（遗传学专业论文）碱性脂肪酶产生菌的筛选产酶条件的优化及其基因组文库的构建.pdf

碱性脂肪酶产生菌的 筛选， 产酶条件的优化 及其基因组文库的构建 专业遗传学 硕士生 牛冬云指导教师张义正教授 从成都及其附近地区富含油脂的土壤中采集样品，利用以橄榄油为主要基 质的富集培养基培养、以三丁酸甘油酷为主要基质的平板初筛和摇瓶复筛的筛 选模型，反复筛选确定了2 株碱性脂肪酶活性较高的菌株 ( w a和wp ) 。经过 形态观察和生理生化特性分析，将 w a菌株鉴定为解淀粉芽抱杆菌 ( b a c i l l u s a m y l o l i q u e f a c i e n s ) , w p 菌 株鉴定为 火 神发光 杆 菌 ( p h o t o b a c t e r i 。 二l o g e i ) 。 迄 今尚未有解淀粉芽抱杆菌能产生碱性脂肪酶的报道。 通过单因素分析和正交分析法， 优化了 解淀粉芽抱杆菌w a产脂肪酶的发 酵条件，确定此菌最佳产酶条件为:1 .0 % 橄榄油，1 % 淀粉为碳源，2 % 黄豆粉 和2 % 玉 米粉为 氮源， 培养 基 起始p h 7 .0 ， 接 种量为7 % ， 培养温 度为3 0 0c , 1 0 0 m l 三角瓶装量为1 5 m l , 1 8 0 r p m培养7 2 h 。在此发酵条件下，该菌发酵上清液中 酶活可达 1 2 u / m l o 对发 酵液 性 质进 行初步 研究 发 现， 此酶最 适反 应 温度为3 7 0c ， 最佳反 应p h 为8 .5 ， 在p h 7 .0 - 1 0 范 围 内 活 性 稳定 ， 并 具 有 一 定的 热 稳 定 性。 1 0 m m o l/ l c 犷 + 和k ,3 ,f 酶有激活作用， 而c u e , 和f e - 十 则 对该酶有抑制作用。 将解淀粉芽抱杆菌 c b . a m y l o l iq u e f a c ie n s ) 总d n a经s a u 3 a i 部分酶解后， 利用琼脂糖凝胶回收 的p u c 1 9 载体连接 组文库。该文库有 4 - - 1 o k b d n a片段， 然后与b a m h i 酶切及脱磷酸化处理过 以大肠杆菌d h 5 a 为受体， 构建了解淀粉芽抱杆菌的基因 5 0 0 0 - 6 0 0 0 个克隆，其中8 0 % 以上克隆中的 插入 片段大小在 4 - 1 o k b 之间。 此文库为各种基因的筛选奠定了 很好的基础。 关键词碱性脂肪酶， 发酵条件， 解淀粉芽抱杆菌， 酶学性质， 固体平板法， 基因组文库 i s o l a t i o n , o p t i m a l i z a t i o n o f f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s a n d c o n s t r u c t i o n o f g e n o m i c d n a l i b r a r y o f a l k a l i n e l i p a s e - p r o d u c i n g b a c t e r i a l s t r a i n s ma j o r : g e n e t i c s c a n d i d a t e : d o n g - y u n n i ut u t o r : p r o f . y i - z h e n g z h a n g t w o a l k a li n e l ip as e - p r o d u c i n g b a c t e r i a l s t r a i n s ( w a a n d wp ) w e r e i s o l a t e d fr o m s o i l b y m e a n s o f s o l i d p l a t e m e t h o d . s t r a i n w a w as i d e n t i fi e d as b a c i l l u s a m y l o l i q u e f a c i e n s a n d f ir s t l y r e p o rt e d t o p r o d u c e a l k a l i n e l i p as e e n z y m e , a n d wp as p h o t o b a c t e r i u m lo g e i . f a c t o r s a f f e c t i n g t h e l i p as e f e r m e n t a t i o n o f b ., 4 m y l o l i q u ef a c i e n s w e r e in v e s t i g a t e d . t h e c o m p o s i t i o n o f t h e f e r m e n t a t i o n m e d i u m w as o p t im i z e d勿 o r th o g o n a l t e s t a n d t h e o p t i m a l l i p a s e - p r o d u c i n g c o n d i t i o n s w e r e f o u n d t o b e as f o l l o w s : 1 % o l i v e o i l , 1 % s o l u b l e s t a r c h a s c a r b o n s o u r c e , 2 % s o y b e a n m e a l a n d 2 % c o rn m e a l as n it r o g e n s o u r c e , i n it i a l p h 7 .0 a n d t h e o p t i m a l c u l t i v a t i o n t e m p e r a t u r e 3 0 0c f o r 7 2 h w i t h 1 5 m l m e d i u m i n 1 0 0 m l fl as k a t 1m. u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , t h e a l k a l i n e l i p as e a c t i v ity o f t h e s u p e rn a t a n t c a n r e a c h a m a x i m u m y i e l d o f 1 2 u i m l . t h e a lk a li n e l ip as e a c t i v i ty i s o p t i m a l a t p h 8 .5 a n d 3 7 0c , a n d s t i m u la t e d 场 c a a n d k b u t in h i b it e d b y c u e + a n d f e 3 + . t h e li p as e p r o d u c e d b y th i s s t r a in h as g o o d t h e r m o - s t a b i l i ty a t a c e r t a i n e x t e n t a n d w as s t a b l e r a n g i n g p h 7 .0 t o p h 1 0 .0 . d n a fr o m b . a m y l o l iq u e f a c i e n s w as p a rt i a ll y d i g e s t e d w it h s a u 3 a l . t h e d n a fr a g m e n t s r a n g i n g fr o m 4 - 1 0 k b w e r e r e c o v e r e d f r o m a g a r o s e g e l a n d i n s e rt e d i n t o b a m h l s i t e o f p l as m i d v e c t o r p u c 1 8 . t h e r e c o m b i n a n t d n a w as t r a n s f o r m e d i n t o e s c h e r i c h i a c o l i d h 5 a a n d a b o u t 5 0 0 06 0 0 0 c l o n e s w e r e o b t a i n e d . t h e a g a ro s e g e l e le c t r o p h o r e s i s s h o w e d t h a t 8 0 % o f c l o n e s c o n t a i n i n s e rt e d fr a g m e n t w i t h 4 - 1 0 k b i n s i z e . t h i s g e n o m i c l i b r a ry i s u s e fu l f o r g e n e c l o n in g , i n c l u d i n g l ip a s e g e n e . k e y w o r d sa lk a l i n e l i p a s e , b a c i l l u s a m y l o l i g u e f a c i e n s , s o l i d p l a t e m e t h o d , f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s , e n z y m e p r o p e r ty , g e n o m i c d n a l i b r a r y vi i 碱性脂肪酶产生菌的筛选，产酶条件的优化 及其基因组文库的构建 1 引言 脂肪酶 ( e c 3 . 1 . 1 . 3 )是二种特殊的酷键水解酶， 于广泛存在许多动植物及 微生物中 2 0 1 ， 它能催化天然底物油脂 ( 甘油三脂) 水解， 产生脂肪酸和甘油。 在水解过程中存在中间产物甘油单醋和甘油二酷。从催化特性来看，脂肪酶可 以 催化酷类化合物的分解，合成和酷交换，具有严格的化学选择性和高 度的立 体异构专一性，且反应不需要辅酶，反应条件温和，副产物少。脂肪酶的另一 显著特点是:它只能在异相系统 ( 即油一 水界面) 或有机相中作用， 这不仅发展 了“ 界面酶学” ，也促进了“ 非水酶学” 的研究和深入。 脂肪酶是人类最早研究的酶类之一，在工业上的应用己有几十年的历史， 主要应用于:油脂水解工业、皮革绢纺原料脱脂、废水处理、食品风味改善、 乳化剂、三甘酷的结果分析、洗涤剂工业、脂肪酸酷的合成、聚酷反应、生物 催 化 拆 分 等 领 域 63 . 9 4 1 脱脂是制革和皮毛加工业的关键工序之一，皮革脱脂程序在蛋白酶脱毛之 前进行，只有将裸皮所含的天然油脂去除到一定程度，才能使胶原纤维松散并 使成革达到理想的效果，否则，会影响到靴制、染色、涂色等后续工序，导致 成革手感僵硬、表面油腻感强、涂层脱落掉浆以 及染色不均匀等缺陷，影响成 革的等级率，软化工艺中结合脂肪酶处理，能去除胶原纤维中的脂肪，具有不 影响皮革厚度和牢固 度的优点。目 前通用的脱脂方法主要有皂化法脱脂、 乳化 法脱脂和溶剂法脱脂等3 种，它们都存在劳动强度大、皮板深层去脂不理想和 环境污染严重等缺陷。酶法脱脂皮板柔软，富有弹性，粒面毛孔清晰;毛发光 亮 柔软， 对皮革 质量 有明 显的 提高 14 1 。 使 用酶 法脱 脂， 利用 碱性 脂肪酶 把难 溶 于水不易皂化的脂肪分解为易溶于水的甘油和脂肪酸。在碱性条件下，不溶于 水的游离脂肪酸与n a 或k 结合形成皂盐，初始形成的皂盐可作为去垢剂，加 速脂肪从皮中除去。作为一种高效无污染的脱脂剂，脂肪酶可用于皮革绢纺羊 毛骨胶脱脂和污水处理等方面。 酶制剂是一种环保型产品，用其代替许多污染严重的化料用于皮革加工被 认为是 一种清洁工艺 18 1 。 原 料皮中 含有不同 程 度的 脂 肪， 这些脂 肪主要以 脂肪 细胞形式存在于皮下组织和皮纤维之间，而脂肪含量较多的猪皮、绵羊皮等还 有大量脂肪细胞存在于毛囊周围。制革中使用的大部分化料为亲水性的，而脂 肪为疏水的。 这些脂肪的存在， 影响了浸水中包括水在内的化料的渗透和作用， 因而很不利于后面化料的对皮纤维的充分和均匀松散以及结合，进而影响到成 革的颜色、手感等性能。所以 脂肪的去除对于制革很重要，而且越早越好。对 于脂肪含量较高的原料皮，采用分步脱脂效果要好得多。脂肪酶水解并分散脂 肪，不仅对表面的油脂具有较好的去除作用，而且能将位于生皮深层的纤维之 间的游离脂肪水解。因而皮纤维间能充分且均匀充水，达到快速、均匀的浸水 效果。 同时由 于脂肪酶只作用脂肪， 对纤维蛋白 无破坏作用， 因而浸水更安全。 制革技术发展到今天， 酶制剂不仅可用于软化， 更多的新型酶制剂被开发出来， 如用于浸灰/ 脱毛的浸灰蛋白酶、用于脱脂的脂肪酶等，并得到推广应用。 目 前脂肪酶的生产方法主要有提取法和微生物发酵法，从经济和工艺角度 出发，利用微生物发酵法制备脂肪酶是最为方便的。因为微生物资源丰富，生 产不受自 然环境的影响，可用人工控制来大量积累目的酶，产酶周期短，生产 . 成本低，所以发酵法是工业生产脂肪酶制剂的一种经济而实用的方法。作为一 种重要的工业酶类，提高这类酶的产量有重要的应用价值。另外，对脂肪酶这 类“ 界面酶” 的催化作用方式和结构模型等分子机理的了 解甚少， 而仅用生化手 段对它们进行分析有一定的难度。目 前，人们已把注意力集中到克隆和鉴定脂 肪酶基因 2 2 -2 7 1 ， 研究其表达调 控方式， 以 提高脂肪酶的 产量2 8 . 3 6 1 。 许多脂肪酶 己 经纯化3 1 -3 3 1 ， 希望通过分析脂肪酶的一级结构，揭示脂肪酶的结构和功能的 关 系 3 1. 4 0 4 3 虽然微生物脂肪酶的应用不如淀粉酶和蛋白酶那样广泛，但在许多方面己 显 示出 不 可 估量 的 开 发 潜力 3 0 1 。 从 各 种 酶的 应用 率 来 看: 脂 肪 酶占 总 用 酶 量的 2 5 % 左 右 2 5 1 。 近 年 来 随 着界 面 酶 学 及固 定 化 技 术 的 不断 深入 和 发 展， 脂 肪 酶的 众多 新特性正 在被发 现， 使 这一 酶 种将再次 成为 生 物技术的 研究 热点 3 9 。 我国 对微生物脂肪酶的研究与开发较晚，近年来有关细菌碱性脂肪酶的研究报道愈 见 增多 2 -6 . 13 1 ， 但 仍 与国 外 脂 肪酶 的 研究与 应 用 存 在 一 定的 差 距。 原 因 之 一 是 酶 的活性在有机介质中降低和酶的不稳定性，其二是酶的成本高。为此要不断开 发高活力、高产量、 低成本的稳定的脂肪酶品种;拓展其应用领域，尤其在非 水相酶催化领域，包括生物催化拆分、多聚物的合成和药物的合成等;另外， 对脂肪酶的固定化技术和酶催化反应器进行系统研究，研制高效能的生物反应 器4 9 1 ， 通过将酶固定化在载体上不仅提高了 其稳定性， 而且可使酶重复连续使 用， 这将导致整个过程的成本大大将低， 因为酶的消耗占 整个成本的主要部分。 主要从以 下3 个方面进行攻关:( 1 ) 提高碱性脂肪酶产生菌发酵酶活的技术: ( 2 ) 提高碱性脂肪酶的提取收率; ( 3 ) 提高颗粒酶制剂制造水平， 缩短与国外 的距。 本论文工作首先筛选产生碱性脂肪酶的细菌菌株，然后优化发酵条件，分 析发酵液中碱性脂肪酶的部分性质，最后建立相应的基因组文库，为脂肪酶基 因的克隆和深入开展该类基因的研究工作奠定基础。 2 材料与方法 2 . 1材料 2 . 1 . 1菌株和质粒 2 . 1 . 1 . 1菌株 大肠杆菌 ( e s c h e r ic h i a c o l i ) d h 5 a : 其基因型为 s u p e 4 4 a l a c u 1 6 9帅 8 0 l a c z ai 1 5 ) h s a r 1 7 r e c a l e n d a l g y r a 9 6 t h i - 1 r e la l ，本室保存。 解淀粉芽抱杆菌及火神发光杆菌: 从成都及其附近地区的油脂厂、 食品厂、 肉制品厂、食堂菜市等与油脂类物质常年接触的土壤及下水道出口等地采集的 土样、水样中分离得来，用于本实验研究。 2 . 1 . 1 .2质粒载体 p u c 1 8 , 2 .7 k b , a m p l a c z a . ，由 本实验室保存，其物理图 谱如下 ( 图i ) . a p a u ( 1 7 2 ) 刁 夕刀 u 劫内 目 口 c 翻 f m 1 ( 4 2 4 ) 压 娜班料翔 a s a 1 ( 4 鹉】 刀 .1 ( 4 3 5 ) a 8 a i (4 3 7 ) 月 .牡( t i t ) 勺 7 a u( 1 n1 ) 图1 p u c 1 8 的物理图 谱 2 . 1 .2培养基 2 . 1 .2 . 1富集培养基组成 ( %) : 橄榄油2 .0.( n h l ) 2 s 0 4 0 .5 k 2 h p 0 4 0 .5 mg s o 4 - 7 h 2 0 0 . 1 用n a 2 c o 3 调节p h至7 .5 - 8 .0 , 1 0 磅高 压蒸汽灭菌2 5 m in 2 . 1 . 2 .2 肉汁膝培养基 ( %) : 气jll : 0，.月 蛋白陈 na c l 牛肉膏 琼脂 n目-、j : l人u 用n a 2 c o 3 调节p h至7 .5 - 8 .0 , 1 5 磅高 压蒸汽灭菌2 5 m i n 2 . 1 .2 . 3平板分离培养基:肉汁陈培养基中加入2 . 5 % 橄榄油和 1 .5 % 琼脂，用 n a 2 c 0 3 调节p h至7 .5 - 8 .0 , 1 0 磅高压蒸汽灭菌2 5 m i n ， 灭菌后冷却到 6 0 0c ， 加入维多利亚蓝b ( 4 m 创 1 0 0 m l ) ， 保持无菌条件乳化i m i n 倒平板. 2 . 1 .2 . 4初筛培养基 上层培养基为肉 汁炼培养基， 1 5 磅高压蒸汽灭菌2 5 m i n ， 取l o m l 倒平板。 下层培 养基 ( % ) :三丁 酸甘油醋 0 .5 ， 琼脂1 .5 , p h 7 .5 - 8 . 0 , 1 0 磅高压蒸汽灭菌2 5 m i n 后乳化 ( 快速混匀)取 l o m l倒平板。 2 . 1 . 2 . 5摇瓶培养基 ( %) : 橄榄油0 .5 %黄豆粉2 .0 , 玉米粉3 . 0 ，可溶性淀粉1 .0 . 凡h p 0 4 0 .5 n a n 0 3 0 . 5 , p h 7 .5 - 8 .0 1 0 0 m l三角瓶装液2 5 m l , 1 0 磅高压蒸汽灭菌2 5 m i n . 2 . 1 .2 .6 l b 培 养 基 ( 叭) m . 胰蛋白陈 1 0 ;酵母粉5 ; n a c l 1 0 ; 6 .6 m l 1 n n a o h调声 到7 . 5 2 .1 .2 .7 s o b 培 养 基 ( g / l ) m ; 胰蛋白 陈 2 0 ;酵母粉5 ; n a c l 0 .5 8 ; k c l 0 . 1 9 ; * 1 0 0 x m g t 1 0 m l 加3 m l 1 n n a o h 调p h 到 7 .0 * 1 0 0 x m g 2 ( 1 0 0 m l ) : m g c 12 -6 h 2 0 2 0 .3 3 g ; m9 s o 4 -7 h 2 0 2 4 .6 5 g 2 . 1 .2 . 8 s o c 培养基1 t 1 : s o b + 2 0 m m 葡萄 糖 固体培养基在相应的液体培养基中加入1 . 5 %的琼脂粉 2 . 1 .3溶液和缓冲液 2 . 1 .3 . 1 溶液i ii 1 % 葡萄 糖， 5 0 m m o u l e d t a ( p h 8 .0 ) , 2 5 m m o l / l t ri s - h c i ( p h 8 . 0 ) 2 . 1 .3 .2 溶液1 1 111 0 . 2 m o l / l n a o h, 1 % s d s 2 . 1 . 3 .3 溶液i i i 1 , 3 m o l/ l k a c ( p h 4 . 8 ) 2 . 1 .3 . 4 t b缓冲液m 2 5 0 m m o l 几k c i , 5 5 m m o l / l mn c 1 2，1 5 m m o n c a c 1 2 k me s p h b _ 7 1 2 . 5 mmo l / l 2 . 1 .3 . 5 t e缓冲液f0 1 0 m m o l/ l t r i s p h 8 .0 , 1 m m o 11 l e d t a p h 8 . 0 2 . 1 .3 . 6 底物乳化液 称取4 0 g 聚乙 烯醇 ( p v a ) 加去离子水8 0 0 m l ， 在沸水浴中加热搅拌， 直 至 全部溶解， 冷却后用0 .2 m o l / l n a o h调至p h 8 .2 ，再定容至1 0 0 0 m l . 量取 4 % 聚乙 烯醇溶液 1 5 0 m l ， 加橄榄油 5 0 m l ， 用高速组织捣碎机搅拌 3 m i n ，中间休息5 m i n ，再搅拌3 m i n ，即可取出备用。 2 . 1 .3 .7 0 .0 5 m o l / l p h 8 甘氨酸- n a o h缓冲液 称取甘氨酸1 . 8 8 g ， 加4 0 0 m l 去离子水溶解， 0 .2 m o l / l n a o h调至p h 8 .2 , 再定容至5 0 0 rn l即可，需新鲜配置。 2 . 1 .3 .8 0 . 0 5 m o l / l n a o h 标准溶液 称取n a o h 固体4 . 5 g ， 用去离子水溶解至1 0 0 0 m l ， 用邻苯二甲酸氢钾标定， 使用时再稀释一倍，即为0 . 0 5 m o l / l n a o h 标准溶液。 2 . 1 .3 . 9 l g / l 酚酞指示液 把l g 酚酞用9 5 %的乙醇溶液溶解至1 0 0 m l . 2 . 1 . 4 2 . 1 . 4 . 1 分子克隆工具酶与重要生化试剂 限制性内切酶及其它工具酶 研究中 所用的d n a限 制性内 切酶. t 4 d n a连接酶、 r n a s e a等购自m b i 公司、 宝 生 物工 程 ( 大 连) 有限 公 司 和 美国g i b c o - b r l 公司， t a g d n a聚 合 酶 购自 美国p r o m e g a公司。 2 . 1 . 4 . 2 试剂 聚乙 烯醇 ( p v a ) : 聚合度1 7 5 0 少。 ， 上海化学试剂采购供应站经销; 橄榄 油:化学纯，中医药集团上海化学试剂公司;维多利亚蓝 b :上海化学试剂厂 g u r r 进口分装;其他试剂均采用国产分析纯或化学纯。 2 . 1 . 5 重要实验仪器 日 本 o l y m p u s o p t i c a l公司制造的 c h s型普通光学显微镜和日 本 j e m - 1 0 0 0 x i 1 型电 子显 微镜用于菌体形态结 构 观察。 美国 安 普科技公司 产 b io lo g微生物鉴定仪用于 菌种鉴定。 p c r反应在美国m j r e s e a r c h公司的 p t c - 1 0 0 型p c r仪上进行。所有的凝胶照相和数据处理均采用英国u v p公司 制造的u v p g e l d o c u m e n t a t i o n a n d a n a l y s i s s y s t e m g d s 1 8 0 0 0 系统进行。 7 5 2 型 紫 外 光 分 光 光 度计; c e n tr if u g e 5 8 0 4 r 型 离 心 机( 德国e p p e n d o r f ) . l r h - 2 5 0 a 型生化培养箱 ( 广东省医疗器械厂) ;d h w- 4 2 0 型电热恒温水箱 ( 北京国华医 疗器械厂) 。 2 . 2 方法 2 . 2 . 1 0 . 0 1 nn a 0 h的配置19 1 首先制成 1 n n a o h ，再稀释 1 0 0 倍。1 n n a o h把约4 5 的n a o h溶解于1 水中即得。但因为n a o h中含有碳酸钠 n a 2 c 0 3 ，所以通常把制成的油状粘稠 液体再稀释。配制油状粘稠液是在烧杯中把n a o h溶解与同量的水， 冷却后移 入带橡皮塞的下口瓶中放置数日。这放置过程中， n a 2 c o : 因不溶于浓稠的 n a o h中，而沉淀于瓶底。这个粘稠液的浓度为1 5 - 1 6 n。制备1 n n a o h时， 把这油状粘稠液6 5 加热煮沸，驱逐c 0 2 ，用水稀释至1 l即可。虽然除掉了 n a 2 c o 3 ，但并未得到准确的 i nn v 一耗取的n a o h溶液的体积) 2 份溶液平行滴定的结果， 其相对偏差不应超过0 .2 %. 2 .2 .3碱性脂肪酶活性的测定 2 . 2 .3 . 1指示剂滴定法11 1 1 采用酸碱滴定法测定碱性脂肪酶的酶活。 反应液的组成为: 橄榄油一 聚乙烯 醇乳化液5 m l , 0 .0 5 m o u l p h 8 .0 甘氨酸一a o h缓冲液4 m l , 稀释的待测酶液 1 m l 。 取i o o m l 三角瓶2 只分别作为对照和样品， 分别加入上述反应液， 3 5 0c 水浴反应 i o m i n后 加待测酶液之前需预热 5 m i n左右) ，加入 1 5 m l 9 5 %的乙 醇溶液终止反应，取出，于空白 对照和样品溶液中各加2 滴酚酞作为指示剂， 用。 .0 5 m o l / l n a o h标准溶液滴定，直至微红色并保持3 0 s 不褪色为终点，记 录消耗的。 0 5 m o 比 n a o h标准溶液体积。对照组的乙醇终止剂应在加酶液之 前加入。 酶活力的计算公式如下: u = ( v -v o ) x 5 0 x n / t 公式中: u一 样品的酶活力，u ; v一 滴定样品时消耗。 .0 5 m o l / l n a o h标准溶液的体积， m l ; v 。 一 滴定对照时消耗。 .0 5 m o l/ l n a o h标准溶液的 体积， m l ; 5 0 一。 .0 5 m o l/ l n a o h标准溶液1 . 0 0 m l 相当于5 0 p m o l 脂肪酸 ( 每毫升 0 .0 5 m o u l n a o h溶液含有5 0 微克分子n a o h数) ; n 一 酶液稀释倍数; t 一 反应时间，m i n e 在反 应条件下 3 5 0c , p h 8 . 0 ) ， 每分钟催化脂肪水解产生1 微摩尔( l l m o l ) 游离脂肪酸的脂肪酶量定义为1 个脂肪酶单位 ( u ) . 由于缓冲液离子强度较底，为测得反应初速度及减少测定操作误差，酶液 浓度以反应后净耗0 .0 5 m o l / l n a o h 1 . 5 - 2 .5 m l为宜，一般应控制在2 .o m l . 2 .2 .3 . 2药典测定方法11 8 1 参照文献阴， 稍加修改。使用中国药典胰酶肠溶片的胰脂肪酶测定法。量 取橄榄油乳液( 取橄榄油4 m l 与阿拉伯胶7 . 5 g ， 研磨均匀， 缓缓加水研磨使成 l 0 0 m l ， 用高 速组织捣碎机以8 0 0 0 r p m搅拌两次， 每次3 m i n ， 取乳剂在显微镜 下 检查， 9 0 % 乳粒的 直 径应在3 1x m以 下， 并不 得 有超过l o p m的 乳 粒) 2 5 m l , 8 %牛胆盐溶液2 m l与水i o m l ， 置1 0 0 m l烧杯中， 用n a o h溶液 ( 0 . 1 m o l/ l ) 调 节p h 至9 .0 ， 在3 5 0c + 0 . 1 水浴中 保 温1 0 m i n ， 再 调节p h至9 .0 ， 精密 量 取稀释的待测酶液 1 m l ，在3 5 0c + 0 . 1 水浴中准确反应 l o m i n ，同时用 0 . 0 5 m o l/ l n a o h标准溶液滴定， 使反应液的p h恒定 在9 . 0 ， 记录消耗的0 .0 5 m o l / l n a o h 标 准 溶 液 体 积 。 另 取 在 水 浴 中 煮 沸 ， 1 5 3 0 m in 的 上 述 供 试 品 溶 液1 m l 照上述方法测定作空白对照。 平均每分钟消耗的0 .0 5 m o l/ l n a o h标准溶液的量应为0 .0 8 - 0 . 1 6 m l ， 否则 应调整浓度，另行测定。 2 .2 .3 .3紫外法(1 3 ( 取对硝基苯乙醋溶于无水乙氰中， 制成2 .5 m m o u l的底物溶液， 再3 m l比 色皿中 加入2 . 8 5 m l p h 6 .5 的 磷酸缓冲液及o . 1 m l 底物溶液， 3 7 保温2 m i n , 加 入 0 . 0 5 m l发酵上清夜，4 1 0 n m下测定酶催化产生的对硝基苯酚的吸收值 ( s = 1 4 2 0 0 0 ) 。以 每分钟产生 1 微摩尔 ( p m o l ) 的 对硝基苯酚所需的酶量定义 为 1 个酶活单位。 2 .2 .4碱性脂肪酶菌株的 筛选 将采集的 土样( 油脂厂， 屠宰厂， 含油污泥等) 分别取l g 加入盛有无菌生 理盐水的试管中， 振匀后取5 m l 悬浮液加入盛有2 5 m l富集培养基的三角瓶中， 1 8 0 r / m i n , 3 5 0c ， 摇瓶培养。 2 - -3 d 后， 移取5 m l 至另一盛有新鲜培养基的三角 瓶中继续培养。 重复同样操作2 - 3 次， 将经富集培养的菌液用无菌水适当稀释， 涂布于平板分离培养基上， 3 5 倒置培养2 - 3 d ， 选择透明水解圈直径与菌落直 径比值大的菌落用划线法纯化至单菌落。挑取一环活化的菌株，接种入肉 汁膝 液体种子培养基，3 5 0c , 1 8 0 r / m in ，振荡培养2 4 h ， 然后取1 m l液体种子于摇 瓶培养基， 3 5 0c , 1 8 0 r p m摇瓶发酵7 2 h 将发酵液离心 ( 3 0 0 0 r p m , 2 0 m i n ) , 取 上清夜用酸碱滴定法测定碱性脂肪酶活力。 2 . 2 . 5 碱性脂肪酶产生菌的分类鉴定 根据文 献曰的 方法， 对菌株进行形态特征、 菌落特征， 以 及生理、 生化特 性的鉴定， 并以 “ 伯杰细菌鉴定手册 ( 第8 版) ( b e r g e y s m a n u a l o f s y s t e m a t i c b a c t e ri o lo g y ) t 0 1 和 微生 物分类 学 1 1 5 1 作为 分 类参 考。 2 . 2 .5 . 1革兰氏 染色 试剂:结晶紫液 ( 赫克尔h u c k e r 的配方) 甲 液:结晶 紫2 g ，乙 醇 ( 9 5 % ) 2 0 m l 乙 液: 草酸铰0 . 8 8 g ,蒸馏水 8 0 m l 将甲、乙 两液混合，静置4 8 h 后使用。 卢哥尔氏 碘液 碘片 1 g , k i 2 g ,蒸馏水3 0 0 m l 0 .5 % 番红水溶液 番红/ 乙醇液 ( 2 .5 %) 2 0 m l ,蒸馏水8 0 m l 挑少许1 2 - 2 4 h 培养的 大肠杆菌， 待测菌株和枯草杆菌分别 涂在玻片上的 左中 右 3 小滴水中，火焰固定，滴加结晶紫初染l m i n ，用水冲净结晶紫后，再滴加碘 液染色1 m i n ， 水洗， 9 5 % 乙醇脱色2 0 s e c ， 加番红液复染l m i n ， 水洗， 吸干， 镜 检。菌体红色为革兰氏阴性，. 蓝紫色为革兰氏阳性。 2 . 2 . 5 . 2鞭毛染色 ( 银染法) a . 染液 甲液:单宁酸 甲醛 ( 1 5 %) 蒸馏水 a g n 0 3 5 g , 2 . o ml, 1 0 0 ml 2 g f e c 1 3 na o h ( 1 %) . 5 g . o ml 乙液: 将a g n 0 3 溶解后， 取出1 0 m l 备用 浓的氢氧化钱，则形成很厚重的沉淀， 蒸馏水l 0 0 m l ，向 其余的9 0 m l a g n 0 3 液中慢慢滴入 再继续滴加氢氧化钱并不断振摇溶液到 刚刚溶解沉淀成为澄清溶液为 止。 再将备用的a g n 0 3 慢慢回滴，则出 现薄雾， 但轻轻要摇动后， 薄雾状的 沉淀又消失， 再继续 滴入a g n 0 3 ， 直至摇动后仍呈 现轻微而稳定的薄雾为止。如雾重，则银盐沉淀出，不宜使用。 b ， 菌液制备及涂片 用于鞭毛染色的菌种应预先连续在新制备的斜面接种2 - 3 代后再使用。将 待鉴定的菌株接种在普通肉 汤培养基斜面上于 3 7 培养 1 2 - 1 5 h ， 用接种环挑 取斜面上少许菌苔， 在载玻片的水滴中轻沾几下，将玻片倾斜， 使菌液随水滴 缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥。 c . 染色 滴加甲液染3 - 5 m i n ，水洗。用乙液冲去残水后，加乙液染3 0 - 6 0 s e c ，并在 小火稍微加热，使其冒蒸汽而染液不干，然后水洗干净，风干，镜检。 2 .2 . 5 .3芽抱染色 ( 改良的s c h a e f f e r - f u l t o n氏染色法) a .制备菌悬液加1 - 2 滴水于小试管中， 用接种环挑取2 - 3环菌苔于试管中， 搅拌均匀，制成菌悬液。 b 染色加孔雀绿2 - y 3 滴于小试管中， 并使其与菌液混合均匀，然后将试管 置于沸水浴中加热 1 0 - 2 0 m i n . c .涂片固定用接种环挑取试管底部菌液，于清洁载玻片上， 涂成薄膜，然 后涂片通过火焰3 次温热固定。 d .脱色水洗，直致流出的水无绿色为止。 e .复染用番红复染液染色2 - 3 m i n ,倾去染液并用滤纸吸千残液。 镜检干燥后用油镜观察，芽抱呈绿色，菌体呈红色。 2 . 2 . 5 . 4英膜染色 ( 湿墨汁法) 加1 滴墨汁于干净的载玻片上， 并挑取少量菌体于其充分混匀， 上面放清洁 盖玻片。然后在盖玻片上放1 张滤纸，向下轻压吸收多余菌液。显微镜下观察: 若背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈，既是荚膜。 2 .2 .5 . 5过氧化氢酶的测定 从普通肉汤培养基挑一环菌， 涂在干净的载玻片上， 滴加1 0 %的过氧化氢， 有气泡产生者为阳性。 2 .2 . 5 . 6甲基乙酞甲醇试验 ( v .p . 试验) 培养基 ( 1 0 0 0 m l ): 蛋白 陈5 g ,葡萄 糖5 g n a c l 5 g , p h 7 . 0 - 7 .2 分装试管，每管约4 - 5 m l 将待测菌株接种于上述培养基中， 3 7 培养4 - 6 d 。 取培养液约2 m l 和等量的 4 0 0/ o n a o h( 或k o h ) 相混合， 加入少量( 约0 . 5 - - 1 .o m g ) 肌酸， 充分震荡 2 - - 5 m in 后， 若培养液出 现红色， 即为 v .p . 阳性。 培养7 d 后， 测定培养液的 p h 值。 2 . 2 . 5 . 7油脂水解 培养基:普通肉 汤培养基+ 0 .5 % 橄榄油 将培养基制成平板， 菌体点种在平板上， 3 7 培养2 - 4 d ， 观察菌落周围有 无透明圈出现，透明圈的大小说明水解油脂能力的强弱。 2 . 2 .5 . 8淀粉水解 培养基:普通肉汤培养基+ 0 .2 %可溶性淀粉 将培养基制成平板，凝固后将培养皿倒置室温或温箱中过夜。取新鲜菌种 点种在平板上，3 7 培养2 - 4 d ，形成菌落后，在平板上滴加卢哥尔氏 碘液，平 板呈蓝色。而菌落周围若有无色透明圈出现，说明淀粉被水解，透明圈的大小 说明 水解淀粉能力的强弱。 配制培养基时，可先将可溶性淀粉在少量蒸馏水或 牛肉 汁中加热溶解，然后再加其他成分。 2 . 2 . 5 . 9酪素水解 牛奶平板的制备: 取5 g 脱脂奶粉加入5 0 m l 蒸馏水中，另 称取1 . 5 9 g 琼脂溶 于5 0 m l 蒸馏水中， 将两液分开灭菌， 待冷至 4 5 - - 5 0 时， 将两液混匀倒平板， 即成。 将菌种点种于牛奶平板上，3 7 培养，观察有无透明圈的产生。 2 . 2 . 5 . 1 0明胶水解 培养基 ( i o o o m l ): 蛋白 陈o . l g , 牛肉 膏5 g , na c l 5 g , k h 2 p o 4 0 . 5 9 , p h 7 2 酸性汞试剂; h 9 c 1 2 1 5 g , 蒸馏水i o o m l 将菌种点种于明胶平板上， 3 7 培养1 - -3 d , 如菌落周围出现透明圈者为阳性。 明胶 葡萄糖 k 2 h p 0 4 琼脂 hci 2 0 ml 滴加酸性汞试剂在菌落周围， 2 . 2 . 5 . 1 1柠檬酸盐或丙酸盐的利用 培养基 ( 1 0 0 0 m l ): 柠檬酸钠 ( 或丙酸钠)2 g , n a c l 5 g m g s o 4 -7 h 2 0 0 .2 g , ( n h 4 ) 2 h p 0 4 1 g i % t, 百 里 酚 蓝水溶液l o m l , k 2 h p 0 4 -3 h 2 0 1 g 琼脂.2 0 g 以 上成分除指示剂外加热溶解， 调节 p h 6 . 8 - 6 .9 ， 再加入指示剂。 培养基分 装试管，灭菌后摆成斜面备用。 取幼龄菌种接种于斜面上，3 7 培养3 - 7 d ，培养基呈蓝色者为阳性反应， 不变者为阴性。 2 .2 . 5 . 1 2在p h 5 . 7 的营养肉 汤上的生长 培养基 ( 1 0 0 0 m l ): 蛋白 膝1 0 g , 分装试管，灭菌。 取菌液一环，接种于上述培养基中， p h 5 .7 , 葡萄搪 加b 3 7 培养卜3 d 后观察生长情况。 2 .2 .5 . 1 3糖醇发酵试验 培养基 ( 1 0 0 0 m l ): ( n h 4 ) 2 h p 0 4 1 g ，酵母膏0 .2 g m g s 0 4 -7 h 2 0 0 2 g ，糖l o g 0 .4 % 4甲 酚紫乙醇液2 g , n a c l 5 g 琼脂5 - 6 g 测定糖或醇类包括葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、 蔗糖、乳糖。 在加入指示剂前调节 p h 6 . 8 - 7 .0 ， 然后加入指示剂， 分装试管， 培养基高度 约为 4 - 5 c m ，灭菌。用1 8 - 2 4 h 幼龄的菌种，用针穿刺接种于培养基中，3 7 0c 培 养1 , 2 , 4 , 7 d 甚至1 4 d ， 观察结果。 指示剂有紫色边黄， 表示糖类发酵产酸: 琼脂柱内有气泡表明产气。 2 .2 . 5 . 1 4耐盐性试验 在肉汤培养基中分别加入2 %, 5 %, 7 %, 1 0 %的 n a c l ，对培养基要求十分 澄清。取幼龄菌种，直针接种， 3 7 0c 培养3 - - 7 d ，与未接种的对照管对比，目 测 液体培养基的浑浊情况，记录其耐盐性范围。这是一项观察渗透压对细菌生长 影响的 试验。由 于不同 菌的耐盐性不同，故常以 此作为鉴别特征。 2 . 2 . 6 枯草芽抱杆菌总d n a的 提取 接种一环枯草芽抱杆菌于5 0 m l l b培养基中， 3 7 振荡培养 1 2 h 。 将培养 液倒入5 0 m l 离心管中， 4 0 0 0 r p m离心1 0 m i n ， 弃上清夜。 将沉淀悬浮于2 m l 溶液i 中， 涡旋振荡， 4 0 0 0 r p m离心1 0 m i n ， 收集菌体。 将沉淀悬浮于5 m l 溶 液i 中， 加入溶菌 酶2 5 m g ( 5 m g / m l ) , 3 7 0c 温 浴3 0 m i n ， 其间 不断 转动离心 管。 加入1 / 2 0 体积的1 0 % s d s , 6 5 水浴， 转动管子至澄清。 加入等体积的酚 / 氯仿 ( 1 : 1 ) ， 轻轻摇匀， 离心， 取上清液。 加入等体积的氯仿， 轻轻摇匀，离 心，取上清液。加入两倍体积的一 2 0 无水乙醉沉淀 d n a 。为加强沉淀效果， 可再加入1 / 2 4 体积的n a c l ( 5 m o l/ l ) .离 心， 用7 0 % 乙 醇洗涤沉淀2 次， 干燥。 用d d h 2 0溶解d n a沉淀。加入r n a s e ，消化r n a 。电泳检查d n a的质量和 浓度。 2 .2 .7 质粒d n a的提取 2 .2 . 7 . 1质粒的大批量提取 接一环含质粒的 e . c o l i 细胞于 5 0 m l l b液体培养基中，3 7 振荡培养 1 21 5 h , 4 0 o o r p m离 心1 0 m in ， 弃 上 清 夜。 加 入3 毗 溶 液i 充 分 混 合， 置 于 室温5 m i n ， 加入6 m l溶液i l l 轻轻