（遗传学专业论文）高转化率酵母的筛选、鉴定及培养条件的优化研究.pdf

， 摘要 本文从1 4 个酵母菌株中筛选出一株具有潜在工业应用价值的菌株1 2 y 一5 。 经较为深入的形态特征及1 2 项生理生化特性的检测，以n j w k r e g e rv a n r i j 2 4 和j a b a r n e t t “”等的酵母分类系统为依据进行了分类鉴定。进而用币交 试验法对该酵母生长的培养基配方及影响生长的重要理化因素进行了较为深入 的研究，在此基础上对影响生长的重要理化因素进行了宽范围的测验；并以摇 瓶最佳的培养条件为基础，在3 7 升k f l 一生物反应器上进行了放大试验。得到 如下结果： 1 认为该菌株可能是丝孢酵母属( t r i c h o s p o r o n ) 一新种。 2 该菌株以生物量为考核指标的摇瓶适宜培养基为：葡萄糖4 、蛋白胨 2 、酵母膏1 ；适宜的生长温度为3 0 。c 、p h 5 56 0 、溶氧为5 0 0 m 1 三角瓶装 液量4 0 m l ( 摇床偏心距1 5 c m 、1 5 0r m i n ) 、培养时间4 0 小时，生物量2 9 3 m g m l 、 转化率o 7 4 7 ( 克细胞克可利用糖) o 3 以还原糖5 1 的玉米糖化液为培养基，3 7 升k f l 一生物反应器放大试 验，接种量2 0 、培养周期2 0 小时，成熟酵母醪生物量达4 2 9 m g m ，转化率达 0 7 4 0 ( 克细胞克可利用糖) 。 根据实验结果，就一系列理化因子对该酵母生长速率和可发酵性糖转化为 细胞量的转化率影响规律进行了分析探讨，提出了该酵母在可能的工业化应用 、 时的适用培养基配方和工艺技术参数。卜7 一一 关键词丝孢酵母菌株鉴定生物量转化率 a b s t r a c t i nt h e p r e s e n tw o r k ，t h es t r a i n1 2 y - 5 t h a ts h o u l db eo fu s ef o r p r o d u c t i o n o fs i n g l ec e l l p r o t i e nw a ss e l e c t e df r o m1 4s t r a i n s o fy e a s t i s o l a t e s t h em o r p h o l o g i c a la n dp h y s i o l o g i c a ld e s c r i p t i o no ft h es t a i n 1 2 y 一5w a sp r e s e n t e d t h ey e a s ts t r a i n1 2 y - 5w a si d e n t i f i e da tt h es p e c i e s l e v e lu s i n gt w oy e a s tt a x o n o m ys y s t e m sp u b l i s h e db y j w k r e g e r - v a n r i j ( 1 9 8 4 ) i a n dj a b a r n e t t ( 1 9 8 3 ) i n a d d i t i o n t h e a b i l i t y t o a s s i m i l a t es e v e r a lc o m p o u n d sa sm a i ns o u r c e so fc a r b o na n dn i t r o g e n w a se v a l u a t e da tt h e5 0 0 m ls h a k e - f l a s ka n d3 7 lk f lb i o r e a c t o rs c a l e s e f f e c t so f p h ，t e m p e r a t u r e ，c o n c e n t r a t i o n o fd i s s o l v e d o x y g e n a n d u t i l i z a b l es u g a ro nt h eg r o w t hr a t eo fc e l l sa n dt h er a t eo ft h ec o n v e r s i o n o fs u b s t r a t ei n t ob i o m a s sw e r es t u d i e d t h er e s u l t sw e r ea sf o i l o w s ： 1 t h e y e a s t s t r a i n1 2 y - 5 ，b a s e do nc a r e f u lc o m p a r i s o nw i t hk n o w n y e a s t s t r a i n s ，w a sp r i m a r i l y i d e n t i f i e da st h et r i c h o s p o r o ns p n o v 2 t h es u i t a b l eg r o w t hc o n d i t i o n sw i t hah i g hb i o m a s sw e r ef o u n dt ob e a t3 0 c ，p h 5 5 6 0 ，i n4 0 m lo fm e d i u mo f4 g l u c o s e ，2 p e p t o n e ， 1 y e a s te x t r a c tm i x t u r ei n 5 0 0 m ls h a k e f l a s k ，1 5 0r m i n ( s h a k i n g t a b l 0 t h eb i o m a s sa n dt h er a t e o fc o n v e r s i o nw e r e2 9 3 r a g ( d r i e d c e i l s m 1 ) a n d0 7 4 7 ( g r a m d r i e d c e l l s g r a m u t i l i z a b l e s u g a r ) a t s h a k e - f l a s ks c a l ea b o v ef o r4 0 h ，a n d4 2 9 r a g ( d r i e dc e l l s m 1 ) a n d 0 7 4 0 ( g r a m d r i e d c e l l s g r a m u t i l i z a b l e s u g a r ) , r e s p e c t i v e l y ，i n 3 7 l k f lb i o r e a c t o rc o n t a i n e d5 1 u t i l i z a b l eh y d r o l y z e ds u g a ro fm a i z e f o r2 0h 3 o u rr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ey e a s ts t r a i n1 2 y - 5s h o u l db eap o t e n t i a l y e a s t s t r a i np r o d u c i n gt h es i n g l ec e l lp r o t e i n k e yw o r d s ：t r i c h i s p o r o n i d e n t i f i c a t i o no fs t r a i nb i o m a s s r a t eo f c o n v e r s i o n 3 材料和方法 1 菌株： 本实验采用的酵母菌株为t y - l 、8 y 一2 、h y l 、t y2 0 0 9 、2 0 0 2 d y 、2 0 0 3 d y 、 t z y 2 0 0 6 、1 2 y 一5 、11 y 一1 、f y 、a y 、h y 、p y 、m y ( 均系本实验室保存菌株) 。 2 培养基 2 1 y e p d 培养基 y e p d ，液体培养基：酵母浸膏1 ，蛋白胨2 ，葡萄糖2 ，自然p h 。 y e p d z 液体培养基：酵母浸膏1 ，蛋白胨2 ，葡萄糖4 ，自然p i 。 y e p d 液体培养基：酵母浸膏0 5 ，蛋白胨1 ，葡萄糖2 ，自然p l 以上三种培养基加2 琼脂即为固体培养基 2 ，2 麦芽汁液体培养基“” 将麦芽汁调至1 0 波林的糖度，p h 至5 4 ；过滤后分装试管，每管4 m l ；8 磅2 0 分钟灭菌。加2 琼脂即为固体培养基。 2 3 m c c l a r y 培养基“” 葡萄糖0 1 ，k c l o 1 8 ，酵母汁0 2 5 ，醋酸钠0 8 2 ，琼脂2 ，用蒸馏水 配，装管。8 磅1 5 分钟灭菌；搁置斜面。 2 4 k l e y n 培养基n 8 3 k 也p 0 t0 0 1 2 ，k z h p o t0 0 2 ，醋酸钠o 5 ，葡萄糖0 0 6 2 ，n a c l 0 0 6 2 ， 蛋白胨0 2 5 ，水洗琼脂2 ，生物素2 0 微克，每l o o m l 加混合盐类l m l ，蒸馏 水配，p h 6 9 7 1 ；装管；8 磅2 0 分钟灭菌，搁置斜面。 混合盐溶液：m g s o 。7 h ：00 4 ，n a c l0 4 ，c u s o 。5 h 。00 0 0 2 。 m n s o 。4 h 。00 2 ，f es o ；4 h ：00 2 ，用蒸馏水配。 2 5 g o r o d k o w a 培养基“” 葡萄糖0 1 ，蛋白胨1 ，n a c l1 2 ，水洗琼脂2 ，蒸馏水配，装 管；8 磅2 0 分钟灭菌；搁置斜面。 2 6 马铃薯块培养基“” 将马铃薯去皮，切成长条斜面：装入试管( 在试管底部预先垫上一小 团湿棉球) ；8 磅灭菌3 0 分钟。 2 7 马铃薯葡萄糖琼脂培养基“8 1 去皮马铃薯2 0 0 克，葡萄糖2 0 克，琼脂2 0 克，自来水1 升。将马铃 薯沈净，去皮，切成小块，立即放入水中，以免被氧化。煮沸3 0 分钟， 经纱斫j 过滤，滤液加水至i 升，加入葡萄糖干琼脂，熔解后分装三角瓶或 试符，8 磅2 0 分钟灭菌。 2 8 糖发酵基础培养基“8 1 1 2 5 豆芽汁：黄豆芽1 2 5 克加水1 升，煮沸半小时，过滤后补足水 至1 升。8 磅3 0 分钟灭菌备用。 2 9 同化碳源基础培养基n 8 1 ( n h 。) 。s 0 40 5 ，k h 。p 吼0 1 ，m g s o 。7 h ：00 0 5 ，酵母膏0 0 2 ， 水洗琼脂2 ，用蒸馏水配，熔化后过滤，装大试管，每管约装2 0 m 1 ，8 磅2 0 分钟灭菌备用。 2 1 0 同化乙醇基础培养基m 3 ( n h 。) 。s 0 40 1 ，k h 。p o 。0 1 ，m g s o 。7 h 。00 0 5 ，酵母膏0 0 1 ， 用蒸馏水配，过滤后每管定量装5 m l ，8 磅1 5 分钟灭菌，使用时加3 l 醇( 用9 9 乙醇0 1 5 m 1 ) 。 2 1 1 同化氮源基础培养基“8 3 葡萄糖2 ，k h ：p o 。0 1 ，m g s o ；7 h 。00 0 5 ，酵母膏0 0 2 ，水洗琼 脂2 ，用蒸馏水配，过滤后装大试管，每管2 0 m ，8 磅1 5 分钟灭菌。 2 1 2 产生类淀粉化合物培养基“” ( n h 。) 。s o ，0 1 ，k h ：p o 。0 1 ，m g s o 7 h ：00 0 5 ，葡萄糖1 ，水 洗琼脂2 5 ，用蒸馏水配，p h 4 5 ，分装小试管，8 磅2 0 分钟灭菌，搁置斜 面。 2 1 3 产酯培养基“” 葡萄糖5 ，用1 0 豆芽汁配制，分装于5 0 m 1 三角烧瓶中，每瓶2 0 m l 8 磅2 0 分钊，灭菌。 2 14 无维生素基础培养基“” ( n h 。) ：s o 。0 5 ，k i t ：p o 0 1 ，m g s o 。7 h ? 00 0 5 ，c a c l ：2 t l z 00 0 1 ， n a c l0 0 1 ，葡萄糖2 ，加蒸馏水l o o m l ，分装试管，每管5 m 1 ，8 磅2 0 灭菌分钟。 2 1 5 尿素分解测定培养基“ 蛋白胨0 1 克，n a c l0 5 克，k h 。p o ；0 2 克，加0 0 0 1 2 克酚红于 l o o m l 蒸馏水中，调节p h 6 8 ，加琼脂2 克，分装试管，每管装2 7 m l ， 灭菌后，再每管加入0 3 m l 经过滤灭菌的2 0 尿素溶液，混合后搁置斜面。 2 1 6 高渗透压培养基n 8 1 称取5 0 克和6 0 克葡萄糖，分别加入5 0 m 1 和4 0 m l 于1 的酵母膏溶 液中，加3 的琼脂熔化后，分装试管，每管3 - 5 m l ，灭菌后搁置斜面， 即为5 0 9 1 0 t f l l6 0 葡萄糖酵母膏琼脂。 2 17 无机盐葡萄糖培养液“” ( n i l ) zs o t 0 5 ，k h z p 0 1 0 1 ，m g s o 。7 h 。00 0 5 ，豆芽汁( 2 0 ) 0 5 9 o 葡萄糖1 j ，蒸馏水配制。 2 1 8 明胶培养基“” 麦芽汁1 0 0 0 m l ，加明胶1 2 0 克，加温使其溶解，分装试管，l o 磅灭菌 1 5 分钟，凝固后备用。 2 1 9 废糖蜜培养基 ( n h ，) ：s o 。0 5 2 9 ，比p o 。0 0 7 6 ，m g s o 7 h 。00 0 3 9 ，以处理过的废 糖蜜配制成含糖4 ( 。b x ) 的培养基。 废糖蜜预处理：原糖蜜加水稀释两倍，煮沸2 0 分钟，瓶口用8 层纱们溢 住，静置冷却过夜，次同取上清液( 弃沉淀) 用于配制发酵培养基。 2 2 0 葡萄糖合成培养基( 碳源测试) 葡萄糖4 ，( n h 。) ：s o ，0 7 8 ，k h ：p o 。0 1 5 ，m g s o 7 h 。00 0 5 3 ，p 1 6 0 。 2 2 1 氮源测试基础培养基 k h 。p o 。0 15 ，m g s o 。7 h ：00 0 5 3 ，葡萄糖4 ，p h 6 0 。 2 2 2 玉米糖化醪培养基 糖化醪的制备：将玉米( 产于内蒙古) 粉碎成玉米粉，以玉米粉：水 = l ：4 的比例配制玉米粉水混合液，混匀后静置3 0 分钟。以玉米粉含淀粉 7 0 计加淀粉酶l o u g 淀粉，升温至9 0 。c ，保温3 0 分钟，取出，待温度 降至5 5 5 8 时，加入糖化酶适量，保温糖化1 8 小时。取糖化上清液即 0 为糖化醪，测其糖度和还原糖含量。 配方：( n h ，) 。s o 。0 7 8 ，k h ，p 0 。0 1 5 ，m g s 0 。7 h 。00 0 5 3 ，酵母粉 0 5 ，用糖化醪配成还原糖5 1 ，总糖5 8 ，p h 6 0 。 3 方法和步骤 3 1 菌种筛选( 初筛和复筛) 本实验对14 个酵母菌株经y e p d ，平板培养( 3 0 。c 、2 4 h r ) ，观察菌落 大小和生长速度，然后选择生长较快、菌落较大、菌落突起明显的菌株 作为下一步试验菌株。 对仞筛选出的菌株进行三角烧瓶振荡培养，再从中选育出高转化率 菌株。具体方法：将斜面菌种分别移种两环到装有1 0 m y e p d ：培养液的试 管t p ，3 0 培养2 4 h r ，再将试管巾的全部培养液各自接种至装有 0 0 i n y f ) ，j 养液的5 0 0 m l 二二巾胍t h 振荡培养( 3 0 。c 、1 5 0 r m in ) ，通 、f 观察形念变化，母隔1 2 h r 采川t - n 法( 1 跌样1 5 】n 高心，沈涤两；，：， 在8 5 。c 卜- 烘干4 8 小时称重) 进行一次生长与生物量测定，记录实验结果。 3 2 酵母菌1 2 y - 5 的分类鉴定 3 2 1 细胞形态学观察“” 取酵母菌1 2 y 一5 移种于麦芽汁液体培养基中，2 5 2 8 。c 下培养3 天后 观察结果。 3 2 2 培养特征“” 取培养酵母菌1 2 y 一5 ，移种于麦芽汁液体培养基中和固体斜面上， 2 5 2 8 。c 下培养3 天后观察结果。 3 2 3 子囊孢子的形成1 取酵母菌1 2 y 5 用麦芽汁琼脂斜面移接2 3 代，再以生长旺盛的培养 物移种至m c c a r y 培养基、k le y n 培养基、g o r o d k o w a 培养基和马铃薯块 斜面，2 5 2 8 。c 下培养3 - 5 天后开始涂片观察。 3 2 4 假菌丝的形成和形态“” 取平底培养皿，倒一薄层马铃薯琼脂培养基，凝固后倒置数小时， 使表面稍干，用新培养的酵母菌1 2 y 一5 划线接种2 3 条，在其上盖上灭 菌盖片( 盖片可用7 5 7 , 醇浸泡后，火焰烧去乙醇，待盖片冷却后盖上) ， 2 5 。2 8 。c 下培养3 5 天后，用低倍显微镜观察盖片下划线两旁是否形成假 丝及其类型。 3 2 5 掷孢子的形成和形态“” 测定镜像的形成，将酵母1 2 y 一5 接种j 发岿：汁川体剩i 利i - 皈， 2 j 2 8 倒咒培养3 7 灭肝，观察刹丽4 f | 刘f ( j 试管壁和l l l l , 。川：址丫ij 肜成f 【 菌落形状相同之镜像，如能形成，则观察掷孢子的形状和大小。 3 2 6 尿素分解试验“” 取新培养的酵母菌1 2 y 一5 ，接种于作水解尿素试验的琼脂斜面上， 2 5 2 8 。c 培养，每天观察结果。5 7 天后，如琼脂斜面上呈现淡红色，则 此酵母能分解尿素。 3 2 7i ) b b 测试m 1 在y e p d ，固体斜面上培养至少1 0 天的酵母菌1 2 y 5 培养物，在5 5 0 下处理几小时，然后用冰预冷的d b b 试剂淹没，如果培养物在2 分钟之 内( 室温下) 变成暗红色，那么结果为“+ ”。 d b b 试剂必须保存在冰浴条件下，在变色之前的几分钟之内使用。试 剂配制：将固蓝b 盐溶解在冰浴的0 1 m t r i s h c l 缓冲液中，p h 7 0 ，浓 度为l m g m l 。 3 2 8 发酵糖类“” 取1 2 5 豆芽汁为基础液，分装杜氏管，1 5 磅灭菌1 5 分钟；测试的 糖分别用无菌蒸馏水配成1 0 的溶液，煮沸1 5 分钟，稍冷，用无菌移液 管吸取一定量的糖液分装于杜氏管，使糖浓度达到2 ，棉子糖为4 ；以 新鲜培养的酵母菌1 2 y5 分别接种于发酵管，2 5 2 8 。c 下培养，每天观察 结果。儿能发酵某种糖时，则在小管顶部收集到一定的c o ：。 3 2 9 碳源同化“” 碳源同化的测定，一般采用生氏谱法，具体方法如下： ( 1 ) 菌液制备：挑取新鲜培养的酵母菌1 2 y 一5 一接种环入l m l 无菌 7 l i 坐 l ! i 水t i t ， 皑匀历，：l j 4 成g 日j j 也怂 乎液。 ( 2 ) 浇制，i i i 7 f i r 扳：j o j ：衍f 装f 2 0 i n l 尤碳澌! | ，| 1i 。i f i lt lj i 莽j 。! ，熔化 后冷至4 56 ( 7 左右，再将l m l 的菌液全部倒入无碳原的基础培养丛试管一f ， 充分摇匀，倾碟，凝固后2 8 。c 下倒置几小时，使表面稍干，在平皿的底 部标上碳源名称的标记。为了避免邻近不同碳源的干扰，在不同碳源的 交界区之间，用无菌小钢铲开一狭沟( 平板近中心不丌沟) 。每皿以六种 碳源为宜。 ( 3 ) 点样：用无菌不锈钢匙( 或用无菌牙签) 按标记加碳源少许( 约 米粒大小) ，先正放2 4 小时，然后置2 8 下倒置培养1 2 天，观察结果。 ( 4 ) 测试乙醇同化，在同化乙醇基础培养基中，接入酵母菌1 2 y 一5 少许，2 8 。c 下培养3 7 天后观察。观察时注意生长情况，是否形成醭、 环或岛，并根据混浊情况，判断其生长的强弱。以不加碳源的空白培养 进行对照。 3 2 1 0 氮源同化3 具体方法与同化碳源相同，只是改用无氮源的基础培养基，且以 ( n h 。) ：s o 。和空白作对照。本实验还采用了液体法，在液体无氮源基础 培养基中加入0 7 8 k n 0 。或0 5 9 ( n h 。) ：s o 。作氮源同化测试。 3 2 1 1 产生类淀粉化合物的测试“8 1 在酵母生成类淀粉化合物的斜面培养基上，划线接入新培养的酵母 菌1 2 y 一5 ，2 8 。c 下培养l 2 周后，在表面滴上路哥氏碘液1 2 滴。凡能生 类淀粉化合物的酵母，在菌落周围呈蓝色。 3 2 1 2 产酯测定1 取1 0 豆芽汁配成5 的葡萄糖溶液，接入新培养的酵母菌1 2 y5 ，2 8 下培养3 5 天，用嗅觉判断是否有酯类香气。 3 2 1 3 在无维生素培养基巾的生长试验” 取新培养的酵母菌1 2 y5 接种于无维生素的培养液r h2 8 。c 下培养 l 2 周后，观察生长情况，并以含维生素培养基作对照。如在无维生素培 养基上不生长的酵母，往往还需做需要维生素的测定，一般采用生氏谱 法。 3 2 1 4 耐高渗透压的测试“” 将培养的酵母菌1 2 y 一5 划线接种于含5 0 、6 0 葡萄糖和1 酵母膏溶 液的琼脂培养基上，2 8 ( 2 下培养1 2 周后，观察生长与否。 3 2 1 5 抗放线菌酮测试“” 称取5 m g 、5 0 m g 放线菌酮溶于4 5 m l 蒸馏水中，过滤灭菌，采用无菌 操作吸取此液4 5 m l 入灭菌试管中，并加入0 5 m i 浓缩1 0 倍的无机盐葡 萄糖溶液培养液( 放线菌酮为0 0 1 、0 1 ) ，接入少许新培养的酵母菌 4 1 2 y5 ，2 5 2 8 。cf 振荡培养l 3 周后，观察结果，并以不加放线菌酮的培养 液作对照。 3 2 1 6 在不同温度下的生长测试“” 将新培养的酵母菌1 2 y 一5 划线接种于y e p d ，固体斜面，分别置于2 5 。c 、 3 0 。c 、3 5 。c 、3 7 。c h4 2 。c 下培养3 天，观察生长与否。 3 2 1 7 明胶液化测试“” 以酵母菌1 2 y 一5 穿刺接种于明胶培养基中，2 5 。c 下培养。如酵母对明胶 不起液化作用，则在2 0 。c 以下仍保持固态：如液化则在2 0 1 2 以下不再凝固， l 3 周内测量液层的深度。 3 3 最佳培养基配方的研究 3 3 1 碳源测试 将酵母菌1 2 y 一5 斜面移接5 环于y e p d ：培养液( 5 0 0 m lj 角烧瓶中装液量 l o o m l ) 中，2 8 3 0 。c 下振荡培养( 1 5 0 r m i n ) 1 8 小时，制成种子液。再以1 0 接种量转接于葡萄糖合成培养液和废糖蜜培养液( 5 0 0 m l 三角烧瓶中装液量 l o o m l ) 中，2 8 3 0 下振荡培养( 转速1 7 5 r m i i q ) ，每隔1 2 小时取样测定干 重( 方法同3 1 ) ，记录实验结果。 3 3 2 氮源测试 将酵母菌1 2 y 一5 斜面移接5 环于y e p d 。培养液( 5 0 0 m l 三角烧瓶中装液量 l o o m l ) 中，2 8 3 0 c 下振荡培养( 1 5 0 r m i n ) 1 8 小时，制成种子液。在氮源 测试基础培养基中分别加入( n h 。) 。s o t0 5 3 、尿素0 2 4 、蛋白胨0 3 0 和酵母粉0 4 0 ，配制成测试氮源培养液( 5 0 0 m l 三角烧瓶中装液量l o o m l ) ， 以1 0 的接种量接入上述种子液，2 8 3 0 。c 下振荡培养( 转速t 7 5 r m i n ) ，每隔 2 小时取样测定干重( 同上) ，记录实验结果。 3 3 3 碳源和氮源正交试验”“ 按l 。( 3 ) 进行证交表设计，选择葡萄糖和废糖蜜作为碳源，酵母粉和 尿素作为氮源进行4 因子3 水平乖交试验，记录实验结果。 3 3 4 最适培养条件正交试验 按l 。( 3 。) 正交表进行p h 值、温度、溶氧和糖浓度4 因子3 水平正交试 验，记录实验结果。 3 4 不同p h 值、温度、溶氧和糖浓度对1 2 y 一5 生长的影响 3 4 1 不同起始p h 值对酵母菌1 2 y - 5 生长代谢及生物量的影响 将酵母菌1 2 y 一5 斜面移接5 环于y e p d 。培养液( 5 0 0 m l 三角烧瓶r l 装液量 1 0 0 m 1 ) 中，2 8 3 0 下振荡培养( 1 5 0 r m i n ) 1 8 小时制成一级种子液。再 将一级种子液以1 0 的接种量转接于y e p d 。培养液( 5 0 0 m l 三角烧瓶中装液量 1 0 0 m 1 ) 中，2 8 3 0 下振荡培养( 1 5 0 r m i n ) 1 8 小时，制成种子液。将y e p d 培养液的p h 值分别调至4 5 、5 0 、5 5 、6 0 、6 5 和7 0 ( 用p h 计测定) ， 各装量l o o m l 于5 0 0 m l 三角烧瓶中，共配制1 2 瓶( 每个样品重复一次) ，接 种量l o ，振荡培养( 3 0 、1 5 0 r m i n ) 。每隔2 4 小时测定p h ( 用p h 计测定) 、 还原糖”“( 参照工业发酵分析1 9 8 3 ) 和干重( 同上) 变化，根据结果选择适 宜起始p h 值。 3 4 2 不同温度对酵母菌1 2 y 一5 生长代谢及生物量的影响 种子液获得同( 3 4 1 ) 。将y e p d 培养液的p h 值调至6 0 ，装液量1 0 0 m l 于5 0 0 m l 三角烧瓶中，共配制1 0 瓶( 每个样品重复一次) ，接种量1 0 ，分 别置于五个不同温度( 2 7 、3 0 、3 3 、3 6 和3 9 ) f 振荡培养 ( 1 5 0 r m i n ) ，侮隔1 2 小时测定p h ( 刷t ) 、还原糖( 同上) 和干重( 同上) 变化，根据结果选择适宜生长温度。 3 4 3 不同溶氧对酵母菌1 2 y 一5 生长代谢及生物量的影响 将酵母菌1 2 y 一5 斜面移接5 坏于y e p d ! 培养液( 5 0 0 m l 三角烧瓶中装液量 l o o m l ) 中，2 8 3 0 下振荡培养( 1 5 0 r m i n ) 1 8 小时，制成种子液。将y e p d ： 培养液以不同的装液量( 4 0 m l ，7 0 m l ，1 0 0 m l ，1 3 0 m l ，1 6 0 m 1 ) 装入5 0 0 m 三角瓶中，共配制1 2 瓶( 每个样品重复一次) ，接种量1 0 ，振荡培养( 3 0 、1 5 0 r m i l 3 ) ，每隔2 4 小时测一次干重( 同上) ，根据结果选择适宜通气量。 3 4 4 不同糖浓度对酵母菌1 2 y 一5 生长代谢及生物量的影响 种子液获得同( 3 4 1 ) 。将y e p d ，培养液中的葡萄糖浓度分别以2 、4 、 6 、8 7 0 、1 0 和1 2 取代，各以装液量1 0 0 m l 装入5 0 0 m l 三角烧瓶中，共配制 1 2 瓶( 每个样品重复一次) ，接种量1 0 ，振荡培养( 3 0 。c 、1 5 0 r m i n ) ，每 隔1 2 小时测定p t 值( 同上) 、还原糖( 同上) 和干重( 同上) 变化，根据结 果选择适宜糖浓度。 3 5 生长曲线的测定及其在玉米糖化醪上的应用 3 5 1 以最佳培养基配方，测定酵母菌1 2 y 一5 的生长曲线 具体方法：配制y e p d ：培养液，p h 值调至6 0 ，装量4 0 m l ( 5 0 0 m 1 的三角 烧瓶) ，共配制3 8 瓶，接种量1 0 ( 种子液同3 4 1 ) ，振荡培养( 3 0 。c 、 1 5 0 r m i n ) 。每隔2 小时测定p h 值( 同上) 、还原糖( 同上) 和干重( 同上) 的变化( 每瓶取样两次，以消除因多次取样而使培养液量减少形成的误差) ， 记录实验结果。 3 5 2以玉米糖化醪培养液上发酵罐扩大培养 发酵罐参数：p h 值6 0 、温度3 0 。c 、溶氧1 0 0 5 0 、搅拌速度7 0 0 r m i n ； 每隔1 小时耿样进行显微摄影，连续观察细胞形忿的变化；每隔2 小时取样 测定还原糖( 同上) 和干重( 取1 0 m l 样品离心，洗涤两次，1 0 5 。c 真空于燥2 小时) 的变化，记录实验结果。 结果与讨论 1 菌种筛选( 初筛与复筛) 本研究以筛选高转化率高生物量的酵母优良菌株为目标，从1 4 株出 发菌株中通过平板培养观察菌落的大小和生长速度，初步选出4 株生长 良好的酵母菌株：1 2 y 一5 ，2 0 0 3 d y ，a y ，h y 。并对初筛选出的4 个菌株 进行了生长速度和生物量的测定。而其中1 2 y 5 细胞形态大，生长速度 更快。结果见表1 1 和图l 一1 。 表l 一14 个酵母菌株生长速度和生物量测定结果 、问( h r j + 7 2 d , 1 1 寸_ 后 藉遨愁 01 22 43 64 86 07 2转化率 ( g 细胞，卫糖1 1 2 y 一5 o 0 536 01 16 01 53 51 9 4 02 00 02 3 o o 05 7 5 2 0 0 3 d y0 2 5 39 069 5 82 5 99 01 10 01 57 5 o3 9 4 埘 0 、5 054 089 0l o 8 51 3 8 01 5 2 01 4g u 0 7 h yn1 550 58r on 听i f ni f1 5l7 0 nl “n + 转化率：每克糖产生的细胞克数。 图1 14 酵母菌株生长与生物量曲线 由表1 i 和图1 一l 中可以看出，酵母菌1 2 y 一5 的生长速度与生物量显著优 于其它三个菌株，菌体得率最高，7 2 小时发酵醪生物量为2 3 m g m l ，转化率 高达5 7 5 ，这表明酵母菌1 2 y 一5 具有良好的快速生长性能。故认为有必要 对酵母菌1 2 y 一5 作进一步的分类鉴定、培养基配方及培养条件的研究，以进 一步揭示该菌株的生物学基本特性，为根据实验目的筛选酵母培养的最佳配 方与工艺参数提供设计依据，为今后实际应用奠定基础。 2 1 2 y 5 的生物学特性研究与分类鉴定 为了进一步了解酵母菌1 2 y 一5 的生物学特性及其在分类上的地位，根据 n j w k r e g e r v a nr i j ( 1 9 8 4 ) 等酵母分类系统，对其个体、群体形态特征和 相关生理生化特性进行了较为系统的研究。 2 1 细胞形态1 2 5 j1 2 6 l 经麦芽汁液体培养基培养3 天后观察，酵母菌1 2 y 一5 细胞呈卵圆形至圆 柱形，极少球形，单个或成对出现。可见假菌丝、有隔菌丝和不同长度的节 孢子。无性繁殖主要为芽殖( 一端芽殖、两端芽殖和多边芽殖) 。液体培养假 菌丝少于固体培养，细胞群体中以卵圆形、圆柱形细胞为主。见图2 - 1 、2 - 2 、 2 3 、2 4 、2 5 、2 6 。 幽2 - i 培养3 小时钏胞形态 图2 - 2 培养5 小时细胞形态图2 - 3 培养8 小时细胞形态 图2 - 4 培养1 0 小时自胞形态图2 - 5 培养1 l 小时细胞形态图2 - 6 培养1 7 小时细胞形态 2 2 培养特征( 群体形态) 酵母菌1 2 y 一5 在麦芽汁固体培养基中培养3 天后菌落呈乳白色，腊质，表 面褶皱，边缘不整齐。 液体静置培养不发酵，培养液清，表面形成醭和环，试管底部沉淀较紧密， 但j ，c 淀量比较少，表时】酵母菌1 2 y 5 的生长需要充足的氧气。 2 3 孢子生成测验结果 在所试4 种产孢培养基上均不能形成子囊孢子，可见酵母菌1 2 y 一5 无有 性生殖，属于无孢子酵母类；经掷孢子生成测验，无镜影形成，说明其也不 产掷孢子。 2 4 假菌丝形成观察结果 恻2 7 似丝形态 幽2 - 8 似丝形态幽2 - 9 假丝形态 存i 铃薯琼脂培养基中培养3 天后观察，假菌丝形成明显，似藕节状排 列，具分枝，莹树状。形态见图2 7 、2 - 8 、2 - 9 、2 - 1 0 、2 - 11 、2 - 1 2 。 h2 - 1 0 “丝形态 h2 - 1 l 似丝形态 2 5 发酵糖类结果 孵博简1 2 y 一5 化被测的葡萄觏k 乳精、卜乳糖、麦芽糖、蔗柳 、棉f 概、 纤维：桃和菊桃l = i = 氏发酵铝+ - ，发酵培养，小管顶部均不见气体，故不发酵， 属j ：小发酵：| i l i i 类的酵母。 2 6 碳源和氮源同化结果 本实验对酵母菌1 2 y 一5 进行了2 5 种碳源和4 种氮源同化测试，结果见表2 1 。 表2 一l碳源和氮源同化结果 川t 同同同同同 碳源躬称碳源名称 碳源名称碳源名称碳源名称氮源名称 化化 化化化化 、r 乳糖鼠李糖水杨廿=甘油肌醇 硫酸铵 山梨糖蔗糖乳糖 核糖醇d l 一乳酸硝酸钾 d 小糖麦芽糖棉f 糖山梨醇 柠檬酸弧硝酸钠 l 5 口拉f f i 精海藻糖菊糖什露醇甲醇l 一赖氨酸 d 阿拉伯糌纤维：糖淀粉j 矛醇乙醇 + ：同化：“ ”表示能同化此碳源，反之! j ! | j 为“一”。 2 7 其余生理生化测试结果 本实验对酵母菌1 2 y 一5 进行了鉴定待测的多项生理生化测试，结果如表 2 2 。根据表2 一l 和表2 2 的试验结果，对酵母菌1 2 y 一5 进行酵母分属检索【2 3 l ， 结果初步将它归在假丝酵母属r ”斫比) 和丝孢酵母属( t r i c h o s p o r o n ) 范围内。 在参考了中外酵母分类系统1 1 1 8 1 9 、2 32 4 1 的基础上，根据已检测揭示的酵母菌 1 2 y 一5 的形态和生理生化特征，与假丝酵母属( c a n d i d a ) 1 9 6 个种中的相近种 和丝孢酵母属( t r i c h o s p o r o n ) 2 0 个种的主要特征进行了系统地比较( 见表 2 3 、2 - 4 ) ，酵母菌1 2 y 一5 属于丝孢酵母属( t r i c h o s p o r o n ) 的成员。 表2 - 2 生理生化测试结果 测试项目结果 * d b b 试验 尿素分解试验 产生类淀粉化合物的测定 产酯测定 在无维生素培养基中的生长测试 耐高渗透压的测试5 0 葡萄糖 + w 耐高渗透压的测试6 0 葡萄糖 + w 抗放线菌酮测试0 1 放线菌酮 抗放线菌酮测试0 0 1 放线菌酮 在不同温度下的生长测试2 5 。c 在不同温度下的生长测试3 0 在不同温度下的生长测试3 5 。c 在不同温度下的生长测试3 7 。c 4 - w 在不同温度下的生长测试4 2 明胶液化测试 + ：d b b 试验；监b 盐显色反应，w ：表示弱乍k 。 并且根据1 2 y 一5 的几项( d b b 试验、尿素分解测试、在3 7 。c 下生长测试、 在无维生素培养基中的生长试验、硝酸赫同化和柠檬酸同化等) 上述两个属 的酵母菌种中尚未报道的特性，可以认为1 2 y 一5 可能是该属的一个新种。 表2 - 3 酵母菌1 2 y 一5 与假丝酵母属的特征比较 菌种+列化 d b bu r3 7 v f r e o 编号 n 0 3a rm a l am ec exe rr i bic l l 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 + ws 1 1 1 2+ so r 1 3 1 4 l5 1 6 1 7 g 1 9 2 0 2 1 1 2 y 5 生采培养壮中的生k 试验，n o ，= 硝酸枯，a r = 熊果甘，m a = 麦芽糖，l a = 乳糖，m e = 蜜糖，c e = 纤维 一糖，x = d 小糖，e r = 赤藓糖醇。r i b = 核糖时，l 二叭酊，c i = 柠檬眩。v ：表，i 口r 蹙反 j ，s ：表小悭j 五 心，w ：表_ i 弱反成 + ：菌种编号：引自nj w k r e g e r v a nr i j ( 1 9 8 4 ) 中假丝酵母属( c a n d i d a ) 。i ：c a m y l o l e n t a ， 2 ：ca n t a r c t i c a ，3 ：ca q u a t i c a 4 ：ca u r i c u l a r i a e ，5 ：cb a c a r u m ，6 ：cb 0 9 0 r t e n s l s ，7 ：cc u r i o s a 8 ：cc u r v a t a 9 i c d i f e l u e n s ，1 0 ：c f o l i o r u m ，1 i ：c f r a g a r i o r u m ，1 2 ：c g r a m i n i s ，1 3 ：ch u m i c o l a ，1 4 ：c 砂i o p h i l a ，1 5 ：c i n g e n i o s t l ，1 6 ：c j a v a n i c a ，1 7 ：c m a r i n a ，i8 ：co l u s c o n d m ，1 9 ：c p h i l y l a ，2 0 ：c p u s t u l a ，2 1c t s u k u b a e n s i a 表2 - 4 酵母菌1 2 y 一5 与丝孢酵母属各种的特征比较 同化 种名 d b bu rf3 7 n 0 3m a l a m e c e x e rr mii nc 1 t ra c u l e a t u m+ ( w ) t rr e t t n i c t m j t rm d i b i o s a c e u m 一+ i - t rv a r i a b i l e t rc a p i t a t u m t rf e r m e n t a n s t re r i e n s e + w s j _ i ，1 山，c + 、，、，一 t ra q u a t i l e t rb r a s s i c a e t rc u t a n e u m + ( 一) + ( 一) t r f i g u e i r a e t r i n k i n t r p p u l l u l a n s + w t rb e e m e r i d t rb e i g e l i i + d+ d t rd u i c i t u m + d一d+ d t rl u t e t i a ed t ri o u b i e r i d 1 2 y 5 酵母 l a = 乳糖，m e = 蜜二糖，c f 纤维二糖，x = d 木糖，e r = 赤藓糖醇，r i b = 核糖醇，卜肌醉，i n = 菊糖， c l - 柠檬酸，3 t c = 在3 7 c 下作生长温度测试。v ：表示可变反应，s ：表示慢反戍，w ：表示弱 反应，d ：表示延迟反应。 3 适宜的培养基配方的研究结果 从对该菌株鉴定结果可知，酵母菌1 2 y 一5 可利用的碳氮源种类多， 表现了其对代谢底物广泛的适应性。从应用研究方面考虑，我们首选了 易得价廉的碳氮源种类，并对其适宜的配比与其它影响生长的理化条件 进行了研究。 3 1 碳源测试 用废糖蜜培养基和葡萄糖合成培养基对1 2 y 一5 进行碳源测试，结果 见图3 1 。 1 20 0 1 00 0 80 0 一 暑 詈60 0 c = 三2 _ 一 0 0 20 0 o0 0 01 22 43 6d 86 07 2 时问( h r ) 图3 1 不同碳源下生长与生物量变化 从图3 1 可以看出，在以废糖蜜为碳源的半合成培养基和葡萄糖为碳 源的合成培养基中进行培养比较，前者利于酵母菌1 2 y 一5 的生长。这可 能是由于废糖蜜培养基中除糖外还含有某些利于酵母生长的调节因子， 成分比较复杂，而合成培养基中除葡萄糖外，其余只是一些无机盐类， 缺乏维生素等生长调节因子所至。同时也可见该酵母生长的营养要求较 高。 3 2 氮源测试结果 在测试氮源基础培养基中分别加入( n h 4 ) 2 s 0 40 5 3 ，尿素o 2 4 ， 蛋白胨0 3 0 ，酵母粉o 4 0 ，进行氮源测试。从图3 2 可以看出，酵母 菌1 2 y 一5 在以酵母粉( 0 4 ) 作为氮源，生长明显优于其它氮源，这与碳源 测试结果一致，说明此酵母的生长需要一定的生长因子来调节，而这些 因子在天然培养基中含量较丰富。这就提示我们在配制合成培养基时应 添加适量的酵母粉作为生氏调节因子来促进生长，以提高产率。 20 0 00 0 80 0 = 警 o e60 0 40 0 2o o 0 0 0 01 22 43 6