（遗传学专业论文）线粒体延伸因子g和信号序列受体γ亚基的克隆、鉴定和定位.pdf

线粒体延伸因子g 和信号序列受体丫亚基 的克隆、鉴定和定位 摘要 本论文分两个部分，第一部分是线粒体延伸因子g 的克隆和鉴定，第二部分 是亿号序列受体y 亚基的克隆和鉴定。 1 线粒体延伸因子g 的克隆和鉴定 债核细胞线粒体中的蛋白质合成与细胞质中的蛋白翻译体系相似，分成起 始、延伸和终止三个阶段，每个阶段由许多蛋白因子催化完成。从进化角度来说， ， 线粒体因子与相对应的原核因子较接近，而与细胞质中的因子相差较大。、：在这部 分的工作中，我们分离了两个分别编码人和小鼠线粒体延伸因子g 的c d n a ， g f m 和g f m 。g f mc d n a 长3 4 8 1b p ，编码的蛋白由7 5 1 个氨基酸组成，与大 鼠e f g 。t 和e s c h e r i c h i ac o l ie f g 的一致性分别为8 4 和4 2 ，相似性分别 为8 8 和6 2 ，与在细胞质中具有与e f - g 相似功能的蛋白人e f 一2 有2 4 的 一致性和3 9 的相似性。小鼠g f mc d n a 含有2 5 6 4b p ，其中包含一个编码7 5 1 个残基的阅读框，g f m 蛋白与人g f m 的一致性为8 9 ，相似性为9 4 。n o r t h e r n 印迹分析表明，人g f m 有三个转录本，大小分别为3 8 ，3 4 和2 9k b 。前两 个转录本在心脏、骨骼肌和睾九中表达量较高，在肝和肾呈中等量表达，在其它 组织如脑、胎盘和肺的表达量较低。第三个转录本只在睾丸中检测到。人g f m 在各组织中的相对丰度与另外两个人线粒体延伸因子e f t u 。和e 卜t s 。基本一 致，这提示三个延伸因子的表达水平相当。同样检测小鼠g f m 的组织表达谱， 结果发现一个3 0k b 大小的条带高丰度表达于心脏、骨骼肌、肾和睾丸。另外， 利用辐射杂种细胞定位方法，人g f m 被定位于人染色体3 q 2 5 卜q 2 6 2 。通过比 较基因组d n a 序列和c d n a 序列，分析和确定了g f m 的基因组结构，g f m 由 、 1 8 个外显子组成，至少长4 0k b 。，- 2 信号序列受体y 亚基的克隆和鉴定 ，7 在真核细胞中，新生多肽在内质网膜上的转移是蛋白合成过程中一个重要步 复旦土学硕士学位论文 捕姜 骤，许多蛋白在合成时需要被运输穿过内质网( e r ) 膜。这个穿膜过程可以被分成 定位循环和真正的蛋白转移两个阶段。对于前一阶段人们已经了解的比较清楚， 然而对于真正的转移过程还了解的不多。新生多肽需要在多种e r 膜蛋白的作用 下才能完成转移过程，信号序列受体( s s r ) ，也称为易位子( t r a n s l o c o n ) 相关蛋白 ( t r a p ) , i , t 是其中之一? 在蓬第二部分的工作中，人信号序列受体y 亚基基因s s r 3 被分离和克隆，其c d n a 全长3 0 6 1b p ，5 7 6 1 4 位编码1 8 5 个氨基酸，在蛋白水 平与大鼠t r a p 丫相似性达9 8 。( n o r t h e r n 印迹分析检测到三条大小分别为o 8 ， 2 5 ，3 8k b 的转录本。3 8k b 转录本表达最广泛，在除胸腺之外的组织都被检测 到，其中，在胰腺和心脏中表达量较高，在脾脏、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、 结肠和外周血白细胞中表达量中等，在脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌和肾中表达量 较低。0 8k b 转录本的组织分布与3 8k b 转录相似，表达水平略低。2 5k b 转录 本的信号只在少数组织中检测到，但心脏和胰腺仍是主要表达的组织此外，通 过辐射杂种细胞定位，s s r 3 基因被定位于人染色体3 q 2 5 1 - q 2 5 3 区带，位于 d 3 s 1 2 7 5 和d 3 s 1 6 0 5 位标之间j 、，7 r ： 关键词：线粒体延伸因子g ，信号序列受体y 亚基，克隆，组织表达谱，r h 定位 中图分类号：勺7 5 、：? 兰兰圭! 璺! 竺竺兰 兰兰 c l o n i n g ，c h a r a c t e r i z a t i o n a n d m a p p i n g o fm i t o c h o n d r i a l e l o n g a t i o nf a c t o rg a n d s i g n a ls e q u e n c er e c e p t o r 丫s u b u n i t a b s t r a c t t h i st h e s i si s c o m p o s e d o ft w o p a r t s t h e f i r s t p a r t i st h e c l o n i n g a n d c h a r a c t e r i z a t i o no fm i t o c h o n d r i a le l o n g a t i o nf a c t o rg t h es e c o n dp a r ti st h ec l o n i n g a n dc h a r a c t e r i z a t i o no f s i g n a ls e q u e n c er e c e p t o ry s u b u n i t 1 c l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no f m i t o c h o n d r i a le l o n g a t i o nf a c t o rg s i m i l a rt ot h et r a n s l a t i o n a ls y s t e mi nc e l lc y t o p l a s m ，t h ei n i t i a t i o n ，e l o n g a t i o na n d t e r m i n a t i o no fp r o t e i n s y n t h e s i s i nm i t o c h o n d r i ao fe u k a r y o t e sa r e c a t a l y z e db y s e v e r a l p r o t e i nf a c t o r s t h e s ef a c t o r s ，f r o mt h ev i e w p o i n to fe v o l u t i o n ，a r e m o r e c l o s e l y r e l a t e dt ot h e c o r r e s p o n d i n gp r o k a r y o t i c o n e sr a t h e rt h a nt h o s ei nt h e e u k a r y o t i cc y t o p l a s m w e i s o l a t e dt w oc d n a sc o d i n gf o rh u m a na n dm o u s e m i t o c h o n d r i a le l o n g a t i o nf a c t o rg ( g f ma n d6 f m ) r e s p e c t i v e l y t h eg f me d n a ， w h i c hi so f3 4 81 b pi nl e n g t h ，p r e d i c t sap r o t e i no f7 5 1a m i n oa c i d ss h a r i n g8 4 ， 4 2 i d e n t i t y ，a n d8 8 ，6 2 s i m i l a r i t yw i t hr a te f - g m ta n d e c o l ie f gr e s p e c t i v e l y ， a n d2 4 i d e n t i t ya n d3 9 s i m i l a r i t yw i t hh u m a n e f - 2 ，t h ee q u i v a l e n to fe f gi nt h e c y t o p l a s m t h em o u s eg f me d n a i so f2 5 6 4b pa n dc o n t a i n sa ni n t a c to p e nr e a d i n g f r a m et h a te n c o d e s7 51a m i n oa c i d s s h o w i n g8 9 s e q u e n c ei d e n t i t y a n d9 4 s i m i l a r i t yt oh u m a ng f m n o r t h e r nb l o t t i n ga n a l y s i so fh u m a ng f m r e v e a l e dt h r e e t r a n s c r i p t so f3 8 ，3 4a n d2 9 k b t h ef o r m e rt w ow e r ee x p r e s s e dh i g h l yi nh e a r t ， s k e l e t a lm u s c l ea n dt e s t i s ，m o d e r a t e l yi nl i v e ra n dk i d n e y ，l o w l yi no t h e rt i s s u e s i n c l u d i n gb r a i n ，p l a c e n t a ，l u n g ，w h i l et h el a t e rw a so n l ye x p r e s s e di n t e s t i s t h e r e l a t i v ea b u n d a n c eo fg f mw a sc o n s i s t e n tt ot h eo b s e r v a t i o n sf o rh u m a n e f - t u m ta n d e f - t s m t ，t h e o t h e rt w om i t o c h o n d r i a l e l o n g a t i o nf a c t o r s ，i n d i c a t i n g t h a tt h et h r e e f a c t o r sw e r ee x p r e s s e da tc o r r e s p o n d i n gl e v e l s t h ee x p r e s s i o np a t t e r no f m o u s eg f m w a sa l s od e t e r m i n e d ，w h i c hs h o w e dt h a tg f mw a se x p r e s s e da sa3 0 一k b t r a n s c r i p t ， 兰兰圭! 璺壁堡竺兰 苎兰 a b u n d a n t l y i n h e a r t ，s k e l e t a lm u s c l e ，k i d n e y ，a n d t e s t i s i na d d i t i o n ，g f mw a s a s s i g n e d t oh u m a nc h r o m o s o m e3 q 2 5 1 - q 2 6 2w i t ht h er a d i a t i o nh y b r i dm a p p i n g m e t h o d t h eg e n o m i co r g a n i z a t i o no fg f mw a sa l s oa n a l y z e db yc o m p a r i n gt h i s e d n aw i t hag e n o m i cd n a s e q u e n c e ，w h i c hs h o w e dt h a tg f m c o n t a i n e d18e x o n s a n ds p a n n e d4 0k ba tl e a s t 2 c l o n i n ga n d c h a r a c t e r i z a t i o no f s i g n a ls e q u e n c er e c e p t o ry s u h u n i t t h e b i o s y n t h e s i so f a g r e a tn u m b e r o f e u k a r y o t i cp r o t e i n sr e q u i r e st h e i rt r a n s p o r t a c r o s st h ee n d o p l a s m i cr e t i c u l u mm e m b r a n e t h ep r o c e s sc a nb ed i v i d e di n t ot w o p h a s e s ，at a r g e t i n gc y c l ea n dt h ea c t u a lt r a n s f e ro f n a s c e n tp o l y p e p t i d e sa c r o s st h e m e m b r a n e t h ef i r s tp h a s eh a sb e e nw e l lc h a r a c t e r i z e d ，w h e r e a st h el a t t e rr e m a i n s l a r g e l yu n k n o w n m a n yc o m p o n e n t sa r ei n v o l v e di nt h et r a n s l o c a t i o no ft h en a s c e n t p o l y p e p t i d e sa tt h es p e c i f i cs i t e so fe r m e m b r a n ec a l l e dt r a n s l o c o n s i g n a ls e q u e n c e r e c e p t o r ( s s r ，a l s on a m e dt r a n s l o c o n a s s o c i a t e dp r o t e i n ) e x i s t si nt h ep r o x i m i t yo f t r a n s l o c o n i nt h i s p a r t o ft h et h e s i s ，w e r e p o r t t h ei s o l a t i o no fah u m a nc d n a e n c o d i n gs s r7s u b u n i t ，s s r 3 ，w h i c hi s 3 0 6 1b pa n de n c o m p a s s e sa no r ff r o m 5 7 - 61 4n t e n c o d i n ga 18 5 一a ap r o t e i ns h o w i n g9 8 s i m i l a r i t yt or a tt r a p va tt h e a m i n oa c i dl e v e l n o r t h e r nb l o t t i n ga n a l y s i sr e v e a l e dt h r e et r a n s c r i p t so f 0 8 ，2 5a n d 3 8k bt h a ta l lw i d e l yd i s t r i b u t e d t h e3 8 一k bt r a n s c r i p tw a s e x p r e s s e di n1 5o u to f1 6 t i s s u e s t e s t e d ，e x c e p ti nt h y m u s ，a th i g hl e v e l si np a n c r e a sa n dh e a r t ，a tm o d e r a t e l e v e l si n s p l e e n ，p r o s t a t e ，t e s t i s ，o v a r y ，s m a l li n t e s t i n e ，c o l o na n dp e r i p h e r a lb l o o d l e u k o c y t e ，a n da tl o wl e v e l si nb r a i n ，p l a c e n t a ，l u n g ，l i v e r ，s k e l e t a lm u s c l ea n dk i d n e y t h ee x p r e s s i o n p a t t e mo f t h e0 8 一k bt r a n s c r i p tw a ss i m i l a rt ot h a to f3 8 一k bo n ew i t h s l i g h t l yl o w e re x p r e s s i o na m o u n t t h ee x p r e s s i o no f2 5 - k bt r a n s c r i p tw a sr e s t r i c t e d a sc o m p a r e dt ot h o s eo ft h eo t h e rt w ot r a n s c r i p t s ，w h i l et h ea m o u n tw a sa l s oh i g hi n p a n c r e a sa n dh e a r t b e s i d e s ，t h es s r 3g e n ew a sa s s i g n e dt oh u m a nc h r o m o s o m e 3 q 2 5 1 q 2 5 3b e t w e e n m a r k e r d 3 s 1 2 7 5 a n d d 3 s 1 6 0 5b yr a d i a t i o nh y b r i d m a p p i n g k e y w o r d s ：m i t o e h o n d r i a le l o n g a t i o nf a c t o rg ，s i g n a ls e q u e n c er e c e p t o r 丫s u b u n i t ， c l o n i n g ，t i s s u ee x p r e s s i o np a t t e r n ，r hm a p p i n g 墨兰圭堂璺兰堡竺兰! 坐 第一部分 人和小鼠线粒体延伸因子g 基因，g f m 和g f m 的克隆、鉴定和g f m 的定位 前言 蛋白质的翻译由三个阶段组成：起始、延伸和终止，每个阶段都在不同的蛋 白因子催化作用下完成。比较蛋白质合成的三个阶段发现延伸阶段是细胞最保守 的功能之一。原核生物的蛋白质合成延伸阶段需要三个延伸因子：延伸因子t u ( e f - t u ) 、延伸因子t s ( e f - t s ) 和延伸因子g ( e f g ) 。首先e f - t u 与g t p 结合，再与氨酰- t r n a 结合，形成一个四元复合物，然后把正确的氨酰- t r n a 传递到核糖体受体位点( a 位点或氨酰位点) ，之后，以e f - t u ：g d p 的形式从 核糖体上释放出来e f - t s 作为一个乌嘌呤交换因子( g e f ) 与释放的e f t u ：g d p 作用，促进e f - t u 上的g d p 与g t p 交换，重新形成的e f t u ：g t p 可以参加下 一轮反应。e f - g ，又称移位酶( t r a n s l o c a s e ) ，它催化肽酰- t r n a 在肽键形成后 由a 位点向p 位点( 肽酰位点) 移位，e f g 的功能发挥与e f t s 和e f t u 相 似，同样依赖于g t p 的结合和水解m 2 1 。 真核细胞含有两套蛋白质翻译体系，一套位于细胞质核糖体上，这套翻译体 系的延伸因子是：e f 一1 g t ，e f 一1 b 和e f 一2 ，分别对应于原核细胞中的e f - t u 、 e f - t s 和e f - g 。另一套翻译体系位于线粒体中。线粒体是半自主的细胞器，有 其自身的遗传物质，能被转录并在位于线粒体基质中的核糖体上翻译。然而，线 粒体中的延伸因子是由核基因编码，在细胞质核糖体上合成，然后运输到线粒体 中【3 ，4 1 。尽管如此，线粒体延伸因子在结构上与真核细胞质中的功能对应物的差 异较大，而与原核细胞的功能对应物更相近瞿 迄今为止，牛和人线粒体延伸因子t u ( e f t u 。) 和t s ( e f _ t s 。) 已经被克 隆和鉴定，并在e c o i l 中以h i s 标记蛋白表迭，牛e f - t s 。i 能与e c o l i e f _ t u 形成复合物，该复合物对p o l y ( u ) 指导下的苯丙氨酸多聚化有活性，牛e 卜t u 。 也具有该活性 6 7 1 。牛肝脏线粒体中的e f g 已被分离纯化，胶过滤层析和 兰兰查! 璺兰堡竺苎兰竺 s d s p a g e 表明牛e f g 是单链多肽，分子量为8 0 ，0 0 0m ，e f g 的移位活性 对热敏感，但在g d p 或g t p 存在的情况下，对热敏感度降低，e 卜g 的活性还 可被n 一乙酰马来酰亚氨抑制，与其它移位酶不同的是，牛e f g 的活性不被羧 链孢酸抑制i ”。大鼠e f g 。基因已被鉴定，其d n a 序列编码7 5 2 个氨基酸， e f g 。广泛表达在各种组织，其中肝脏胸腺和脑中表达量较高1 9 】。原核生物延 伸因子的研究进展相对较快，人们已经得到了t h e r m u st h e r m o p h i l u se f g 的晶 体结构，没有g d p 结合时，e f g 大小为5 0 6 0 1 1 8a ，由五个结构域组成； 结合g d p 时，大小为7 6 1 0 4 1 1 6a ，是一个拉长的分子】。但是，至今有关 人和小鼠e f g 。的研究还没有被报导。为了更全面的了解哺乳动物线粒体，特 别是人线粒体中的蛋白质合成，分离和克隆线粒体延伸因子g 是必要的。 本研究结合了生物信息学技术和实验分析方法，克隆和鉴定了人和小鼠线粒 体延伸因子g 基因g f m 和g f m 。 兰兰圭! 璺! 苎竺苎 兰二竺! 材料和方法 一研究策略 以大鼠e f g 。t 基因c d n a 序列( g e n b a n k 登录号l 1 4 6 8 4 ) 作为基因信息 探针，对g e n b a n kh u m a ne s t 或m o u s ee s t 数据库进行搜索，把得到的高度同 源序列在w i s c o n s i np a c k a g e 中装配拼接；或者利用e s tm a c h i n e 中的e s t a s s e m b l ym a c h i n e 和e s te x t r a c t o r 将出发序列步移并拼接，得到e s t 重叠群序 列，然后用实验方法加以克隆，并用实验方法和生物信息学方法相互配合鉴定。 二技术路线如图1 所示 大鼠e f g 。t 搜索g e n b a n ke s t 数据库，拼接成重叠群 中 设计引物，p c r 扩增，产物测序验证 0 + 生物信息学分析 厂r 厂 推导蛋白质组织表达谱染色体定位基因组结构 的一级结构分析分析 分析 图1 实验技术路线示意 三材料与设备 a 分子生物学实验材料 1 p c r 引物( 上海生工生物工程有限公司合成) ( 1 ) 根据人e s t s 设计的g 脚c d n a 片段克隆引物： a 1 ： 5 - g t g c t c t g c g c t t g c c a t g a g a c 3 b 1 ： 5 一t c a t g t c g g c a t g c a t g c g a g c c 3 a 2 ： 5 a c t g g a g g t a g g t c g a t t t g g a c 3 兰兰圭兰翌! 竺竺苎 ! 二竺! b 2 ：5 一g a g t c a g t c a a c t c a c a g t a a g c 一3 ( 2 ) 根据g f m 3 末端序列设计的r h 定位引物： r h a ：5 一c a at g ga g ta t ag c ag g ta t ca g 3 r h b ：5 c c aa t ca a ta g ag t tg a ga t ag a c - 3 ( 3 ) 根据小鼠e s t s 设计的g f m c d n a 片段克隆引物： m a l ：5 c c t t g g a a g t g g c t g t t c c a g g c - 3 m b l ：5 一c g g t c c t c g t g t t g t a g a t g g t g 3 m a 2 ：5 c g ct a t a c tc a at c ag a at g ac t c 3 m b 2 ：5 c a t t c a a g c a g a c t c c a t c a t c c 3 ( 4 ) p g e m t 载体的正反向引物： f 2 ：5 一c g c c a g g g t t t t c c c a g t c a c g a c 一3 r 2 ：5 一t c a a c a a g g a a a c a g c t a t g a c 3 2 人8 种组织c d n a 文库( 脑、骨骼肌、睾丸、肾、骨髓、肝、胎盘和外周血 白细胞，c l o n t e c h 公司) ：文库载体分别为噬菌体九g t l on k g t ll ，滴度为3 9 1 0 9 m 1 3 p c r 扩增试剂盒( 上海p r o m e g a 公司) 4 d n a 测序试剂盒( p e 公司) 自动测序，b i g d y e t e r m i n a t o r c y c l es e q u e n c i n gr e a d y r e a c t i o n 5 p c r 产物纯化试剂盒( q i a g e n 公司) 6 质粒抽提试剂盒( b o e r h r i n g e rm a n n h e i m 公司) 7 柱离心式胶回收试剂盒( b o e r h r i n g e r m a n n h e i m 公司) 8 放射l 生a 3 2 p d a t p ( a m e r s h a m 公司) 9 人体1 6 种组织m r n an o r t h e m 印迹膜( m u l t i p l et i s s u en o r t h e r n b l o t ， c l o n t c c h 公司) ，包括m t ni 和m t ni i ，载有的m r n a 分别来自心脏、脑、 胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾、胰腺、脾、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小 肠、结肠粘膜和外周血白细胞1 6 种组织。 1 0 人鼠体细胞辐射杂种板g e n e b r i d g e4 ( r e s e a r c hg e n e t i c s 公司) 11 克隆载体和宿主菌： 质粒p g e m t 载体( p r o m e g a 公司) 大肠杆菌j m l 0 3 ( 本室保存) 4 量旦土学嘎士学位论文 弟一部分 一 1 2 小鼠n o r t h e m 印迹膜制备试剂： t r i z o lr n a 抽提试剂( l i f e t e c h n o l o g y 公司) 。 d e p c ( a m r e s c o 公司) 。 57 甲醛凝胶电泳缓冲液：将2 0 6g m o p s ( 3 一( n - 玛琳代) 丙磺酸) 溶于8 0 0 m l 经用d e p c 处理的5 0m m o l l 乙酸钠溶液，2m o l ln a o h 调p h 至7 0 ， 加1 0m l 经d e p c 处理的o 5m o l le d t a ( p h8 0 ) ，加d e p c 水定容至ll ， 经0 2m m 微孔滤膜过滤灭菌，室温避光保存 甲醛凝胶加样缓冲液：含5 0 甘油，1mm o v le d t a ( p h8 0 ) ，o 2 5 溴酚 蓝，0 2 5 - 7 - - 甲苯青( 灭菌并经d e p c 处理) 。 h y b o n d t m n + 尼龙膜( a m e m h a m 公司) 。 1 3 各种溶液： n o r t h e m ( - 预) 杂交液：5 0 甲酰胺，5 xs s p e ，1 0 xd e n h a r d t 液，2 s d s ，c t d n a ( 1 0 0p g m 1 ) 其他常规溶液均参照分子克隆实验指南配制。 b 生物信息学分析软件和数据库 1 w i s c o n s i np a c k a g e ( v e r s i o n1 0 0 ，g e n e t i c sc o m p u t e r g r o u p ( g c g ) ，u s a ) 2 c l u s t a l x m u l t i p l es e q u e n c ea l i g m n e n tp r o g r a m ( v e r s i o n1 8 ，j d t h o m p s o n ，e t c ) 3 t r e e v i e w ( v e r s i o n1 6 1 ，r d m p a g e ，u n i v e r s i t yo f g l a s g o w ，u k ) 4 s e q u i n ( v e r s i o n2 7 ，n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n ，u s a ) 5 g e n b a n k 数据库，b l a s t 序列数据库搜索软件和o m i m 数据库( n a t i o n a lc e n t e r f o rb i o t e c h n o l o g y i n f o r m a t i o n ，u s a ) ：h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v 6 t h ee s t m a c h i n e ：h t t p ：w w w t i g e m i t e s t m a c h i n e h t m l 7 s a n g e r r h m a p p i n g s e r v e r ： h t t p ：w w w s a n g e r a c u k s o f t w a r e r h s e r v e r r h s e r v e r s h t m l 8 g d b ：h t t p ：w w w g d b o r g 9 s m a r t ：h t t p ：s m a r t e m b l - h e i d e l b e r g d e 1 0 h u m a ng e n en o m e n c l a t u r e d a t a b a s e ：h t t p ：w w w g e n e u c l a c u k n o m e n c l a t u r e 5 墨兰圭! ! 兰苎竺苎一兰竺 11 p c g e n e 软件包( u n i v e r s i t yo fg e n e v a ，r e l e a s e6 7 ) 12 t h m m ：h t t p ：w w w c b s d t u d k s e r v i c e s t m h m m 主要仪器设备： p c r 扩增仪：p t c 1 5 0 、p t c 2 0 0 型( m jr e s e a r c h 公司) ；p e9 6 0 0 型( p e 公司) 杂交反应箱( 英国h y b a i d 公司) s u p r a f u g e2 2 、b i o f u g e 2 8 s 高速冷冻离心机( 德国h e r a e u s 公司) ；h i m a c c r 2 2 e 高速冷冻离c 2 机( h i t a c h i 公司) a b l 3 7 7 型全自动d n a 测序仪( p e 公司) 微型同位素检测仪：m i n i m o n i t o rs e r i e s9 0 0 型( m i n i i n s t r u m e n t s 公司) 微量加样器：1 0 0 0 p l 、2 0 0 9 l 、2 0 9 l 规格各一支( 法国g i l s o n 公司) 凝胶成像系统：f r 2 0 0 ( 上海复目公司) 四方法 1 c d n a 序列的克隆和测序 根据e s t s 拼接得到的重叠群序列设计引物，以多种人组织c d n a 文库为模 板进行p c r 扩增( 反应体系和条件见图2 ) ，产物通过1 琼脂糖胶电泳检测p c r 产物大小及特异性，目的p c r 产物经p c r 产物纯化试剂盒( 按操作手册) 或柱 离心式胶回收试剂盒( 按操作手册) 纯化后，将p c r 产物直接测序，确认序列 正确之后将其克隆至p g e m t 载体( 连接体系和条件见图3 ) ，转化大肠杆菌， 再次测序验证( p e 公司a b l 3 7 7 自动测序仪，反应体系和条件见图4 ) 。用b l a s t 程序1 1 2 1 在g e n b a n k 数据库中查新。向g e n b a n k 递交序5 , 1 ，h u m a ng e n e n o m e n c l a t u r ec o m m i t t e e ( h g n c ) 递交命名，申请相关资料。 2 推导蛋白质的一级结构分析 , 1 9 3p c g e n e ，参考同源序列，分析得到推导的读框。以推导的蛋白质序列， 用b l a s t p 搜索g e r t b a n kn r 数据库，得到不同物种的相应序列；利用c l u s t a l x t 23 】 对不同物种的相应序列做多重联配，并制作n e i g h b o rj o i n i n g 系统树 ( r e s a m p l i n g ：b o o t s t r a p1 0 0 0 ) ，t r e e v i e w 显示，以直观了解序列间的关系。 兰兰查! 翌兰! 竺竺兰! 竺 p c r 扩增反应体系 d n a 模板 2 5 m m 引物l 2 5 m m 引物2 1 0 x b u 仃e r 2 0 m m d n t p s 2 5 m m m g c l 2 t a q 酶( 5 u 9 1 1 10p i o 5u l 0 5g l 2 5k t l o5g l 15g l 0 2d 1 加d d h 2 0 至2 5 0 l a l p c r 扩增反应条件： 9 3 x 3 m i n + 9 3 l m i n + 6 6 l m i n - - - 7 2 1m i n _ 7 2 x 5m i n 连接体系 t l 1 2c y c l e s ( 每个循环降低0 5 至6 0 ( 2 ) 后6 0 ( 23 5c y c l e s 图2 克隆基因时的p c r 反应体系和反应条件 p c r 产物( 5 0 n g ) p g e m - t 载体( 5 0 n g ) t 4d n a 连接酶1 0 x b u f f e r t 4d n a 连接酶( 1w e i s su n i t l a l ) i 0u l 1 0 a l 1 0 “l 1 0 9 l 加d d h 2 0 至 连接条件：1 4 1 6 连接过夜 1 0 0u l 图3 p c r 产物与p g e m t 栽体连接体系及条件 7 墨兰圭竺璺主堂竺竺苎上生二! 竺 测序反应体系 商品化m i x t u r e 引物 质粒p c r 产物 40u l 6 p m o l 2 0 0 4 0n g 加d d h 2 0 至 1 0g l 反应条件： 9 4 c 1 0s e c _ 5 0 x 5s e c _ 6 0 c 4m i n l ji 1一，。一 2 5c y c l e s 产物纯化：乙醇沉淀法，具体操作如下：1 0 t l 反应产物十8p l 水+ 3 2 “l 无水乙醇， 室温放置0 5h ，1 5k2 0 r a i n 离m ，弃上清，加7 0 乙醇2 0 0 “】洗涤，1 5k2 0 r a i n 离o ，弃上清，自然晾干，溶于2 - 4g l 上样b u f f e r 中，取2 “l 电泳测序 测序胶：长3 6c m 电泳板，胶浓度为4 7 5 ，交联度为1 9 ：1 ( 丙烯酰胺：n ，n - 亚甲双雨 烯酰胺) ，含6 m 尿素 电泳： 1h 左右出峰，收集9h ，计算机自动采集 图4 测序反应的体系、条件和方法 3 小鼠r n a 的抽提和n o r t h e r n 印迹膜的制备 ( 1 ) 小鼠总r n a 的抽提 参见公司提供的操作手册。 ( 2 ) 甲醛凝胶r n a 电泳 制备凝胶：将1 2 3m o l l 甲醛溶液、琼脂糖水溶液和5 甲醛凝胶缓冲液 按1 ：3 5 ：1 1 比例混合，通风橱内制胶。 按下列样品混合，制备上样液 总r n a ( 3 0 g ) 4 5p 1 5 甲醛凝胶缓冲液2 0g l 甲醛3 5 “l 甲酰胺1 0 0g l 甲醛凝胶加样缓冲液2 0u 1 总体积2 0 0g l 上样，将凝胶置于1 甲醛凝胶缓冲浪( 电压3 - 4v c m ) ，电泳1 2h 。 ( 3 ) 总r n a 转移至尼龙膜 将凝胶用d e p c 水淋洗几次除去甲醛，用7 5m mn a o h 溶液浸泡凝胶 i 旦大学硕士学位论文 摹一部分 1 5 2 0m i n ，再用d e p c 水淋洗凝胶，并用2 0 x s s c 浸泡凝胶4 5m i n ；在凝胶上放 置用2 0 x s s c 处理过的尼龙膜，转移r n a2 4 4 8 h 。尼龙膜用2 x s s c 、0 1 s d s 溶液淋洗片刻，室温晾干：短波长紫外照射1 0 1 5s e c 以交联r n a 于膜上。将尼 龙膜在8 0o c 固定2h ，待用。 4 组织表达谱分析 f 1 ) 杂交探针的制备及纯化： 以克隆到的c d n a 片段为模板，用c t a 2 p d a t p ，通过随机引物标记法标记 目的c d n a 片段作为探针( 标记体系见图5 ) ，水浴3 7 c 标记好后，用新华滤 纸，通过纸层析，检测标记率，标记率 6 5 视为可用，经s e p h a d e x g 5 0 柱纯化 收集第一峰，变性后置冰上待用 ( 2 ) n o r t h e r n 印迹杂交 将人体1 6 种组织的m r n an o r t h e r n 印迹膜或制备的小鼠1 0 种组织m r n a 印迹膜用0 5 s d s 烫洗后，放入含有1 0 0p , g m l 变性小牛胸腺d n a 的n o r t h e m 预杂交液的杂交管内，杂交炉中4 2 c 滚动预杂交1 6 2 4 小时。将变性待用的标记 探针加入杂交管内，4 2 c 滚动杂交1 6 2 4 小时。然后洗膜压片及放射自显影一星 期。 d n a 模板( 5 0 n 咖1 ) 5 b u f f e r ( i n c l u d i n gp r i m e r ) d c t p ( 2m m ) d t t p ( 2m m ) d g t p ( 2m m ) n 3 2 p d a t p ( 3 0 0 0 m c i m m o d k l e n o w 酶 l i t l 1 0u 1 2p 1 2 i , t 1 2u i 5u 1 1u l 加d d h 2 0 至 5 0u l 图5 随机引物标记法标记的p c r