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新月细柱藻种复合体及海链藻多样性研究 摘要 细柱藻属( c y l i n d r o t h e c a ) 是海洋硅藻中一个较小的类群，目前仅有少数 几个种被描述。新月细柱藻( c y ，i n d r o t h e e ac o s t e r u m ( e h r e n b e r g ) l e w i ne t r e i m a n n ) 是胶州湾常见的底栖硅藻种类，也是双壳类养殖的重要饵料生物。c c o s t e r i u m 与其它海洋硅藻相比，其鉴定工作存在诸多问题，也极易和长菱形 藻( 肼t z s c h i al o n g i s s i m a ) 混淆。 本研究建立了采自胶州湾的1 2 株大小存在差异的底栖硅藻单克隆培养体系。 其中1 l 株经鉴定确认为c o s t e r i u m , l 株确定为弯端长菱形藻 o n g i s s i m a p a r r e v e r s ag r u n o w ) 。我们对其核编码的s s ur d n a 基因和叶绿体编码的r 6 c l 基因进行了克隆和测序序列分析表明，1 1 株c c o s t e r j u m 的s s ur d n a 基因 和，6 d 基因存在很大的序列变异：1 7 7 5 b p 的s s ur d n a 基因扩增片断中有3 1 个 变异位点；n 9 0 b p 的r 6 c l 基因扩增片断中存在1 1 8 个变异位点，其中1 0 8 个变 异位点为密码子的第三位碱基。依据拍c l 基因核苷酸序列推导的氨基酸残基变 异明显小于核苷酸变异。弯端长菱形藻s s ur d n a 和，6 c l 基因扩增片断分别长 1 7 7 7 b p 和1 1 9 0 b p ，与新月细柱藻序列差异很大 分别通过两基因核菅酸序歹l j 构建的邻接( n e i g h b o rj o i n i n g ，n j ) 系统发育树 将l l 株cc o s t e r i u 四分成相同的六个分支( c l a d e ) 通过s s ur d n a 基因构建 的n j 树将所有的细柱藻聚为一支，将弯端长菱形藻与其它菱形藻种类聚为另一 支。s s ur d n a 基因n j 树将细柱藻分为两个明显的支系( 1 i n e a g e ) ：支系i 由1 2 株cc o s t e r i u m 组成，包括本实验分离到的全部l l 株c o s t e f i u b i ) 该支 系中部分节点没有得到较高的支持率( 7 0 ) 。统计分析表明，支系i 中株系间的平均遗传距离高于其它微藻种的种 内变异程度，差异极显著( p g c ，具有明显的a t 偏好性( 表2 3 ) 。1 1 条细柱藻，6 正基因序列中，1 1 8 个位点上有碱基变异存在，其中有1 0 8 个发生在密码子第三位碱基上，发生在 密码子第二位、第一位碱基上的个数仅分别为3 和7 ( 图2 5 ) 。在碱基组成上， 而吐基因序列密码子第三位具有更为明显的a t 偏好性，即密码子n n a 和n n t 占有很高比例( 8 0 ) 。将而c l 基因核苷酸序列翻译成氨基酸序列后发现，氨 基酸残基的变异程度明显小于核苷酸的变异程度，且要低一个数量级。如 m g b 0 4 0 1 和m g b 0 5 0 2 的而乩基因存在6 4 个核苷酸序列的差异，但氨基酸残基 的差异数仅为4 。m g b 0 5 0 3 、m g b 0 5 0 4 和j z b - 2 8 具有相同的柏c l 基因序列，虽 然m g b 0 5 0 2 与它们相比有2 个核苷酸变异，但四者所对应的氨基酸序列完全相 同( 表2 4 ) 。 而乩基因还存在非常明显的密码子使用偏好性。如根据m g b 0 5 0 1 的，6 正基 因序列推导出的3 9 6 个氨基酸残基中有3 6 个亮氨酸，其中有3 5 个( 9 7 2 2 ) 由u u a 编码，编码甘氨酸的3 8 个密码子中g g u 占3 5 个( 9 2 1 1 ) ，编码精氨酸 的2 3 个密码子中c g u 占2 1 个( 9 1 3 0 ) 。 2 4 新月细柱藻种复合体及海链藻多样性研究 2 3 系统学分析 分别通过n j 和m p 法构建了s s i jr d n a 和，6 c l 基因的系统树。但在本文中 仅给出了n j 法构建的系统树，m p 法所构建系统树的b o o t s t r a p 值( 5 0 ) 列于 n j 法构建的系统树中。 n j 和咿法构建的s s i jr d n a 基因系统树拓扑结构相似。在n j 系统树中( 图 2 6 ) ，本研究中的1 1 株藻与细杠藻属的其它种( 或株) 聚为一个分支( 9 6 f o r n ja n d9 5 f o rm p ) ，弯端长菱形藻与菱形藻属的其它种聚为另一分支( 7 9 f o r n ja n d7 8 f o rm p ) 细柱藻属又非常明显的形成两个支系；支系i 含有1 2 株 新月细柱藻，本实验分离的1 1 株全部包含在内；支系l i 则包括cc o t e r i u 口 ( a y 4 8 5 4 7 1 ) ，cf u m f o r m i s1 a y 4 8 5 4 5 7 ) 和彤c o t e r i u m ( = cc o t m i u 强 a y 4 8 5 4 5 5 ) 。支系i 中m g b 0 5 0 2 、m g b 0 5 0 3 、m g b 0 5 0 4 和j z b - 2 8 聚为一支( 9 7 9 6f o r n ja n d9 6 f o r 神) ，m g b 0 5 0 l 和m g b 0 4 0 1 聚为一支( 5 1 f o rn j ) ，m g b 0 5 0 5 和j z b - 3 a 聚为一支( 5 9 f o rn j ) 在s s ur d n a 基因系统树中一些节点没有得 到较高b o o t s t r a p 值( 5 0 ) 的支持。 在r b c l 基因系统树中细柱藻的各分支均得到很高b o o t s t r a p 值的支持( 图 2 7 ) ，其拓扑结构与s s ur d n a 基因系统树差异较小tj z b 一3 c 形成m g b 0 5 0 2 、 m g b 0 5 0 3 、m g b 0 5 0 4 和j z a - 2 8 这一支的姊妹群( 1 0 9 f o rn ja n d i p ) ：m g b 0 5 0 6 为m g b 0 5 0 1 和m g b 0 4 0 1 这一支的姊妹群( 9 9 f o rn ja n d9 7 f o rm p ) 。r b c l 基因系统树中，细柱藻同样形成两个支系，本实验的n 株藻仍旧包含在同一支 系中。数据库中还没有来源于菱形藻属的柏c l 基因序列存在，仅利用分予手段 还无法对弯端长菱形藻进行准确的系统学定位。 需要着重指出的是，分别通过s s ur d n a 和r b c k 两基因构建的n j 系统树将 1 l 株新月细株藻分成了相同的6 个分支。 2 4 统计分析结果 支系i 的1 2 条新月细柱藻s s ur d n a 基因序列两两之间的遗传距离分布于0 到0 0 0 9 之间( 表2 5 ) ，平均值为0 0 0 4 。其它微藻种的种内遗传距离分布及 新月细柱藻种复合体及海链藻多样性研究 其平均值列于表2 6 。独立样本t 检验结果表明，1 2 条细柱藻的平均遗传距离 明显高于其它种的种内遗传距离( p o 0 5 ) 。但是，如果将支系i i 中的序列也用于统计分析， cc l o s t e r i u m s s ur d n a 基因序列的平均遗传距离将明显变大，而且会在p 一 粗体序列号为本实验获得( s e q u e n c ea c c e s s i o nn u m b e r ss h o w ni nb o l d f a c ea r e o b t a i n e di nt h i ss t u d y ) 堑星塑堡苎翌兰笪笪丝堂篓蔓童壁丝堡壅 图2 11 1 株细柱藻的光学显微镜照片 f i g u r e2 1l i g h tm i c r o s c o p ei m a g e so fd i f f e r e n ti s o a r e so f c y l i n d r o t h e c a ( t r a n s v e r s es t r i a ea n di n t e r s t r i a e & r en o tv is i b l e a ， m g b 0 4 0 2 ；b ，m g b 0 5 0 2 ：c ，m g b 0 5 0 3 ：d ，m g b 0 5 0 6 ；e ，j z b - 2 8 ：f ，j z b - 3 a ；g 。 m g b 0 4 0 1 ：h ，m g b 0 5 0 4 ：i ，m g b 0 5 0 5 ：j ，m g b 0 5 0 1 ：k j z b - 3 c s c a l eb a r s = 2 0 姗) 新月细柱藻种复合体及海链藻多样性研究 图2 2 两株细柱藻在扫描电镜下的形态特征( a m g b 0 4 0 1 ：b ，m g b 0 4 0 2 ) f i g u r e2 2m o r p h o l o g i e so f2c y l i n d r o t h e c as t r a i n su n d e rs c a n n i n g e l e c t r o nm i c r o s c o p y ( a ，m g b 0 4 0 1 ，s c a l eb a r = 2 0 胁：8 ，m g b 0 4 0 2 ，s c a l e b a r = 4 0 肛m ) 图2 3 弯端长菱形藻在光学显微镜下的形态特征( a ，侧面观：b ，正面观) f i g u r e2 3l i g h tm i c r o s c o p i ci m a g e so fn i t z s c h i a o n g i s s i m a , f a r t e v e r s 8 新月细柱藻种复合体及海链藻多样性研究 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 i 1 1 2 3 4 4 4 56 6 6 6 6 6 6 6 6 66 6 6 6 6 6 7 7 7 80 0 0 0 1 2 2 3 3 33 4 4 4 5 5 6 6 6 7 6 6 7 7 6 2 4 5 8 90 3 3 3 3 4 4 5 5 56 6 7 7 9 9 1 2 7 00 4 4 4 5 2 8 3 4 5 9 1 2 8 1 1 8 9 9 0 8 9 0 3 6 7 7 3 0 71 4 5 6 7 1 7 1 2 78 9 0 1 4 5 6 3 0 01 1 7 9 0 7 8 9 2 83 3 6 嬲0 0 1 3 j z b 一3 a a i 兀卜g g a g ua c i 脱埙兀i 触“麟u u g i 兀m i 圮ga u a - u c g c a u j 功一3 cc a a g a i 卜g u - i z b 一2 8 c 一l g u a 一u 。 硒0 5 c g g 仉a g _ - 瓤 鼢o 5一 g g - 一： 脚5 0 4c ac 仉以 。一 确如o 3c 一 g m - u 新 脚5 0 2 c g c 一舭 巳机_ u 瑚1c g g u 粕丑0 4 0 2c ， g | _ c g c g - 直c x 眦1c g c g 。- 仉 厶d o s t e r i 瓯( e 7 3 2 6 )c ag 一 点d 竹f 啪埘( y 4 8 5 4 5 5 ) c 一0 u a - c a c 锄c g c c | c u a c g u 。 触而擅f fc 硼k g a - 麟 弘cc 喊c c u a c g u 已c 2 0 s t e z i l m ( a 葛4 8 5 4 7 1 ) c d u a - c a u g c a 瓯cc d g c c a 篮u a c g u 图2 4 细柱藻属s s ur d n a 基因核苷酸变异位点 f i g u r e2 4n u c l e o t i d ev a r i a t i o ns i t e so fs s ur d n ag e n e 。 c y j n d r o t h e c as p e c i e s 新月细柱藻种复合体及海链藻多样性研究 表2 3 细柱藻的s s ur d n a 和柏乩基因序列碱基组成表 t a b l e2 3n u c l e o t i d ec o m p o s i t i o n so ft h es s ur d n aa n dr b c lg e n e s s s ur d n ar b c l t c a g t c a g n n t + n i n a j z b 3 a 2 8 41 9 32 6 02 6 33 3 31 5 92 9 62 1 38 1 8 j z b 靶 2 8 3j 9 32 6 22 6 13 2 61 6 22 9 ，82 1 3 8 0 6 z 酣瑚 2 8 51 9 22 6 22 6 13 2 81 6 12 9 52 1 7 8 0 3 m g 瑚5 嘶 2 8 51 9 32 6 02 6 33 2 8 1 6 9 2 9 42 0 9 8 0 3 m g b o s 0 5 2 8 41 9 32 6 02 6 33 3 3 1 5 9 2 9 72 1 2 8 2 0 m g b o s 2 8 51 9 22 6 22 6 13 2 81 6 ，l2 9 52 1 7 8 0 3 m g b 0 5 0 3 2 8 51 9 22 6 22 6 13 2 81 6 12 9 52 1 78 0 3 m g b 嗍2 8 41 9 32 6 22 6 13 2 81 6 12 9 42 1 78 0 1 m g b 蜊2 8 51 9 32 6 02 6 23 3 21 6 52 9 32 1 08 1 i m q b d 4 佗2 8 21 9 52 6 12 6 23 3 31 5 52 9 s2 1 38 2 3 m g b 0 帅l2 8 31 9 42 6 12 6 23 3 21 6 52 9 42 0 98 0 3 m 8 7 3 2 6 2 8 21 9 42 6 32 6 2 斟4 8 5 4 7 12 8 21 9 52 6 22 6 2 a y 4 8 5 4 5 52 8 11 9 52 6 22 6 1 娃蟪5 4 5 72 8 21 9 42 6 32 6 1 m 5 9 0 胁3 6 11 3 63 2 21 8 18 0 9 a v g 2 8 41 9 _ 32 6 12 6 23 3 31 5 92 9 92 1 08 0 6 n n t + n n am e a n sa + t i nt h l r dc o d o np o s i t i o n s 由州oqo讪op譬fkg 譬l。jb：f1v；u：11 hooct、口以mc瑚，lqok h o 碑p 1 e 研 避昧锹甾枷铤网瑚弓鼍涨丰最 cowp醇h奢qhpom【o：zn o k ，k “匝 ：gu；：u6n1，。q8；n；：8gvii：dinu；gi；3 。i。；ii；毒：u ；：暑g on；nq蠢8哥d。氅o：-oni】_毒8；o宴mn菅n；一：o：q，no雪哥口8；：暑gon；：11譬司u警6。氅一：。臣蓄：8；o童昌巷-n；0：o：u鼍墨。置叠蓉8；：量goin；：nu：司8叠d。氅0；8已吾；8；口墨nn季：膏；0：o：yno趸：要f18；譬口。nq鼍nnug；-n；蒈蓬：n；：净叶。1暑8；膏-n鼍：?nq；：3u；il；毫：u；q量；叶nn，ug：n；营善；，8g【iqoo；b；un；：譬3；：净；暑：冀 il；8qin叠。onflfl u0u0；8。0譬譬-n；窖d；皇弓no弓：nn；8u；。r；j：u ；：nng on；：11u：杖看d。【0-。1lf吾8；o叠nn巷：p；0：o：utn。盘委rg ；衄。n on；：旮u：r1wdo望-vo巳v萼：8；o0口；n譬g8 d譬哥譬l。qj司； gqnn。v8u l】萎暑98 h旨1。暑弓g前口口jgg口0_譬口蓍u8委89譬u墨8譬0i】_器nfl8。flg苦暑oo弓笔窨(】目骘口毒 dp嚣p蔷8兮v霹暑8兮06上品。苗6909n=露是d霉9cno等【怨。高毋98n口。葛nnn80上甚g；口9cn=器；苗“n6c高寻怒g99荨0口o暑器99_嚣岔譬p骘口导葛n=09葛8葛“068导nn【8p口篙ngo导o89兮 8 8 8 0 8 0 m66mo88譬上厶譬上上上上皇8召菪召掘8霉口口荨_荨荨葛ocoeeo盆nnnnnnn簧暑= 一r_rrrr_rrr o o q 。邑口090日鐾_ 0 9 0 鼙n 8 0 望n 8 0 目譬【090目鼙 【o寸。四。嚣 h o 甘。四。鼋霜巴 u 目z r舞n h 欲摩掣馨蚺耀捌糖瞄挚啦聪毒麟堪异吸鞲 赛 l 2 o aooo=昏2 一 |甘口nnnn寸nn盆 望 一 |n叶n。nnnn 一荨豁 望 ln崎nnnn n n昌霉； 望 l。一一n 一一一霉零0 窝 呈 l- - _ 。m 。 器罨g 爨篙 望 鲁 l 一一。n 。器石g 饼畚 ： 一一。n nn 嚣譬葛葛墨 望 一 n寸n 葛毯翟雩高。；豁 呈 一一gh 。嚣暑g 毯长 譬 。 t ， h 焉g 篇焉凑器蛊g 罱芸 肆 l 蔫葛雩提葛罱一荨零最罱 鳓羡l | | l 蜜 惑m暑、葛【om暑暑uo甚ocm肖t 一p l咖州i。-qjv mucm-m-州口勺州ooc州异习ohd暑，c口h西一pehm富ov mocm-州口可hpooojc铀oh04量3州事-f山 叫n o【丑醇_ 锭叫划u籁呔删蝴餐甾瑚酶g昨辖球皿嗡雅卜诞v籁呔榭镒椎蜒g匡武也瞳墒弓鼍摊蜷最qn僻 供骞掣址抵瓣摧瓣瞄肇啦聪毒错蚶疑叹蒋 堑星塑壁曼翌墨鱼竺墨塑壁堡垒堂堡堡壅 - 叫 n 0 0 5 图2 6 基于s s u r d n a 基因用邻接法构建的系统树( 左边数值表示n j b o o t s t r a p 值，右边为m pb o o t s t r a p 值，小于5 0 的b o o t s t r a p 值未给出。以h a m e c r u c i g e r a 为外类群。) f i g u r e2 6n jp h y l o g e n e t i ct r e eb a s e do nt h es s ur d n ag e n e ( n jb o o t s t r a p v a l u e s ( 5 0 9 6 ) f r o m1 0 0 0r e p l i c a t e sa r eo nt h el e f t a n dm pb o o t s t r a p v a l u e sa r eo i lt h er i g h t h a s l ec r u c i g e r aw a ss e l e c t e da so u t g r o u p ) 堑旦塑壁翌登丝竺垦塑壁蔓童堂竺婴壅 一一一一 1 0 0 1 图2 7 基于曲正基因用邻接法构建的系统树( 左边数值表示n jb o o t s t r a p 值， 右边为m pb o o t s t r a p 值。以v i t z s c h i al o n g i s m m av a r r e v e r s a 为外类群) f i g u r e2 7n jp h y l o g e n e t i ct r e eb a s e do i lt h e 动虎g e n e ( n 3b o o t s t r a p v a l u e s ( 5 0 ) f r o m1 0 0 0r e p l i c a t e sa r eo nt h el e f t ，a n dm pb o o t s t r a p v a l u e sa r e o nt h er i g h t n i t z s c h i a o n g i s s i m a v a r ，r e v e r s a w a ss e l e c t e d a so u t g r o u p ) 4 0 t l ， 霜蒿岛曼篙鬣蜀昌昌蒿搿。 - 鼍 葛瓮2 焉斜搿高呙品盈。 。 一 一 蒿搿曼；8 搿搿搿瓮高葛瓮 。 一 一 寸卜n 口卜卜“卜、。2 蓦蓦三一 _一q - = 2 。= 22 2 = 2 重量差善 o 卜一a 卜卜崎n 遣誊基暑基 i , w ooo oo 岛饿雕畸叶崎崎卜 善誊荟誉gg dd 6d 6o 一- wm 一一 善菪毫吾暑暑詈 百66d ddd hoo口n。 薹星荟善鲁暑暑 o ooo o6 oo 幛囊o 。崞一 薹薹善荟荟詈詈鲁 o ooooo6石o i n= = 一 善季耋li l 萎；i 寸_h崎 誉晷罾誉誉菪誉善言三三 ooo o ooo o ooo na 囊 霉摹萎萎薹重荟荟善詈詈 oooo ooo ooooo n 2 善爱逞善善誊善誉菪誉兰詈三 oooo oo ood6 66 o 一逞善薹誊基誉g 善蓉菪髻兰三詈 ooooo oo oo ooo 百。 叠号卑誉蓉誉蕾蕾警莒量基爹爹爹 因星垦里里里里宴望善善摹毫专享 锄co篁_西mcozo-j 中p_eo州惑m，善，ocp c 一 一p l一-ioq4riv。co-i。州口可州poo【ojc uolm上ejc可c时p_t，i。每o【_)oc由p_【口 雅卜梅v靼艘鹫啦缎隧箍叫埘v籁昧榭甾杠蜒g星赢世函醐n0l f1麟挺器n琳 o一蕾km芷 n m_【上卜 靛睾掣棼她麟摧瓣越肇啦w霉铸蛳蒜叹嚣 新月细柱藻种复合体及海链最多样性研究 表2 6 用于统计学分析的微藻种及其序列数和遗传距离 t a b l e2 6s p e c i e su s e df o rs t a t i s t i c a lc o m p a r i s o n ，t h e i rs e q u e n c e n u m b e r s ，a n dv a l u e so fg e n e t i cd i s t a n c e 新月细柱藻种复合体及海链藻多样性研究 第三部分海链藻核糖体r n a 基因片段的扩增及多样性 分析 海洋浮游植物是海洋初级生产力的重要组成部分，也是海洋环境指示生 物。水体的理化性质影响浮游植物种类和数量，而浮游植物群落结构变化又 可指示海水质量。赤湖是藻类大量繁殖导致的海水变色现象，现已成为最严 重的海洋环境灾害。海链藻目( t h a l a s s i o s l r a l e s ) 的海链藻属 ( t h a l a s s i o s i r a ) 和骨条藻属( s k e l e $ o n e m a ) 微藻是近岸极常见的浮游性 硅藻，也是形成高纬度海岸春季赤潮的主要种类。以往对胶州湾的浮游植物 调查表明，骨条藻属中的中肋骨条藻( c o s t a t u m ) 是胶州湾的常见种，长 年在数量上都占有很大优势；海链藻属的种类则较少，数量上也不多 近年来，在我国发生了多起海链藻目微藻引发的赤潮，如1 9 9 8 年胶州湾 中肋骨条藻赤潮，2 0 0 1 2 0 0 2 年秋冬季节东南沿海双环海链藻 ( z h a l a s s i o s i r a d i p o r o c y l u s ) 赤潮等。因此，分析表层海水海链藻目微藻 动态变化，快速鉴定海链藻耳微藻藻种是研究赤潮形成过程的重要内容。为 使用分子生物学方法分析主要赤潮形成藻的群落变化、快速鉴定赤潮形成藻 种，我们设计了海链藻日特异引物，并通过胶州湾近岸海水海链藻且s s ur d n a 基因片断的扩增，检验了所设计引物的特异性。 1 材料和方法 1 1 引物设计 从g e n b a n k 下载海链藻日s s ur d n a 基因全长或近全长序列4 5 条，g e n b a n k 收录号为：a j 8 1 0 8 5 4 5 9 、a y 4 8 5 5 2 6 、a y 4 8 5 4 9 9 、 y 4 8 5 4 9 4 、a y 4 8 5 4 7 3 、 a y 4 8 5 4 7 2 、a y 4 8 5 4 6 9 、a y 4 8 5 4 5 2 、a y 4 8 5 4 4 5 、x 8 5 3 9 8 、a j 5 3 5 1 6 6 7 2 、a j 5 3 5 1 6 5 、 a j 5 3 6 4 5 0 、a y 4 9 6 2 0 6 1 3 、a f 3 7 4 4 7 7 8 2 、a f 4 6 2 0 5 8 6 0 、x 8 5 3 9 3 9 7 ，同 时也参考了一些与海链藻目具有较近亲缘关系及胶州湾常见藻类的序列。用 4 3 新月细柱藻种复合体及海链藻多样性研究 d a m b e ( v e r s i o n2 1 ，h t t p ：w w w a i x l u o t t a w a c a ) 对这些序列进行对位 排列，找到海链藻目的保守区段，根据这些区段用p r i m e r5 0 设计引物。用 在线b l a s t ( h t t p ：v m w n c b i n l m n i h g o v b l a s t ) 分析了所设计引物对海 链藻目的特异性和覆盖面，确定1 8 s f5 - g c at t aa g tt g tc g gg c ag g 一3 和1 8 s r 5 c c ag g ac a tc t aa g gg c at c 一3 为海链藻目s s ur d n a 基因 片断扩增引物。 1 2 海水取样及海水浮游生物混合d n a 提取 于2 0 0 4 年7 月中旬采青岛栈桥附近近岸海水，立即带回实验室，用 0 2 2pm 混合纤维素膜过滤收集浮游生物。用液氮研磨后，用c t a b 法抽提浮 游生物混合d n a ，酚、氯仿纯化备用。2 倍c t a b 提取液组份为：l o o m m o l l t r i s h c l ，p h 8 o ；1 4 m o l ln a c i ；2 0 m m o l le d t a ，p h 8 o ；2 c t a b ( w v ) ： 0 1 p v p p ( w v ) 。 1 3s s ur d n a 片段扩增、变异类型文库构建及序列分析 用约5 0 n g 作模板扩增s s ur d n a 基因片段。p c r 反应终体积为5 0 p l 。其 中包括o 2 5 儿e xt a qd n a 聚合酶( 5 u 儿，大连宝生物) ，d n t p 各0 2 m o l l ， 正反向引物各0 2 p m o l l ，l x p c r 缓冲液( m g ”p l u s ) 。扩增程序为：9 5 预 变性3 m i n ：9 4 c 变性l m i n ，5 3 复性l m i n ，7 2 延伸l m i n ，共3 0 个循环； 7 2 延伸l o m i n 。割胶回收p c r 扩增产物，与载体p m d l 8 - t ( 大连宝生物) 连 接，转化感受态j m l 0 9 ，获得s s ur d n a 基因变异类型文库。随机挑选重组子 测序，用d a m b e 软件进行多序列对位排列，用m e g a 2e v e r s i o n2 1 ， h t t p ：删m e g a s o f t w a r e n e t ) 软件构建系统树。将核苷酸测序结果提交 到g e n b a n k 。获得收录号为：t j z 0 1 ，a y 7 8 5 1 6 4 ；t j z 0 2 ，a y 7 8 5 1 6 5 ；t j z 0 3 ， a y 7 8 5 1 6 6 ；t j z 0 4 ，a y 7 8 5 1 6 7 ；t j z 0 5 ，a y 7 8 5 1 6 8 ；t j z 0 6 ，a y 7 8 5 1 6 9 ；t j z 0 7 ， a y 7 8 5 1 7 0 ) t j z 0 8 ，a y 7 8 5 1 7 1 ：t j z 0 9 ，a y 7 8 5 1 7 2 ；t j z i o ，a y 7 8 5 1 7 3 。 新月细柱藻种复合体及海链蕞多样性研究 2 结果与分析 2 ，1 引物覆盖面及特异性分析 引物1 8 s f 能覆盖2 7 条海链藻目的序列，该引物对海链藻目微藻的覆盖 率 6 0 。引物1 8 s r 覆盖3 9 条海链藻目的序列，海链藻目覆盖率为8 6 7 。 引物1 8 s f 和1 8 s r 能同时覆盖2 3 条海链藻目微藻序列，覆盖率为5 1 1 。从 数据库下载的4 5 条序列中，有3 5 条来源于海链藻属，引物对覆盖其中的2 0 条。覆盖率为6 2 9 9 6 ；有1 0 条序列来自骨条藻属，引物对覆盖其中的3 条， 其中2 条为数据库中仅有的中肋骨条藻近全长序列数据库中存在同一个种 重复提交的情况，引物对的实际覆盖率可能会有变化。数据库中海链藻目微 藻的序列还比较少。另外，海链藻目物种组成的复杂，同一物种不同地理类 型也可能存在变异。因此，基于数据库序列的分析只能是一种参考 2 2 海水s s ur d n a 基因多样性分析 用c t a b 法提取的浮游生物混合蜊a 分子均一，分子量在2 1 k b 左右( 图 3 1 ) s s ur d n a 基因片段扩增条带均一( 图3 2 ) 。1 5 0 n gp c r 产物与s o n g 载体连接，获得2 0 0 个左右的重组子随机挑选l o 个重组子测序，获得的序 列长度均为7 4 3 b p ，序列两两之间最多存在1 6 个碱基差异。， 将已知海链藻目微藻s s ur d n a 基因序列与测序所得序列进行多序列对位 排列，构建系统树( 图3 3 ) 。t j z 0 2 、t j z 0 5 、t j z 0 6 、t j z i o 、t h a j a s s i o s i r a c o n c a v i u s c u a 与t j z 0 7 为姊妹类群，支持率为7 2 t j z 0 3 、t j z 0 9 与 t h a l a s s y o s i r ap s e u d o n a n a 最相似，它们与t h a a s s i o s i r at e n e r a 形成姊 妹类群