型 为了与传统的s s r 进行区别，我们称之为e s t 分子标记( e s tm i c r o s a t e l l i t e m a r k e r ) 。根据e s t 开发的类型不同，e s t 分子标记可分4 类：( 1 ) e s t s s r 和 e s t - p c r 标记，这一类的核心是利用p c r 技术，在工作上操作简单、成本低， 是目前研究最多的一类：( 2 ) e s t - a f l p ，这一类是依靠p c r 技术和限制性内切 酶技术相互依托为基础的分子标记，具有可靠性好，重复性强，可信度高等优 点，但是工作量较大，实验成本高，对d n a 的纯度和内切酶的质量要求很高； ( 3 ) e s t s n p ，这一类以依靠特定e s t 序列区段内单个核苷酸的差异进行分子标 记，可通过杂交，p c r 等方法进行检测。由于d n a 测序技术的大大提高，s n p 这种多态性高的分子标记应该会在豆科中得到广泛应用，目前大豆中己经有少量 的s n p 分子标记应用到图谱构建中，但由于s n p 分子标记技术花费较高，有时 还需利用d n a 芯片，一般实验室还难以很快应用，这也限制了s n p 标记在图谱 构建，基因定位及基因克隆中的应用：( 4 ) e s t r f l p ，这一类是以分子杂交和限 制性内切酶结合的标记方法，依靠e s t 为探针，在不同限制性内切酶反应后， 和基因组d n a 杂交的分子标记。但r f l p 实验操作繁琐，检测周期长，成本 高昂，d n a 质量要求高，需要量大，稳定性差，通常要接触放射性物质。 5 蚕豆e s t s s r 分了标记的建立及j 乓应用 1 4 2e s t s s r 标记的优势 s s r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ) 简单重复序列，又称s s r s 或s t r ( 短串联重复 序列) ，在人类和动植物基因组中都有广泛分布。例如，在小麦的基因组中平均 每2 9 2k b 就含有一个二核苷酸( a c ) n 重复，平均每2 1 2k b 就一个二核苷酸( a g ) n 重复，在三核苷酸重复中，( t c t ) n 和( t t g ) n 所占比例大约是二核苷酸重复序列 的1 0 。s s r 分子标记的特点：( 1 ) 广泛分布在植物基因组中，并且分布均匀且 随机；( 2 ) s s r 序列的两侧顺序具有比较保守的特性；( 3 ) 大部分s s r 没有功能， 经常会出现增加或者减少几个重复序列，在品种之间有大部分的变异位点； ( 4 ) s s r 标记具有孟德尔式遗传方式的共显性；( 5 ) 在扩增时，只需少量模板d n a ， 即使d n a 降解，也能准确地分析并鉴定出来。综合这些特点，s s r 在生物科学 研究上已经成为广泛应用的分子标记。如在构建植物遗传连锁图谱、遗传多样性 研究和品种鉴定等方面都发挥着重要作用。 传统上的s s r 标记需要构建基因组文库、识别和筛选重复序列、克隆、测 序及引物设计，所用过程长，并且缓慢，获得s s r 引物费时费力，并且成本高。 e s t s ( 表达序列标签) 的出现，带动了s s r 的发展。e s t 是一段短的e d n a 序列， 大约2 0 0 - 7 0 0b p ，通过对植物基因进行测序而产生，作为某一基因中存在的特 有序列，在早期用来搜索和查询d n a 和蛋白质数据库中的相似基因。在近年来， e s t s 发展十分迅速，在g e n b a n k 数据库上能够检索的水稻、大豆和拟南芥就分 别有数万条，并且数量还在不断的增加。e s t s 数据库为s s r 标记的发展提供一 个巨大、宝贵的资源，能够大幅减少s s r 引物开发的成本。 依靠e s t 建立s s r 标记是目前广泛的应用方法。经过前期处理后，对序列 进行拼接，去掉冗余序列，对转录片段的长度进行延长，利用软件搜索s s r ，根 据所得到的结果对e s t 中s s r 的频率、分布和特点进行分析，然后对目标s s r 进行选取并设计引物，通过p c r 对e s t s s r 标记进行建立。搜寻s s r 位点的软 件都有一定的差异，可以成批处理数据或逐条处理序列，并且这些软件还具有不 同的搜寻算法，在研究中使用多种软件结合互用，相互验证，可以得到更为准确 的结果。e s t 序列进行开发的s s r 标记相比基因组文库开发的s s r 标记具有更 多的特点与优势：( 1 ) 因为使用的是公共e s t 序列，在s s r 引物开发过程中，免 去了克隆和测序步骤，所以e s t s s r 标记在开发过程中简单并且成本低； ( 2 ) e s t s s r 标记选取的是比较保守的转录区，所以在