（分析化学专业论文）基于植酸纳米金、纳米金属氧化物的传感界面构筑及其电化学研究.pdf

上海师范大学硕士学位论文 摘要 摘要 随着纳米科技的迅猛发展，其应用也已拓展到了传感器领域。纳米材料具有 比表面积大、稳定性高和生物兼容性好等特点，并且还能在酶的电子转移过程中 体现出其特有的催化效应。植酸是一种环境友好型试剂，每个分子含有6 个非共 平面的磷酸酯键，能与金属纳米粒子或金属氧化物纳米粒子发生强络合作用。这 些新型功能材料作为良好的电子传递媒介在电化学领域中获得了广泛的应用，吸 引了众多科学研究者对其结构、性质和应用进行了深入的探索。 生物传感器在卫生安全检测、环境监测和临床医学等领域具有十分广阔的应 用前景。而如何实现生物分子在转换器上固定化，同时又稳定地保持其生物活性 则是构建生物传感器中最为关键的技术。本研究论文旨在针对这一问题，结合纳 米科技和自组装技术等手段，借助纳米功能材料在电极表面构筑电化学传感界 面，具体发展了如下4 种过氧化氢生物传感器： ( 1 ) 本章节介绍了一种简单有效的过氧化氢( h 2 0 2 ) 生物传感器制备方法。 通过自组装技术，血红蛋白( h b ) 被成功地固定到了由金纳米粒子( a 心呼s ) 植 酸( p a ) 纳米复合链修饰的玻碳电极上。用紫外可见吸收光谱进行表征，结合循 环伏安测试的结果表明：a 心咿s 发挥了自身优秀的生物相容性和电子传递性的 特点，吸附在该纳米链上的h b 保持了良好的生物活性，并实现了直接电子转移。 进一步研究可知该生物传感器对h 2 0 2 具有良好的生物催化活性，h 2 0 2 检测的线 性范围为2 2 l o 一3 6 x 1 0 4m o ll ，检测限为7 4 1 0 西m o ll 1 ( 信噪比s n = 3 ) 。 米氏常数( k 垆) 为1 4 7i 砌o ll 。 ( 2 ) 基于氧化锌纳米粒子( z n o ) 和血红蛋白之间等电点的差异较大将二者混 合制备h b z n o 溶液。将玻碳电极( g c e ) 交替浸入植酸和h b z n o 溶液中进行层 层自组装。用场发射扫描电子显微镜( f e s e m ) 对电极表面多层膜的形貌进行表 征，并用电化学交流阻抗光谱( e i s ) 表征电极的修饰过程。进一步的循环伏安 实验表明：包埋在该 h b z n o p a ) n 复合结构中的h b 实现了其与电极间的直接电 子转移而且对h 2 0 2 具有良好的催化活性。 h b z n o 】p a 6 g c e 对h 2 0 2 响应时间 短( 小于3s ) ，检测的浓度范围为2 o 1 0 击1 2 1 0 4m o ll ，检测限可达1 4 摘要上海师范大学硕士学位论文 1 0 币m o ll 。( s n = 3 ) 。尺秽= 5 1i n m o ll 。 ( 3 ) 通过植酸与金纳米粒子的层层自组装，在金电极的表面形成一个三维有 序介孔金纳米界面，再将辣根过氧化物酶( h r p ) 修饰到这个介孔结构上制备生物 传感器。用原子力显微镜( a f m ) 和循环伏安法对这个介孔界面的形成过程进行 表征。以对苯二酚作为电子媒介实现h r p 与电极之间的电子传递，并且该介孔 膜内的h r p 显示了其对过氧化氢优秀的电催化还原能力。所制备的生物传感器 与被测h 2 0 2 的浓度呈线性关系，响应浓度范围为6 5 1 0 。6 1 4 1 0 。5m o ll 1 。 在信噪比s n = 3 时，检测限为3 3 1 0 击m o ll 。并计算其k 罗为0 0 7 8i 姗o ll 一。 该传感器灵敏度和精确度高，具有令人满意的稳定性和重现性。 ( 4 ) 将辣根过氧化物酶，金纳米粒子和纳米二氧化钛( t i 0 2 ) 固定玻碳电极上 制备纳米复合膜，对其电化学性能进行研究。用场发射扫描电子显微镜、电化学 交流阻抗和表征紫外可见光谱对复合膜进行表征。实验结果表明：t i 0 2 的特殊 结构可以有效地防止a u n p s 团聚，a l | n p s 促进了电子的转移，h i 冲在此复合膜 内保持了其生物活性。循环伏安扫描表明t i 0 2 和a u n p s 的组合具有协同效应， 不仅实现了瑚心的直接电子转移，还提高了此修饰电极的电化学性能。复合膜 内的h r p 体现了其对过氧化氢良好的催化还原性质。响应电流与h 2 0 2 的浓度在 6 0 1 0 。5t 01 4 1 0 4l n o ll 1 内呈线性关系，检测限为6 5 l o 。6i n o ll 。1 ( s n = 3 ) ， k 垆为1 2i 砌0 1l - 1 。此外，该传感器具有较长的使用寿命和良好的重现性。 关键词：纳米材料；植酸；自组装；直接电子转移；生物传感器 u 上海师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t w i mt l l es o a r i n gd e v e l o p m e mi i li 姗o t e c l l i l o l o g y ，i t s 印p l i c a t i o nh a se x p a i l d e d i n t ot h ef i e l do fs e n s o r s n a n o m a t 甜a l sh a v ep a n i c u l a rq u a l i t i e ss u c ha sl a r g es p e c i f i c s u r f a c ea r e a h i g hs t a b i l i t ya n de x c e l l e n tb i o c o m p a t i b i l i 够a n da l s om a n i f e s tt 1 1 e i r s p e c i f i cc a t a l 如ce 腩c ti nt h ee l e c 仃d nt r a l l s f e rp r o c e s so fc e r t a i ne i l z y i i l e p 蛳i ca c i d i sa i l e n v i r o m n e n t 一衔e n d l yn a t u r a l l yo c c l l l 矗n g a c i dw i l i c hl i 嬲6 n o n c o p l a n a r p h o s p h a t eb o n d ss 仃u c t u r a l l y i t si 砌n s i cp r o p e 啊m a k e sp h y t i ca c i ds h o was t r o n g t e n d e n c yt oc o m p l e xa n dc h e l a t ew i mm e t a lo rm e t a lo x i d en a n o p a r t i c l e s t h e s en e w 如n c t i o n a lm a t e r i a l sa c t 弱g o o de l e c 乜o nt r a n s f e rm e d i a t o rw e r ew i d e l yu s e di n 恤 f i e l do fe l e c t r o c h e m i 蚰瓢w i l i c ha n r a c t e d 铲e a ti n t e r e s to fr e s e a r c h e r st oe x p l o r em e i r c o n f i g u r a t i o n ，p r o p e r t ya n da p p l i c a t i o l l b i o s e n s o r sa r ee x p e c t e dt 0b eo fp r o m i s i n gp r o s p e c to f 印p l i c a t i o ni nh e a l t l l 锄d s a f i e t ) rt e s t ，e i i l o m e n t a lm o n i t o r i n g ，c l i l l i c a lm e d i c i n ea n dm 锄yo t l l e rf i e l d s h o w t oi i i 1 1 1 1 0 b i l 娩eas p e c i f i cb i o m o l e c u l eo n t ot r a i l s d u c e ra i l dr e t a i n “si l a _ t u 】mb i o a c t i v 埘 i st h em o s tc m c i a ls t e pi i lm ef i a b r i c a t i o no fb i o s e n s o r 1 1 l i st l l e s i si sa i m e da ts o l v i n g m ep r o b l e mb ym e a n so fn a n o t e c l m o l o g y ，s e l f a s s e m b l ya 1 1 do m e rt c c h i l i q u e s ， e m p l o y i i l g l ef h n c t i o n a ln a n o m a t e r i a l st 0c o n s 仇j c ts e r i e se l e c t r o c h e m i c a ls e n s i n g i m e r | 沁e f o u rs p e c i f i ch y d r o g e np e r o x i d eb i o s e i l s o r sh a v e b e e nd e v e l o p e da s f o h o w s ： ( 1 ) as i m p l ea 1 1 de 腩c t i v es 仃a t e g yf o rf a b r i c a t i o no fh y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) b i o s e n s o r h a s b e e ni n t l 0 d u c e db ys u c c e s s 如l l yi m m o b i l i z e dh e m o g l o b i n ( h b ) o ng o l d n a n o p a r t i c l e s ( a u n p s ) p h y t i ca c i d ( p a ) c o m p o s i t ec h a i no ng l a s s yc a r t i o ne l e c t r o d e t l l r o u g hs e l f - a s s e m b l y t h ee n t r a p p e dh bi nn a n o c h a i nw a s c h a r a c t e r i z e db yu v - v i s a l b s o 印t i o ns p e c t r o s c o p ya n di n v e s t i g a t e db yc y c l i cv o l t 乏l i ! 吡n e t d ，t h e s e r e s u l t s s u g g e s t e dt l l a tm ea b s o r b e dh br e t a i n i t sb i o a c t i v i 够a i l dr e a l i z ed i r e c te l e c 旬r o n t m s f e rd u et ot h ei m p r o v e db i o c o m p a t i b i l i t ya i l dc o n d u c t i v i t ) ，o fa u n p s t h e b i o s e n s o rd i s p l a y e dg o o db i o e l e c t r o c a t a l y t i ca k l i t ) ，t o w a r dt l l er e d u c t i o no fh 2 0 2 ，锄d m el i n e a rc a l i b r a t i o nw a so b 协i n e di nm e 啪g ef r o m2 2 l0 。5t o3 6 x10 4n l i i l o ll 。1 i l i a b s t r a c t上海师范大学硕士学位论文 、析t i lad e t e c t i o nl i m i to f 7 4 1 0 石i 姗o ll 1 ( a tt l l e 枷oo fs i g i l a lt 0n o i s e ，s n = 3 ) m 印p a r e m m i c h a e l i s m e t e nc o n 纯m t ( k 秽) 、懈e s t i l l l a t e dt ob e1 4 7m m o ll - 1 ( 2 ) ah 锄。西o b i n - z n os 0 1 u t i o nw a sp r e p a r e db a s e do n 也ed i 能r e n c ei 1 1 i s o e l e c 仃i cp o i n t l a y e r - b y l a y e r ( l b l ) 弱s e m b l yf i l m so fh b - z n o 锄dp h ”i ca c i d w e r ef a b r i c a t e d b ya l t e m a t e l yi m m e r s i n gt h eg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e ( g c e ) i n t o 恤 s o l u t i o no fp aa i l da s p r e p a r e dh b z n o f i e l de m i s s i o ns c a i l l l i n ge l e c 仃o nr n j c r o s c o p y ( f e s e m ) 、v a s 印p l i e dt oo b s e et h em o 咄0 1 0 9 ) ，o fm u l t i l a y e rf i l m s t h ee l e c 们d e m o d i f i c a t i o np r o c e s sw a sc h a r a c t e r i z e d 、i t l le l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c 仃o s c o p y ( e i s ) c y c l i cv 0 1 t a m m e 仃ys h o w e d 也a tme n c a p s u l a t e di i lm e h b - z n o p a ) n 触m e w o r kr e a l i z e dd i r e c te l e c t r o nt r a l l s 向埘m 恤u i l d e d y i n gg c ea 1 1 dk e p tg o o d c a t a l ”i ca c t i v 吼t h e h b - z n o p a ) 6 g c er e s p o n d e dr a p i d l y ( 1 e s st l l a i l3s ) t oh 2 0 2 i nt h el i n e a rm g ef 0 咖2 o l o 6t o1 2 1 0 4m o ll - 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t i m e 鼬i l i 够a i l dr 印r o d u c i b i l i 够 k 叼啊o r d s ：n a l l o m a t e r i a j s ；p 吼i ca c i d ；s e l f - a s s 锄b l y ；d i r e c te l e c 们nt r a i l s f e r ； b i o s e n s o r v 上海师范大学硕士学位论文 附录 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名：五艰 日期： 论文使用授权声明 劢多，s ，1 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名： 慢导师签名： 作者签名：惘 导师签名： ，- 一r 一 日期： 厶上7 上海师范大学硕士学位论文绪论 第一章绪论 生命科学作为自然科学研究中的一项前沿课题，它与分析化学的进步与发展 相互促进、相辅相成。而自然界中各种生命物质的氧化还原反应、催化作用、能 量转换以及反应机制若从生命科学的电化学本质来看，这些现象通常都伴随着电 荷的运动，因此可以认为许多生命现象也表现为一种电化学现象。2 1 世纪以来， 随着纳米技术和表面科技的蓬勃发展，电分析化学也向着超高选择性和超高灵敏 度的方向不断迈进，并且为解决生命科学领域中的各种重大问题做出了突破性的 贡献。 生物分子作为生命科学的基本研究对象，对于其生物反应的研究具有及其重 要的意义。通过研究生物分子内部以及其相互之间进行的特征电子转移，将有助 于我们了解自然界中生命物质的能量转换和新陈代谢过程。本世纪发展的方向趋 于由蛋白质转为酶的直接电子转移研究，而实现酶的直接电子转移则为开发第三 代无媒介生物传感器提供了一个扎实的基础。此外，通过与生命科学、材料科学 和物理化学等学科的交叉联用，可以使生物传感器实现实时、现场和活体检测的 目标。这些应用在生命科学领域中的相关研究中显示出了巨大的潜在应用价值， 这必将使电分析化学在理论和应用上的水平提高到了一个新的层次。 1 1 生物传感器简介 生物传感器是一种以生物活性单元( 酶、抗体、核酸和细胞等) 作为敏感基 元，对目标检测物具有高度选择性的分析检测装置【l 】。它的研究与发展经历了三 个阶段，也就是我们常说的第一、二、三代生物传感器。起初，c l a r k 等在1 9 6 2 年提出了研制葡萄糖酶传感器的设想【2 l 。到了1 9 6 7 年，u p d i k e 等将葡萄糖氧化 酶固定在氧电极表面，自此第一代生物传感器问世【3 1 。之后，科学家们逐步开发 了通过检测媒介体的电流变化来反映底物浓度变化的第二代生物传感器，以及实 现酶与电极之间直接电子转移的无媒介第三代生物传感器【4 ，5 1 。 生物传感器的种类繁多，但它的组成通常都包括两个主要部分( 如图1 1 所 示) 。其一是感应器，它由对被测生物活性物质( 如酶、抗体、核酸和细胞等) 具有高选择性分子识别功能的膜构成。其二是转换器，它能够把膜上进行的生化 绪论上海师范大学硕士学位论文 反应中所消耗或生成的化学物质、光、热等信号转换成为电信号，并将这些电信 号经电子技术处理后输出到仪器上，从而实现检测和分析的目的吲。 图1 1 生物传感器示意图 f i g 1 - 1 s c h e m a t i ci l l u s n a t i o n0 f ab i o s e s n s o r 生物传感器的发展任重而道远，作为一门由化学、生物学、物理学和电子学 等多种学科相互渗透而成长起来的新学科，多种学科的交叉使生物传感器在理论 上和技术上都存在许多未知的问题有待探索和开发，特别是在它的应用上还有极 为广阔的开拓前景。 1 2 构筑生物传感界面中生物分子的一般固定化方法 将酶、抗体和抗原等具有分子识别能力的生物功能物质，吸附或包埋到某些 基底上制备成感应器，这个过程称之为生物功能物质的固定化。这一步骤在生物 传感器的研究和开发中至关重要，因此为了研制价廉、灵敏度高、选择性好且工 作寿命长的生物传感器，如何能够稳定、有效地把生物功能物质固定到基底表面 并保持其高活性，已成为了全球科学研究者关注和探索的目标。经过多年以来的 不断研究，研究者们已建立了各种不同功能生物分子的固定化方法。较为经典的 有如下几种： 1 2 1 物理吸附法 物理吸附法是指通过氢键、疏水键或极性键的作用，使生物分子吸附到不溶 性的惰性基底上。例如使用活性碳嘲、石墨粉7 1 和离子交换树脂【8 1 等材料作为吸 附其它生物组分的载体。这种方法的特点是操作简单、条件温和，但其缺点是生 物分子与基底表面之间的结合力弱，易使基底表面的生物分子脱落或泄漏，因此 2 上海师范大学硕士学位论文绪论 根据这种法所制备的生物传感器重现性比较差。 1 2 2 化学交联法 化学交联法是指生物分子在交联剂( 能够调节、促进聚合物分子之间共价键 或离子键形成的试剂) 的作用下，组分之间互相共价交联键合成网络结构。或将 生物分子直接与载体共价交联。常用的交联剂有戊二醛【9 1 等。化学交联法的优点 是固定在基底上的生物分子通常都比较牢固所以不容易脱落，但它的缺点是扩散 阻力大，使反应难以控制从而需要较多量的样品。 1 2 3 共价键合法 共价键合法指的是将基底表面进行活化处理后，通过共价键将生物分子偶联 固定到基底表面上的方法。比较常用的活化的方法有高碘酸氧化法【l 田和烷基化法 【1 1 1 等。这种方法的优点是：生物分子是通过所形成特殊键固定到基底上的，因此 被固定的生物分子不易掉落，而且使用这种法还可以改善生物分子在基底表面的 定向。但其缺点是成本较高，且操作复杂使得生物分子容易失活。 1 2 4 包埋法 包埋法是将生物分子包于聚合物膜内的孔状结构内部从而达到固定化目的 的方法。包埋的方式可分为凝胶包埋法【1 2 】和胶囊包埋法两种形式。这种方i 去 的优点是可以任意控制聚合物膜的形状与孔径，且操作条件温和，因此对生物分 子的活性影响比较少。但包埋法的缺点是操作时需要考虑很多的额外因素，而且 条件不易控制。 1 2 5 电化学聚合法 电化学聚合法是指把生物分子同聚合物一起混合到电解液中，借助电位循环 扫描法或恒电位法使溶液中的聚合物发生氧化还原反应从而生成聚合物膜，在此 过程中生物组分通过静电吸引或吸附作用结合到聚合物膜中。制备生物传感器时 常用的聚合物膜通常被分为两种。一种是导电型聚合物，常见的有聚苯胺【1 4 】和聚 吡咯等。另一种则是非导电型聚合物，常见的有聚苯酚1 6 1 等。这种方法的优 点是操作简便，而且可以通过控制聚合物膜的厚度来控制生物分子的量，因此所 制备的生物传感器具有较好的重现性，并且具有较强的抗干扰能力。其缺点是生 3 绪论 上海师范大学硕士学位论文 物分子的活性易受聚合物膜的影响。 1 3 制备生物传感器的生物分子固定化新技术 在固定生物分子构筑生物传感界面时，传统的方法和技术都有自身的优势与 不足，例如形成的膜较厚、均匀度较差、附着力低和生物活性的丧失等等，从而 影响到了生物传感器的检测灵敏度、重现性以及工作寿命等。因此，作为提高生 物传感器工作性能的关键因素之一，生物分子的固定化技术有待进一步的发展。 例如如何避免生物膜中各组分之间过多的相互作用，从而使生物分子在固定化后 仍能保持其原有的活性和高度的选择性。如何使各种方法制备的生物膜具备良好 的稳定性，并且通过这种制备方法能获得较高的重现性，同时生物分子在被固定 后能够适应多种测试环境等等。随着科研工作者对成膜技术的发展与创新，各种 新的生物分子固定化方法开始被应用于制备生物传感器： 1 3 1 纳米技术 纳米粒子( n a i l o p a r t i l c e s ，n p s ) 是一种处于原子和分子所代表的微观物质世 界与宏观物质世界所交界的过渡区域内的超微颗粒，其粒径介于1 1 0 0n m 之 间。这些纳米尺度的颗粒具有壳层的结构，并且在其粒子的内部分布着周期排布、 结晶完好的原子。这种特殊的构型使纳米粒子产生了常规粒子所不具备的特效， 即表面效应( 表1 1 ) 、体积效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应。这些特殊 效应使纳米粒子凸显出其比表面积大、吸附力强和生物相容性好等优点，并且近 年来它们已被广泛地用作为载体基质，从而使生物分子有效且充分的固定到电极 f 7 1 9 1 。 4 粒径( 姗)包含原子总数( 个)表面原子所占比例 l3 09 9 22 5 1 0 28 0 54 0 1 0 34 0 1 03 0 x1 0 42 0 2 02 5 1 0 51 0 表1 1 纳米粒子粒径与表面原子数的关系 t 抽l el - 1 r e l a t i o n s h i po ft h ed i 踟e t e ro fn 锄o p a n i c l e s 锄dt h en 啪b e ro fs u r f k ea t o m 上海师范大学硕士学位论文 绪论 纳米粒子在制备生物传感器中的作用主要体现在以下2 方面：( 1 ) 用于制备 生物传感器的活性界面。例如金属氧化物纳米粒子和金属纳米粒子等具有良好生 物相容性的新型纳米材料开始被用来研制第三代生物传感器【2 0 2 1 1 ，使用这些纳米 材料能够很好地保持生物分子的活性，并且加快生物分子与电极表面之间的电子 转移速率。( 2 ) 帮助实现生物分子与电极表面之间的直接电子转移。在众多纳米 材料中，金纳米粒子由于具有出色的电子传递性，因而常被用来作为酶与电极之 间的电子导线，使得深埋在酶内部的氧化还原中心与电极表面进行直接的电子转 移。正因为具备这种特性，金纳米粒子被广泛地用来研究蛋白质的直接电化学【冽。 而且金纳米粒子的制备方法简单，在实验室中通常采用还原氯金酸( h a u c l 4 ) 的方法进行合成【2 3 1 。 1 3 2 自组装技术 自组装技术是一种新型的分子成膜技术，近年来这种新方法在研究与制备生 物传感器的时候受到了越来越多研究者的青睐。运用这种技术可以根据需要将带 有不同活性功能团的单层膜修饰到电极的表面，而且所制备的膜致密均匀、稳定 性好、缺陷较少，因此特别适合作为生物分子固定化的载体膜。+ 自组装单分子膜( s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ，s a m s ) 是指分子之间通过非共 价键( 氢键、范德华力、静电吸引等) ，自发地吸附在液固或气固界面上所形成 的有序分子组装体系，是一种可以研究表面现象和界面现象的理想模型f 2 4 1 。相比 于其它的单层膜，自组装单分子膜除了具有制备条件简单、有序度高和缺陷少等 之外，通过合理与优化的设计，这种在基底电极表面上依靠牢固的化学键相结合 方式形成的自组装膜，其厚度还可以达到分子尺度的精确控制。更为重要的一点 是，通过改变自组装时间或溶液浓度等方式可以很好地调控s - 蝴s 的结构和性质 之间的关系。经过调控的s a m s 的结构可以很好地保持酶的天然构象和催化活 性，并且这种有序的结构能够缩短酶的活性位点与电极表面之间的相对位置，从 而使酶处在一个有利于电子传递的微环境中【2 5 】。这些独特的性质和广阔的应用前 景使自组装技术成为了研制生物传感器时广受欢迎的方法【2 6 ，2 刀。 1 3 3 碳纳米管技术 碳纳米管( c a r b o nn a i l o t u b e ，c n t ) 是一种管状的碳分子，其骨架呈六边形 的蜂窝状结构，这种结构使c n t 具有金属或半导体的特性，因此借此制备的修饰 5 绪论上海师范大学硕上学位论文 电极能够促进电子的传递。按照管子层数的不同，碳纳米管可分为单壁碳纳米管 ( s w c n t ) 和多壁碳纳米管( m w c n t ) 两种。管子的半径方向只有纳米尺度， 几万根碳纳米管合起来也只有一根头发丝那样宽，碳纳米管也由此得名。而c n t 在轴向则可长达数十到数百微米。自从1 9 9 1 年i i j i m a 从电弧放电法生产的碳纤维 中首次发现碳纳米管f 2 8 1 ，由于其独特的结构和奇异的性质及其潜在的应用前景， c n t 已经吸引了全世界研究者们的关注。在传感器领域的应用中，利用c n t 对电 极进行表面修饰时，不仅可以将c n t 本身的物化特性如大比表面积效应等弓l 入到 电极表面，同时由于其表面负载有较多的功能基团，因此对一些生物分子的电化 学行为可以产生出特有的催化效果，至今已有许多的工作报道了关于碳纳米管在 生物传感器上的应用研究【2 9 ，3 0 1 。 1 3 4 溶胶凝胶技术 溶胶凝胶( s 0 1 g e l ) 技术是指一种将无机化合物或有机化合物经溶液、溶胶、 凝胶这一转变而固化，之后通过热处理的方法制备而得氧化物或其他固体化合物 的方法【3 。由于溶胶凝胶体系具有高度的化学均匀性，而且其多孔网状的结构 也特别有利于固定生物分子，因此s 0 1 g e l 技术在生物传感器的制备中的优势就 体现在了酶的固定上。首先，将溶胶凝胶材料作为酶的固定化载体，可以很好 地保持酶的活性。再者，s 0 1 g e l 基质具有化学惰性，可以使包埋于其中的酶呈现 出更好的热稳定性和反应活性【3 2 】。另外，当使用无机化合物材料作为基质时，通 过反应条件的控制可以获得比有机聚合物材料更好的几何构型和活性界面，并提 高传感器的灵敏度【3 3 1 。此外，将溶胶凝胶技术与纳米技术、碳纳米管技术等科 技的交叉联用可以为s 0 1 g e l 在生物传感器中的应用提供更为广阔的前景【3 4 l 。 1 4 生物传感器对h 2 0 2 的精确检测 过氧化氢( h 2 0 2 ) 作为一种重要的化工产品，兼具氧化、漂白、消毒和杀菌 等多种功效。它的涉及面十分广泛，因此对h 2 0 2 含量的测定在工业分析、环境 监测、生物制药、食品科学和临床化学等领域具有非常重要的实际意义【3 5 ，3 6 1 。目 前检测h 2 0 2 时采用的主要手段有滴定法【3 7 1 、光谱法【3 引、荧光法【3 9 1 、化学发光法 和电化学法【3 5 ，3 6 1 等几种方法。近年来，电化学方法，尤其是基于酶的直接电 化学的无媒介体生物传感器得到了迅速的发展，这是因为用电化学方法研制的 6 上海师范大学硕士学位论文绪论 h 2 0 2 生物传感器其制备工艺相对简易，成本也低，并且具有很高的灵敏度和选 择性【4 1 ，4 2 1 。另外，酶在生物体内以及食物和药物中有极为重要的影响，而h 2 0 2 作为生物体内许多过氧化酶参与酶促反应的副产物，对其浓度进行准确测定则具 有十分重要的研究意义。生物传感器具有对酶的分子识别和催化选择功能，使用 它来检测h 2 0 2 浓度不但体能现出响应迅速和操作便捷的特点，而且只需要很少 量的试样就可以检测出试液中h 2 0 2 的浓度。因此，如何在对h 2 0 2 进行精确检测 时充分发挥生物传感器的反应高度专一性和信号检测高灵敏性等优势，将会是研 究者们为之不断奋斗的目标。 1 5 植酸简介 肌醇六磷酸酯又名植酸( p a ，m w6 6 0 4 3 ) ，是一种广为人知的环境友好型试 剂，常温下为淡黄色至淡褐色的浆状液体，易溶于水。除了无毒性外它还有很好 的生物兼容性，主要以有机磷的形式大量存在于植物种子以及花粉、根茎等其他 植物组织中【4 3 1 。植酸及其衍生物可以用于d n a 重组【删和d n a 修复m 5 1 ，同时它 也是一种天然的抗氧化剂m 1 ，种种特性使植酸被广泛地应用于食品医药和日用化 工等诸多领域。 h o 图1 2 植酸结构图【4 7 1 f i g 1 2 b a s i cs t m c t u r eo fp h ”i ca c i d 【4 7 】 7 绪论上海师范大学硕士学位论文 图1 2 是植酸的结构示意图，可以看到在植酸分子的环己六醇六元环上对称 地连接着6 个磷酸盐官能团，并且每个官能团能够游离并提供2 个质子，而在这 1 2 个游离位点上，有6 个位点具有强烈的酸性( m a 约为1 5 ) ，另有3 个位点 呈弱酸性( p k a 介于5 7 7 6 ) ，剩余的3 个位点则酸性更弱( p k a 远远大于1 0 ) 。 因此，植酸在p h 2 o 条件下是带负电的【4 8 】。由于植酸的独特性质和结构，使 其具有很强的螯合多价金属离子的能力，而且易与带正电的蛋白质或金属和金属 氧化物纳米粒子结合。因此，电化学研究者们开始使用植酸用于研究血红蛋白【4 9 ， 5 0 1 、肌红蛋白【4 8 1 和细胞色素c 刚的直接电化学。此外，相比于聚合物材料，使用 这种带有多配位基自由基的小分子植酸可以获得更好的介孔结构和刚性【5 2 1 。 1 6 本研究论文的构思 本研究论文拟针对目前电化学生物传感器发展中所遇到的焦点技术问题，即 如何通过一种简单有效的方法，实现生物分子在基底电极表面的固定化，并保持 其生物活性的长期稳定这一关键技术步骤，寻找突破口从而开发新型电化学生物 传感界面。构思在本课题组原有相关研究成果的基础上，结合电化学生物传感器 制备的最新进展，合理选择能有效保持酶原有生物活性的功能材料和固定技术， 设计一系列新颖的生物分子固定程序，从而制备操作简单、性能优良的电流型生 物传感器。拟从以下两方面开展具体研究工作： 1 使用新型功能纳米材料。凭借纳米粒子在吸附能力和催化效率等方面所 具备的独特优势，将其运用到生物传感器界面的构筑当中。并从众多的纳米材料 中挑选金纳米粒子、氧化锌和二氧化钛纳米粒子作为酶的固定化载体，从而充分 发挥它们比表面积大、表面活性中心多、生物相容性好和电子传导性优秀的特点。 同时结合各种生物分子的修饰方法将酶与纳米材料稳定牢固地组装到不同基底 电极的表面，并最终实现酶的直接电子转移及其对过氧化氢电催化还原，同时考 察修饰电极上的酶对底物的亲和性大小。 2 采用方便快捷的表面修饰技术。为了尽力避免酶在固定化过程中所造成 的活性降低，与传统经典修饰方法相结合，运用分子自组装技术在电极上构建高 密度堆积、均匀有序并且稳定牢固的自组装单分子膜。选用植酸作为连接纳米材 料与酶的分子试剂，充分发挥其环境友好、络和能力强和成膜性好的优点。并通 8 上海师范大学硕士学位论文 绪论 过设计组装程序，利用小分子植酸的多吸附位点与纳米粒