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中山大学硕士学位论文 大蕉m p r c i 基因盐胁迫应答机制的分子生物学研究 中文摘要 专业：遗传学 硕士生：张碧佩 指导老师：王金发教授 盐胁迫是植物所面临的主要非生物胁迫之一，其已经严重影响了农业生产。 当前在盐碱地种植耐盐植物是十分有效的生物治理方案，因此寻找一些耐盐植物 及其相关基因至关重要。本实验室前期对一个来自大蕉的低温诱导基因g p r c l 进行了抗寒生理功能的研究，通过比对分析推测该基因可能与耐盐相关，为了进 一步研究该基因的耐盐性功能，我们采用转基因手段在拟南芥中对该基因进行耐 盐生理功能的研究，获得如下几个的主要结果： 1 ) 通过进行g p r c l 基因的同源分析以及检测盐胁迫对该基因转录水平的 影响，揭示该基因参与植物的盐胁迫应答。 2 ) 通过将m p r c l 基因转化酵母中同源基因删的缺失突变体，发现 m p r c l 基因可以在功能上互补删基因的缺失，使突变体恢复与野生 型可比的耐盐性，揭示m p r c i 基因与其同源的删基因具有功能相似 性，进而提示了g p r c l 基因在植物中的相似功能。 3 ) 为了研究m p r c i 基因在植物中所参与盐胁迫应答，我们将该基因转化拟 南芥中同源基因r c i 2 a 突变体，发现转基因植株对高n a + 的耐受性恢复到 野生型水平，但同时也表现了对高k + 的敏感性，揭示g p r c 7 基因与拟 南芥的a t r c l 2 a 基因功能相似，并推测m p r c i 基因盐胁迫应答机制可能 与其对n a + k + 的协调相关。 4 ) 为了探究m p r c i 基因对植株体内n a + k + 水平的影响，我们用i c p a e s ( 原子发散) 测定胁迫下拟南芥体内钠钾含量，发现植株地上茎叶部分的 高n a + 和高k + 积累直接导致了表型上的敏感。在高n a - 环境中，转基因 植株的地上茎叶部分n a + 含量相比野生型和r c i 2 a 突变体最低，而在高 k + 环境中，该植株地上茎叶部分则显著积累l ( + ，提示m p r u 基因可能 参与植株地上部分的n a k + 调控过程。 5 ) 为了研究m p r c i 蛋白对质膜的物理性质的影响，我们分离了拟南芥叶 细胞的原生质体测定质膜流动性，检测到无论在高n a + 还是高k + 处理后， 叶细胞的质膜流动性会比正常条件的下降，但转基因植株的质膜流动性 下降程度相对最小，提示m p r c i 基因所编码蛋白可以在高n a + 或高k + 环境中稳定膜的流动性以维持膜的功能。 6 ) 根据我们的研究结果并结合已有的文献报道，我们提出了一个可能的模 型为了阐释m p r c i 及其同源蛋白a t r c l 2 a 的调控n a + k + 吸收和排放的 作用机制。 关键字：m p r c i , r c l 2 ，拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) ，盐胁迫应答，细胞 质膜 n ad i s s e r t a t i o ns u b m i t t e dt os c h o o io fl i f es c i e n c e s s u ny a t - s e nu n i v e r s i t yi np a r t i a lf u l f i l l m e n to ft h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo fm a s t e ro fp h i l o s o p h y m o l e c u l a rb i o l o g i c a ls t u d yo ns a l t - - s t r e s s r e s p o n s em e c h n i s m o fm p r c lg e n ef r o m p l a n t a i n m a j o r ：g e n e t i c s n a m e ：z h a n gb i p e i s u p e r v i s o r ：w a n gj i n f a ( p r o f ) a b s t r a c t h i g l ls a l i n i t yi so n eo ft h em a i na b i o t i cs t r e s s e s ，a f f e c t i n gl a r g ea r e a so fc u l t i v a t e d l a n di nt h ew o r l da n dl i m i t i n gc o n s t r a i n t st og l o b a la g r i c u l t u r e a tp r e s e n t , p l a n t i n g s a l t - t o l e r a n tp l a n t so ns a l i n es o i li sa ne f f i c i e n tb i 0 4 r e a t m e n tw a y , a sar e s u l t , i ti s i m p o r t a n tt ou n d e r s t a n dt h em e c h a n i s m si n v o l v e di ns a l t t o l e r a n c eo fp l a n t s b a s e do n o u rp r e v i o u ss t u d yo nf u n c t i o n so fal o w - t e m p e r a t u r e - i n d u c e dg e n em p r c if r o m p l a n t a i n , w el o o k e di n t o i t se f f e c to ns a l t - t o l e r a n c ea n de l a b o r a t e di t sf u n c t i o n a l m e c h a n i s mi nt r a n s g e n i ca r a b i d o p s i si nt h i sw o r k t h em a i nr e s u l t sa sf o l l o w s ： 1 ) h o m o l o # ca n a l y s i sa n de x p r e s s i o np a t t e r n so ft h em p r c ig e n ei n d i c a t e d t h a tm p r c ip r o b a b l yf u n c t i o n e da sa t r c l 2 ag e n ei n v o l v i n gi nn a + k + r e l a t i v ep a t h w a y s 2 ) 蚴氓ag e n ew a se x p r e s s e d i np m p 3d e l e t i o n y e a s tt o e x a m i n et h e f u n c t i o n a lh o m o l o g u c sb e t w e e nm p r c ia n dp m p 3 e x p r e s s i o no fm p r c ! i n p m p 3 ab a c k g r o u n dc o n f e r r e dt h ec o m p a r a b l es o d i u mt o l e r a n c eo fw i l dt y p e d e m o n s t r a t i n gt h a tm p r c i h a da ne q u i v a l e n tf u n c t i o n 、 ，i mp m p 3 3 ) t oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to fm p r c ig e n e0 1 1s a l t - r e s p o n s ei nt r a n s g e n i cp l a n t s w eo v e r e x p r e s s e dm p r c ig e n ei n a r a b i d o p s i sr c i 2 am u t a n t t h ed a t ao f p h e n o t y p e ss u g g e s t e dt h a tt r a n s g e n i cp l a n t sh a dc o m p a r a b l en 容t o l e r a n c e w i t h w i l d t y p ew h i l ep e r f e r m e dc s e n s i t i v i t y u n d e rh i g hn a + o rl r t r e a t m e n t , r e s p e c t i v e l y m p r c ig e n ep r o b a b l yf u n c t i o n e da sa t r c l 2 ag e n e i n v o l v i n gi nn a + k + r e l a t i v ep a t h w a y si np l a n t s 4 、t oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to fm p r c lg e n eo nn 0 喂r e g u l a t i o n t h ec o n t e n t s o fn a 十a n dk 十w g l ed e t e r m i n e db yi c p - a e sa s s a y s ，w h i c hc o n f i r m e dh i g l l n do rk + i ns h o o tl e a d i n gt os e n s i t i v i t ya n dt r a n s g e n i cp l a n tc o n t a i n e dt h e l o w e s tn a + c o n t e n th a dt h ef e w e s tl ( + l o s si nh i g h - n a + t r e a t m e n t , w h i l et h e m o s tk + c o n t e n ti nh i g h - k + t r e a t m e n t i ti n d i c a t e dm p r c tm i g h ti n v o l v ei n s h o o tn 容暖r e g u l a t i o n 5 ) t oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to fm p r c io np h y s i c a lc h a r a c t i o no fp m ，w e i s o l a t i o no fm e s o p h y l lp r o t o p l a s tt ot e s t i 黟t h ep mf l u i d i t y t h e r ew a sa s i g n i f i c a n td e c r e a s ei np mf l u i d i t y ( a n yt y p e ，a sc o m p a r e dt oc k ) w h i l et h e d e c r e a s ei nt r a n s g e n i cp l a n tw a sm u c hs l i g h t e rt h a nt h a ti nr c i 2 a ，w h i c hw a s t os a ym p r c ic o u l dm a i n t a i nt h ep mf l u i d i t yu n d e rs t r e s ss oa st om a i n t a i n t h ef u n c t i o no fp l a s m am e m b r a n e 6 ) b a s eo na l lo fo u rr e s u l t sa n dr e s u l t sr e p o r t e db yo t h e r s ，w ep r o p o s e da p o s s i b l em o d e lt oe x p l a i nt h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s m so fm p r c ia n di t s h o m o l o g o u sp r o t e i na t r c l 2 a , i nr e g u l a t i n gt h en a + k + f l u x k e yw o r d s ：m p r c i , r c l 2 ，a r a b i d o p s i st h a l i a n a ，s a l t - s t r e s sr e s p o n s e ，p l a s m a m e m b r a n e ( p m ) i v 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：；略吻t 面b 日期：础年夕月1 日 ， 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 学位论文作 导师签名： 日期：加7 矿年月，日 张碧佩中山大学硕士研究生学位论文大蕉m p r c i 基因盐胁迫应答机制的分子生物学研究 第1 章文献综述与研究背景 1 1 土壤盐碱化危害 所谓土壤盐碱化是指水溶性盐类在土壤的土体层或者风化层积累到一定程 度以致影响农业生产，环境卫生和经济利益( r e n g a s a m y ，2 0 0 6 ) 。一般认为土壤 的饱和浸出液的电导率( e c e ) 超过4 d s m 1 即是盐渍土( r i c h a r d s ，1 9 5 4 ) ，这个阈 值通常会随着土壤的水分状况，当地的气候状况以及所栽种的植物品种有所变化 ( m a a se ta 1 ，19 8 6 ) 。 盐碱地土壤实际上分为盐化土和盐土、碱化土与碱土两种盐碱土类型，盐化 土与盐土是可溶性盐类( 氯化物、硫酸盐、重碳酸盐和碳酸盐类) 在土壤表层的 积聚过程，当易溶盐类在土壤表层( o 2 0c m ) 累积量达到影响或危害作物生长和 发育时( 0 2 ) ，便成为盐化土。当表层含盐量达到l 时，严重危害作物，使其 严重减产，甚至绝收，便成为盐土。而另一类碱化土和碱土的表层含盐量并不高， 但土壤胶体上的吸附性钠离子超过一定量( 芝5 吸附性阳离子总量) ，便成为碱 化土；吸附性钠离子与吸附性阳离子总量比值之2 0 时便形成碱土。吸附性钠 离子量较高的土层( 碱化层) ，碱化层的p h 达9 或9 以上( 刘建红，2 0 0 8 ) 。 土地盐碱化是人类面临的一个世界性问题。根据2 0 0 0 年的f a o i 附e s c o 世界土壤地图，全世界的盐碱化土壤面积达到8 31x1 0 8h m 2 ，且以1 4 的速率逐 年增加( l i u c h l ia n dg r a t t a n , 2 0 0 7 ) 。中国的松嫩平原是世界苏打盐碱土集中分布 区之一，盐碱化土地面积达到2 3 x 1 0 6h r a 2 ，占该地区面积的1 5 2 ( 邓伟e ta 1 ， 2 0 0 6 ) 。土壤盐碱化已成为影响世界农业生产最主要的非生物胁迫之一，因而对 盐碱地进行开发治理是世界相关国家和机构非常关注的热点。 1 1 1 盐碱地形成原因 盐碱土是在一定的自然或者人为条件下形成的，其形成的实质主要是各种易 溶性盐类在地面作水平方向与垂直方向的重新分配，从而使盐分在集盐地区的土 壤表层逐渐积聚起来，干旱和半干旱地区更易形成盐碱土( 吴立全，2 0 0 8 ) 。根据 土壤和地下水的作用过程，通常将盐分主要分为三类： 张碧佩中山大学硕士研究生学位论文大蕉m p r c i 基因盐胁迫应答机制的分子生物擘研究 1 ) 结合地下水的盐分( g r o u n d w a t e ra s s o c i a t e ds a l i n i t y , g a s ) ，通过地面蒸发 作用以及植物的蒸腾力，随着土壤毛细管作用使所含盐分的水上升到地表 e 兰 ，石； 2 ) 非结合地下水的盐分( n o n g r o u n d w a t e ra s s o c i a t e ds a l i n i t y , n a s ) ，对于地下 水位比较深且排水系统差的地方，盐分普遍是由雨水，岩石风化和风移带来； 3 ) 灌溉结合的盐分( i r r i g a t i o na s s o c i a t e ds a l i n i t y , i a s ) ，一般此类盐分主要集 中在植物的根部区域( r e n g a s a m y , 2 0 0 6 ) 。 盐碱土中最主要的盐分是n a c i ，同时n a + 也是造成盐碱地植物离子特异性伤 害的首要离子，而其他可溶性盐类，如c a 2 + 、m 9 2 + 、f e 3 + 、i p 、s 0 4 2 、c 0 3 2 - 和h c 0 3 也起了协同作用( p e s s a r a l d i ，1 9 9 9 ；t e s t e ra n dd a v e n p o r t ，2 0 0 3 ) 。 1 1 2 盐碱地对植物的危害 盐碱土壤可以通过以下两个途径对植物造成伤害： 1 ) 渗透胁迫：高浓度的盐分导致土壤的渗透势( o s m o t i cp o t e n t i a l ) 和基质势 ( m a t r i cp o t e n t i a l ) 降低，从而抑制了植物对土壤中的水份吸收，导致植物缺 水( r e n g a s a m y , 2 0 0 2 ，2 0 0 6 ) 。这种渗透胁迫和土壤干旱引起的结果是一样的。 2 ) 离子胁迫：对于绝大多数植物来说，n d 是离子胁迫中最主要的离子，因为 n a + 会积累在植物的根、茎、叶，造成植物组织的坏死而缩短植物的生命周 期( m u n n s ，2 0 0 2 ) ，或抑制光合作用而直接危害植物的生长( b a k e ra n dh a l l s ， 1 9 8 8 ) 。同时，植物在n a + 胁迫下，细胞膜会强烈的去极化( 约是6 0 8 0 m v ) ( s h a b a l ae ta 1 ，2 0 0 3 ；s h a b a l ae ta 1 ，2 0 0 6 ) ，尽管这种去极化会缓解n a + 过度积 累，但更为严重的后果是导致植物体内原来的离子稳态破坏，最主要是体内 k + 的大量流失( s h a b a l ae ta 1 ，2 0 0 6 ) ，植物体内的许多胞质酶是由k + 激活而 受n a + 抑制的( f l o w e r s e ta 1 。1 9 7 7 ) 。因此，这种离子胁迫比上述的渗透胁造 成的危害更大( m u n n s 。2 0 0 2 ) 。 此外，土壤中高浓度的n a - 还会破坏其他矿质营养，加重了渗透胁迫，而且 还会造成一系列的次级伤害，比如氧化胁迫( z h u , 2 0 0 1 ) 。通过上述几种胁迫的 共同作用下，植物生理生化代谢严重受到影响，进而危及植物的生长发育，最终 导致植物的生物学产量和经济产量降低。 张碧佩中山大学硕士研究生学位论文大蕉m p r c i 基因盐胁迫应答机制的分子生物学研究 1 2 植物的耐盐机制 在盐碱地种植耐盐植物是当前最有效的生物治理方案，因为可使植物茎叶覆 盖地面可减弱地表水的蒸发，抑制土壤返盐，同时强大根系大量吸水，茎叶面蒸 腾使地下水位下降，从而有效的防止盐分向地表积累。此外，根、茎、叶翻入土 壤，能增加有机质含量，产生各种有机酸，对土壤碱度起一定中和作用，对盐土 改良有积极作用( r i c h a r d s ，1 9 9 2 ；张克强e ta 1 ，2 0 0 5 ) 。但是，这个治理方案亦有 其限制性，最主要的问题是如何运用有效的策略选择这些耐盐性好且具经济效益 的作物( c o n w a y , 1 9 9 7 ) 。因此，从各个水平研究一些盐生植物的耐盐机制至关重 要。 首先，以一定水平的盐度为筛选压力，既可以在不同种类的植物间比较耐盐 能力，也可以在近缘种类间或不同品种间，甚至于同个品种的不同个体间进行比 较( t e s t e ra n dd a v e n p o r t , 2 0 0 3 ) 。近些年来，植物耐盐有关的基因相继得到克隆， 植物转基因技术有了重大突破，这为有效利用旱地及盐碱地提高作物产量，治理 盐渍化及荒漠化土地提供了新的思路和方法( a p s ee ta 1 ，1 9 9 9 ；p i a oe ta 1 ，2 0 0 1 ； p a n d c y e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 一般认为，在高盐环境中，耐盐能力较强的植物的地上组织排除n a + 并同时 维持高水平的k + 浓度的能力更好，也就是说地上部分的低n a + 高k 水平直接对 应着植物的耐盐能力( f l o w e r sa n dh a j i b a g h e r i ，2 0 0 1 ；z h u , 2 0 0 1 ；m u n n s ，2 0 0 2 ) ，当 然，也会许多例外的植物，比如，单子叶中的玉米( 和盐诱导的a b a 水平上升 相关) ( a l b e r i e oa n dc r a m e r , 1 9 9 3 ) 和水稻( n a + 的转运机制很特殊，大量的n r 通过内皮层渗入根部) ( y e oe ta 1 ，1 9 9 9 ) ，双子叶植物的耐盐机制比单子叶植物更 为复杂也不完全按上面的关联性( d i n ga n dz h t h1 9 9 7 ) ，另外在盐生植物中该关 联性是不成立的，因为盐生植物的茎干积累的n a + 要比淡生植物的高很多( r m c r a n dd a v e n p o r t , 2 0 0 3 ) 。因此，植物的耐盐能力不仅仅是调控盐从根部吸收和转运 到地上组织的能力，还有对地上组织内高浓度的盐分的处理，包括对盐的区室化 ( c o m p a r t m e n t a t i o n ) 或通过盐腺类泌盐结构排出多余的盐分等手段( f l o w e r sa n d d a l m o n d , 1 9 9 2 ；陈敏c ta 1 ，2 0 0 8 ) 。 大体上，植物的耐盐机制遵循以下几条，如图1 1 所示( t e s t e ra n dd a v e n p o r t , 2 0 0 3 ；陈敏e ta 1 ，2 0 0 8 ) ： $ 孽m 十 擘日 研究i 擘n 论t 置枷月“墨目盐胁4 # 机q 的帝子# 学研完 1 ) 2 、 3 ) 4 ) 5 、 限制毹分的最初流入 增大盐分的外排； 限制木质部的盐分流入或者增大盐分到达地上组织前的回流 增大盐分通过韧皮部的再循环回到根部； 增人已到地l 一纰织的n a + 的旺盘化或者分敞到特殊部分( 如老叶木髓 细胞1 ： 通过泌舳结构排出体外。 t e s t e r 等( t e s t e ra n dd a v e n p o r t ，2 加3 ) 认为，植物耐盐的机制可分为两个不 同的水平，一个就是植物整株水平，另外一个是植物单个细胞水平。 + n a g i a t - i s t 1 ) d a t h t x yl e m h i l c 邢州l m ，i t c 、l m 山跏k 耐一“m ” 图i - 1 高等植物的耐盐机制f 引自( t e s t e ra n d d a v e n p o r t , 2 0 0 3 ) f i g u r e1 - im e c h a n s i m s o f s a l t - t o l e r e n c e i n h i g h p l i n ! 张碧佩中山大学硕士研究生学位论文大蕉心口脚基因盐胁迫应答机制的分子生物学研究 1 2 1 整株水平对高盐的适应 在高盐环境中，植物除了提高每个细胞的耐盐能力，还必须有其他各种机制 从整株水平进行调控，主要对两个方面的控制：1 n a + 的吸收；2 n a + 在植物体内 的分配。该控制过程往往由植物体内一些特殊的细胞类型完成，其过程包括： 1 2 1 1 调控n a + 向地上组织的运输 对于多数植物来说，维持地上组织的一个低n a + 水平是耐盐的关键，尽管一 些植物不按此规律，比如多数的盐生植物。而要进行该调控，植物需依次把好以 下几道关： 1 ) 限制根部对n a + 的净吸收：在高盐的环境中，n a - 进入植物的根部是以单 向内流形式进入，盐浓度和电势就决定这种内流是一种非耗能的被动运 输( c h e e s e m a n , 1 9 8 2 ) ，在淡生植物中，该种单向内流率相当高，在外界 5 0m mn a c i 浓度时可达o 5 - 2 01 t m o lg - 1 w tm i n 1 ( d a v e n p o r ta n dt e s t e r , 2 0 0 0 ) ，如此高的内流并未造成n a + 在根部的快速积累，原因就是植物根 部还存在n a + 选择性的外排系统调控根部的n a + 净吸收( q i ue ta 1 ， 2 0 0 2 ) ，该外排系统有两个方向，其中一个是由根部重新回到环境中，另 外一个则是进入木质部而后到达地上组织( 即成为根部调控自身离子稳 态的负作用) ( t e s t e ra n dd a v e n p o r t , 2 0 0 3 ) 。而盐生植物由于生理构造上的 差异，这种内流相对就低很多，如s p e r g u l a r i am a r i n a 在1 0 0m mn a c i 的坏境中只有0 2 4p m o lg - 1 w tm a n 1 ( c h e e s e r n a ne ta 1 ，1 9 8 5 ) ，因此盐 生植物对外排机制的依赖性就相对小很多。 2 )限制进入木质部的n a + 流：木质部作为地下组织和地上组织的质外体区 室o e s t e ra n dd a v e n p o r t , 2 0 0 3 ) ，最大程度地限制n a + 从根部皮层进入木 质部，可维持地上组织的低n a + 水平( s a n t a - m a r i aa n de 阿e i l l ，2 0 0 1 ) ，目 前，n a + 如何进入木质部的机制还不太清楚，有报道认为a b a 和肌醇在 耐盐植物中可作为该关卡的控制器( n e l s o ne ta 1 ，1 9 9 9 ；t e s t e ra n d d a v e n p o r t , 2 0 0 3 ) 3 )增强n r 从木质部的回流：与限制n a + 进入木质部协同的就是n a + 从木 质部的回流，该回流机制尚不清楚，可能是通过一种n a 渗透性的离子 通道( w e g n e ra n dr a s c h k e ，19 9 4 ) ，也有认为是n r 矿反转运子的反向工 张碧佩中山大学硕士研究生学位论文大蕉坳愈卫基因盐胁迫应答机制的分子生物学研究 作导致( l a c a na n dd u r a n d ，1 9 9 6 ) 。具体这些回流的n a + 去向何处，现发 现有部分积累于空泡细胞( v e oe ta 1 ，1 9 7 7 ) ，也有在茎的基部和中部 ( b l o m - z a n d s t r ae ta 1 ，19 9 8 ) 。 1 2 1 2 韧皮部的再循环回到根部 再循环机制可以明显减少n a + 在叶里的积累( l o h a u se ta 1 ，2 0 0 0 ) ，但是再循 环是否启动及其循环的方向，常常依赖于植物所处的外界环境( b l o m z a n d s t r ae t a 1 ，1 9 9 8 ) 。 1 2 1 3 地上组织的区室化 在高盐坏境，植物地上组织中最需要保护的是幼叶等光合作用旺盛，代谢比 较活跃的组织( j a m e se ta 1 ，2 0 0 2 ) ，因而高浓度的n a + 在进入地上组织时，会被隔 离到一些空泡细胞或者代谢活性低的细胞，如老叶，维管鞘( k a r l e ye ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 1 2 1 4 泌盐 许多盐生植物都存在一种泌盐结构，叫做盐腺，其分布在叶的质外体的一个 小空间，与叶里的其他细胞由蜡质隔开，通过将盐泵入其中再分泌到叶表面，从 而将体内多余的盐分排出( a m a r a s i n g h ea n dw a t s o n , 1 9 8 9 ) 。这种盐腺较容易进 化，因此在各种植物间结构多样，而且有盐腺的植物发现比较少，可能是由于进 化该结构或者运作时耗能大( h i l l ，1 9 7 6 ) 。 1 2 1 5 调控蒸腾作用气孔关闭 r o b e r t s 和j a m e s 等( r o b e r t sa n ds n o w m a n ，2 0 0 0 ；j a m e se ta 1 ，2 0 0 2 ) 发现一 些高等植物在高盐环境中发生保卫细胞的关闭，这种气孔的关闭是由于内向k + 通道的活性下调导致，气孔关闭的直接结果是植物的气体交换率降低，进而光合 作用率也下降，但却可以提高植物在高盐环境的存活率，该种机制不仅在盐生植 物中存在，淡生植物也普遍使用该机制。 1 2 2 细胞水平对高盐的适应 1 2 2 1 胞内区室化 这是植物细胞维持胞质内低n a + 水平最直接有效的机制，一般细胞会把多余 的n a + 从细胞质和细胞器中排出隔离到液泡，为了维持液泡和胞质的渗透压持 平，胞质内会合成一些对细胞无害的渗透剂。高等植物的n r 区隔化是由液泡 张碧佩中山大学硕士研究生学位论文大蕉m p r c i 基因盐胁迫应答机制的分子生物学研究 n a + 旷反向转运蛋白完成的，其驱动力来源于液泡矿a t p a s e 和旷p p a s e 产生 跨液泡膜的旷电化学势梯度( b l u m w a l d c ta 1 ，2 0 0 0 ) 。主要分为下列阶段： 将n a + 泵入液泡；n a + 从液泡的回渗；合成渗透保护剂。 其中回渗是通过液泡表面的阳离子选择性通道完成，因为回渗不利于植物的 耐盐，这些；离子通道活性很低，而且并非全部开放( d e m i d c h i ka n dt e s t e r , 2 0 0 2 ) 。 渗透保护剂一般是有机溶质，溶解度很高，电中性或者两性，也可以是次级代谢 物，如甘露醇类的多聚物，其既可以维持胞质内的渗透压，也可以保护一些胞内 发生的生化反应免受无机离子的影响( h ue ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 1 2 2 2n 曩+ 的外捧 多余n a + 从细胞的外排是逆着浓度梯度进行的，是一个主动运输过程，需要 a t p 提供能量作为驱动力。对于低等植物，a t p 源于质膜n 矿a t p a s e 的水解作 用( s h o n oc ta 1 ，2 0 0 1 ) 。高等植物n a + 的外排机制主要与质膜n a + 一反向转运蛋 白有关，质膜旷a t p a s e 水解a t p 产生能量把旷从细胞质中泵出细胞，产生 跨膜矿电化学势梯度，提供能量，驱动质膜上n a + n - f 反向转运蛋白，使旷顺其 电化学势进入细胞，同时伴随着反向协同作用使n a + 逆其电化学势排出细胞 ( p a d a ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 1 2 2 3 胞内耐受高盐 d y m 等( d y m 既a 1 ，1 9 9 5 ) 曾通过离体的生化实验证明，在适合的溶质或者 代谢中间物存在的情况下，植物的细胞质酶类可以在高盐环境中维持酶活。一些 盐生细菌的胞质酶类在高盐环境可通过改变蛋白结构来适应高盐。然而，在植物 体内尚缺乏直接实验证据。 1 2 2 4 损伤应答和修复 细胞在受到高盐胁迫时，胞内合成一系列的蛋白作为对胁迫的应答以保护细 胞，比如渗透蛋白和脱水蛋白，它们的功能类似分子伴侣，维持蛋白在高盐下的 结构不变( c a m p b e l la n dc l o s e ，1 9 9 7 ) 。此外，上面所提及的渗透压保护剂也是其 中的一类应答物质( c h e r te ta 1 ，2 0 0 2 ) 。因为高盐胁迫同时会引起其他次级胁迫， 比如氧化胁迫( z h a n ge ta 1 。2 0 0 7 ) 。由此产生的氧还化合物r o s 必须由细胞清 除出去( z h u , 2 0 0 1 ；z h a n ge ta 1 ，2 0 0 7 ) ，一些渗透压保护剂，如脯氨酸，甘露醇 等具有清除r o s 的能力( x i o n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) 。a l b i n s k y 等( a l b i n s k ye ta 1 ，1 9 9 9 ) 张碧佩中山大学硕士研究生学位论文大蕉m p r c i 基因盐胁迫应答机制的分子生物学研究 通过u v 敏感筛选到了盐敏感的植株，认为植物的高盐胁迫下还存在d n a 的修 复过程。 1 2 3 基因整体水平表达调控的改变 在全基因范围寻找植物盐胁迫下的表达调控改变，普遍的手段是基因芯片分 析。t e s t e r 等( t e s t e ra n dd a v e n p o r t ，2 0 0 3 ) 曾指出盐胁迫能引起大约占植物全基 因组8 的转录水平变化，当然植物之间存在较大差异，w a n g 等( w a n ge ta 1 ， 2 0 0 3 ) 对一些植物的盐应答基因初步的做了统计见表1 1 。目前研究对于模式植 物拟南芥的芯片分析最为详尽。有关拟南芥的芯片数据已经在几个公共数据库公 开，比如t a i n a s c ，g e n e v e s t i g a t o r 和a t g e n e x p r e s s ( m a e ta 1 ，2 0 0 6 ) 。基于标 准的a f f y m e t r i x 芯片的a t g e n e x p r e s s 数据库的结果显示拟南芥中共有2 4 1 9 个基 因会在3 h 的盐胁迫后发生变化，而在2 4h 的盐胁迫后则增加至3 9 3 0 个基因。 根据这些数据，m a 等( m a e ta 1 ，2 0 0 6 ) 将目标聚焦在其中的1 4 9 6 个基因中，这 些基因中1 0 0 0 个基因受到盐胁迫的明显上调，而有将近5 0 0 个则受到明显的下 调，通过模糊k - 均值聚类f f u z z yk - m e a n sc l u s t e r i n g ) ，这1 4 9 6 个基因中又被剔除 3 5 3 个联系数值较低的基因，那么剩下的1 1 4 3 个基因中8 2 可被分成l o 个主类， 剩下1 8 进入1 0 2 l 小类中( 图1 2 ，c 0 c 9 ，c 1 0 c 2 1 ) 。在1 0 个主类中c 0 ，2 ， 4 ，6 ，8 和9 受盐胁迫上调的基因，而c l ，3 ，5 和7 则是受到盐胁迫下调的基 因。 但是，这些基因中只有不到2 5 的基因是盐胁迫特异性调控的，多数还受到 其他胁迫因子的调控，如低温，渗透，伤害和激素等，也是说明植物体内的非生 物胁迫通路相互交叉成复杂的网络系统。值得一提的是图1 2 中的c 6 是一类盐 胁迫早期应答的基因，共7 6 个，该类基因有些普遍的特征： 1 ) 启动子元件通常含有d r e s ，m y b s 和a b r e s 2 ) 不仅对高盐应答，也对渗透胁迫应答和a b a 应答 这些基因中主要是一些转录因子如d r e b i a ，d r e b 2 a ，m y b 等，还有一 些逆境通路的功能蛋白如r d 2 9 a ，r d 2 0 和k i n l 等。 在c 6 类基因中，有一类a t r c l 2 基因( r a r ec o l di n d u c i b l eg e n e ) 是低丰度的 低温诱导基因，c a p e l 等( c a p e lc ta 1 ，1 9 9 7 ) 鉴定了其中两个基因同源基因， 张碧佩十m 大学h 研究生学位论i 太蕉埘删基目盐胁迫应菩机制的分子精学研究 a t r c l 2 a 和a t r c l 2 b ，是定位在细胞质膜上的高度疏水的小蛋白，受低温、渗透、 盐胁迫和a b a 诱导表达( m e d i n ae ta l ，2 0 0 1 ) 。该类小膜蛋白既非膜上的离子通 道亦不能作为上游的转录因子，然而却保守的存在植物中，因此展开对其功能 的探究。 衰i - i 植物中的盐应簪相关基园i 引白( w a n ge t a l ，2 0 0 3 ) t a b l e l - 1 g e n e s h n p u c a t e d i n m a r t sr e s p o n s e t os a l t n c ：l c * y w 巾 h w h l ” b * d i l 4 _ 【m oe “t ，_ ” 。龇j 器 _ w # l q h 一【m 4m f _ l q 一一 t 一 i 一f l l f h i l _ 端 = 一警= = ：口器 a 目i e m r 二”= “二”：4 二”二。二：”一j 一二” 田1 2 拟甫芥中1 1 4 3 十受盐调控的基因【引自o i - e t | l ，2 帅田 i g u r e l - 2 1 1 4 3 9 e n e sr e g u l a t e d b ys a l ts t r e s s h a r a o b 1“0口1叫口j1 张碧佩中山大学硕士研究生学位论文大蕉m p r c i 基因盐胁迫应答机制的分子生物学研究 1 3r c l 2 基因的研究现状 r c i ( r a r ec o l di n d u c i b l e ) 基因是低丰度的低温诱导基因，该类基因在拟南芥 中的研究较为广泛，包括以下四类：第一类为r c l l 和r c l 2 ，它们编码由约2 5 0 个氨基酸组成的酸性蛋白，与磷酸丝氨酸结合蛋白( 1 4 3 3 蛋白) 家族有高度一致 性( j a r i l l oe ta 1 ，1 9 9 4 ) ；第二类为r c l 2 ，编码5 4 7 7 a a 组成的高度疏水且保守的 小蛋白存在两个潜在的跨膜区，该家族基因共有8 个似t r c l 2 a 2 h ) ( m e d i n ae t a 1 ，2 0 0 7 ) ；第三类为r c l 3 ，该基因编码产物为一种过氧化物酶( l l o r e n t ee ta 1 ， 2 0 0 2 ) ；第四类为r c l 4 ，编码类c a 2 + h + 双向转运子( c a 2 + , , l - i + a n t i p o r t e r ，c a x l ) ( c a t a l ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 除了拟南芥，r c l 2 系列的基因遍布于1 5 0 多个物种，在高等植物中相似度 极高( 4 1 9 2 ) ，如水稻的o s l t i 6 ( m o r s ye ta 1 ，2 0 0 5 ) 、大麦的b l t l 0 1 ( g o d d a r d e ta 1 ，1 9 9 3 ) 、小麦的w p i 6 ( i m a ie ta 1 ，2 0 0 5 ) 、羊草的a c p m p 3 ( i n a d ae ta 1 ，2 0 0 5 ) ， 不仅在多种高等植物，还遍布于低等植物，细菌，真菌，原生动物，后生动物， 如苔藓的印s ! h p ( 1 ( r o e m e re ta 1 ，2 0 0 4 ) 、酵母的p m p 罗( n a v m ea n dg o f f e a u ， 2 0 0 0 ) 、大肠杆菌的y q a e 、线虫的t 2 3 f 2 3 等等。但在高等动物( 如节肢动物和 脊椎动物) 中却没有同源基因( m e d i n ae ta 1 ，2 0 0 7 ) 。r c l 2 编码蛋白的结构在进化 上如此保守，并且不同物种之间编码该膜蛋白的基因可以进行功能互补( i m a ie t a 1 ，2 0 0 5 ) ，提示它们在功能上是非常保守的一类膜蛋白，在生命活动中具有重要 作用。 对于r c l 2 类基因的生物学功能研究，目前文献报道相对较少。自c a p e l ( c a p e l e ta 1 ，1 9 9 7 ) 从拟南芥中鉴定到a