（遗传学专业论文）雌激素调控人类wnk4基因表达的机制研究.pdf

目录 1 1 1111 11 11 1 1i i i ii iiti y 18 9 3 3 6 3 一、摘要 1 中文论著摘要( 1 ) 2 英文论著摘要( 4 ) 二、英文缩略语( 8 ) 三、论文 论文一人类w n k 4 基因启动子a p 1 顺式作用元件的鉴定 1 。前言( 9 一) 日n 看“”( ) 2 实验材料( 1 0 ) 3 实验方法( 1 2 ) 4 实验结果( 附论文图片) ( 2 1 ) 5 讨论( 2 7 ) 6 小结( 2 9 ) 论文二a p 1 介导雌激素对人类w n k 4 基因m r n a 表达的调控 。前言(30)1 3 0 刖吾”( 2 实验材料( 3 1 ) 3 实验方法( 3 3 ) 4 实验结果( 附论文图片) ( 4 2 ) 5 讨论( 4 8 ) 6 小结( 4 9 ) 四、本研究创新性的自我评价( 5 0 ) 五、参考文献( 5 1 ) 六、附录 综述( 5 7 ) 在学期间科研成绩( 6 9 ) 致谢? ( 7 0 ) 个人简介( 7 1 ) 中文论著摘要 雌激素调控人类w n k 4 基因表达的机制研究 刖昌 w n k 【w i t h n o - l y s i n e ( k ) k i n a s e 】是一类丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，包括 w n k l 4 。该激酶家族成员的特点是其催化结构域第二亚区中保守的具有锚定a t p a 和1 3 磷酸基团作用的赖氨酸位点被半胱氨酸替代，赖氨酸则位于第一亚区，但 是激酶的生物活性并没有发生改变。目前，对w n k 4 激酶的功能研究表明w n k 4 在电解质平衡和血压调节方面扮演着重要角色。可见，研究w n k 4 基因表达调控 机制，不仅能阐明高血压发生的某种机理，也为开发治疗高血压新药提供线索和 目标。我们研究组成员前期通过r t - p c r 检测发现包括雌激素、糖皮质激素在内 的几种激素可以下调人类w n k 4 ( h 删) 基因的表达；并且通过一系列实验验 证了糖皮质激素通过位于h w n k 4 启动子区域的糖皮质激素反应元件负性调节该 基因的表达，为阐明糖皮质激素作为药物应用产生的副作用( 如钠水储留、碱中 毒和高血压等) 提供依据。由于雌激素是生殖系统、心血管系统和脑、骨骼等器 官生长、发育和功能维持的重要调节子，因此有必要进一步探索雌激素下调w n k 4 基因表达的具体机制。本研究以1 7 1 3 一雌二醇( e 2 ) 为刺激因素，探讨雌激素对 h w n k 4 基因表达的影响及其作用机制。 材料与方法 一、实验材料 l 、人胚肾h e k 2 9 3 细胞系； 2 、刺激药物：e 2 、i c i1 8 2 ，7 8 0 、放线菌素d ( a c t i n o m y c i n d ) 和放线菌酮 ( c y c l o h e x i m i d e ) 3 、r n a 提取相关试剂、r t 试剂盒及r e a l t i m ep c r 相关试剂； 4 、人类c j u n 、c f o s 表达载体和人类雌激素受体a l p h a ( e r a ) 表达载体； 5 、基因重组及萤光素酶报告基因检测相关试剂及试剂盒； 6 、d n a 蛋白质结合实验、免疫共沉淀( c o i p ) 、电泳泳动迁移实验( e m s a ) 及 染色质免疫沉淀( c h i p ) 相关试剂； 7 、w e s t e r nb l o t 相关试剂。 二、实验方法 1 、r e a l t i m ep c r 检测e 2 等药物刺激前后h w n k 4m r n a 表达水平的变化； 2 、利用生物信息学软件分析h w n k 4 基因启动子结构，构建h w n k 4 启动子序列 系列截短的萤光素酶报告基因重组体，应用双荧光素酶活性检测系统检测启动 子的活性以及e 2 对h w n k 4 启动子活性的影响，鉴定h w n k 4 启动子关键的转 录调控区和雌激素反应区； 3 、e m s a 和c h i p 实验鉴定h w n k 4 启动子内a c t i v a t o rp r o t e i n - l ( a e - 1 ) 反应元件； 4 、应用双荧光素酶活性检测系统检测转录因子a p 1 过表达对h w n k 4 启动子活 性的影响； 5 、应用d n a 蛋白质结合实验和c h i p 实验鉴定a p 1 反应元件的d n a 蛋白质复 合物组成以及检测e 2 对c j u n 、c f o s 和e r a 蛋白与a p 1 元件结合力的影响； 6 、通过免疫共沉淀和r e - c h i p 方法鉴定结合于a p 1 反应元件的各转录因子之间 的相互作用； 7 、应用双荧光素酶活性检测系统和r e a l t i m ep c r 方法检测a p 1 和e r a 共同作 用对h w n k 4 转录的调节； 8 、w e s t e r nb l o t 检测e 2 对转录因子a p 1 蛋白表达水平的影响。 结果 1 、r e a l t i m ep c r 结果表明e 2 e r a 以浓度依赖的方式下调h w n k 4m r n a 的表达 水平；并且雌激素受体抑制剂i c i1 8 2 ，7 8 0 和转录抑制剂a c t i n o m y c i n d 可分别 抑制这种下调，而蛋白合成抑制剂c y c l o h e x i m i d e 则否； 2 、a l i b a b a 2 1 和t r a n s f a ct e s s 软件预测分析结果显示h w n k 4 启动子区域 有多个转录因子结合元件，包括g r 、g a t a l 、a p 1 、s p 1 等，但是没有e r e ； 3 、h w n k 4 基因启动子的2 1 6 一2 0 2 区域是该基因关键的转录调控区和雌激素反 2 应区； 4 、e m s a 和c h i p 实验分别在体外和体内条件下证明了h w n k 4 启动子2 1 6 2 0 2 区存在a p 1 反应元件； 5 、通过共转染转录因子a p 1 和h w n k 4 启动子1 u c 载体，萤光素酶活性检测发现 a p 1 可以上调h w n k 4 启动子的转录活性； 6 、d n a 蛋白质结合实验和c h i p 实验结果显示e 2 e r a 可使c f o s 、c j u n 和e r a 与h w n k 4 启动子a p 1 反应元件的结合增强； 7 、免疫共沉淀结合w e s t e r nb l o t 实验和r e - c h i p 实验共同验证了c j u n 和e r a 之间 存在直接的相互作用； 8 、萤光素酶活性检测发现c f o s c j u n 过表达显著增加p 2 1 6 1 u c 的活性，而e 2 e r a 则抑制这种活性的增加；同样，r e a l t i m ep c r 的结果也显示e 2 e r a 能下调 c - f o s c - j u n 诱导的h w n k 4 基因转录； 9 、w e s t e r nb l o t 实验结果提示e 2 刺激可上调转录因子a p 1 蛋白表达，并且e r a 过表达会增强这种上调作用。 结论 1 、e 2 刺激可以下调h w n k 4 基因m r n a 表达水平； 2 、h w n k 4 基因启动子2 1 62 0 2 区域存在a p 1 反应元件； 3 、a p 1 反应元件对h w n k 4 启动子的基础转录活性起关键作用并介导e 2 对h w n k 4 基因转录的抑制； 4 、结合于h w n k 4 启动子a p 1 反应元件的d n a 蛋白质复合物包括c j u n 、c f o s 和e r a ，其中c j u n 和c f o s 直接结合d n a ，e r a 通过与c j u n 相互作用的方 式间接结合d n a ，e 2 e r a 增强了c - j u n 、c - f o s 和e r q 与a p 1 反应元件的结 合，这是e 2 e r a 使h w n k 4 基因m r n a 表达下调的可能机制。 关键词 w n k 4 ；m r n a ；a p 1 ；转录调控；1 71 3 一雌二醇；雌激素受体a l p h a ； 3 英文论著摘要 r e g u l a t i o no fh u m a nw i t h n o l y s i n e ( 1 pk i n a s e - 4 g e n ee x p r e s s i o nb ye s t r o g e n i n t r o d u c t i o n w i t h - n o l y s i n e ( k ) k i n a s e - 4 ( w n k 4 ) i sam e m b e ro ft h es e r i n e t h r e o n i n ep r o t e i n k i n a s ef a m i l ya n di su n i q u ea m o n go t h e rp r o t e i nk i n a s e si nh a v i n gas u b s t i t u t i o no f c y s t e i n ef o rl y s i n ea ta ni n v a r i a n tp o s i t i o no ft h ek i n a s ed o m a i n ，w h i l et h eb i o l o g i c a l a c t i v i t yo ft h el 【i n a s ed o e sn o tc h a n g e i nr e c e n ty e a r s ，m a n ys t u d i e sf o c u s e do nt h e p h y s i o l o g i cf u n c t i o n so fw n k 4 h a v er e v e a l e dt h es i g n i f i c a n c eo fw n k 4i nt h ec o n t r o l o fb l o o dp r e s s u r ea n de l e c t r o l y t eh o m e o s t a s i s a n dt h u si ti si m p o r t a n tt od e t e r m i n et h e r e g u l a t o r ym e c h a n i s m so fw n k 4e x p r e s s i o n w i t hr e s p e c tt o t h et r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o no ft h eh u m a nw n k 4 ( hw n k 4 ) g e n e ，w eh a v ep r e v i o u s l yr e p o r t e dt h a t g l u c o c o r t i c o i d ss u p p r e s s hw n k 4 e x p r e s s i o nt h r o u g hn e g a t i v eg l u c o c o r t i c o i d - r e s p o n s i v ee l e m e n t s ，w h i c hp r o v i d e sac l u ef o ru n d e r s t a n d i n gs o m ep h a r m a c o l o g i c a d v e r s ee f f e c t so fg l u c o c o r t i c o i d s ，s u c ha ss o d i u ma n dw a t e rr e t e n t i o n ，a l k a l o s i s ，o r h y p e r t e n s i o n e s t r o g e n sa rek e yr e g u l a t o r so fg r o w t h ，d e v e l o p m e n t ，m a i n t e n a n c e ，a n d f u n c t i o n si nal a r g en u m b e ro ft a r g e tt i s s u e s ，i n c l u d i n gt h er e p r o d u c t i v et r a c t ，m a m m a r y g l a n d s ，b o n e ，b r a i n , a n dc a r d i o v a s c u l a rs y s t e m ；h o w e v e r , a na s s o c i a t i o nb e t w e e n e s t r o g e na n dh y p e r t e n s i o nr e m a i n se l u s i v e a se s t r o g e na n dw n k 4 a r eb o t ht h o u g h tt o r e g u l a t eb l o o dp r e s s u r e ，i ti so fi n t e r e s ta n di m p o r t a n c et od e t e r m i n ew h e t h e ro rn o t hw n k 4i sa ne s t r o g e n r e s p o n s i v eg e n e ，a n di fs o ，w h a tt h er e s p o n s ei s m a t e r i a l sa n dm e t h o d s m a t e r i a l s 1 h u m a ne m b r y o m ck i d n e yc e l ll i n eh e k 2 9 3 ； 2 s t i m u l ii n c e l lc u l t u r e ：17 1 3 一e s t r a d i o l ( e 2 ) ，i c i18 2 ，7 8 0 ，a c t i n o m y c i n - da n d 4 c y c l o h e x i m i d e ； 3 r a g e n t sa n dk i t sf o rr e a l t i m ep c r ； 4 e x p r e s s i o nv e c t o r sf o rh u m a nc - j u n ，c - f o sa n de s t r o g e n r e c e p t o ra l p h a ； 5 r e a g e n t sa n dk i t sf o rg e n ec l o n i n ga n dl u c i f e r a s er e p o r t e ra s s a y ； 6 r e a g e n t sf o rd n a - b i n d i n ga s s a y , c o i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( c o - i p ) ，e l e c t r o p h o r e s i s m o b i l i t ys h i f ta s s a y ( e m s a ) a n dc h r o m a t i ni m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( c h i p ) ； 7 r e a g e n t sf o rw e s t e r nb l o t m e t h o d s 1 r e a l - t i m ep c rw a su s e dt ot e s tt h ec h a n g e so fhw n k 4m r n al e v e lw i t hs t i m u l i ； 2 t h ehw n k 4p r o m o t e rw a sa n a l y z e du s i n gb i o i n f o r m a t i c ss o f t w a r e s ；as e r i e so f t r u n c a t e dl u c i f e r a s er e p o r t e rc o n s t r u c t sw e r eg e n e r a t e da n da s s a y e du s i n gd u a l - g l o l u c i f e r a s es y s t e mt oi d e n t i f yt h ek e yr e g u l a t o r yr e g i o no ft h ehw n k 4g e n e ； 3 e m s aa n dc h i pa s s a yw e r ec a r r i e do u tt oi d e n t i f ya p 一1r e s p o n s i v ee l e m e n tw i t h i n 4 l u c i f e r a s ea s s a yw a su s e dt oe x a m i n et h et r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t yo ft h ehw n k 4 p r o m o t e rw h e n a p 一1o v e r e x p r e s s i o n ； 5 d n a - p r o t e i nb i n d i n ga s s a y a n dc h i p a s s a yw e r ep e r f o r m e dt oi d e n t i f yt h e c o m p o n e n t so fd n a - p r o t e i nc o m p l e xa ta p 1s i t ea n dt h e i rd n a - - b i n d i n ga f f i n i t y ； 6 i m m u n o p r e c i p p i t a t i o nc o m b i n e dw i t hw e s t e r nb l o ta n dr ec h i pa s s a y sw e r eu s e dt o i d e n t i f yt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h e s et r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ； 7 l u c i f e r a s ea s s a ya n dr e a l - t i m ep c rw e r ec a r r i e do u tt oa s s e s st h er e g u l a t i o no f a p 一1a n de r ao nhw n k 4t r a n s c r i p t i o n ； 8 w e s t e r nb l o tw a sp e r f o r m e dt od e t e c tt h ei n f l u e n c eo fe 2o na p 一1p r o t e i nl e v e l r e s u l t s 1 r e a l - t i m ep c rr e s u l t ss h o w e dt h a te 2i n f l u e n c e st h ee x p r e s s i o no fhw n k 4m r n ai n t h eg e n o m i cp a t h w a yi n v o l v i n ge r a ； 2 b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i sw i t ha l i b a b a 2 1a n dt r a n s f a ct e s sr e v e a l e dt h a tt h e 5 k r e g u l a t o r yr e g i o n ( 一4 8 4t o + 1 ) o ft h ehh w k 4g e n ec o n t a i n e dn oc o n s e n s u se r e ， b u tm u l t i p l ep u t a t i v eb i n d i n gs i t e sf o ro t h e rt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ( e g ，g r ，g a t a 一1 ， a p 一1a n ds p 1 ) ； 3 t h er e g i o nf r o m 一2 1 6t o 2 0 2o ft h eh w n k 4p r o m o t e ri sr e s p o n s i b l ef o rt h eb a s a l t r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t yo ft h eh w n k 4p r o m o t e ra sw e l la st h er e s p o n s et oe 2 e r a ； 4 e m s aa n dc h i pa s s a yd e m o n s t r a t e dt h er e g i o n 一216 - 2 0 2o fhw n k 4 p r o m o t e rw a s a na p 一1r e p o n s i v ee l e m e n tu n d e ri nv i t r oa n di nv i v oc o n d i t i o n s ； 5 t h et r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t yo ft h ehw n k 4p r o m o t e rc o u l db ei n c r e a s e db ya p - 1 p r o t e i no v e r e x p r e s s i o n ； 6 d n a - p r o t e i nb i n d i n ga s s a ya n dc h i pa s s a ys h o w e dt h a tt h eb i n d i n go fc - f o s ，c - j u n ， o re r at ot h ehw n k 4 p r o m o t e rr e g i o nw a si n c r e a s e db ye 2 e r a ； 7 c o i m m u n o p r e c i p i t a t i o nc o m b i n e dw i t hw e s t e r nb l o ta n dr e c h i pa s s a ys h o w e da d i r e c ti n t e r a c t i o nb e t w e e ne r aa n da p 一1i nh e k 2 9 3c e l l s ； 8 a p 一1i n c r e a s e dp 2 1 6 一l u ca c t i v i t ys i g n i f i c a n t l ya n de 2 e r ai n h i b i t e dt h ei n c r e a s e d a c t i v i t y , w h i c hw a si na g r e e m e n tw i t ht h eh w n k 4m r n a r e s p o n s et oc - f o s c - j u n a n de 2 e r a ； 9 w e s t e r nb l o ta n a l y s i ss u g g e s t e de 2i n c r e a s e dt h ep r o t e i nl e v e lo fc - j u na n dc - f o si na d o s e d e p e n d e n tm o d e ，a n dt h i se 2 e f f e c tw a sf u r t h e r a u g m e n t e db ye r a o v e r e x p r e s s l o n c o n c l u s i o n i e 2d o w n r e g u l a t e sh w n k 4m r n al e v e li nh e k 2 9 3c e l l s ； 2 t h ep o s i t o n 2162 0 2o fhw n k 4 p r o m o t e rc o n t a i n sa na p 1r e s p o n s i v ee l e m e n t ； 3 t h ea p 一1e l e m e n ti sr e s p o n s i b l ef o rt h eb a s a lt r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t yo ft h eh w n k 4 p r o m o t e ra sw e l la st h er e s p o n s et oe 2 e r a ； 4 t h ep r o t e i nc o m p l e xb i n d i n ga ta p - 1e l e m e n tw i t h i nhw n k 4p r o m o t e ri sf o r m e db y c - f o s ，c - j u na n de r a c f o sa n dc - j u nb i n dd i r e c t l yt od n a ，w h i l ee r ab i n d s t h r o u g hc j u n w ep r o p o s et h a tt h ea p - 1e l e m e n tw i t h i nt h e5 - r e g u l a t o r yr e g i o no f t h ehw n k 4 p r o m o t e ri sr e l a t e dt ot h er e p r e s s i o nv i aad i r e c ti n t e r a c t i o nb e t w e e ne r a a n dc j u n 6 k e yw o r d s w i t h n o - l y s i n e ( k ) k i n a s e - 4 ；m r n a ；a c t i v a t o rp r o t e i n 一1 ；t r a n s c r i p t i o nr e g u l a t i o n ； 17 1 3 - e s t r a d i o l ；e s t r o g e nr e c e p t o ra l p h a 7 英文缩略语 8 论文一 人类w n k 4 基因启动子a p 1 顺式作用元件的鉴定 i 上- j o o 刖吾 w n k 【w i t h - n o 1 y s i n e ( k ) k i n a s e 】是一类丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，包括 w n k l 4 。该激酶家族成员的特点是其催化结构域第二亚区中保守的具有锚定a t p a 和p 磷酸基团作用的赖氨酸位点被半胱氨酸替代，赖氨酸则位于第一亚区，但 是激酶的生物活性并没有发生改变【1 】。l i i t o n 等人【2 1 通过定位克隆研究发现人类 w n k l 基因第l 内含子较长片段的缺失突变或w n k 4 基因第7 1 7 外显子错义突变 都可能造成一种罕见的常染色体显性遗传病，即i i 型假性低醛固酮血症( p h a i i ) ， 又称为家族性高钾性高血压( f h h t ) 或g o r d o n 综合症，临床表现为高血压、高 钾、高氯血症以及代谢性酸中毒。由于人类w n k 4 基因定位的染色体区域正是控 制血压数量性状遗传位点的热点区域，且该区域与原发性高血压的发生密切相关 1 3 , 4 1 ，因此w n k 4 与高血压的关系引起人们极大兴趣。目前，对w n k 4 激酶的功 能研究表明w n k 4 在电解质平衡和血压调节方面扮演着重要角色。例如，肾脏中 w n k 4 可抑制噻嗪类利尿药敏感的n a - c 1 共转运体活性【5 ，6 1 ；抑制盐酸阿米洛利敏 感的钠通道e n a c 2 0 】；刺激网格蛋白依赖的肾外髓部钾通道r o m k 的胞吞【7 ，8 】；磷 酸化旁细胞紧密连接蛋白c l a u d i n s l 4 【9 , 1 0 】，从而调节体内钠、钾、氯离子平衡。但 是，导致p h a i i 的突变型w n k 4 抑制n c c 和e n a c 的功能丧失，减少r o m k 和 磷酸化c l a u d i n s 的功能增强，致使n a + 、k + 内流以及c l 的渗透性增加，引起血压 和血钾升高。w n k 4 基因突变导致的双向作用正符合p h a i i 造成电解质紊乱和高 血压的机制，也提示w n k 4 可能对不同离子通道进行多种功能调节。而且，w n k 4 也调节t r p v 5 介导的c a 2 + 通道，这一发现可能解释了p h a i i 患者发生高尿钙的 机制【l 。可见，研究w n k 4 基因表达调控机制，不仅能阐明高血压发生的某种机 理，也为丌发治疗高血压新药提供线索和目标。 9 真核生物基因在表达的过程中，要受到不同水平的调控，如转录水平、转录 后水平以及蛋白质翻译和翻译后水平调控。其中转录水平的调控是最主要也是内 容最丰富的调控。关于w n k 4 基因的表达调节机制，我们了解甚少，鉴于w n k 4 在离子通道活性调节以及血压调节方面的重要性，我们课题组对人类w n k 4 ( h w n k 4 ) 基因进行了表达调控方面的研究。我们前期通过5 r a c e p c r 检测 确定了h w n k 4 基因的转录起始点，成功鉴定了位于h w n k 4 基因启动子区的糖皮 质激素结合元件g r i ( 3 3 7 - 3 2 6 ) 和g r 2 ( 2 8 5 2 7 6 ) 以及g a t a 1 ( 4 2 6 4 1 6 ) 反 应元件，并且发现：糖皮质激素、乙酰化和m i c r n a 能从不同方面影响h w n k 4 基因的表达水平【1 3 4 1 - 4 2 1 。由于软件分析h w n k 4 基因转录起始点上游6 0 0b p 区域 没有t a t a 盒模序，但是有多个a p 1 和s p 1 结合位点，而后二者对于无t a t a 盒的启动子的基础转录活性很重要，因此，本研究旨在寻找影响h w n k 4 基因基础 转录活性的重要元件并进一步研究其在h w n k 4 基因表达调控中的作用。 一、菌株及细胞株 实验材料 细胞系来源 大肠杆菌j m l 0 9 感受态细胞 人类胚胎肾细胞系h e k 2 9 3 日本t a k a r a 公司 中国科学院上海细胞生物学研究所 p m d l 8 tv e c t o r p c d n a 3 1v e c t o r 萤光素酶报告基因载体p g l 3 b a s i c 海。肾荧光素酶载体p r l - t k c j u n 载体p c d n a 3 1 - j u n c f o s 载体p c d n a 3 1 f o s 日本t a k a r a 公司 日本t a k a r a 公司 美国p r o m e g a 公司 美国p r o m e g a 公司 s j l y e 教授惠赠( 多伦多大学) s j l y e 教授惠赠( 多伦多大学) l o 三、其他主要分子生物学相关实验材料 主要实验材料来源 d m e m 培养基、胎牛血清美国g i b c o 公司 胰蛋白酶 美国b i o s h a r p 公司 琼脂糖日本t a k a r a 公司 l b 培养基胰蛋白胨和酵母提取物 美国s i g m a - a l d r i c h 公司 胶回收及质粒制备试剂盒 中国a x y g e n 公司 t 4d n a 连接酶、t 4 多核苷酸激酶日本t a k a r a 公司 限制性内切酶日本t a k a r a 公司 脂质体l i p o f e c t a m i n e t m 2 0 0 0美国p r o m e g a 公司 d u a l g l o 刑双荧光素酶检测系统 美国p r o m e g a 公司 【y 3 2 p a t p北京福瑞生物公司 c j u n 多克隆抗体美国s a n t ac r u z 公司 c - f o s 多克隆抗体美国s a n t ac r u z 公司 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺德国m e r c k 公司 蛋白a g 琼脂糖珠美国s a n t ac r u z 公司 其它试剂：t b e 、1 0 0m mp m s f 、1md t t 、1 0n ml e u p e p i n 、2 3m g m la p r o t i n i n 等参照分子克隆实验指南配制。 四、主要的仪器设备 主要实验仪器生产厂家 超净工作台b s b 3 a 二氧化碳细胞培养箱b n a 31 1 台式高速离心机d 3 7 5 2 0 台式低温超速离心机3 1 6 k 电泳仪 电泳槽 澳大利亚g e l a i r e 公司 日本e s p e c 公司 德国b i o f u g e 公司 美国s i g m a a l d r i c h 公司 美国b i o r a d 公司 美国b i o r a d 公司 自动凝胶成像分析仪g d s 8 0 0 0 p c r 扩增仪( 9 6 0 0 型) 电热培养箱3 0 3 f a 3 全温振荡培养箱h z q - f 1 6 0 恒温水浴锅h h 1 美国u v p 公司 美国p e r k i n e l m e r 公司 上海申光仪器仪表有限公司 哈尔滨东联电子技术开发有限公司 常州国华电器有限公司 五、生物信息学网址和计算机分析软件 l 、基因组数据库 h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v g e n o m e g u i d e h u m a n 2 、序列比对数据库 b l a s t n ：h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v b l a s t n n r 3 、引物设计软件 p d m e r 3 ：h t t p ：w w w b a s i c n w u e d u b i o t o o l s p r i m e r 3 4 、启动子及转录因子预测软件 h t t p ：w w w s o f i b e n y c o m h t t p ：w w w g e n e r e g u l a t i o n c o m p u b p r o g r a m s a l i b a b a 2 i n d e x h t m l h t t p ：w w w c b i l u p e n n e d u c g i - b i n t e s s t e s s ? r q 2 s e a f r - q u e r y 5 、凝胶成像及扫描分析软件 g r a b i t2 o ： u v pg e l w o r k si da d v a n c e dv e r s i o n2 5 6 、统计学软件 s p s sv e r s i o n16 o 实验方法 一、细胞培养及转染 1 、细胞培养 人胚肾细胞系h e k 2 9 3 常规在d m e m 培养基( 1 0 胎牛血清，1 0 0u m l 青 霉素，1 0 0u m l 链霉素) 、3 7 、5 c 0 2 及饱和湿度的条件下培养。o 2 5 胰酶 1 2 消化传代。 2 、脂质体法转染 ( 1 ) 转染前一天在6 孔或2 4 孔培养板中接种h e k 2 9 3 细胞； ( 2 ) 分别用无血清无抗生素的培养基配制所需质粒d n a 和脂质体l i p o f e c t a m i n 2 0 0 0 ，室温孵育5m i r a ( 3 ) 将质粒d n a 和l i p o f e c t a m i n2 0 0 0 混合，室温孵育2 0m i n 后加入细胞培养基 ( 无抗生素) 中； ( 4 ) 培养2 4h 后加入药物刺激，继续培养2 4h 后收获细胞。 二、h 删启动子结构及活性分析 ( 一) h w n k 4 启动子区顺式作用元件的预测 应用生物信息学软件a l i b a b a 2 i 和t r a n s f a ct e s s ，对h w n k 4 基因启动 子区4 8 4 - + 1 序列进行预测，寻找可能的顺式作用元件。 ( 二) 构建h 删基因5 侧翼序列系列截短的p m d l 8 t 克隆载体 1 、p c r 扩增反应： 在前期己构建的p 4 8 4 一l u e 、p 3 2 5 - l u c 和p 2 1 6 一l u c 载体基础上，以人类基因组 d n a 为模板，分别扩增h w n k 4 启动子区2 0 2 + 6 2 、1 5 2 + 6 2 和1 0 9 + 6 2 片 段。引物序列如下： 上游引物：5 c t f 蚣g g t a c c t g a g g g g c t g c t c g 3 、 5 t a t t g g t a c c c t g g g g g g c a a g g 3 5 t t a g g t a c c g g c c a g g c c g a g c t - 3 下游引物：5 g a c a t g a g g a c g g t g g t c t c 3 扩增条件： 9 5 5m i n 一9 4 3 0s e c 一- - * 5 8 3 0s e c 一7 2 1 0m i n 。 3 e y ee s 7 2 3 0s e e 7 p c r 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收纯化试剂盒回收纯化。 1 3 2 、连接反应： p c r 产物 1 0 x 连接缓冲液 p m d l 8 - t 载体 7m 1g l 2l a l d d h 2 0 1 6 连接1 6h 。 u pt o1 0p l 3 、转化反应： 连接产物加入到5 01 t lj m l 0 9 感受态细胞中 i 轻轻混合，冰上放置3 0m i n 土 4 2 热休克lm i n 后立即冰上放置2m i n l 加入9 5 01 t ll b 培养液，3 7 振荡培养lh 上 瞬离1 0s ，涂布于l b 琼脂平板( 含a m p5 0g g m 1 ) ，3 7 过夜培养 4 、酶切鉴定阳性克隆： ( 1 ) 碱裂解法提取质粒d n a ： 收集1m l 在l b 培养基中培养过夜质粒菌液，1 0 ，0 0 0g 离心5m i n ，弃上清； 加1 0 0l x l 预冷t e ，充分悬浮细菌； 加2 0 0g l 新配制的i l 液( o 2m o l ln a o h ，l s d s ) ，混匀，冰上1m i n ； 加预冷的3m o l l n a a c1 5 0l a l ，混匀，冰上3m i n ； 1 2 ，0 0 0g 离心1 0m i n ； 吸取上清至新离心管，加8 0 0 山无水乙醇沉淀1 0m i n 。1 2 ，0 0 0g 离心8m i r a 用7 0 乙醇沉淀沈涤，7 , 5 0 0g 离心1 0m i r a 弃上清，干燥，加入3 0i t lt e ，充分溶解质粒d n a 。 ( 2 ) 双酶切反应： 1 4 质粒d n a k p ni (