（遗传学专业论文）刺茄抗病基因pto的克隆及分析.pdf

棋算史擎硕士学位沧文 刺茄抗病基因p t o 的克# 邑扫分析 刺茄抗病基因p t o 的克隆及分析 指导教师 遗传学专业硕士研究生 唐克轩教授 黄蓓蓓 复旦大学生命科学学院，遗传工程国家重点实验室，遗传学研究所 复旦一交大一诺丁汉植物生物技术研发中心 上海市邯郸路2 2 0 号，中国，2 0 0 4 3 3 摘要 细菌性斑点病( b a c t e r i a ls p e c k ) 亦称细菌性叶斑病或斑疹病，是一种严重影响茄科 作物产量和品质的病害。作为一种易传播病害，细菌性斑点病的寄主广，危害重，化学 防治成本高、效果差，并且存在食品安全性和生态安全性问题。选育抗细菌性斑点病品 种是细菌性斑点病防治的根本途径，但却面临育种周期长和抗细菌性斑点病资源严重匮 乏的限制。利用基因工程技术分离植物抗细菌性斑点病相关的基因并通过遗传转化创造 作物抗细菌性斑点病新材料，具有基因型资源广泛、周期相对较短和不受生殖障碍限制 等优点，是抗细菌性斑点病遗传改良的一个重要方向。 根据基因对基因学说( g e n e - f o r - g e n et h e o r y ) ，植物抗病基因r 的产物即受体蛋白 r 与来自病原菌无毒基因a v r 的直接或间接产物，即a v r 配体之间的原初识别，是介导 植物抗病反应的根本分子机制。许多抗病和感病植物材料之间的本质差异并不在于个别 下游防卫反应基因的有无，而在于负责原初识别的抗病基因的有无或启动抗病信号传导 的机制上存在差异，所以克隆和利用受体蛋白类的抗病基因是植物抗病基因工程的核心 内容之一。迄今已有6 大类植物抗病基因克隆成功，它们绝大多数均符合基因对基因学 醴并编码一种介导抗病信号传导的胞内或跨膜受体蛋白，这些抗病基因在转化感病植物 以后均成功地取得了抗病性的提高。 细菌性斑点病由丁香假单胞杆菌 p s e u d o m o n a ss y r i n g a e ( p s ) 引起的。番茄和丁香 假单胞杆菌番茄致病变种p s t 之间的分子互作是一个研究较为详细的植物与病原菌分 子互作的机理模式。抗病番茄品种带有抗病基因p t o ，p s t 则带有相应的无毒基因a v r p t o ， 两者的互作引起番茄对细菌性斑点病的抗病反应。p s 病菌除侵染番茄外，还能侵染茄 子、辣椒、龙葵、白花曼陀罗和毛曼陀罗等。刺茄与番茄同属茄科，目前应用面积最大 的砧木，根系发达，抗病性及抗逆性强。利用野生刺茄作砧木进行茄子嫁接栽培，可以 增强茄子的抗低温能力，且高抗茄子黄萎病、枯萎病、青枯病、根线虫病、细菌性斑点 病等多种病害。特别是嫁接苗中后期植株生长旺盛，生长量大，茄子产量高、品质好。由 刺芽甜尢病_ 基因p t o 的j u 垒刀。于析 此，我们在刺茄( y e l l o w f r u i tn i g h t s h a d e ，s o l a n u ms u r a t t e n s e ) 中开展了p r o 介导的抗 细菌性斑点病的分子机制的研究。 番茄抗细菌性斑点病研究已取得突破。采用图位克隆法( m a p b a s e dc l o n i n g ) 已成 功分离出番茄( l y c o p e r s i c o np i m p i n e l l i f o l i u m ) 抗细菌性斑点病的p t o 基因。它并不局限于 小种特异性，而且可以介导跨越丁香假单胞杆菌属物种间的抗细菌性斑点病性，比如它 们转化烟草后可以提高烟草抗丁香假单胞杆菌烟草致病变种的能力。茄科内番茄的一些 近缘物种如茄属的野生种刺茄等存在对细菌性斑点病，黄萎病、枯萎病、立枯病、线虫 等病害的接近免疫的高抗性，由于细菌性斑点病的小种分化性复杂，寄主广泛，在这些 近缘物种中克隆p t o 基因的同源基因是寻找新型抗细菌性斑点病基因的一个重要途径， 同时也有助于揭示p t o 基因的系统发生学和抗病作用机制。本研究选择与番茄属亲缘关 系相近的茄属植物刺茄为对象，克隆其与番茄p t o 基因家族对应的两个同源基因s s p t o 和 s s p t o 一2 。以此为跳板，使我们能够更容易地从茄科内其它物种或更远缘的物种中克隆 具有不同识别特异性的p t o 同源基因。 为了研究刺茄中p 胁介导的抗细菌性斑点病的分子机制，本文采用同源克隆的方法 首次从刺茄中克隆了与番茄p r o 基因家族对应的两个同源基因s s p t o 和s s p t o 一2 ，并对其 功能进行了研究，得到如下结果： 1 用r a c e p c r 的方法首次从刺茄中克隆了与番茄p t o 基因家族对应的两个同源基因 s s p m 和s s p t o 一2 ，s s p t o 的全长e d n a 为1 3 3 1 b p ，含有一个9 6 0 b p 的开放阅读框，编 码一个由3 2 0 个氨基酸组成的前体蛋白，无内含子。氨基酸水平上的多重序列比对 表明，s s p t o 蛋白分别与番茄( l y c o p e r s i c o n p i m p i n e l l i f o l i u m ) 和番茄( 上h i r s u t u m ) 中的 p r o 蛋白一致性为7 1 4 和7 1 6 。s o u t h e r n 杂交结果表明，在刺茄基因组中存在 s s p t o 的小基因家族。半定量r t - p c r 表明，s s p t o 在刺茄的各个部位都有表达，其 中在茎中的表达量最高，而在烟草花叶病毒诱导6 天后，在根中的表达量最高。更 多的表达分析表明，防御胁迫途径中的信号分子，如甲基茉莉酸( m e j a ) ，水杨酸 ( s a ) ，赤霉素( g a 3 ) 和双氧水( h 2 0 2 ) 与对照相比，正调节转录水平的s s p t o 。而冷诱 导对s s p t o 的表达则没有显著影响。同时，暗处理负调节s s p t o 的表达。研究结果 表明，刺茄的这个新的胁迫和病原体诱导的s s p t o 可能不仅参与防御，胁迫应答途径， 而且参与植物的生长和发育的多种过程。 2 用基因组步移的方法从刺茄中克隆到一个p t o 类似基因，命名为盛p f o 一2 ，它编码 了定位于细胞质中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，克隆了其包含启动子区、终止子区和 全长基因组序列，并对其启动子区基本活性元件和抗病相关的元件以及其它的元件 进行了预测。对其2 3 6 5 b p 的片断进行分析表明，这个基因包含9 0 5 b p 的启动子区， 启动子区具有核心启动子，9 2 4 b p 的开放阅读框和5 3 6 b p 的终止子区，终止子富含 a + t 序列、形成发夹结构，具备终止子的特征。推测的s s p t o 一2 的氨基酸序列与已知 刺省谊u 口i 基园p r o 啦口口童a j r 祈 的p t o 蛋白有很高的同源性。根据启动子区预测已有的调控元件，对其进行半定量 r t - p c r 表达分析。分析表明s s p t o 2 的转录表达受赤霉素和水杨酸的正调节，受暗 处理的负调节。 3 构建了含s s p t o 基因的植物表达载体p c a m b i a l 3 0 4 - - s s p t o 。 刺茄类p t o 基因的克隆为刺茄中尸幻介导的抗细菌性斑点病的分子机制的深入研究 功能打下了基础，该研究对获得更多具有自主知识产权的功能基因、为利用基因工程 技术改良农作物抗病性具有潜在的重要意义。 关键词 防御胁迫：r a c e 基因组步移：基因克隆；p t o ：刺茄：启动子：调控元件 g e n b a n k 回a c c e s s i o nn u m b e r s a y 6 7 2 5 9 1 ：s s p t o 全长c d n a a y 8 8 3 0 2 0 ：s s p t o 一2 基因，全编码框 缩略词表 a a ：a m i n oa c i d ，氨基酸 a b a ：a b s c i s i ca c i d ，脱落酸 a l r ：a v i r u l e n c eg e n e ，无毒基因 b l a s t ：b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l ，基本局部比对搜索工具 b p ：b a s ep a i r ，碱基对 c d n a ：c o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，互补( 链) 脱氧核糖核酸 c t a b ：c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i o mb r o m i d e ，十六烷基三甲基溴化胺 d e p c ：d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e ，焦碳酸二乙酯 d n a ：d e o x y 曲o n u c l e i ca c i d ，脱氧核糖核酸 g a 3 ：g i b b e r e l l i ca c i d ，赤霉素 g s p ：g e n e s p e c i f i cp r i m e r ，基因特异引物 h 2 0 2 ：h y d r o g e np e r o x i d e ，双氧水 k d a ：k i l od o l t o n ，千道尔顿 l r r ：l e u c i n e r i c hr e p e a t ，富亮氨酸重复 m e j a ：m e t h y ij a s m o n a t e ，甲基菜莉酸 m r n a ：m e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i d ，信使核糖核酸 援旦大擎硕士掌位论文刺茄抗病基因p t o 的克隆及分析 m w ：m o l e c u l a rw e i g h t ，分子量 n c b hn a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n ，国家生物技术信息中心 o r f ：o p e nr e a d i n gf r a m e ，开放读码框 p c r ：p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，聚合酶链式反应 p i ：i s o e l e c t r i cp o i n t ，等电点 p s t ：p s e u d o m o n a ss y r i n g a ep v t o m a t o ，丁香假单胞杆菌番茄致病变种 p t ip r o t e i n ：p t o i n t e r a c t i n gp r o t e i n ，p r o 相互作用蛋白 p v p ：p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e ，聚乙烯吡咯烷酮 r ：r e s i s t a n c eg e n e ，抗病基因 r a c e ：r a p i da m p l i f i c a t i o no f e d n ae n d s ，c d n a 末端快速扩增 r e ：r e s p o n s i v ee l e m e n t ，应答元件 r n a ：r i b o n u c l e i ca c i d ，核糖核酸 r t ：r e v e r s et r a n s c r i p t i o n ，反转录 r t - p c r ：r e v e r s et r a n s c r i p t i o na n dp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，反转录聚合酶链式反应 s tp k ：s e r i n e t h r e o n i n ep r o t e i nk i n a s e ，丝氨酸苏氨酸蛋白激酶 s a ：s a l i c y l i ca c i d ，水杨酸 s s p t o ：s o l a n u ms u r a l t e n s ep t o ，刺茄p t o 基因 t m ：t r a n s m e m b r a n e ，跨膜 t m v ：t o b a c c om o s a i cv i r u s ，烟草花叶病毒 u t r ：u n t r a n s l a t e dr e g i o n ，非翻译区 a m p ：a m p i c i l l i n ，氨苄青霉素 c a b ：c a r b e n i c i l l i n ，羰苄青霉素 k a n ：k a n a m y c i n ，卡那霉素 h y ：h y g r o m y c i n ，潮霉素 稷旦上擎硕士掌位论冀 刺茄抗病基因p r o 的克隆及分析 c l o n i n g a n d a n a l y s i s o f t h e g e n e p t o f r o m s o l a r i u m s u r a t t e n s e s u p e r v i s o r m a s t e rc a n d i d a t e m a j o r i t y ：g e n e t i c s p r o f d r k c x u a nt a n g b e i b e ih u a n g s p e c i a l t y ：p l a n tm o l e c u l a rb i o l o g y i n s t i t u t eo fg e n e t i c s s t a t ek e yl a b o r a t o r yo fg e n e t i ce n g i n e e r i n g f u d a n s j t u n o t t i n g h a m p l a n tb i o t e c h n o l o g yr dc e n t e r s c h o o lo fl i f es c i e n c e s f u d a nu n i v e r s i t y 2 2 0h a n d a nr o a d ，s h a n g h a i ，p r c h i n a2 0 0 4 3 3 s u m m a r y b a c t e r i a ls p e c kc a u s e db yp s e u d o m o n a ss y r i n g a e ( p s ) i sa n _ i m p o r t a n td i s e a s ef o rt h e p r o d u c t i o no fs o l a n a c e a e a a sa ne a s i l yb o r nd i s e a s e ，i th a sav e r yb r o a dh o s tr a n g e c h e m i c a l c o n t r o lo ft h i sd i s e a s ei so fh i g hc o s ta n dl e s se f f i c i e n ta c c o m p a n i e dw i t hf o o ds a f e t ya n d e n v i r o n m e n ts a f e t yp r o b l e m s s e l e c t i n gb a c t e r i a ls p e c kd i s e a s er e s i s t a n tc u l t i v a r si st h eb a s i c s t r a t e g yt oc o n t r o lt h i sd i s e a s e ，b u ti t i sc o n f i n e db yl o n gt e r mo fs e l e c t i o na n dd e f i c i e n c yo f r e s i s t a n c eg e n o t y p e s g e n ee n g i n e e r i n gi sa l la d e q u a t es t r a t e g yt oc r e a t en e wb r e e d i n g g e r m p l a s m sb yi s o l a t i n g a n dt r a n s f o r m i n gu s e f u lb a c t e r i a ls p e c kd i s e a s er e s i s t a n c e r e l a t e d g e n e sw i t hs h o r tt e r ma n dw i t h o u tc o n f i n e m e n tf r o mr e p r o d u c t i v eb a r r i e r s a c c o r d i n gt og e n e f o r - g e n et h e o r y ，t h ec o r em e c h a n i s mo f p l a n tr e s i s t a n c et op a t h o g e n i n v a s i o nl i e si nt h ep r i m a r yr e c o g n i t i o nb e t w e e nt h er e c e p t o r - l i k ep r o t e i no ft h er e s i s t a n c e g e n e ( r ) p r o d u c to ft h eh o s ta n dt h el i g a n d ( o re l i c i t o r ) o ft h ea v i r o l e n c eg e n e ( a v r ) p r o d u c t o ft h ep a t h o g e n m a n yr e s i s t a n ta n ds u s c e p t i b l ep l a n tg e n o t y p e sa r en o tt y p i c a l l yd i f f e r e di n d o w n s t r e a md e f e n s i v eg e n e sb u ti nw h e t h e ro rn o tp o s s e s s i n ga na d e q u a t er e s i s t a n c eg e n e a n di nt h em e c h a n i s mo fd e f e n s e r e l a t e ds i g n a lt r a n s d u c f i o n t od a t e6t y p e so fp l a n t r e s i s t a n c eg e n e sh a v eb e e nc l o n e d ，m o s to fw h i c hc o n f o r mt og e n e - f o r - g e n et h e o r ya n d e n c o d ec y t o p l a s m i co rt r a n s m e m b r a n er e c e p t o r - l i k ep r o t e i n sw h i c hc a i l m e d i a t es i g n a l t r a n s d u c t i o nr e l a t e dt od i s e a s er e s i s t a n c e e x p r e s s i o no ft h e s erg e n e si ns u s c e p t i b l ep l a n t s r e s u l t e di na c c e p t a b l ee n h a n c e m e n to fd i s e a s er e s i s t a n c e t h ea d v a n t a g e so fb o t ht o m a t oa n dp s p v t o m a t of o rg e n e t i ca n dm o l e c u l a ra n a l y s i s 5 损旦史擎硕士掌也沧文 刺笳抗病基因p t o 的克隆及分析 h a v em a d et h ei n t e r a c t i o no ft h e s et w oo r g a n i s m sam o d e ls y s t e mt os t u d yt h em o l e c u l a r b a s i so fp l a n td i s e a s er e s i s t a n c ea n ds u s c e p t i b i l i t y t h ep t og e n ei nt o m a t oi n t e r a c t sw i t h a v r p t oe x p r e s s i n gi np s p v t o m a t os t r a i n s ，r e s u l t i n gi nr e s i s t a n c et ob a c t e r i a ls p e c kd i s e a s e i na d d i t i o nt ot o m a t o ，p s ta l s oi n f e c t se g g p l a n t s ，c a p s i c u m s ，s o l a n u mn i g r u m ，d a t u r a c a n d i d a ，d a t u r ai n n o x i am i l la n ds oo n s o l a n u ms u r a t t e n s e ，ac h i n e s ew i l dr e l a t i v eo f e g g p l a n ta n dav a l u a b l eg e n n p l a s mf o re g g p l a n tb r e e d i n ga tp r e s e n t ，b e l o n g st os o l a n a c e a e l i k el y c o p e r s i c o na n dh o l d sm a n yu s e f u la g r o n o m i ct r a i t se s p e c i a l l yi t sb r o a ds p e c t r u mo f r e s i s t a n c e st oav a r i e t yo fd i s e a s e s o nt h eb a s i so ft h e s e ，w eb e g i nt os t u d yt h em o l e c u l a r b a s i so fp t o m e d i a t e dr e s i s t a n c et ob a c t e r i a ls p e c kd i s e a s ei ns o l a n u ms u r a t t e n s e as t r i k i n ga d v a n c e m e n ti nb a c t e r i a ls p e c kd i s e a s er e s i s t a n c ee n g i n e e r i n gh a sb e e n a c h i e v e do nt o m a t o b yu s i n gm a p b a s e dc l o n i n gm e t h o d ，p t og e n eo f b a c t e r i a ls p e c kd i s e a s e r e s i s t a n c eg e n el o c u sh a v eb e e ni s o l a t e df r o mt o m a t o ( l y c o p e r s i c o np i m p i n e l l i f o b u m ) o n e e x t i n c tf e a t u r eo ft h e mi st h a tt h e ya r en o tt y p i c a l l yr a c e s p e c i f i c ，e g ，t r a n s f o r m a t i o no ft h e m i n t ot o b a c c oc a l le n h a n c er e s i s t a n c et op s p v t o b a c i s o m er e l a t i v es p e c i e so ft o m a t of r o m f a m i l ys o l a n a c e a es u c ha s t h ew i l de g g p l a n ts p e c i e ss o l a n u ms u r a t t e n s es h o w sa l m o s t i m m u n i t yt ob a c t e r i a ls p e c kd i s e a s ea n do t h e rd i s e a s e s b e c a u s er a c e s ，s t r a i n so rv e g e t a t i v e c o m p a t i b i l i t yg r o u p s ( v c g s ) o fb a c t e r i a ls p e c kd i s e a s ep a t h o g e n sa r ew i d e l yd i f f e r e n t i a t e d a n dt h e ys h a r eav e r yb r o a dh o s tr a n g eo fa sm a n ya ss e v e r a lh u n d r e dp l a n ts p e c i e s ，i ti s r e a s o n a b l et op r e s u m et h a tc l o n i n gh o m o l o g o u sg e n e so fp t of a m i l yf r o ms o l a n a c e o u s s p e c i e s o re v e nm o r ed i s t a n ts p e c i e si sap r a c t i c a lw a yt of i n db a c t e r i a ls p e c kd i s e a s e r e s i s t a n c eg e n e sw i t hn e ws p e c i f i c i t i e s i nt h i sr e s e a r c ht h es o l a n u ms p e c i e sss u r a t t e n s e ，t h e r e l a t i v es p e c i e so fg e n u ss o l a n u mt og e n u sl y c o p e r s i c o n ，w a su s e da sm a t e r i a la n dt h e2p t o h o m o l o g o u sg e n e ss s p t oa n ds s p t o - 2w e r ec l o n e d t h i sa c h i e v e m e n tw i l le n a b l eu st oi s o l a t e m o r eu s e f u lp t oh o m o l o g o u sg e n e sf r o mo t h e rs o l a n a c e o u ss p e c i e so re v e nm o r ed i s t a n t s p e c i e sa n di tw i l la l s oh e l pt oc h a r a c t e r i z et h ep h y l o g e n ya n dr e s i s t a n c em e c h a n i s mo f p t o g e n ef a m i l y t os t u d yt h em o l e c u l a rb a s i so f 尸幻m e d i a t e dr e s i s t a n c et ob a c t e r i a ls p e c kd i s e a s ei n s u r a t t e n s e p r o l i k eg e n e si n c l u d i n gs s p t oa n ds s p t o - 2w e r es u c c e s s f u l l yi s o l a t e df r o m 矗 s u r a t t e n s e ，a n dt h e i rf u n c t i o n sw e r ea l s os t u d i e d t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： i an o v e lp t o l i k eg e n e ( d e s i g n a t e da ss s p t o ) i sc l o n e df r o my e l l o w - f r u i tn i g h t s h a d e ( s o l a n u ms u r a t t e n s e ) b yu s i n gr a p i da m p l i f i c a t i o no fe d n ae n d s ( r a c e ) p c rm e t h o d t h ef u l l - l e n g t he d n ao fs s p t oi s13 31b pl o n gw i t ha no p e nr e a d i n gf r a m eo f9 6 0b p e n c o d i n gap o l y p e p t i d eo f3 2 0a m i n oa c i dr e s i d u e s t h ed e d u c e ds s p t op r o t e i nh a sa c a l c u l a t e dm o l e c u l a rw e i g h to f3 6 2 1k d aw i t ha l li s o e l e c t r i cp o i n to f6 1 8 m u l t i p l e 6 棋旦土学硕士掌位论文刺茄扰病基因p r o 的兜隆及分析 s e q u e n c ea l i g n m e n ts h o w st h a ts s p t op r o t e i ns h a r e s7 1 4 a n d7 1 6 i d e n t i t i e st op t o p r o t e i n sf r o ml y c o p e r s i c o np i m p i n e l l i f o l i u ma n dl h i r s u t u mr e s p e c t i v e l y g e n o m i c s o u t h e r nb l o ta n a l y s i si n d i c a t e st h ep r e s e n c eo fas m a l lf a m i l yo fs s p t oi nt h e s s u r a l t e n s eg e n o m e s s p l oi sf o u n dt ob ec o n s t i t u t i v e l ye x p r e s s e di nt h e s u r a t l e n s e p l a n tw i t ht h eh i g h e s te x p r e s s i o ni ns t e m s h o w e v e r ，u n d e ri n d u c t i o nb yt m v f o r6d ， s s p t oe x p r e s s e st h eh i g h e s ti nr o o t s f u r t h e re x p r e s s i o na n a l y s i sr e v e a l st h a tt h e s i g n a l i n gc o m p o n e n t so fd e f e n s e s t r e s sp a t h w a y s ，s u c ha sm e t h y lj a s m o n a t e ( m e j a ) ， s a l i c y l i ca c i d ( s a ) ，g i b b e r e l l i ca c i d ( g a 3 ) a n dh y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) ，u p r e g u l a t et h e s s p t ot r a n s c r i p tl e v e l so v e rt h ec o n t r 0 1 c o l dt r e a t m e n t ，n e v e r t h e l e s s ，h a sn os i g n i f i c a n t e f f e c to ns s p t o e x p r e s s i o nw h e r e a s s s p t o e x p r e s s i o n i s d o w n r e g u l a t e db yd a r k t r e a t m e n t o u rf i n d i n g ss u g g e s tt h a tt h i sn o v e ls t r e s s a n dp a t h o g e n i n d u c i b l es s p t of r o m ss u r a t t e n s em a yp a r t i c i p a t en o to n l yi nt h ed e f e n s e s t r e s sr e s p o n s i v ep a t h w a y s ，b u ta l s o i nd i v e r s ep r o c e s s e so fp l a n t sg r o w t ha n dd e v e l o p m e n t 2 ap t o l i k eg e n e ( d e s i g n a t e da ss s p t o - 2 ) i n c l u d i n gt h ep r o m o t e rr e g i o n ，t e r m i n a t o rr e g i o n a n dt h eg e n o m i cs e q u e n c ew a si s o l a t e df r o ms o l a n u ms u r a t t e n s eb yu s i n gg e n o m i c w a l k e rt e c h n o l o g yw h i c he n c o d e dac y t o p l a s m i c a l l yl o c a l i z e ds e r i n e t h r e o n i n ep r o t e i n k i n a s e a n a l y s i so f t h e2 3 6 5b ps e g m e n tr e v e a l e dag e n ei n c l u d i n ga9 0 5b p5 f l a n k i n g r e g i o n ，a9 2 4b po p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) a n d a5 3 6b p3 f l a n k i n gr e g i o n t h ed e d u c e d a m i n oa c i ds e q u e n c eo ft h es s p t o 一2g e n es h a r e dh i g hh o m o l o g yw i t ho t h e rk n o w np t o s t h ed e d u c e ds s p t o 一2p r o t e i nc o n t a i n e dn os i g n a lp e p t i d ew i t hac a l c u l a t e dm o l e c u l a r w e i g h to f3 4 6ik d a t h ea n a l y s i so f t h ec o r ep r o m o t e r , b a s i ca c t i v em o t i f , m o t i fr e l a t e d t oa n t i - d i s e a s ea n do t h e rm o t i f si ns s p t o 一2p r o m o t e rr e g i o nw a sp r e s e n t e d a c c o r d i n gt o p r e s u m e dm o t i f s ，s e m i - q u a n t i t a t i v er t - p c ra n a l y s i sr e v e a l e dt h a ts s p t o 一2t r a n s c r i p t s w e r eu p - r e g u l a t e db yd e f e n s e r e l a t e df a c t o r ss u c ha sg i b b e r e l l i ca c i d ，s a l i c y l i ca c i da n d d o w n r e g u l a t e db yd a r k n e s s t h et e r m i n a t o rw a sr i c h i na + ta n di tf o r m e das t e m s t r u c t u r e ，w h i c hw a st h et y p i c a lf e a t u r eo f t e r m i n a t o r 3 ap l a n te x p r e s s i o nv e c t o rp c a m b i a l 3 0 4 - s s p t oc o n t a i n i n gs s p t og e n ew a sc o n s t r u c t e d t h ec l o n i n go fs s p t oa n ds s p t o 一2p r o v i d e sab a s i sf o rf u r t h e ri n v e s t i g a t i n gt h e i r d i s e a s e - r e s i s t a n c ef u n c t i o n s t h i ss t u d yi so fp o t e n t i a li m p o r t a n c en o to n l yf o rt h eo b t a i n i n g o fi n t e l l e c t u a lp r o p e r t i e so fm o r ed i s e a s er e s i s t a n c eg e n e sb u ta l s of o rt h ei m p r o v e m e n to f c r o p sf o rd i s e a s er e s i s t a n c e sb yg e n e t i ce n g i n e e r i n g 7 棋蕈 擎硕士掌位沦文 刺茄抗病基因p t o 的充隆及分析 k e v w o r d s d e f e n s e s t r e s s ；r a c e ；g e n o m i cw a l k i n g ；g e n ec l o n e ；p t o ；ss u r a t t e n s e ；p r o m o t e r ； r e g u l a t o r ym o t i f 8 刺茅甜充病基因p t o 的j 口堑西分析 第一章文献综述 1 1 细菌性斑点病是一类严重威胁许多农作物生长的世界性病害 自1 9 3 3 年以来，番茄细菌性斑点病在美国、前苏联、意大利、南非、印度、澳大 利亚、新西兰和巴西等国有发生报道，危害遍及各大洲，该病可造成5 - 7 5 的产量损失 ( y t m i se ta 1 ，1 9 8 0 ) 。1 9 7 8 年番茄细菌性斑点病造成美国佐治亚州1 6 0 公顷的番茄歉收。 澳大利亚1 9 8 0 和1 9 8 3 年该病严重发生，1 9 8 5 年再度流行。以前我国番茄细菌性斑点 病仅在台湾省有发生记载。1 9 8 8 1 9 9 9 年吉林省长春市郊区的番茄大棚内发现番茄细菌 性斑点病。1 9 9 9 年黑龙江省和辽宁省的番茄产