（遗传学专业论文）内皮祖细胞移植治疗肢体缺血及其归巢机制的初步研究.pdf

摘要 内皮祖细胞( e n d o t h e l i a lp r o g e n i t o rc e l l s ，e p c s ) 是一类能 分化为成熟内皮细胞的前体细胞，能参与新生血管的形成。以往动物 体内的研究表明内皮祖细胞移植能促进动物缺血模型血流改善，内皮 祖细胞移植有望成为缺血性疾病的治疗方法之一。虽然，利用患者自 体的细胞进行移植离临床应用的距离最近，但是，患者存在的心血管 病风险因素如高血压、糖尿病和高脂血症造成内皮祖细胞数目减少而 且功能下降，使移植效果大大降低。而脐带血来源的干祖细胞具有 相对数量多，增殖能力强和未受心血管风险因素的影响等优点。脐带 血来源的内皮祖细胞能成为缺血性疾病细胞移植治疗的种子细胞之 一。 文献报道了不同实验室用不同的细胞表面标志分离培养内皮祖细 胞，它们有不同的表面标志和生长特征，而且，它们的起源也存在争 议。为了更好地利用内皮祖细胞进行临床移植治疗，需要对内皮祖细 胞的表面标志，生物学特征和起源有更深入的认识。脐带血来源的不 同分化程度的内皮祖细胞的等级秩序已经明确，但是，它们的功能研 究尚未见报道。 内皮祖细胞从定居的骨髓来到缺血组织参与新生毛细血管的形 成，要经历动员、迁移、生存、增殖、归巢、跨过毛细血管、在基质 中移行，最后整合到新生血管壁中。目前，只对动员、生存、增殖、 归巢、在组织中移动过程有一些了解。但是，它们怎样跨过毛细血管 尚不清楚。 本研究从脐带血分离单个核细胞，采用含有内皮细胞条件培养液 的培养体系，得到了两种内皮祖细胞，并对它们的表面标记，生物学 特征和体内外成血管能力进行了比较。并利用高增殖潜能内皮祖细胞 ( h i g hp r 0 1 i f e r a t i v ep o t e n t i a l e n d o t h e l i a lp r o g e n i t o rc e l l s ， h p p e p c s ) 研究了黏附分子在内皮祖细胞跨毛细血管过程中的作用。 本研究分为三个部分，主要研究方法和结果如下： 第一章人脐带血来源的两种内皮祖细胞的分离和培养 目的：建立从人脐带血分离培养内皮祖细胞的方法和培养体系。 方法：本研究利用离心的方法从脐带血分离单个核细胞，不经分 选种在人纤连蛋白包被的培养皿中，采用含有内皮细胞条件培养液的 培养体系进行培养，得到了先后出现的两种内皮祖细胞即循环成血管 细胞( c i r c u l a t i n ga n g i o g e n i cc e l l s ，c a c s ) 和高增殖潜能内皮祖 细胞，并利用挑选集落的方法分离并纯化t h p p - e p c s 。利用公认的方 法即摄取乙酰化低密度脂蛋白和结合植物凝集素对它们鉴定。并进一 步用免疫细胞化学、r t p c r 、流式细胞计数的方法对它们进行一些内 皮细胞相关的表型检测，并对其起源进行了初步研究。 结果：采用添加内皮细胞条件培养液的培养体系，对从脐带血分 离的单个核细胞进行培养，得到了两种内皮祖细胞，一种在培养的第 4 - 7 天出现，呈梭形或椭圆形，核浆比例小，被称为循环成血管细胞 ( c a c s ) ；另一种出现在培养的第2 3 周，呈典型的“鹅卵石”形态， 集落样生长，核浆比例大，被称为高增殖潜能内皮祖细胞( h p p - e p c s ) 。 这两种细胞均能摄取乙酰化的低密度脂蛋白和结合植物凝集素，免疫 组化显示它们表达内皮细胞的标志女n c d 3 1 、c d l 4 4 和v w f ，说明它们都 是内皮祖细胞。r t - p c r 的结果也说明它们有内皮细胞特异的基因转录 女n c d 3 1 、k d r 、c d l 4 4 和e n o s ，这些都支持它们是内皮祖细胞。流式细 胞计数的定量数据显示，c d 3 1 、c d l 4 4 和k d r 在c a c s 中的表达分别为 9 0 6 5 4 、6 6 3 1 8 2 和3 1 7 8 3 ，在h p p e p c s 的表达 分别为8 4 1 9 5 、9 6 6 1 4 和9 7 2 1 6 ；然而，两种细 胞也存在差别，c a c s 不表达原始干祖细胞的标志女h c d l 3 3 ( 0 2 5 0 1 6 ) ，而h p p e p c s 表达c d l 3 3 ( 6 4 2 1 7 4 ) ；部分c a c s 表达单 核巨噬细胞的标志c d l 4 ( 1 8 0 6 4 ) 和泛白细胞的标志c d 4 5 ( 3 1 4 5 7 ) ，而h p p e p c s 不表达c d l 4 ( 0 1 8 0 1 7 ) 和c d 4 5 ( 0 0 1 0 0 1 ) 。进一步的分析发现c a c s 不表达t 、b 淋巴细胞和粒细胞的表 面分子标志c d 3 、c d l 9 和c d l 5 。 结论：我们建立了采用含内皮细胞条件培养液的内皮祖细胞培养体 系，从脐带血分离单个核细胞培养得到了两种内皮祖细胞即c a c s 和 h p p - e p c s 。两种细胞表面分子表达存在差异，c a c s 表达c d l 4 并h c d 4 5 ， 不表达c d l 3 3 ；而h p p e p c s 表达c d l 3 3 ，而不表达c d l 4 矛h c d 4 5 。c a c s 可 能不是起源于t 、b 淋巴细胞和粒细胞。 第二章两种内皮祖细胞的生物学特性以及成血管能力的比较 u 目的：比较两种内皮祖细胞的生物学特征和成血管能力。 方法：本研究用f i t c 标记a n n e x i nv 联合p r o p i d i u mi o d i d e ( p i ) 的流式细胞术检测凋亡，比较两种细胞抵抗无血清培养基诱导的凋亡 的能力；用增殖曲线、倍增水平、倍增时间的计算及m t t 增殖实验等 方法比较两种内皮祖细胞的增殖特点；用有限稀释法单个细胞的集落 形成实验比较两种细胞的集落形成能力；用基质胶上毛细血管样结构 的形成实验比较两种细胞的体外成血管能力；利用免疫缺陷的无胸腺 裸鼠建立后肢缺血模型，从肢体挽救率、血流改善和毛细血管密度三 个指标评价两种细胞移植后体内促进新生血管形成的能力；并利用荧 光标记示踪的方法研究移植的内皮祖细胞能否整合入新生的毛细血 管中。 结果：经4 8 d , 时的无血清培养诱导，h p p - e p c s 中的早期凋亡发生 率为1 2 o 6 ，而c a c s 中的早期凋亡发生率为4 5 1 4 。 h p p e p c s 基本无晚期凋亡发生( o 1 0 1 ) ，c h c s 晚期凋亡发生率 为2 1 o 8 。h p p e p c s 显示比c a c s 具有更强的抗凋亡能力。c a c s 只能达到4 6 个倍增，而h p p e p c s 能达至l j 6 0 多个倍增，并且还没有衰 老的迹象。从p d t 和c p d l 来看，h p p - e p c s 的累计倍增水平是c a c s 的9 5 3 倍，相应地，h p p - e p c s 的平均倍增时间明显短于c a c s 。m t t 实验的结 果也支持h p p e p c s 增殖明显快于c a c s 。h p p - e p c s 的光吸收值 a 4 加( 1 ：4 0 稀释后) 为o 8 0 0 1 8 ，是c a c s 的a 4 9 0 衄( 0 2 0 0 1 2 ) 的4 倍。 9 6 0 个来自c a c s 的单个细胞中，没有一个集落形成。但是，在9 6 0 个来 自h p p e p c s 的单个细胞中，超过3 5 的细胞有细胞增殖分裂，产生2 - - 5 0 个子代细胞，此外，大约有4 5 的细胞在1 4 天的培养期间产生了 超过5 0 个的子代细胞，形成了集落，并且来自二级集落的9 6 个单个细 胞中有5 个三级集落形成。这说明，我们能从脐带血培养出不同分化 等级秩序的内皮祖细胞，h g c a c s 和h p p - e p c s ，而且，后者含有h p p - e c f c 和l p p e c f c 。从体外成血管能力看，h p p - e p c s 形成的毛细血管样结 构数( 2 8 6 1 5 8 ) 明显高于c a c s ( 4 7 3 4 ) ，p o 0 1 ；而且h p p - e p c s 形成的速度更快，显示了更强的体外成血管能力。体内实验揭示，内 皮祖细胞移植能增加肢体的保留比例( h p p - e p c 移植组为9 1 2 ，c a c 移 植组为4 1 2 ，对照组为0 1 2 ) ，减少肢体脱失率( 包括轻度脱失和严 重脱失，h p p e p c s 移植组为3 1 2 ，c a c 移植组为8 1 2 ，对照组为1 2 1 2 ) 。 内皮祖细胞移植能促进缺血肢体的血流恢复，各内皮祖细胞移植组的 相对血流比值r 的增加比对照组明显增加，各p o 0 1 ，h p p - e p c s 移植 i 组r 值从术后第一天的0 1 5 3 0 0 3 8 增至术后第1 4 天的0 7 1 3 0 0 8 1 ；c a c s 移植组从0 1 4 5 0 0 3 4 增至0 5 9 9 0 1 4 8 ；而对照组 只从0 1 2 8 0 0 3 4 增到0 4 4 4 0 1 2 0 。而且，h p p - e p c s 移植组的增 加程度较c a c s 移植组的为高，p o 0 5 。内皮祖细胞移植能促进毛细血 管增生，h p p - e p c s 移植组( 3 7 0 3 5 5 4 ) 和c a c s 移植组( 3 1 8 8 4 8 4 ) 的毛细血管密度都较对照组( 2 4 6 9 5 9 6 ) 的高，各p o 0 0 1 ，并且 h p p - e p c s 移植组的密度较c a c s 移植组的为高，p o 0 1 。荧光显微镜可 见两种内皮祖细胞均能出现在缺血组织中，而非缺血组织中未见。激 光共聚焦显微镜观察可见两种内皮祖细胞整合入新生的毛细血管中。 结论：h p p - e p c sl 卜, c a c s 具有更强的抗凋亡能力、增殖能力、体外 成血管能力；h p p - e p c s 具有二级、三级集落形成能力，而c a c s 无集落 形成能力。两种内皮祖细胞移植都能促进缺血肢体新生血管形成，而 h p p - e p c s 具有更强的能力。两种细胞均能归巢缺血组织中，且能整合 入新生血管中。 第三章l f a - 1 和v l a - 4 参与了高增殖潜能内皮祖细胞的归巢 目的：了解l f a 一1 和v l a - 4 是否参与了内皮祖细胞归巢过程，及 其在内皮祖细胞与成熟内皮的黏附和跨内皮迁移中的作用。 材料与方法：利用流式细胞术检测h p p e p c s 中整合素b1 ( v l a - 4 ) 和b2 ( l f a - 1 ) 的表达及基质细胞来源因子的受体c x c r 4 的表达。利用流式细胞术检n d , 鼠骨髓内皮细胞相应的受体( i c a m 一1 、 i c a m - 2 和v c a m 1 ) 的表达。利用与小鼠内皮细胞的体外黏附实验， 研究经过功能级别的中和抗体阻断v l a 一4 和l f a 一1 后h p p e p c s 黏附 细胞数目的变化。利用跨小鼠内皮细胞单层和微孔滤膜的迁移实验， 研究经过功能级别的中和抗体阻断v l a 一4 和l f a 一1 后h p p e p c s 迁移 细胞数目的变化。用免疫组织化学的方法研究小鼠缺血肌肉中血管内 皮细胞i c a m - 1 、i c a m - 2 和v c a m 一1 的表达情况。采用实时定量r t p c r 的方法研究小鼠肌肉缺血o 、6 、1 2 、2 4 和4 8 小时时i c a m l 、i c a m 一2 和v c a m - 1 基因的m r n a 转录水平的变化。采用手术结扎股动脉的方法 构建裸鼠后肢缺血模型，移植经过功能级别的v l a 一4 和l f a l 中和抗 体阻断后的h p p - e p c s ，观察肢体坏死长度和肢体脱失情况，用放射 性核素方法检测缺血肢体血流恢复程度，用免疫组织化学染色血管内 皮细胞的方法计数毛细血管密度，并利用荧光显微镜计数归巢到缺血 区肌肉组织的荧光标记的内皮祖细胞数目。 i v 结果：流式细胞术结果表明h p p - e p c s 表达整合素b1 ( c d 4 9 d c d 2 9 ， v l a 一4 ) 和p2 ( c d l l a c d l 8 ，l f a 一1 ) ，阳性表达细胞分别为5 6 4 1 3 8 和8 5 7 1 1 2 。h p p e p c s 中c d l 8 4 ( c x c r 4 ，s d f - 1 的受体) 阳 性表达细胞为8 7 3 6 4 。未经活化的小鼠骨髓内皮细胞( n l b m e c ) 表达i c a m 一2 ( c d l 0 2 ) 9 0 6 4 4 ；低表达i c a m 一1 ( 3 1 0 7 ) 和 v c a m - 1 ( 3 o 0 8 ) 。经过i l 一1 和t n f - q 活化后，m b m e c 中i c a m - 1 和v c a m - 1 表达明显增高，阳性表达细胞分别为9 4 2 4 6 和9 3 8 5 1 。缺血2 4 小时的小鼠后肢肌肉组织切片免疫组化表明缺血肌肉 纤维束之间的毛细血管内皮黏附分子i c a m - 1 和v c a m 一1 高表达，i c a m 一2 表达较弱。用s y b rg r e e n 定量r t - p c r 的方法研究i c a m - 1 ，2 和v c a m 一1 的基因转录水平变化。缺血6 5 时，i c a m - i 和v c a m - 1 的表达均上升； 缺血1 2 - 2 4 d x 时，黏附分子的表达达到高峰，直至4 8 d , 时仍维持在较 高水平。i c a m 一2 的表达略有增加，但不明显。2 h c d i l a 抗体组黏附细 胞( 3 1 7 5 7 5 6 7 2 ) 或c d 4 9 d 抗体组黏附细胞( 3 2 3 7 4 5 5 5 6 ) 均 较同型对照抗体组黏附细胞( 6 5 6 2 1 7 1 7 4 ) 少，各p o o l ，差异 有显著性。而且， j h c d il a 和c d 4 9 d 两种抗体联用组黏附细胞明显减 少( 1 1 2 5 3 2 0 5 1 ) ，其黏附细胞数较任何单一抗体组黏附细胞均减 少，p o o l ，差异有显著性。力h c d l l a 抗体组迁移细胞( 1 9 0 2 6 5 8 4 5 ) 或c d 4 9 d 抗体组迁移细胞( 1 9 7 1 o 4 8 5 3 ) 均较同型对照抗体组迁移 细胞( 5 2 5 5 3 8 4 9 7 ) 少，各p o o l ，差异有显著性。而且，力h c d ! l a 和c d 4 9 d 两种抗体联用组迁移细胞明显减少( 8 0 1 8 - + 3 0 9 4 ) ，其迁移 细胞数较任何单一抗体组迁移细胞均减少，p o 0 5 ，差异有显著性。 内皮祖细胞移植后，缺血裸鼠没有出现严重肢体脱失。经黏附分 子抗体阻滞内皮祖细胞后肢体挽救率( c d ll a 抗体封闭组，5 1 0 ；c d 4 9 d 抗体封闭组，6 i 0 ；同时2 h c d i l a 和c d 4 9 d 两种抗体封闭组，5 1 0 ) 与 同型对照抗体封闭组( 8 1 0 ) 之间无明显差异。但是，各组肢体坏死 长度( c m ) 存在明显的差异。c d l l a 抗体组( o 7 3 o 2 4 ) 、c d 4 9 d 抗 体组( o 6 9 0 1 8 ) 及两种抗体联用组( 1 2 0 2 6 ) 的肢体坏死长 度都较同型对照抗体组( 0 3 4 0 2 1 ) 为高。各p o 0 5 ，差异有显著 性。而且，两种抗体联用组比任一种抗体组的肢体坏死长度都要高， 各p o 0 5 。 各抗体阻滞组血流恢复( c d il a 抗体封闭组从术后第1 天0 1 2 8 0 0 0 3 8 8 多j 术后第1 4 天0 5 8 2 0 0 0 7 3 7 ：c d 4 9 d 抗体封闭组从0 11 6 0 0 0 3 6 9 蛰j 0 6 1 6 0 0 0 7 2 1 ；c d l l a 和c d 4 9 d 两种抗体联用组从0 1 2 5 0 v 0 0 4 2 4 至 1 0 5 1 2 0 4 - 0 0 6 4 7 ) 均较同型对照抗体封闭组( 从0 1 3 3 0 0 0 3 9 2 至w 0 7 0 2 0 0 0 6 4 7 ) 低，各p o 0 5 ，差异有显著性。而且， 两种抗体联用组比任一种抗体组的肢体血流改善都要明显，各p o 0 5 。 各抗体封闭组毛细血管密度( 毛细血管数r a m 2 ，c d i l a 抗体封闭组为 3 1 6 2 5 6 5 ；c d 4 9 d 抗体封闭组为2 9 8 1 4 4 9 ；2 h c d l l a 和c d 4 9 d 两种抗体封闭组为2 1 3 1 5 9 1 ) 都较同型对照抗体封闭组( 3 9 2 4 5 0 1 ) 低，各p o 0 5 ，差异有显著性。而且，两种抗体联用组比任 一种抗体组的毛细血管密度都低，各p o 0 5 。从归巢内皮祖细胞数目看，c d i l a 抗体封闭组( 5 6 0 1 2 7 ) 、c d 4 9 d 抗体封闭组( 4 7 8 1 1 6 ) s h c d l l a 与c d 4 9 d 两种抗体联用组( 2 3 9 1 0 9 ) 都较同型对照抗体封闭组 ( 1 2 3 9 2 3 1 ) 低，各p o 0 5 ，差异有显著性。而且，两种抗体联用 组比任一种抗体组的归巢细胞数低，各p o 0 5 。 结论：l f a 一1 和v l a 一4 参与了内皮祖细胞归巢过程，在内皮祖细胞 与缺血区血管内皮的黏附和跨内皮迁移中发挥了重要的作用。内皮祖 细胞可能通过l f a 一1 和v l a _ 4 与血管内皮细胞的i c a m - i 和v c a m 一1 的相互 作用介导这一过程。 关键词内皮祖细胞，血管形成，缺血，细胞移植，黏附分子 a bs t r a c t e n d o t h e l i a l p r o g e n i t o rc e l l s ( e p c s ) a r ep r e c u r s o r s t h a tc a n d i f f e r e n t i a t et oe n d o t h e l i a lc e l l sa n dp r o m o t et h en e o v a s c u l a r i z a t i o no f i s c h e m i ct i s s u e s p r e v i o u ss t u d i e so na n i m a l sh a v es h o w nt h a te p c s t r a n s p l a n t a t i o nc o u l di m p r o v et h er e c o v e r yo fi s c h e m i am o d e l si nv i v o a n di tm a yb eac l i n i c a lt h e r a p ym e t h o dt op a t i e n t sw i t hi s c h e m i cd i s e a s e s t h en u m b e ro fe p c si s o l a t e df r o mp e f i p h e r a lb l o o di sr e d u c e di np a t i e n t s w i t hc a r d i o v a s c u l a rr i s kf a c t o r s f u r t h e r m o r e t h ef u n c t i o n so fe p c sa r e i m p a i r e di np a t i e n t sw i t ha g i n g ，d i a b e t e so rh y p e r c h o i e s t e r o l e m i a t h e f e a s i b i l i t yo fu s i n gt h e s ec e l l sf o ra u t o g r a f f i n gi np a t i e n t sw i t hi s c h e m i c v i 0 0 4 2 4 至 1 0 5 1 2 0 4 - 0 0 6 4 7 ) 均较同型对照抗体封闭组( 从0 1 3 3 0 0 0 3 9 2 至w 0 7 0 2 0 0 0 6 4 7 ) 低，各p o 0 5 ，差异有显著性。而且， 两种抗体联用组比任一种抗体组的肢体血流改善都要明显，各p o 0 5 。 各抗体封闭组毛细血管密度( 毛细血管数r a m 2 ，c d i l a 抗体封闭组为 3 1 6 2 5 6 5 ；c d 4 9 d 抗体封闭组为2 9 8 1 4 4 9 ；2 h c d l l a 和c d 4 9 d 两种抗体封闭组为2 1 3 1 5 9 1 ) 都较同型对照抗体封闭组( 3 9 2 4 5 0 1 ) 低，各p o 0 5 ，差异有显著性。而且，两种抗体联用组比任 一种抗体组的毛细血管密度都低，各p o 0 5 。从归巢内皮祖细胞数目看，c d i l a 抗体封闭组( 5 6 0 1 2 7 ) 、c d 4 9 d 抗体封闭组( 4 7 8 1 1 6 ) s h c d l l a 与c d 4 9 d 两种抗体联用组( 2 3 9 1 0 9 ) 都较同型对照抗体封闭组 ( 1 2 3 9 2 3 1 ) 低，各p o 0 5 ，差异有显著性。而且，两种抗体联用 组比任一种抗体组的归巢细胞数低，各p o 0 5 。 结论：l f a 一1 和v l a 一4 参与了内皮祖细胞归巢过程，在内皮祖细胞 与缺血区血管内皮的黏附和跨内皮迁移中发挥了重要的作用。内皮祖 细胞可能通过l f a 一1 和v l a _ 4 与血管内皮细胞的i c a m 一1 和v c a m 一1 的相互 作用介导这一过程。 关键词内皮祖细胞，血管形成，缺血，细胞移植，黏附分子 a bs t r a c t e n d o t h e l i a l p r o g e n i t o rc e l l s ( e p c s ) a r ep r e c u r s o r s t h a tc a n d i f f e r e n t i a t et oe n d o t h e l i a lc e l l sa n dp r o m o t et h en e o v a s c u l a r i z a t i o no f i s c h e m i ct i s s u e s p r e v i o u ss t u d i e so na n i m a l sh a v es h o w nt h a te p c s t r a n s p l a n t a t i o nc o u l di m p r o v et h er e c o v e r yo fi s c h e m i am o d e l si nv i v o a n di tm a yb eac l i n i c a lt h e r a p ym e t h o dt op a t i e n t sw i t hi s c h e m i cd i s e a s e s t h en u m b e ro fe p c si s o l a t e df r o mp e r i p h e r a lb l o o di sr e d u c e di np a t i e n t s w i t hc a r d i o v a s c u l a rr i s kf a c t o r s f u r t h e r m o r e t h ef u n c t i o n so fe p c sa r e i m p a i r e di np a t i e n t sw i t ha g i n g ，d i a b e t e so rh y p e r c h o i e s t e r o l e m i a t h e f e a s i b i l i t yo fu s i n gt h e s ec e l l sf o ra u t o g r a f t i n gi np a t i e n t sw i t hi s c h e m i c v i d i s e a s e sa r eu s u a l l yh a m p e r e db yt h er a r i t yo ft h ec e l l si nt h ep e r i p h e r a l b l o o da n dt h ed y s f u n c t i o no ft h ec e l l sa l t h o u g ht r e a t m e n to ft h e s ep a t i e n t s w i t h p e r i p h e r a l b l o o d d e r i v e dc u l t u r e de p c sm a yb eap o t e n t i a l t h e r a p e u t i co p t i o n t h eu m b i l i c a lc o r db l o o dm a y b ea na l t e r n a t i v es o u r c e o fe p c sf o re e l lt r a n s p l a n t a t i o nt op r o m o t en e o v a s c u l a r i z a t i o ni np a t i e n t s w i t hi s c h e m i cd i s e a s e s e v e r a lp o p u l a t i o n so fe p c sh a v eb e e nr e p o r t e da n di s o l a t e db y d i f f e r e n ts u r f a c em a r k e r sa n ds h o w e dd i f f e r e n tp h e n o t y p ea n d c h a r a c t e r i s t i c sa sw e l la st h eo r i g i n t h e s ed i f f e r e n c e ss h o u l db ef u r t h e r c l a r i f i e df o rc l i n i c a l l yc e l l u l a rt r a n s p l a n t a t i o ni nt h ef u t u r e t h eh i e r a r c h y o fe p c sf r o mh u m a nu m b i l i c a lc o r db l o o dw a si d e n t i f i e db a s e do nt h e i r c l o n o g e n i ca n dp r o l i f e r a t i v ep o t e n t i a lb u tt h e i rf u n c t i o nt op r o m o t et h e n e o v a s c u l a r i z a t i o nh a sn o tb e e ne v a l u a t e d i ti sal o n gj o u r n e yf o re p c sc o m i n gf r o mb o n em a r r o wt oi s c h e m i c t i s s u e ，i n c l u d i n gm o b i l i z a t i o n ，m i g r a t i o n ，s u r v i v a l ，p r o l i f e r a t i o n ，h o m i n g ， t r a n s m i g r a t i o na c r o s sc a p i l l a r i e s ，m i g r a t i o ni ne x t r a c e l l u l a rm a t r i xa n d i n c o r p o r a t i o ni n t on e w f o r m e dc a p i l l a r i e s i ti sn o ty e tk n o w nh o we p c s t r a n s m i g r a t ea c r o s sc a p i l l a r i e sa l t h o u g ht h ek n o w l e d g ea b o u te p c si s i n c r e a s i n g i nt h ep r e s e n ts t u d yw eu s e du n f r a c f i o n e d c si s o l a t e df r o mh u m a n u m b i l i c a lc o r db l o o dt oc u l t u r ee p c sa n do b t a i n e dt w ot y p e so fe p c s h p p e p c sa n dc a c s b yu s i n ge n d o t h e l i a lc e l l c o n d i t i o n e dm e d i u ma n d c o m p a r e d t h e i r p h e n o t y p e s ，g r o w t h c h a r a c t e r i s t i c sa n d a n g i o g e n i c p o t e n t i a l w ef u r t h e rs t u d i e dt h er o l eo fa d h e s i o nm o l e c u l a r , c d 1laa n d c d 4 9 d mh p p e p c sh o m i n gt oi s c h e m i ct i s s u e c h a p t e r 1c u l t u r eo ft w ot y p e so fe n d o t h e l i a lp r o g e n i t o rc e l l sf r o m h u m a nu m b i l i c a lc o r db l o o d o b ie c t i v e ：t oe s t a b l i s ht h em e t h o do fi s o l a t i o na n dc u l t u r ee n d o t h e l i a l p r o g e n i t o rc e l l sf r o mh u m a nu m b i l i c a lc o r db l o o da n df i n do u tt h e s u i t a b l ec u l t u r es y s t e mf o re p c s m e t h o d s ：m o n o n u c l e a re e l li s o l a t e db yg r a d i e n td e n s i t yc e n t r i f u g e f r o mh u m a nu m b i l i c a lc o r db l o o dw e r ec u l t u r e di nf i b r o n e c t i n c o a t e d v i i s i x w e l lt i s s u ec u l t u r ep l a t e su s i n gc u l t u r e ss y s t e ms u p p l e m e n t e dw i t h e n d o t h e l i a lc e l l c o n d i t i o n e dm e d i u m t w ot y p e so fe n d o t h e l i a lp r o g e n i t o r c e l l s ，c i r c u l a t i n ga n g i o g e n i cc e l l s ( c a c s ) a n dh i g hp r o l i f e r a t i v ep o t e n t i a l e n d o t h e l i a lp r o g e n i t o rc e l l s ( 唧p - e p c s ) ，w e r eo b t a i n e da n dp u r i f i e db y m e c h a n i c a l l yp i c k i n gu pc o l o n i e s t h e s ec e l l sw e r ei d e n t i f i e db yt w o s t a n d a r d so fe p c s ，u p t a k eo fa c - l d la n db i n d i n gt ol e c t i n ，a n dw e r e a n a l y z e db vf a c sf o rt h e i rp h e n o t y p e sr e l a t e dt oe n d o t h e l i a lc e l l sa sw e l l a sf o rt h e i ro r i g i n r e s u l t s ：w ec u l t u r e dm o n o n u c l e a rc e l l s ( m n c s ) i s o l a t e df r o mh u m a n u m b i l i c a lc o r db l o o du s i n ge n d o t h e l i a lc e l l c o n d i t i o n e dm e d i u ma n d o b t a i n e dt w ot y p e so fe p c s ，r e f e r r e da sc i r c u l a t i n ga n g i o g e n i cc e l l s ( c a c s ) a n dh i g hp r o l i f e r a t i v ep o t e n t i a l e n d o t h e l i a lp r o g e n i t o rc e l l s ( i - i p p - e p c s ) c a c sa t t a c h e do n t ot h ef i b r o n e c t i n c o a t e dp l a t ea td a y s4 - 7a n d a p p e a r e di ns p i n d l e o re l l i p s e - s h a p e ，b u t n o tg a t h e r e di n t oc l u s t e r s h p p e p cc o l o n i e sa p p e a r e da f t e rc u l t u r ef o r2 3w ka n dh a dc l e a r b o u n d a r i e s h p p e p c sa p p e a r e di n “c o b b l e s t o n e l i k e ”m o r p h o l o g yw i t h ah i g h e rv o l u m er a t i oo fn u c l e u s c y t o p l a s ma sc o m p a r e dw i t ht h a to f c a c s t w ot y p e so fc e l l sa c c o r d e dw i t ht h es t a n d a r d so fe p c s ，u p t a k eo f d 讧a c l d la n db i n d i n gt ol e c t i n ，a n de x p r e s s e dt h em a r k e r so f e n d o t h e l i a lc e l ls u c h a sc d 31 ，c d14 4a n dv i f b y i m m u n o c y t o c h e m i s t r y i m p c ra n a l y s i sd i s c l o s e dt h eg e n et r a n s c r i p t i o n o fc d 31 、k d r 、c d14 4a n de 】n o si nt w ot y p e so fc e l l s f a c 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t e df r o m h u m a nu m b i l i c a lc o r db l o o du s i n ge n d o t h e l i a lc e l l c o n d i t i o n e dm e d i u m a n do b t a i n e dt w o t y p e so fe p c s ，r e f e r r e da sc i r c u l a t i n ga n g i o g e n i cc e l l s ( c a c s ) a n dh i g hp r o l i f e r a t i v ep o t e n t i a l e n d o t h e l i a lp r o g e n i t o rc e l l s ( h p p e p c s ) b o t ht y p e so ft h ec e l l sp o s s e s st h ec h a r a c t e r i s t i c so fe p c s i n c l u d i n ge x p r e s s i n