（遗传学专业论文）少棘蜈蚣线粒体基因组全序列和平耳孔蜈蚣的地理种群遗传变异分析.pdf

南京师范大学2 0 0 7 届硕士论文 中文摘要 摘要 本论文包括三部分： 第一章：多足动物线粒体基因组和地理种群遗传变异分析的研究进展。 第二章：补齐少棘蜈蚣线粒体基因组全序列。 采甩长片断扩增和p c r 引物步移测序等方法，补齐少棘蜈蚣 ( s e o l o p e n d r am u l t i l a n ) 线粒体基因组全序列，主要结果如下： ( 1 ) 序列全长为1 3 ，7 3 4b p ，其基因组成和顺序、基因的方向即编码链 的选择、碱基g 的低含量和对碱基a 偏好以及g c 和a t 偏斜与已知的 多足动物线粒体基因组相同。 ( 2 ) 蛋白质编码基因的终止密码子只有t a g 和t a a 2 种，与其它多足 动物不同。 ( 3 ) 基因组中出现了较多的基因重叠区域。 ( 4 ) 基因排列顺序与石蜈蚣最为相似，二者之间仅有1 个t r n a 基因的 位置发生重排。 第三章：用线粒体c o b 基因部分序列探讨中国平耳孔蜈蚣地理种群的遗传变异。 对五个种群1 1 个样地5 8 个平耳孑l 蜈蚣个体的c o b 基因部分序列变异分 析，共定义2 6 个单元型。基于单元型构建m l 和b a y e s i a n 系统发生树， 各样地平耳孔蜈蚣的单元型呈现一种混杂的分布格局。t c s 网络图和最 小跨度网络图( m s n ) 显示了单元型之间的最小突变步数，分析显示出现了 多处祖先单元型( h m ，s h y l ，s y c l ，s y c 2 ，s j z l ) ，并且其它单元型 以祖先单元型为中心呈星状辐射排列。种群的遗传多样性波动范围比较 大，单元型多样度( h ) 范围为o 1 0 0 0 ；核苷酸多样性指数( 兀) 介于o o 1 8 1 6 2 之间。根据节肢动物分子钟，推断现代平耳孔蜈蚣遗传分布格局 中，现代乎耳孔蜈蚣遗传分布格局比较古老，早在第三纪中期就已经形 成，可见更新世的冰期对蜈蚣没有影响，因为在冰期之前它们就已经开 始分化了，所以表现出多个祖先单元型。从五个种群的分歧时间我们可 以看出，华南种群和华中种群为古老的平耳孔蜈蚣种群，而东北种群和 华北种群黄淮平原亚区为较现代的种群，形成这样的分布格局也体现了 动物对温度的适应性。 关键词：多足动物线粒体基因组少棘蜈蚣遗传变异分析细胞色素b 平耳孔蜈蚣 南京师范大学2 0 0 7 届硕士论文英文摘要 a b s t r a c t t h i st h e s i si n c l u d e st h r e ec h a p t e r s ： c h a p t e r1 ：r e c e n tp r o g r e s so nm y r i a p o d am i t o c h o n d r i a lg e n o m ea n dg e n e t i cv a r i a t i o n a n a l y s i so fo t o s t i g m u s ( 0 ) p o l i t u sp o p u l a t i o n s c h a p t e r2 ：r e p l e n i s h m e n to ft h e m i t o c h o n d r i a lg e n o m eo fs c o l o p e n d r am u l t i l a n m i t o c h o n d r i a ld n a e x t r a c t i o n , l o n g p c ra m p l i f i c a t i o n a n d p r i m e r - w a l k i n gs e q u e n c i n gm e t h o d sw e r ec a r r i e do u tf o rd e t e r m i n i n gt h e c o m p l e t em td n as e q u e n c eo f s c o l o p e n d r a m u l t i l a n ( 1 ) t h ec o m p l e t em i t o c h o n d r i a lg e n o m eo fs c o l o p e n d r am u l t i l a ni s1 3 ，7 3 4 b p i ns i z e i t s c o m p o n e n t s ，g e n eo r d e r , g e n eo r i e n t a t i o n ，l o w p e r c e n t a g eo f g u a n i n ea n dh i g hp e r c e n t a g eo f t h y m i n ea sw e l la ss k e w o f b a s eg ca n da ta r em o r es i m i l a rw i t hm y r i a p o d a s ( 2 ) i ti sf o u n dm a n ya d j a c e n tg e n e so v e r l a p s ( 3 ) t h e r ea r eo n l y2s t a n d a r ds t o pc o d e s 瞰a n dt a gf o rp r o t e i ng e n e s ， t h i si sd i f f e r e n tf r o mo t h e rm y r i a p o d a s ( 4 ) c o m p a r a t ol i t h o b i u s f o r f i c a t u s ，t h e r ei so n l yo n et r n ad i f f e r e m c ei n r e a r r a n g e m e n t c h a p t e r3 ：w ee x p l o r e dg e n e t i cv a r i a t i o na n a l y s i so f u s i n gp a r to f m i t o n c h o n d r i a lc o b g e n es e q u e n c eo fo t o s t i g m u s ( o , ) p o l i t u s at o t a lo f2 6h a p l o t y p e sw e r e d e f i n e db ys e q u n c e sv a r i a n c e ，a n d5 8i n d i v i d u a l sw e r ec o l l e c t e df r o m1 1 l o c a t i o n si nf i v ep o p u l a t i o n s p h y l o g e n e t i et r e e s ( m la n db a y s i a n ) o f h a p l o t y p e sa r ev e r yc o n f u s i o n t h ed i a g r a m so ft c sa n dm s n r e v e a lt h a t o t o s t i g m u s ( o ) p o l i t u sh a v em a n ya n c e s t a lh a p l o t y p e s ( h b l ，s h y l ， s y c l ，s y c 2 ，s j z l ) ，w h i c hh a v em a n yr a d i a t i o nf o r m i n ga ”s t a r l i k e s h a p e h a p l o t y p ed i v e r s i t y i s ( 1 1 ) b e t w e e no 1 0 0 0a n dn u c l e t i dd i v e r s i t y ( 兀) b e t w e e n0 o 1 8 1 6 2 ，w h i c hs h o w st h a tt h er a n g eo f g e n e t i cd i v e r s t yi s v e r yl a r g e a c c o r d i n gt om o l e c u l a rc l o c ko fa r t h r o p o d s ，o u rd a t as u g g e s t s t h a tt h ed i s t r i b u t i o np a t t e mo fo t o s t i g m u s ( o ) p o l i t u si s v e r yo r i g i n a l ， w h i c hf o r m e da f t e rt h em i d d l eo ft e r t i a r y p e r i o d ，s oi tm a y b en o t i n f l u e n c e db yg l a c i a lp e r i o d si nt h ep l e i s t o c e n e t h e r e f o r et h i si s w h y t h e r ea r em a n ya n c e s t a lh a p l o t y p e s i ti sp o p u l a t e dt h a ts o u t hc h i n aw i l d b o a ra n dc e n t r a lc h i n aw i l db o a ra r eo r i g i n a lp o p u l a t i o n s ，b u tu s s u r i a n 南京师范大学2 0 0 7 届硕士论文 英文摘要 u s s u r i a nw i l db o a ra n dn o r t hc h i n aw i l db o a ra r em o d e mp o p u l a t i o n s ， w h i c hi se m b o d i m e n to f a n n i m a l sh o wt os u i tt oc l i m a t i cc h a n g e k e y w o r d s ：m y f i a p o d a ；m i t o c h o n d r i a l g e m o m e ；$ c o l o p e n d r am u l t i l a n ；g e n e t i cv a r i a t i o n a n a l y s i s ；c o b ；o t o s t i g m u s ( o ) p o l i t u s i l l 学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 2 、论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经 发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢 意。 作者签名： 日期： 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名： 日期： 南京师范大学2 0 0 届硕士论文 第一章综述 第一章多足总纲线粒体基因组和地理种群遗传变异 分析研究进展 1 1 多足总纲线粒体基因组的研究进展 到目前为止，节肢动物线粒体基因组已经有1 1 8 条全序列公布于g e n b a n k ， 其中包括六足类6 2 条，甲壳类2 9 条，螯肢类2 2 条，多足类5 条。但是目前多足动 物全序列的报道序列非常少，仅有5 条序列包括：唇足纲i t h o b i u s f o r f i c a t u s , s c u t i g e r ac o l e o p t e r a t a ) 两条、倍足纲( n a r c e u sa n n u l a r u s , t h y r o p y g u ss p ) 两条和综 合纲( s c u a g e r a l l ac a u s e g a e ) - - 条。这个结果为节肢动物系统发育学分析提供了新 的证据。可见提供更多的关于多足动物线粒体基因组全序列信息，才能更为准确 的构建系统发生树。进而探讨节肢动物门各纲间的系统发生关系。 1 1 1 多足总纲线粒体基因组的研究背景 从已发表的5 种多足动物线粒体全序列来看，线粒体基因组的长度在1 4k b 1 6k b ，是共价闭合的环状双链d n a ，根据碱性氯化铯密度梯度离心中双链密度不 同分为重链( h 链) 和轻链( l 一链) 。多足动物线粒体基因组在遗传上具有自主性， 每个细胞中有l ，o o o 1 0 ，0 0 0 个拷贝，并且容易从组织中提纯，重复性好，可在电镜 下观察到。分子量较小，处于限制性内切酶的分析范围。基因组的结构比较简单、 稳定，便于进行结果分析。在所有的绝大多数的多足动物中，个体内的线粒体d n a 具有高度的均一性，一般无组织特异性。 多足动物的线粒体基因组虽然大小不同，但它们在基因组成上却很保守，和 其它节肢生物一样。包含1 3 个蛋白编码基因包括细胞色素b 基因，细胞色素c 氧化酶3 个亚基基因( c o x l ，c o x 2 ，c o x 3 ) ，n a d h 氧化还原酶7 个亚基基因( n a d l ， n a d 2 ，n a d 3 ，n a d 4 ，n a d 4 l , n a d 5 ，h a d 6 ) 和a t p 酶2 个亚基基因( a t p 6 , a t p 8 ) ，这1 3 个蛋白或亚基都是线粒体内膜呼吸链的组分，2 个线粒体核糖体r n a 基因( r r n s 、 r r n l ) ，2 2 个翻译线粒体自身编码的蛋白质所必需的t r n a 基因，其中1 8 个t r n a 基因分别对应1 8 种不同的氨基酸，特殊的是丝氨酸和亮氨酸t r n a 分别有两个， 分别是t r n l ，( c u n ) 、t r n l 2 ( u u r ) 、t r n s l a g 叻、t r n s 2 ( u c n ) 。除此还普遍存在一 个大的非编码区，因为该区富含a + t 碱基所以又称为a + t 丰富区，它的长度变 化很大( 2 0 0b p - - 1 3 ，0 0 0b p ) 。 多足动物的蛋白质编码基因的起始密码子一般为t a n ，同时还存在一些特殊 的起始密码子如下：( 1 ) t t g ( 2 ) a c g ，( 3 ) t c g ，( 4 ) t t a ，( 5 ) g t g ，( 6 ) 4 个核苷 酸的起始密码子a t a a 、a t t a 、a t c a 。这些特殊的密码子多出现在c o x l 基因中， 南京师范大学2 0 0 届硕士论文 第一章综述 它们在参与后来的蛋白质翻译的过程中，可以在转录为m r n a 后r n a 编辑转换成 正常的起始密码子完成翻译过程。蛋白质的终止密码子有四种类型，分别为正常 的t a a 、t a g 和两个不完整终止密码子t a 和t 。不完整的密码子较为常见，它们 在转录为m r n a 后由3 端的多聚腺苷酸尾可以将其补全。 动物线粒体d n a 由于是通过母系遗传，基因的序列一般保守，与核d n a 相比相对较小，序列变异相对迅速，因此，m t d n a 用于进化和系统研究具有一 定的优势。动物m t d n a 进化的速率在谱系间、基因间以及基因内部都有所不同， 但进化率平均是单拷贝核d n a 的l 2 倍。在线粒体内，有的m t d n a 区段变异 快，而另一些则高度保守，这使得不同的区段适于分析不同的分类单位水平( l i u a n db e c k e n b a e h ，1 9 9 8 ) 。根据m t d n a 区段或基因的序列来构建分子系统树，并 进而进行分类和进化分析的研究较多。 线粒体基因顺序是研究生物较高阶元系统发育的一种非常有用的工具，近些 年来已经利用该类数据重建了鸟类、有袋类、棘皮动物、线虫类等生物类群的进 化关系。b o o r e ( 1 9 9 8 ) 还对线粒体基因组顺序数据用在重建系统发育的可行性 进行了论证。并在1 9 9 5 年利用该数据进行了节肢动物系统发育学重建，可能是因 为当时多足动物全线粒体基因组的数据很少，b o o r e 得出的结论支持有颚类假说， 本文从现在有的7 0 多种节肢动物线粒体基因组排序分析发现，六足动物和甲壳动 物在基因排列上相似共享排序( c o x l ，l 2 ，c o x 2 ；n a d l ，一t r n l l ，- r r n l ) ，而多足 动物和螫肢动物相似共享排序( h a d l ，t r n l 2 ，一t r n l l ) 。这与以前提出的4 种假说 都有矛盾。该结果和利用核r r n a 基因得到的结果吻合，除了分子证据外还存在 一些形态证据也证明甲壳动物和六足动物的关系要比多足动物近，如小眼的结 构、中枢神经系统的发育特征等。 1 1 2 多足总纲线粒体基因组的重排 1 1 2 1 节肢动物线粒体基因排列顺序的变化 尽管线粒体基因组的进化速度较快，但是3 7 个基因的排列在很长的一段进化 时间内却保持不变，门内不同纲的动物比不同门的动物表现更高的相似性。线粒 体基因组包含3 7 个基因，理论上存在很大的重排潜力，但从现有数据来看重排现 象并不频繁。以此推测不同物种问共享的重排顺序不可能是由于趋同进化而产生 的，更可能是预示着物种之间的某种系统发育关系。基于以上特点，线粒体基因 组排序比较适合解决较高阶元的生物系统发育关系。线粒体基因组排列虽然具有 多样性，但是重排后的线粒体基因组并不受自然选择的限制，不会产生致死效应， 对线粒体的功能影响也很小。大部分多足动物的线粒体基因组都和果蝇的排序一 致。但许多种类也存在着重排现象：重排多为t r n a ，而且某些区域的t r n a 重排 2 南京师范大学2 0 0 届硕士论文 第一章综述 的频率非常高，如位于非编码区附近的t r n a 及t r n a 簇( k ，功，似、r ，s 、 e ，用，( ，q ， 力，r 矽、c 、d ，而蛋白质基因及r r n a 基因却很少发生重排。 d o w t o n 和a u s t i n ( 1 9 9 9 ) 发现在膜翅目中线粒体基因组重排都发生在寄生生活的种 类中，而专性外寄生虱目昆虫h e t e r o d o x u s m a c r o p u s 重排也很频繁，在已研究过 的双翅目昆虫中重排也多发生在外寄生的按蚊中。而且倒位( i n v e r s i o n ) 也多发于 寄生性昆虫中。重排现象很可能和节肢动物的寄生性生活有关。 节肢动物的m t 基因组具有典型的3 7 条编码基因，在少数种类中还有重复的 t r n a 基因或t r n a 基因的假基因( c a m p b e l l & b a r k e r , 1 9 9 9 ：s h a o & b a r k e r , 2 0 0 3 ) 。 一些种类在非编码的a 盯丰富区会发生变化：在蛛形纲蜱螨类血红扇头蜱 ( r h i p i c e p h a l u ss a n g u i n e u s ) 和牛蜱( b o o p h i l u sm i c r o p l u s ) 的m t 基因组中a + t 丰富区 被5 条蛋白编码基因和8 条t r n a 基因分隔，形成2 个区段( b l a c k & r o e h r d a n z ，1 9 9 8 ： c a m p b l e & b a r k e r , 1 9 9 9 ) ；在昆虫纲缨翅类豫r p si m a g i n i s 的m t 基因组中，发生重 排的a + t 丰富区被1 8 条基因所分隔( s r m o & b a r k e r , 2 0 0 3 ) 。r a i m o n de ta t ( 1 9 9 9 ) 用 r f l p 方法在等足目( i s o p o d a ) 寻常平甲虫似r m a d i l l i d i u mv u l g a t e ) 的研究中首次发 现巨大的m t 基因组，其m t d n a 的酶切片段长度之和达到2 0 4 2k b ，为节肢动物之 最。但是。有关该物种的m t 基因组全序列尚未见报道。 节肢动物m t 基因组大小的变化受a + t 丰富区长度变化的影响十分显著。a + t 丰富区的长度最短为2 6 3b p ，最长达4 ，6 0 1b p ，两者相差4 ，3 3 8b p 。前者见于血红 扇头蜱，后者见于黑腹果蝇。a + t 丰富区的这种长度变化主要与重复单元( r e p e a t u n i o 的长度和拷贝数的变化有关( z h a n g & h e w i t t ，1 9 9 7 ) 。尽管多数相邻的m t 基因 具有结构上的简约性，但在某些相邻基因之间仍存在长度不等的非编码序列，被 称为基因间隔区。节肢动物m t 基因组中，基因间隔区的数量、位置以及长度在不 同种类之问有一定差异，也因此影响基因组大小的变化。d y a c u b a 与黑腹果蝇之间 具有7 个相对应的基因间隔区，但各间隔区的长度不同；弹尾类t e t r o d o n t o p h o r a b i e l a n e n s i s 各基因之间共有1 0 5b p 的基因间隔，各间隔区的大小在l 3 3 b p ( n a r d i e ta l ，2 0 0 0 ；2 种按蚊q n o p h e l e ss p p ) 基因间隔区的长度总和分别是4 3 和4 7b p ( c o c k b u m e ta t , 1 9 9 0 ：b e a r de ta l , 1 9 9 3 ) , 蜜蜂( a p i sm e l l i f e r al i g u s t i c a ) 的基因间 隔区总和则长达6 2 0b p ( c r o z i e r & c r o z i e r , 1 9 9 3 ) 。 在一些节肢动物线粒体基因组的研究中发现该区域存在着与基因复制和转 录相关的调控元件。1 9 9 7 年z h a n g 和h e w i t t 在果蝇和蝗虫的控制区发现存在着 明显的茎环结构，推测这种结构可能和d n a 的复制、转录有关系，而后来研究 发现如果控制区茎环结构中的核苷酸发生突变，最终会导致线粒体基因组的基因 重排。在很多节肢动物的线粒体基因组中还含有一些短的非编码区，又称为基因 间隔区，如甲壳动物介形纲壮肢目v a r g u l ah i l g e n d o r f i i 的线粒体基因组中含有三 南京师范大学2 0 0 届硕士论文 第一章综述 个非编码区，虱目h e t e r o d o x u sm a c r o p u s 的线粒体基因组中非编码区共3 9 2b p ， 其中有两个比较大的长度分别为7 3b p 、4 7b p 剩下的2 7 2b p 散在分布于基因编 码间隔区。在其它生物线粒体基因组研究中曾发现有线粒体基因组分发生改变的 情况，该现象在一些节肢动物中也存在如缨翅目的苹蓟马t h r i p s 砌呼腑线粒体 基因组多出了一个t r n a s e r ，和两个t r n a 假基因。 1 1 2 2 多足总纲线粒体基因基因顺序变化类型及特点 对5 种多足类m t 基因组的研究揭示出4 种不同类型的基因顺序( l a v r o ve ta l ， 2 0 0 0 b ；2 0 0 2 ) ：唇足纲伍i t h o b i u s f o r f i c a t u s ) 、唇足纲( s c u t i g e r ac o l e o p t e r a t ) 和综合 纲( s c u t i g e r a l l ac a u s e g a e ) 的基因顺序与t r n a 基因重排；但2 种倍足动物( n a r c e u s a n n u l a r u s 和t h y r o p y g u ss p ) 的基因顺序与前者相比，至少有4 条基因发生了重排， 具有不同转录极性的基因成簇排列在基因组中，彼此之间被两个非编码区隔离 开来，这种排列类型在动物m t d n a 中是比较罕见的。 唇足纲l i t h o b i u s f o r f i c a t u s 和综合纲s c u t i g e r a l l a c a u s e g a e e d l 3 个蛋白编码基 因中顺序与典型的节肢动物线粒体基因排列相同为：c o x l ，c o x 2 ，a t p 8 ，a t p 6 ， c o x 3 ，n a d 3 ，h a d 5 ，n a d 4 ，h a d 4 ，h a d 6 ，c o b ，n a d l ，r r n l ，r r n s ，a + t 丰富区， n a d 2 。唇足纲s c u t i g e r a c o l e o p t e r a t a 中1 3 个蛋白编码基因中顺序为c o x l ，c o x 2 ， a t p 8 ，a t p 6 ，c o x 3 ，n a d 5 ，n a d 4 l ，h a d 6 ，n a d l ，n a d 3 ，n a d 4 ，c o b ，r r n l ，r r n s ， a 十t 丰富区，n a d 2 。其中n a d 3 ，n a d 4 ，c o b ：一个蛋白编码基因发生重排。倍足纲 ( n a r c e u s a n n u l a r u s ，t h y r o p y g u s s p ) 中1 3 个蛋白编码基因中顺序为c o x l ，c o x 2 ， a t p 8 ，a t p 6 ，c o x 3 ，n a d 3 ，n a d 6 ，c o b ，a + t 丰富区，h a d 5 ，n a d 4 ，n a d 4 l ，n a d l ， r r n l ，r r n s ，h a d 2 。其中n a d 6 ，c o b ，a 十t 丰富区三个蛋白编码基因发生重排。 唇足纲l i t h o b i u s f o r f i c a t u s 中t r n a 的排列序列为k ，d 、g 、4 、r ，、研、 e ，日、兀p ，岛，三，工2 、v c ，m 、q 、1 、w ，y 。唇足纲s c u t i g e r a c o l e o p t e r a t 中t r n a 的排列序列为k 、d ，g ，a ，r 、研、e 、f 、s 2 ，m ，c 、y 、n ，h 、t 、 p ，厶l t 、v 、i 、q 、矾倍足纲n a r c e u sa n n u l a r u s ，t h y r o p y g u ss p 中t r n a 的 排列序列为世，d ，g 、a r 、n ，研、e ，f 、岛，t 、q 、y 、f ，h 、p ，1 , 2 、l t ， v ，1 、m ，w ，c 。综合纲& u t i g e r a l l ac a u s e g a e 中t r n a 的排列序列为瓜d 、g ， a ，r ，n 、岛、e ，f 、h 、p 、t 、& 、。上口，l j 、v 、1 ，m 、q 、w 、c 。其中某些 t i a 重排的频率非常高，如，日，八岛，c ，儿们等位于非编码区附近的t r n a 及t r n a 簇饭、d ) ，、r 、 r 、s 、e 、d ，( ，q 、均，( w ，c ，1 ) ，而蛋白质基 因及d 斟a 基因却很少发生重排。 在后生动物的门类内或门类间，已发现线粒体基因的许多不同排列。b o o r e & b r o w n ( 1 9 9 4 ) 认为，对线粒体基因排列的比较在推测后生动物大类群之间的系 统发生上至少有2 个方面的作用：一方面，m t 基因组中的3 7 条基因在理论上具有相 4 南京师范大学2 0 0 届硕士论文第一章综述 当巨大的重排潜力，因而不同物种不大可能趋同性地采取一致的基因顺序，共享的 基因顺序更可能表明一段共同的进化历史：另一方面，基因的重排一般并不频繁， 这种比较适合于在一段时问跨度上追寻古代歧异的发生。比较已知节肢动物m t 基因组的基因排列，在各个类群中都能够找到一种基本相同的基因顺序( 其中不包 括t r n a 基因的位置变化) 。最近的一些研究认为，肢口纲异形鲎i m u l u s p o l y p h e m u s ) 的基因排列可能是节肢动物m t d n a 原始基因顺序的典型。在节肢动 物的4 大类群中，除具有这种原始的基因顺序外，还存在类型各异的基因重排现 象。 1 1 3 多足总纲线粒体基因组的重排机制 1 1 3 1 倍增随杌删除模型 目前用于解释无脊椎动物线粒体基因重排机制的最常用模型是倍增随机删 除模型( d u p l i e a t i o n - r a n d o md e l e t i o n ) ( j e f f r e y , 19 9 9 ；s u m i d a ，e ta 1 ，2 0 0 1 ；m a e e y , 1 9 9 7 ；m o r i t z ，e t a l ，1 9 8 7 ；j e f f r e y , e l a l ，1 9 9 8 ) ，该模型认为含有两个或多个基因的 m t d n a 片断发生倍增，倍增后的基因被随机删除富余拷贝。这一过程可能产生 一些假基因，随后逐步丢失所有基因残迹，结果可导致基因移位。但基因倍增并 不是随机的，有一种位置效应，重排的热点多分布在两个复制起始位点附近，仅 涉及周边的基因，并伴随控制区序列的倍增( j e f f r e y , e la 1 1 9 9 8 ) 。 关于线粒体基因倍增的机制有许多假说。有人猜测环状m t d n a 在复制过程 中的不准确终止，导致基因倍增( j e f f r e y , 1 9 9 9 ；d a v i da n db r a d l e y , 1 9 9 7 ) ；另一种 解释认为是轻链复制错误引起基因倍增( m a c e y , e ta 1 。1 9 9 7 ；s t a n t o n , e ta l 1 9 9 4 ) ， 起始轻链复制的酶可以识别t r n a 的茎环结构，并以此作为轻链复制的起始位 点，而终止信号仍保留在原有位置，结果导致起始t r n a 和终止信号间基因的倍 增：当前最普遍认可的是滑链错配( s l i p p e d s t r a n dm i s p a i r i n g ) 模型( j e f f r e y , 1 9 9 9 ； m a c e y , e ta l ，1 9 9 7 ；j e f f r e y , e ta 1 ，1 9 9 8 ) ，该模型认为复制起始后新生链的3 端向 5 端滑动，重复复制后导致相关基因的串联倍增。大多数发生线粒体基因重排的 节肢动物谱系，如唇足纲、蛛形纲、昆虫纲等，都可以用倍增随机删除模型来解 释( s u m i d a ，e ta ，2 0 0 1 ；m a c e y , e ta 1 ，1 9 9 7 ；m i y a , e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 2 0 0 2 年l a v r o v 等人根据两种倍足类( m i l l i p e d e ) 动物的线粒体基因组重排现 象，又提出了一种重复非随机丢失模型，该模型提出重复基因的两个拷贝不是随 机丢失而是根据两个拷贝的转录极性及其在基因组中的位置非随机丢失，该模型 可以解释一些线粒体基因组中出现的两个大的非编码区现象。多足动物共测出了 4 种，线粒体基因组排列和螯肢动物类似，t r n l 2 都位于n a d l 与w n l l 之间。在2 种 倍足纲生物巨马陆t h y t o p y g u ss p 和n a r c e u sa n n u l a r u s 的线粒体基因重排一致，非 南京师范大学2 0 0 届硕士论文第一章综述 常有趣的现象是它们含有2 个大的非编码区把环状的线粒体基因组分成了2 个部 分，这2 个部分的基因分别采用了相反的转录极性，从t r n l 至o t r n 眩间的基因都由 j 链编码( 除了t r n c ) ，从加z q 到”h ，之间的基因都由n 链编码。因为利用滑链错配 模型不能解释该现象，l a v r o v 等人提出了线粒体基因重排的重复非随机丢失模 型，即整个线粒体基因组先发生一次整体重复，头尾相接形成一个复杂的二聚体 分子，在后来的进化中，两套基因组中的基因根据转录极性和在基因组中的位置 进行非随机丢失，就产生了现在看到的倍足纲的这种特殊的排列方式。该模型在 1 种红藻c h o n d r u sc r i s p u s 的线粒体基因组中也得到了证实，它和倍足纲的线粒体 基因组一样含有2 个大的非编码区而且基因排列及转录极性也很相似。另外两种 唇足纲多足动物s c u t i g e r ac o l e o p t e r a t a 和l i t h o b i u s f o r f i c a t u s 重排顺序不一致。 1 1 3 2 重组模型 重组是在植物、真菌和原生生物中导致m t d n a 变化的较常见机制，曾认为 不存在于动物m t d n a 中( d a v i da n db r a d l e y , 1 9 9 7 ) 。但近年来的研究表明，重组 可能为基因倒置提供了一个合理的解释。d a v i da n db r a d l e y ( 1 9 9 7 ) 首次用实验验 证了动物m t d n a 的重组，他们在研究线虫线粒体基因组控制区串联重复序列时， 发现其存在明显的拷贝数目变化，并且观察到重复序列的倒置现象，证实这是重 组的结果，强调重组的关键在于双链断裂和重新结合：在m t d n a 上两相邻位点 可能同时断裂，断裂产生的双链片断通过共价键作用使两个断裂端重新结合，从 而形成一种游离于原基因组的、具有部分基因组结构的小型双链环状分子 ( m i n i e i r c l e ) ，当某段序列形成m i n i c i r c l e 离开原基因组时，该基因组相应的组分 也将随之丢失。楔齿蜥的线粒体基因组部分基因丢失的现象亦可作为该模型的一 个佐证。k a j a n d e re ta 1 ( 2 0 0 0 ) 在人体细胞中发现了低水平分布的s u b l i m o n s ，这 是一种因部分序列缺失或倍增所产生的重排m t d n a 分子( r e a r r a n g e dm t d n a m o l e c u l e s ) ，推测为m t d n a 双链分子断裂引发线粒体内d n a 重组的结果。他们 的依据是在这些重排的m t d n a 上找到了一系列可同时发生断裂的位点，具有这 些断裂位点的基因组往往出现部分倍增或缺失，形成二聚体甚至多聚体的现象。 随后，d o w t o na n dc a m p b e l l ( 2 0 0 1 ) 整合了上述两个实验的结果，提出一个新的模 型，用以解释基因倒置现象，其论点仍是双链的断裂和重新结合，只是断裂产生 的m t d n a 双链片段不再自身环化脱离原基因组，而是在相应酶的作用下反向接 回断裂位点，致使基因倒置。k a j a n d e re ta 1 ( 2 0 0 1 ) 在研究人类线粒体的病理变化 时，意外的观察到了线粒体内d n a 重组时的中间状态，即h o l l i d a y 连接体。自 此，m t d n a 重组被越来越多地用于解释无脊椎动物谱系中的基因倒置现象( s h a o a n db a r k e r , 2 0 0 3 ；d o w t o n , e l a l ，2 0 0 3 ) 。重组不仅可以用来解释基因的缺失和倒置 现象，也同样适用于解释基因排列顺序的改变。如果一个完整的线粒体基因组有 6 南京师范大学2 0 0 届硕士论文第一章综述 3 个或3 个以上的位点同时断裂，那么由此产生的断裂片断在重新接回原基因组 时，就有可能发生连接顺序的改变，从而导致邻接序列排列顺序的变化。与倍增 随机删除模型相比，这可能更适合于解释长的邻接片段间的位置互换现象。 综上所述，当前线粒体分子生物学研究热点包括：m t d n a 的信息结构、地 位、作用及其与核基因的相互关系；细胞进化中半自主性的必要性：线粒体的起 源和分化，以及不同生物线粒体基因组进化。 1 2 地理种群遗传变异分析的研究进展 1 2 1 地理种群遗传变异分析的研究背景 自1 9 6 2 年n a s s 等首次用电子显微镜观察到线粒体内细丝状的 d n a ( m i t o c h o n d r i a ld n a ，m t d n a ) 之后，核外遗传物质系统的研究逐渐成为分子 遗传学的重要研究领域之一。1 9 8 7 年，a v i s e 等人综合多年来分子群体遗传学的成 果和生物地理学的知识，认为将m t d n a 的基因系统发育和种群地理信息相结合。 可以强有力地检测种群的遗传结构。并称之为“种内系统地理学”( i n t r a s p e e i f i e p h y l o g e o g r a p h y ) ，首次将系统学和群体遗传学联系起来。由此。诞生了系统地理学 ( p h y l o g e o g r a p h y ) 这一新兴的交叉学科。近二十年来，该学科发展十分迅速，目前 已成为国外资源与环境领域的研究热点之一。我国有关系统地理学方面的研究甚 少，在平耳孔蜈蚣的应用也仅见于在分子系统学和群体遗传学方面有相关的零 星报道。 系统地理学是研究物种及物种内不同种群形成现有分布格局的历史原因和 演化过程的- - f - j 学科。作为生物地理学的一个分支，系统地理学己不局限于解释 现有种群的分布状况，而是进一步探究其分布的起因，阐述其进化历程，分析区 域类群在时间上和空间上的发展变化，从而重建生物区系的历史。传统的生物地 理学强调的是高分类阶层的地理分布型式，局限于种或种上水平，并没有在种内 水平上探讨种群的发展历史，所采用的证据除了现今的迁移方式及形态特征、细 胞学和生化学特性外，化石往往是不可或缺的直接证据。而系统地理学的研究则 偏重近缘物种或种群间的研究，从种内水平上描述种群的系统地理格局 ( p h y l o g e o g r a p h i ep a r t t e r n ) ，进而追溯其形成原因。它融入了分子遗传学、种群遗传 学、系统发育学、统计学、行为学、吉地理学和历史生物地理学等学科的精髓。将 神内水平上的微进化( m i e r o e v o l u t i o n ) 署1 1 种及种上水平的大进化( m a c r o e v 0 1 u t i o 曲 有机结合起来。 7 南京师范大学2 0 0 届硕士论文第一章综述 1 2 2 地理种群遗传变异分析的研究内容 分子系统地理学主要探讨种群分化的历史，研究这些种群现有分布格局形成 的原因，如是否是由于受气候变化、地壳运动等历史事件的影响，逐渐经过迁移和 扩散、集群、甚至灭绝等过程而形成的，从种内水平上描述种群的系统地理格局。 进而追溯其形成原因。分子系统地理学研究的核心是遗传谱系空间分布的历史特 征，通过种群遗传结构的分析来探讨种内系统地理格局的形成机制、系统发育关 系以及现有分布特征，并结合种群的地理分布状况来发现和验证与其相关的地质 事件，追溯和揭示种群的进化历程。经过大量的研究发现，目前常见的种群系统地 理格局有5 种类型：系统发育上不连续的种群，分别占有不同的地理区域。这主要 是由于地理阻隔，造成基因流的长期中断和一些过渡类型的逐渐灭绝所致。系 统发育上不连续的种群，却分布于同一地区内。这些占有同一领域的不同种群是 由于基因交流的长期中断，造成彼此之间生殖隔离而形成的。系统发育上具有 连续性的种群，其地理分布却不同。形成该格局的原因主要是这些遗传距离很近 的种群由于发生替代而占据不同的地区。但是，由于发生替代的时间并不很长，而 且种群内部新产生的突变只是固定在局部范围，还未在种群间散布，因此占有不同 的地区的遗传距离相差并不远，这种结构可以或多或少地理解为传统种群遗传学 中的岛屿模型。系统发育上连续的种群空间分布也连续。这些种群不存在地理 隔离，种群之间相互迁移，存在着广泛的基因交流。系统发育上连续的种群，空间 分布具有部分连续性，即一些基因型具有广泛的地理分布，而与其具有同源关系的 另一些基因只占据一特定区域。这种格局的形成，主要是地理种群间存在着中度 的基因流水平。 系统地理学研究的核心内容就是对物种系统地理格局成因的判定与解释。而 影响种群的系统地理格局形成的原因很多，首先是突变( m u t a t i o n ) 、自然选择 ( n a t u r a ls e l e c t i o n ) 、基因流( g e n ef l o w ) 和遗传漂变( g e n e t i cd r i f t ) ，它们是遗传多样性 产生的基础；其次是引起种群数量和结构发生变化的历史事件。故在研究产生物 种系统逢理格局成因时，需通过探究物种特定变异的扩散和隔离程度，并参考 1 9 8 7 年a v i s e 等人在考察了大量物 q * m t d n a 系谱发育和地理分布的关系后总结出 的物种分布5 种模式，找出不同影响因素和历史事