（遗传学专业论文）银屑病与儿童孤独症的易感基因的突变研究.pdf

分类号u d c 分类号v d c 硕士学位论文 蝴j 荆嗍 密级 银屑病与儿童孤独症的易感基因的突变研究 m u t a t i o ns t u d yo fp r e d i s p o s i n gg e n e sf o r p s o r i a s i sa n d a u t i s m 作者姓名：许晓娟 学科专业：遗传学 学院( 系、所) ：医学遗传学国家重点实验室 导师：夏昆教授 指导小组：胡正茂讲师 潘乾高级实验师 答辩委员 中南大学 2 0 10 年6 月 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名：二触 日期：址年月日 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 硕士学位论文 中文摘要 摘要 一、银屑病患者的f l g 基因突变筛查 银屑病( p s o r i a s i s ，p s ，o m i m1 7 7 9 0 0 ) 是一种常见的慢性炎症 性皮肤病，临床特征为皮肤上出现红斑，并覆有银白色鳞屑，可累 及皮肤任何部位，好发于头皮、躯干及四肢伸侧。病理特征为角质增 厚或角化不全、颗粒层变薄或消失、棘层增厚；细胞间隙增宽，炎症 细胞向表皮和真皮浸润。银屑病在世界范围内发病率约为0 6 , - - , 4 8 ； 据估计我国银屑病患者已接近1 , 0 0 0 万。银屑病多发病于1 5 岁至3 0 岁之间，常伴随患者一生。银屑病被认为是一种多基因遗传病，其发 病机制复杂、至今尚未完全阐明。各种遗传或环境因素主要通过影响 免疫系统、炎症反应通路或表皮功能而致病，吸烟、饮酒、精神紧张 和物理损伤等其他原因也是常见促发因素。 f l g ( f i l a g g r i n ) 基因，位于l q 2 1 3 ，编码丝聚蛋白( f i l a g g r i n ， f i l a m e n ta g g r e g a t i n gp r o t e i n ) 的无活性不溶性前体丝聚蛋白原 ( p r o f i l a g g r i n ) 。丝聚蛋白是透明角质颗粒( k e r a t o h y a l i ng r a n u l e s ， k h g ) 中的主要成份。丝聚蛋白的终产物在皮肤表面形成保湿因子。 f l g 基因的突变可导致表皮角化异常，从而引发相关皮肤病。f l g 基因最早被证明是寻常性鱼鳞病的致病基因，最近又有报导f l g 基 因的突变也会导致特异性皮炎的发生。免疫组化的结果显示银屑病患 者的表皮颗粒层中丝聚蛋白明显减少，提示f l g 基因可能参与了银 屑病的发生。 在本研究中，我们收集了2 个中国汉族银屑病鱼鳞病家系，3 2 8 例中国汉族散发银屑病患者和5 0 0 例正常对照，采用长片断p c r 扩 增和直接测序的方法分析患者与正常人的f l g 基因序列，寻找与银 屑病相关的突变。 我们在家系1 中检测到f l g 基因的无义突变k 4 0 2 2 x ，其中先证 者携带有纯合突变k 4 0 2 2 x ，鱼鳞病患者( i ：4 ，i i ：6 ) 携带有杂合突变 k 4 0 2 2 x ，另有4 个表型正常个体( i ：2 ，i i ：l ，i i ：4 ，1 1 ：5 ) 携带有杂合突变 k 4 0 2 2 x 。在3 2 8 例散发病人中检测到2 个纯合突变k 4 0 2 2 x ，2 2 个 杂合突变k 4 0 2 2 x 。在5 0 0 例正常对照中检测到1 5 个杂合突变 k 4 0 2 2 x 。等位基因频率( z 2 = 1 2 5 6 ，p a ( n l n 3 ) 、c 11 9 4 c t ( n l g n 4 ) 和错义突变g 4 0 6 s ( n l g n 3 ) 、g 8 4 r ( n l g n 4 ) 、q 1 6 2 k ( n l g n 4 ) 、 a 2 8 3 t ( n l g n 4 ) 有可能会导致孤独症的发生；n l g n 3 4 基因的突 变在不同人群中都可导致孤独症的发生；其他孤独症患者可能存在其 它基因的突变。 关键词：孤独症，n l g n ，神经突触，突变筛查 i i i 瓤j ： 鬈，： 硕士学位论文英文摘要 a b s t r a c t c h a p t e r1 m u t a t i o na n a l y s i s o ff l gg e n e i nc h i n e s eh a n p s o r i a s i sp a t i e n t s p s o r i a s i s 【o m i m 17 7 9 0 0 i sac o m m o nc h r o n i ci n f l a m m a t o r y d e r m a t o s i s ，c l i n i c a l l yc h a r a c t e r i z e db yr e dr a i s e dp a t c h e sc o v e d n gw i t h w h i t es c a l eo nt h es k i na n dp a t h o l o g i c a l l yc h a r a c t e r i z e db ya b n o r m a l d i f f e r e n t i a t i o ni ne p i d e r m a ll a y e r s ( h y p e r k e r a t o s i s ，p a r a k e r a t o s i s ，s t r a t u m g r a n u l o s u m a a e n u a t i o no r d i s a p p e a r a n c e ， a n d a c a n t h o s i s ) a n d i n f l a m m a t i o n ( i n t e r c e l l u l a rs p a c ew i d e n ，i n f l a m m a t o r yc e l li n f i l t r a t i o no f t h ed e r m i sa n dd e r m a lv e s s e ld i l a t a t i o n ) b yi n v e s t i g a t i n g ，c u r r e n t p r e v a l e n c ea r e0 6 - 4 8 w o r l d w i d e l y , a n d10m i l l i o np s o r i a s i sp a t i e n t s e x i s ti nc h i n a t h eu s u a la g eo fo n s e to fp s o r i a s i si sb e t w e e n15a n d3 0 y e a r sa n dt h e nu s u a l l yp e r s i s t sf o rl i f e p s o r i a s i si s ak i n do fp o l y g e n i c d i s e a s e ，a n dt h ep a t h o g e n e s yo fp s o r i a s i si ss oc o m p l i c a t e dt h a ti s s t i l l e l u s i v e b ya f f e c t i n g i m m u n e s y s t e m ，i n f l a m m a t i o np a t h w a y , t h e e p i d e r m a lb a r r i e r , v a r i o u so fg e n e t i ca n de n v i r o n m e n t a lf a c t o r s c a u s e p s o r i a s i s s m o k i n g ，d r i n k i n g ，p s y c h e n t o n i aa n dp h y s i c a li n j u r i e sa n ds o o na r ea l s ot h et r i g g e r i n gf a c t o r s f l g g e n e ，w h i c he n c o d e sf i l a g g r i n ，i sl o c a t e dw i t h i nt h ee p i d e r m a l d i f f e r e n t i a t i o nc o m p l e x ( e d c ) o nlq 21 3a n de x p r e s s e dl a t ei ne p i d e r m a l d i f f e r e n t i a t i o n k e r a t o h y a l i ng r a n u l e s i nt h e g r a n u l a rl a y e r a r e p r e d o m i n a n t l yc o m p o s e d o f p h o s p h o r y l a t e d a n di n s o l u b l e p r o t e i n p r o f i l a g g r i n k e r a t o h y a l i ng r a n u l e s i nt h e g r a n u l a rl a y e r a r e p r e d o m i n a n t l yc o m p o s e do ft h ep h o s p h o r y l a t e da n di n s o l u b l ep r o t e i n p r o f i l a g g r i n l o s s o f - f u n c t i o n f l gm u t a t i o nl e a d st oa b n o r m a l d i f f e r e n t i a t i o n ( h y p e r k e r a t o s i s ，p a r a k e r a t o s i s ) i ne p i d e r m a ll a y e r s a n d c a u s er e l a t i v ed e r m a t o s i s 。f l gg e n ei si d e n t i t i e dt oc a u s ei c h t h y o s i s v u l g a r i sf i r s t r e s e n t l y , i ti sr e p o r t e dt h a tf l gg e n ea l s oc a u s ea t o p i c d e r m a t i t i s i m m u n o h i s t o c h e m i c a la n a l y s i sr e v e a l e dam a r k e d l yr e d u c t i o n o ff i l a g g r i ne x p r e s s i o ni np s o r i a t i cs k i n 2p s o r i a s i sc h i n e s eh a n p s o r i a s i s i c h t h y o s i sv u l g a r i sf a m i l i e s ，3 2 8 s p o r a d i cu n r e l a t e dc h i n e s eh a np a t i e n t sw i t hp s o r i a s i sa n d5 0 0c o n t r o l s t v 硕士学位论文英文摘要 s h o w e dt h a ti th a sah i g hi n c i d e n c eo fc h r o m o s o m ea b n o r m a l i t y m a n y r e l a t e dl o c ia n ds e v e r a lp r e d i s p o s i n gg e n e sh a v e b e e ni d e n t i f i e db y s i b l i n g ，f a m i l ys t u d y , c a s e c o n t r o l a s s o c i a t i o ns t u d y ，g e n o m e - w i d e a s s o c i a t i o ns t u d y ( g w a s ) a n ds oo n i ti sd e m o n s t r a t e dt h a tt h ea b n o r m a ln e u r o n a ls y n 印s ei sr e l a t e dt o a u t i s m n e u r o l i g i n sa r ep o s t s y n a p t i cc e l la d h e s i o nm o l e c u l e s ，b yf o r m i n g h e t e r o t e t r a m e rw i t hp r e s y n a p t i cc e l la d h e s i o nm o l e c u l e sn e u r e x i n s ， r e g u l a t et h ef i n eb a l a n c eb e t w e e ne x c i t a t i o na n di n h i b i t i o no f t h es y n a p s e i nh u m a n s ，t h en e u r o l i g i np r o t e i nf a m i l yc o m t a i nf i v eg e n e s ，n l g nl ，2 ， 3 4a n d4 y i ti sr e p o r t e dt h en l g n 3 4m u t a t i o n sc a u s ea u t i s m h o w e v e qn os t u d yo nn l g n sa n da u t i s mh a v ed o n ei nc h i n e s eh a n p e o p l e 3l8s p o r a d i cu n r e l a t e dc h i n e s eh a np a t i e n t sw i t ha u t i s mw e r e i n v o l v e di no u rs t u d y b yr o u t i n ep c ra n dd i r e c ts e q u e n c i n gw ea n a l y z e t h en l g n 3 4 yg e n e so f t h ea u t i s mp a t i e n t s w ei d e n t i f i e das a m e s e n s em u t a t i o nc 16 38 g aa n d1m i s s e n s e m u t a t i o n sg 4 0 6 si nn l g n 3a n das a m e s e n s em u t a t i o nc 119 4 c ta n d3 m i s s e n s em u t a t i o n sg 8 4 r 、q16 2 ka n da 2 8 3ti nn l g n 4 a l lt h e6 m u t a t i o n sh a v en o tb e e ni d e n t i f i e di n2 7 8c o n t r o l s t h e s em u t a t i o n si nn l g n 3 4m a yc a u s ea u t i s m t h en l g n 3 4 m u t a t i o n sc a nc a u s ea u t i s mi nd i f f e r e n tr a c eo fp e o p l e m a y b eo t h e rg e n e m u t a t i o n se x i s ti nt h ep a t i e n t s k e yw o r d sa u t i s m ，n l g n ，n e u r o n a ls y n a p s e ，m u t a t i o n v i 硕士学位论文目录 目录 摘墨要i a b s t r a c t 。i v e j录v i i 缩略词v i i i 主要仪器、试剂与耗材 第一章银屑病患者的f l g 基因的突变筛查1 前言1 。日u吾 1 1 研究对象5 1 2 研究方法6 1 3 结果1 0 1 4 讨论1 4 结论17 第二章孤独症患者的n l g n 3 4 y 基因的突变筛查。1 8 前言1 8日 j吾萏 2 1 研究对象2 5 2 2 研究方法2 7 2 3 结果3 0 2 4 讨论3 4 结 论3 8 参考文献3 9 综述4 8 附录6 9 致谢8 0 攻读硕士学位期间主要研究成果8 l v i i 硕士学位论文 符号说明 a d a s d 9 5 c i c c e c n c n v d z e d c f l g f t g w a s h a p m a p k h g m h c m z n m f o r 缩略词 a t o p i cd e r m a t i t i s a u t i s ms p e c t r u md i s o r d e r 9 5 c o n f i d e n c ei n t e r v a l c o r n i f i e dc e l le n v e l o p e c o p yn u m b e r c o p yn u m b e rv a r i a t i o n d i z y g o u s e p i d e r m a ld i f f e r e n t i a t i o nc o m p l e x f i l a m e n ta g g r e g a t i n gp r o t e i n , t t1 1 a g g n n f l a k yt a i g e n o m e - w i d ea s s o c i a t i o ns t u d y 1 1 1 ei n t e m a t i o n a lh a p m a pp r o j e c t l c h t h y o s i sv u l g a r i s k e r a t o h y a l i ng r a n u l e s m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x m o n o z y g o u s n a t u r a lm o i s t u r i z i n gf a c t o r o d dr a t i o p s p s o r i a s i s s n p s s a s s b s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s p l i c es i t ea s p l i c es i t eb v i i i 特应性皮炎 孤独症谱群疾病 9 5 可信区间 角化细胞被膜 拷贝数 拷贝数变异 异卵双生 表皮分化复合体 丝聚蛋白 鳞状尾巴 全基因组关联研究 国际人类基因组单体型图 寻常性鱼鳞病 透明角质颗粒 主要组织相容性复合体 同卵双生 天然保湿因子 拷贝数 银屑病 单核苷酸多态 剪接位点a 剪接位点b 硕士学位论文 符号说明 主要实验仪器 主要仪器、试剂与耗材 3 1 0 0 3 1 3 0 基因分析仪 p t c 2 0 0p c r 仪 p e 2 7 2 0p c r 仪 d u 6 4 0 紫外分光光度仪 隔水式电热恒温箱 g e ld o cl0 0 0 凝胶成像分析系统 小型垂直电泳槽 低电压电源电泳仪 水平电泳仪 j 6 h c 高速离心机 低温台式离心机 c e n t r i f u g e 5 4 15 d 多用脱色摇床t y - b r o t a t o r 超净工作台 b p i i 型架盘药物天平 移液器 微波炉 主要实验试剂及耗材 o 1 1 0 u lp i p e tt i p 1 0 1 0 0u lp i p e tt i p 1 0 0 1 0 0 0u lp i p e tt i p 0 2 m lp c r 管 1 5 m le p p e n d o r f 管 8t u b e sp e rs t r i p m i c r o a m po p t i o n a l p l a t e p e r k i ne l m e r 公司 m jr s e a r c h 公司 p e r k i ne l m e r 公司 b e c k m a n 公司 上海跃进医疗器械厂 b i o - r a d 公司 b i o r a d 公司 a p p l i g e n e 公司 b i o r a d 公司 b e c k m a n 公司 e p p e n d o r f 公司 e p p e n d o r f 公司 上海市新波无线电厂 a p p l i g e n e 公司 苏州净化工程公司 上海医用激光仪器厂 e p p e n d o r f 公司 格兰仕公司 a x y g e n 公司 a x y g e n 公司 a x y g e n 公司 a x y g e n 公司 a x y g e n 公司 a x y g e n 公司 9 6 w e l lr e a c t i o n a x y g e n 公司 i x j 厶- - - 刖吾 银屑病( p s o r i a s i s ，p s ，o m i m2 0 9 8 5 0 ) ，又称为牛皮癣，是一种常见的慢性 炎症性皮肤病，主要的临床特征表现为皮肤上出现红斑，并覆有银白色鳞屑， 可累及皮肤任何部位，好发于躯干及四肢伸侧，有些病人还伴随着关节炎的发生。 病理特征表现为角化过度或角化不全、颗粒层变薄或消失、棘层增厚；细胞间隙 增宽，炎症细胞向真皮和表皮浸润【2 】。银屑病在世界范围内发病率约为0 6 - - 一 4 8 ；据估计我国银屑病患者已接近1 ，0 0 0 万【3 j 。银屑病多发病于青壮年，常 伴随患者一生。 银屑病的发病机制非常复杂、至今尚未完全阐明。各种研究表明，银屑病是 一种多因子疾病，主要与皮肤损伤、病毒感染、代谢障碍、免疫功能紊乱、精 神因素、环境因素和遗传因素等有关【4 。5 】。调查显示，同卵双生子( m o n o z y g o u s ， m z ) 共患银屑病的几率为6 0 7 0 ，异卵双生( d i z y g o u s ，d z ) 的共患几率为 1 5 2 0 ，同胞中的同患病率为8 2 3 1 6 - 7 】。银屑病的家族聚集性、同胞再患的 危险度和同卵双生异卵双生共患的差异性等研究结果说明银屑病的发病机制与 遗传因素密切相关。 通过基于短串联重复序列( s h o r tt a n d e mr e p e a t s ，s t r ) 的全基因组扫描与 连锁分析，基于单核苷酸多态( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ，s n p ) 的关联研 究和全基因组关联研究( g e n o m e w i d ea s s o c i a t i o ns t u d y ，g w a s ) 等方法发现了 一些银屑病的易感区间，即1 p ，l q ，2 q ，3 q ，4 p ，4 q ，6 p ，8 q ，1 4 q ，1 6 q ，1 7 q ，1 8 p ，1 9 p ， 1 9 q ，2 0 p 和2 0 q 等，其中已有1 2 个位点已被o m i m 数据库收录( 表1 1 ) 。 表1 1o m i m 数据库所收录的银屑病易感位点 易感位点o m i m 号染色体位点报道文献 p s o r s12 0 9 8 5 0 6 p 2 1 3 a s u m a l a h t i ( 2 0 0 3 ) p j p s o r s 26 0 2 7 2 317 q 2 5 c a p o n ( 2 0 0 4 ) p p s o r s 36 014 5 4 4 q t e rm a t t h e w s ( 19 9 8 ) p s o r s 4 6 0 3 9 3 5 1 q 2 1c a p o n ( 1 9 9 9 ) u p s o r s 56 0 4 316 3 q 2 1 e n l u n d ( 19 9 9 ) 卅 p s o r s 66 0 5 3 6 4 1 9 p l3l e e ( 2 0 0 0 ) j j p s o r s 76 0 5 6 0 6 l pp a r h a m ( 2 0 0 2 ) 叫 p s o r s 86 1 0 7 0 7 1 6 qn a i r ( 1 9 9 7 ) t ”j p s o r s 9 6 0 7 8 5 7 4 q 3 l z h a n g ( 2 0 0 2 ) 口j l 硕士学位论文第一章 关。在角质层，通过转谷酰胺酶丝聚蛋白与角蛋白丝，兜甲蛋白，毛透明蛋白， 外皮蛋白等相结合形成角化细胞被膜( c c e ) 。最后，丝聚蛋白蛋白水解，这些游 离的氨基酸通过化学修饰形成保湿因子( n a t u r a lm o i s t u r i z i n gf a c t o r ，n m f ) ，有 助于皮肤的湿润性和柔性【3 m 引。 直到2 0 0 6 年，s m i m 掣3 3 j 首次发现了病人中存在f l g 基因的突变： p r s 0 1 x 和c 2 2 8 2 d e l 4 ，提供了丝聚合蛋白原基因可以导致鱼鳞病的直接证据。 随后，p a l m e r 等在a d 患者中也发现的凡g 基因的突变( p r 5 0 1 x 和c 2 2 8 2 d e l 4 ) 。 进一步研究证实f l g 基因突变导致半显性( s e m i d o m i n a n t ) 遗传且不完全外显的 性状发生，杂合子症状较轻或无症状显现，而纯合子或复合杂合子症状较重。 小鼠的f l g 基因位于3 号染色体，与人类高度同源及结构相似，且属于e d c 成员，为研究人类f l g 基因提供了一个很好的工具。r i c h a r db 等p 4 j 构建鳞状尾 巴( f l a k yt a i ，f t f t ) 小鼠模型模拟人类f l g 基因的突变。这些受累小鼠表现为尾 巴和爪子上有大小不等的不规则的鳞屑，颗粒层变薄，棘层加厚，表皮角质化异 常，炎症浸润角质层，丝聚蛋白的表达量明显减少。f a l l o n 等在r i c h a r db 的基 础上研究f t f t 小鼠，通过直接测序检测到f - t f t 小鼠携带有f i g 基因第六个重复单 元的突变5 3 0 3 d e l a 。t i f f a n yc 等人进一步研究f t f t 小鼠模型，发现f t f t 小鼠颗 硕士学位论文 第一章 r s o i x6 8 6 7 d e l g 1 1 0 2 9 d e l a 0 3 3 d , e 1 4l2 2 8 2 d e l 4r w j o d e i l ； 懈掣，x 楸i a $ 3 2 4 7 x n i 眯 6 8 i x l l 吖如l ，le u 话蔺lilil0 0 、lj 上l 、 i 1 即曩 归 ! i3 456 78 - o 8 o 9i 口l 舻o ljiik 。l 千 一 、t j 、t 。k i 回卜d e l 4 4 1 2 姻j 1 一i 。 、0 1 2 轴x 垦委 7 9 q 5 埘r 埘x k 1 0 2 2 x 融圃 鼍。 | 3 3 2 jd e l a 臣阙 咖1 s l 的5 xs 2 55 4 x s 2 8睁xs 3静i 丘x k 1 0 2 2 x q 1 7 0 e 【 $ 1 4 b f 一一向岫 函司 靴i r d簟p m a b l f l gz l p e , l 一b d m m i 臣叫 3 3 2 1 d e i a q 到1 7 x f l 6 _ _ - c - u m k m l 岫 图卜1 丝聚蛋白原( p r o f i l a g g r i n ) 的结构及已报导的突变分布 寻常性鱼鳞病( i c h t h y o s i sv u l g a r i s ，i v ) 是常见的遗传性皮肤角化障碍性疾 病，病理表现为表皮中度角化过度，伴颗粒层变薄或消失，棘层肥厚，真皮层小 血管周围可见少量炎细胞浸润，临床表现为四肢伸侧或躯干部皮肤干燥、粗糙， 伴有菱形或多角形鳞屑，外观如鱼鳞状或蛇皮状，重者皮肤皲裂、表皮僵硬、导 致自身汗毛稀少、排汗异常，致使体内水液代谢失衡，影响内分泌系统。而银屑 病的病理表现为角化过度或角化不全、颗粒层变薄或消失、棘层增厚；细胞间隙 增宽，炎症细胞向真皮和表皮浸润【2 】，临床表现为皮肤覆有银白色鳞屑的红斑： 可累及皮肤任何部位，好发于头皮、躯干及四肢伸侧。从和p s 的病理特征 和临床特征来看，都有角质化发生异常，颗粒层变薄或消失，棘层肥厚，伴有炎 症反应。 2 0 0 7 年，h o f f m e i e ru 等对3 7 5 个银屑病患者针对f l g 进行突变筛查，并没 有发现任何突变，但是对其中l o 个病人通过免疫组化研究丝聚蛋白的表达，发 现患者表皮中丝聚蛋白的表达明显下降【3 副。2 0 0 8 年，c h a n gy c 等针对f l g 基 因中的一个s n pr s l1 5 8 4 3 4 0 做关联分析，得到p - - o 0 2 ，统计学意义显著，表明 了兕g 基因可能是银屑病的一个易感基因i 刈。 病理，免疫组化以及病例对照关联性研究的结果提示f l g 基因可能参与了 银屑病的发生。本研究旨在利用直接测序的方法对2 个银屑病家系以及3 2 8 个散 发银屑病患者针对f l g 基因进行突变筛查，探讨f l g 基因是否为银屑病的致病 基因。 4 硕士学位论文第一章 1 1 研究对象 在本研究中，我们共收集到2 个核心银屑病家系和3 2 8 位散发银屑病患者， 以及5 0 0 个正常个体。 家系1 来自湖南岳阳，3 代共1 4 人，所有成员经过中南大学湘雅医院皮肤 科专科检查，确诊患者3 人，包括银屑病患者1 人，属男性，鱼鳞病患者2 人， 属女性( 图1 2 a ) 。先证者0 i i 2 ) 表现为典型的银屑病症状，四肢与躯干皮肤表 面密集分布肥厚性红色斑块，表面粗糙，有细小鳞状脱屑。其病理组织切片表现 为角化过度伴随角化不全，颗粒层增厚，棘层肥厚，真皮浅层毛细血管扩张、充 血，周围可见淋巴细胞和少数中性粒细胞浸润( 图1 3 ) 。此外，家系中i ：4 和 i i ：6 患有鱼鳞病，表现为典型的鱼鳞病症状：皮肤干燥，四肢伸侧及背部皮肤 有类似鱼鳞状脱屑。 家系2 来自湖南怀化，3 代共9 人，所有成员经过中南大学湘雅医院皮肤科 专科检查，确诊患者3 人，包括男性患者1 人，女性患者2 人( 图1 2 b ) 。先证 者( i i i 2 ) 表现为典型的银屑病症状。此外，家系中i i ：5 患有鱼鳞病，表现为典 型的鱼鳞病症状。 i i i ：1 7 1 1 1 = 2 b 1 1 i ：1 图1 2 银屑病家系系谱图 a 为家系1 的系谱图，b 为家系2 的系谱图。箭头表示家系中银屑病先证者。 一表示银屑病患者，o 表示鱼鳞病患者 散发银屑病患者均来源于中南大学湘雅医院皮肤科门诊和中南大学医学遗 传学国家重点实验室遗传病咨询门诊。3 2 8 位散发银屑病患者全部表现为典型的 银屑病症状。5 0 0 个正常个体的d n a 样本来源于中南大学医学遗传学国家重点 实验室d n a 库。 硕士学位论文 第一章 图1 - 3 银屑病家系l 先证者的临床特征和病理切片 a 为患者的背部照片，皮肤表面密集分布肥厚性斑块，表面粗糙，有细小鳞状脱屑( 照片时 病人由于药物治疗病情已有所好转) ；b 病理切片照片，我 t r i - - d , ：z 看到患者表皮角化过度伴 角化不全，颗粒层增厚，棘层肥厚，真皮浅层毛细血管扩张、充血，周围可见淋巴细胞和少 数中性粒细胞浸润 1 2 研究方法 1 2 1 外周血g d n a 抽提 抽取2 3 位银屑病家系成员( 其中银屑病患者3 人，鱼鳞症患者3 人) 和3 2 8 位散发患者各1 0 m l 外周静脉血，受检者均签署了知情同意书。外周血使用常规 苯酚、氯仿方法抽提g d n a ( 分子克隆，第3 版) 【3 刀。d n a 样本使用l t e 缓冲 液溶解。 1 2 2d n a 浓度标准化 待测样本用紫外分光光度计读出2 6 0 n m 与2 8 0 r i m 的o d 值，从o d 2 6 0 o d 2 8 0 的比值即可判断样本的纯度。纯d n a 的o d 2 6 0 o d 2 8 0 应为1 8 2 0 。样本中如 含有杂蛋白和苯酚，o d 2 6 0 o d 2 8 0 比值会明显降低。根据样本的o d 值即可计 算其浓度。最后，用1 t e 缓冲液稀释d n a 样本至终浓度为5 0 n g v 1 。注明编 号等资料，置于2 0 保存。 1 2 3f l g 基因的突变检测 6 硕士学位论文 第一章 f l g 引物的设计与合成 参照s a n d i l a n d sa 等删报道的引物定购了覆盖整个f l g 基因的引物，由上 海生工生物技术公司合成。引物序列如下见表1 2 。同时由于扩增片段过长，又 设计了针对每对扩增引物的测序引物。具体测序引物见表1 - 3 。 表1 - 2f l g 基因突变检测引物一览表 表1 3f l g 基因测序引物表 7 硕士学位论文 第一章 9 4 1 2 m i n j 9 4 5 0 s 2 哪慨 6 3 。c 5 0 s 瑚2 cl m i n- 9 4 。c 5 0 s ( 0 5 c c y c l e ) 2 6 c y c l e s 5 6 c 5 0 s 7 2 c 5 0 s 一一7 2 c 1 5 m i n 一一- 1 0 + 图l - 4 热启动p c r 循环程序 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 取2 u lp c r 反应产物，加入0 5 u l 的6 非变性载样缓冲液，混匀后在6 聚 丙烯酰胺凝胶上( 3 0 丙烯酰胺6 m l ，1 0 t b e1 5 m l ，t e m e d l 5 1 a l ，1 0 a p s3 0 0 9 l ， 加鞭3 0 【i 】1 1 3 0 0 v 电泳4 0 分钟，用银染法显色：固定液固定3 0 秒一染色液染 色l o 分钟一一蒸水漂洗两次一显色液显色，至出现清晰的产物带型。 测序 跑胶检测后，对扩增特异性好的p c r 产物用虾碱性磷酸酶和核酸外切酶处 理( 表1 5 ) ，3 7 酶切9 0 m i n ，8 0 1 5 m i n 灭活虾碱性磷酸酶和核酸外切酶，处 理完后的产物用a b i3 1 0 0 3 1 3 0 基因分析仪进行自动化测序。 表1 5 虾碱性磷酸酶和核酸外切酶处理的试剂组成 试剂( r e a g e n t s ) 体积( v o l u m e ) 1 0 s a pb u f f e r s a p ( 1 u 9 1 ) e x o n u c l e a s ei ( 2 0 u - t 1 ) p c r 产物 d d h 2 0 0 2m 0 8m 0 2p l 8 0 山 o 8g l 1 2 4 结果分析 测序结果分析 测序结果用d n a s t a r 软件中的e d i t s e q 、s e q m a n 程序分析，以n c b i 数据 库( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v ) 中f l g 基因标准序列( g e n b a n ka c c e s s i o nn o ： 9 硕士学位论文第一章 c 3 5 0 0 c g r s 5 8 0 0 1 0 9 4g c a g g aa l a l1 6 7 g l y c 4 0 7 9 g ar s l l 5 8 6 6 3 lc g c c a c a r 9 13 6 0 h i s c 4 1 2 6 a gr s l1 5 8 1 4 3 3a g a g g a a r 9 13 7 6 g l y c 4 3 0 2 c a u n r e p o r t e d a g c a g gs e r l4 3 4 a r g c 4 51 3 c t u n r e p o r t e d c a c u a uh i s l5 0 5 t y r c 4 5 1 5 c t u n r e p o r t e d c a c u a u h i s l 5 0 5 t y r c 4 5 8 9 c t u n r e p o r t e d g c c g u aa l a l5 3 0 v a l c 4 5 9 0 c a u n r e p o r t e d g c c g u aa l a l5 3 0 v a l c 4 8 3 9 g t u n r e p o r t e d u c g u c us e r c 4 8 5 5 1 c u n r e p o r t e d u a u c a u t y r l 6 1 9 h i s c 4 8 9 3 g c u n r e p o r t e d a g g a g c a r 9 1 6 3 1 s e r c 4 8 9 4 a c u n r e p o r t e d a a c c a ca s n l 6 3 2 h i s c 4 8 9 9 c g u n r e p o r t e d c c c c c up r o c 4 9 0 0 a g u n r e p o r t e d a g g g g g a r 9 1 6 3 4 g l y