（运动人体科学专业论文）不同强度运动对大鼠肾脏Bcl2蛋白表达及细胞凋亡的影响.pdf

摘要目的：过度训练可以引起机体包括肾脏在内的多个脏器疲劳或损伤。如何防止运动疲劳及损伤是目前运动医学界的研究重点。本研究通过游泳方法建立运动模型，观察不同运动负荷状态下大鼠肾脏的组织病理变化。应用免疫组化法检测b c l 2 蛋白在不同负荷运动组的表达情况，应用末端脱氧核苷转移酶介导的缺口标记法( t u n e l )检测大鼠肾脏组织细胞凋亡情况，并对细胞凋亡的机制进行初步探讨，以期为过度训练对肾脏的影响提供理论基础。方法：4 0 只雄性w i s t a r 大鼠随机分成3 组，分别为对照组、一般运动负荷组和超负荷运动组。( 1 ) 对照组：常规饲养，不运动；( 2 ) 一般运动负荷组：进行中等强度游泳训练，每周训练6 天，每天训练1 次。( 3 ) 超负荷运动组：与一般运动负荷组运动环境相同，前2 周的训练安排同一般负荷运动组，第3 周开始负重训练，尾部负重从1 5 重量逐渐增加，训练时间不变。从第4 周开始每天上、下午各训练1 次，并保持这运动量直到第8 周。各运动组训练满8 周后，2 4 小时后2 ( 4 0 m g l 【g )的戊巴比妥腹腔麻醉，取肾组织，常规石蜡包埋，制作5 u m 石蜡切片。采用脏染色观察肾脏的组织病理变化，应用免疫组织化学技术检测肾组织中的b c l 2 蛋白的表达情况，用t u n e l 法检测大鼠肾脏组织细胞凋亡情况。结果：( 1 ) 一般情况观察：对照组和一般运动负荷组情况正常，超负荷组神态困倦，易受惊吓，毛发脱落，体形消瘦、双眼暗淡无光。( 2 ) 组织病理观察：对照组肾小管形态结构正常，间质无充血、水肿。一般运动负荷组肾小球轻度肿大、囊腔面积减小。超负荷运动组。肾小管排列稀疏、紊乱，肾小囊消失、肾小球变性。( 3 ) 免疫组化结果：对照组和一般运动负荷组，b d 2 在肾脏细胞浆中有明显表达，而在超负荷运动组大鼠肾小管细胞的胞浆中表达较少，统计学结果也显示超负荷运动组b c l 2 表达较对照组显著减少( p o 0 5 ) 。( 4 ) 细胞凋亡结果：对照组和一般运动负荷组肾脏组织中凋亡表达较少，而在超负荷运动组大鼠肾脏细胞浆有大量表达，统计学结果显示超负荷运动组凋亡较对照组显著增加( p 0 0 5 ) c o m p a f e dt oo t h e rg r o u p sb c l 一2e x p r e s s i o nd e c r e a s e ds i 印i f i c a n t l yi no v e r l o a dg r o u p o 0 5 ) ( 4 ) a p o p t o s i s ：t h e r ea r e1 e s sa p o p t o s i se x p r e s s i o ni nt h ec o n t r o lg r o u p 卸dt h eg e n e r a le x e r c i s eg r o u p ，i no v e r l o a de x e r c i s eg r o u pl 【i d n e yc e l l sc y t o p l a s mh a v eal a r g en u m b e r0 fe x p r e s s i o n ，t h es t a t i s t i c a lr e s u l t ss h o wt h a tc o m p a r e dt oc o n t r o l 乎d u pt h ea p o p t o s i ss i g n i f ：i c a l l t l yi n c r e a s e df o ro v e r l o a de x e r c i s e 伊o u p ( p 0 0 5 ) ( 5 ) r e l a t i o nb e t w e e nt h er a t eo fa p o p t o s i sa n de x p r e s s i o no fb c l 一2 ：s t a t i s t i c a la n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tr = 0 5 6 9b e 铆e e nt h er a t eo f 印o p t o s i sa n db c l - 2e x p r e s s i o n ，a s s o c i a t e dp r o b a b i l i t yp = o 0 0 1 c o n c l u s i o n ：( 1 ) i ng e n e r a le x e r c i s eg r o u p ，g l o m e t l l l a rm i l ds w e l l i n gb u tt h e r ea r en o to t h e rc l e a r l yp a t h o l o g i c a lc h a n g e s i no v e r l o a de x e r c i s eg r o u p ，t h e r ea r es e r i o u sp a t h o l o g i c a lc h a n g e s t u b u l a rd j s a 玎a n g e d ，r e n a lc y s t sd i s a p p e a r e d ，酉o m e r i l l a rd e g e n e r a t i o n t i p sf o ra p p r o p r i a t el o a dw i l ln o tp r o d u c ed a m a g e ，b u to v e r l o a dc a nd a m a g et h ek i d n e y s ( 2 ) t h e r ea r ec e r t a i nb d 一2e x p r e s s i o ni nn o 咖a l 孕o u p ，c o m p a r e dt og e n e r a le x e r c i s eg r o u p ，b c l 一2p r o t e i ne x p r e s s i o ni n c r e a s e d ，h o w e v e r ，n os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e c o m p a r e dt oo t h e rg r o u p s ，b c l 一2e x p r e s s i o nd e c r e a s e ds j g n i f i c a n t i yi no v e r l o a de x e l i s eg r o u p t i p sf o ra p p r o p r i a t el o a dc a nm a k eb c l 一2p r o t e i ne x p r e s s i o ni n c r e a s e ，l o n gt e n n0 v e r l o a dc a nm a k eb c l - 2p r o t e i ne x p r e s s i o nr e d u c e d ( 3 ) t h e r ea r cl e s sa p o p t o s i si nn o m a le x e f c i s eg r o u p ，w i t ht h ei n c r e a s eo fe x e r c i s ei n t e n s i t y ，a p o p t o s i si n c r e a s e s ，t h ee x p r e s s i o no fa p o p t o s i sa r es i g n i f i c a n t l yd i f 托r e n tc o m p a r e dw i t ho t h e rg r o u p s t i p sf o ra p o p t o s i sr e l a t e dt ot h el o a d ，a p o p t o s i sp e r h a p si so n er e a s o n sf o rf a t i g u e ( 4 ) a p o p t o s i sa n db d 一2e x p r e s s i o nh a v es i g n i f i c a n tn e g a t i v ec o r r e l a t i o n ，h o w e v e r t h e r ea r em o r ec o m p l e xf a c t o r sl l l r o u 曲m o r ec h a n n e l sr e g u l a t i n ga p 叩t o s i s ，褫dt h em e c h a n i s mn e e dt 0b ed e e p e rs t u d y k e yw b r d s ：e x e r c j s e ，o v e r t r a i n i n g ，k i d i l e y ，印0 p t o s i s ，b c l - 2p r o t e i n学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。一签名磕：p 睡钿7 日学位论文版权使用授权书本人完全了解武汉体育学院有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文 ，_ 并编入有关数据库。作鹤獬：裆隰p 彩年钿7 日不同强度运动对大鼠肾脏b c 卜2 蛋白表达及细胞凋亡的影响2 0 0 8 年武汉体育学院硕士学位论文1 前言适度运动可以提高人体各器官的机能及机体免疫力，起到强身健体的作用。现代体育运动，为了追求更好的运动成绩，教练往往采取高强度、大负荷量的方式进行训练，但是长时间超负荷的运动，往往超过机体的耐受极限，对人体造成伤害。国内外诸多文献资料表明，大多数运动项目均能导致肾脏形态结构和功能的异常改变。运动训练中如何减少运动损伤、防止运动性疲劳成为运动医学研究的重要课题之一，而细胞凋亡研究的深入则为进一步研究运动损伤的发生、发展机制提供了一个新的思路。细胞凋亡也称为程序性细胞死亡，系由局部环境的生理性或病理性刺激引起的一种受基因调控的有序的细胞非炎症性死亡，机体通过细胞凋亡清除衰老、损坏及突变的细胞，以达到生物体细胞增值与细胞死亡之间的平衡。虽然说凋亡本身是一种生理性保护机制，但细胞的生存和死亡的调节是机体组织健康存活的中心所在。基因及其产物处于复杂的协作和动态平衡之中，这种平衡调节被打破将导致机能失调和疾病。近年来，凋亡研究也逐渐被引入运动医学和运动人体科学中。学者们通过建立过度运动模型，已经在不少脏器证实了细胞凋亡的存在。p o d h o r s k a o k o l o w 等1 1j 研究发现急性运动可以使未经训练的大鼠在运动后肾小管细胞出现凋亡。袁海平1 2 j 及袁箭峰1 3 j 等研究发现长期超负荷运动和过度训练可引起肝脏及心肌细胞凋亡增加。肾脏作为人体的一个重要器官，血流丰富，在过度运动时因为有效灌注下降等原因，往往出现不同程度的损害，轻者表现为蛋白尿、血尿，重者则出现急性肾功能衰竭，严重的影响了正常的训练和比赛。本研究建立动物不同运动负荷模型，通过切片，光镜下观察肾脏组织形态结构变化；应用t u n e l 法及免疫组化法研究大鼠在不同负荷长期游泳后肾脏组织细胞凋亡及其相关凋亡因子b c l 2 蛋白的表达情况，对过度训练导致肾脏损伤的机制进行初步探讨，以期为过度训练对肾脏的影响提供理论依据。1不同强度运动对大鼠肾脏b c 卜2 蛋白表达及细胞凋亡的影响2 0 0 8 年武汉体育学院硕士学位论文2 综述2 1 运动对肾脏结构和功能的影响运动对肾脏的影响历来为运动医学所重视，肾脏结构和功能的相关指标作为运动员机能评定、运动量监控和运动医务监督等方面的重要依据，对此方面的研究已有不少报道。本文就运动对肾脏结构和功能的影响作综述。2 1 。1 运动对肾脏结构的影响关于运动对肾脏结构的影响主要表现在肾小球血管壁和肾小管上皮细胞变化。刘丽萍【4 】等以游泳训练1 5 天的大鼠为实验对象，观察到肾组织足细胞次级突膨胀，过滤裂隙未变，基膜增厚，密度变浅，部分内皮细胞有轻度变性深染。近曲小管上皮细胞内溶酶体减少，有大量中空小体，线粒体减少，有溶解现象；胞膜内褶减少扩张形成大的空泡，空泡形成处细胞膜破损，上皮细胞与基膜分离，基膜完整，毛细血管内皮细胞破损、脱落与近曲小管上皮细胞之间仅有基膜相隔。远曲小管上皮细胞近腔面几乎无胞质成分，胞膜内褶减少，细胞器位于基底部，内质网扩张。毛细血管极度充盈肿胀，血细胞堆积，血小板欲外出处基膜消失，内皮细胞完整，毛细血管内皮窗孔被血小板接近时的冲力打开，血小板游出毛细血管内皮。张淑芳【5 j 等，对进行8 周运动超负荷的大鼠进行研究后报道，肾小管排列稀疏、紊乱，肾小管扩张，肾小管、肾小球严重变性。有学者研究表明，运动负荷达到一定程度后将导致肾脏超微结构的损伤。戚正本1 6 】等研究不同时间大强度跑对小鼠肾的影响结果为，小鼠大强度持续运动3 0 分钟后，电镜下可见内皮小孔间距和孔径大小不等，肾小管上皮内顶浆大，小泡增多，次级溶酶体增多；运动6 0 分钟后，电镜下除可见以上变化外，还可见肾小体毛细血管扩张、充血，内皮吞饮小泡增多呈蜂窝状，基膜总宽度减少，足细胞宽短、扁平，次突增多，肾小管上皮胞体内部分线立体聚集、肿胀、空泡化，部分内质网扩张等；休息6 0 分钟后，仅见肾小管上皮细胞内少数粒体异常，出现空泡化，部分内质网扩张，次级溶酶体增多，体积增大，其它超微结构未见明显改变。由此可见，运动对肾脏超微结构的影响是随着运动负荷的增加而加重的，而这种影响能随着休息时间的延长而得到部分的恢复。扈诗兴【7 】等从游泳开始后的第二周起对大鼠进行4 体重负重游泳训练，负重时间从1 0 m i n 逐渐增加到1 8 0 m i n 直到1 2 周造模结束，次日处死。光镜下可看到肾小体分布不均，血管球和。肾小囊两层结构模糊，肾小体体积大小不一。血管球部分破坏、体积大小不一。肾小囊壁粗糙，间隙大小不一，囊腔面积减小、甚至消失。近曲小管细胞分界不清，胞核呈球形，位于近基底部，管腔模糊，变扁、甚至消失，细胞腔面刷状缘核基部纵纹结构模糊或消失。电镜下可见滤过屏障三层结构融合，厚度增加。毛细血管内皮细胞的薄膜状无核胞质变薄，甚至消失；基膜的三个亚层融合，呈一高电子密度带，总厚度增加；足细胞突起融合成片，裂孔消失。2 1 2 运动对肾脏功能的影响运动对肾功能的影响主要表现在肾细胞酶组化指标改变、尿成分改变等方面。2 1 2 1 肾功能的酶组化指标改变一系列研究表明，大鼠在剧烈运动后出现肾组织l p o 增高，s o d 活性改变、2不同强度运动对大鼠肾脏b c 卜2 蛋白表达及细胞凋亡的影响2 0 0 8 年武汉体育学院硕士学位论文g s h p x 活性降低、m d a 浓度增加等情况。李吲8 】等人研究了大鼠在安静时、递增负荷跑中和力竭运动后不同时相肾组织氧化、抗氧化指标和生物膜脂质过氧化情况，结果在运动中肾组织氧自由基信号开始增强，运动后3 0 分钟达最高。抗氧化指标s o d活性在同期亦随之增高。运动后3 0 分钟达峰值，反映膜脂质过氧化情况的m d a 浓度在运动中及恢复期都出现明显增高，至恢复期2 小时达峰值，到恢复期8 小时后降至与对照组无显著差异。李海河1 9 j 等发现持久性运动后即刻大鼠肾组织i j p o 水平和尿总蛋白排除率显著升高，s o d 活性升高不显著，g s h p x 活性显著下降。傅晓龙1 1 u j 对进行不同时间游泳运动的大鼠研究表明，大鼠肾组织m d a 的含量随运动时间的延长逐渐增多。与安静组相比，游泳4 0 m i n 组增加显著，力竭后即刻组极显著性增加，力竭后休息2 4 h 组，m d 岔含量达到最大值，远高于其它三组。认为由运动引起的肾缺血过程中，氧化损伤已经产生，其中虽有总抗氧能力的升高，使m d a 含量暂时处于较稳定状态，但肾缺血再灌注期的氧化损伤远大于缺血期，超过了总抗氧能力清除自由基的能力，导致恢复2 4 h 后肾组织内m d a 含量保持极高的水平。丁爱玲1 1 1j 等对进行力竭性游泳运动的大鼠研究表明，与对照组相比，m d a 含量明显升高，s o d 的活性及g s h p x含量显著降低。运动致l p 0 、m d a 浓度增高，g s h p x 活性下降、s o d 活性改变已为众多研究普遍认同，但刘丽萍【1 2 j 研究发现游泳后大鼠肾m d a 明显下降。季丽萍1 1 3 j 等对大鼠分别进行6 周的大强度的间歇训练和持续训练，研究认为无论是间歇训练还是持续训练都能使肾脏组织中的m d a 含量显著下降，s o d 活性有所上升，c a t 、g p x显著升高。2 1 2 2 运动与蛋白尿正常人尿液中仅含微量蛋白质( 日排出量在1 5 0 m g 以下，一般为2 m g ) ，常规方法检查不出。在剧烈运动后或进行长时间大强度运动后，不但尿中酸性代谢产物增加，而且相当一部分运动员尿中出现蛋白质。但运动后经过一定时间的休息，一般可在2 4 小时内自行消失。这种由于运动引起尿中蛋白质增加的现象称为运动性蛋白尿。有关运动性蛋白尿机理的研究已有1 0 0 多年的历史，研究表明几乎所有的运动项目运动后都能出现运动性蛋白尿1 1 4 1 。运动性蛋白尿不仅受个体差异、机能状态、运动项目、环境、年龄等因素的影响，而且与运动强度有关i l 引。袁海平1 1 6 j 等对大鼠进行游泳训练，随着运动强度的增加，尿蛋白含量上升，尤其是大强度运动组，尿蛋白量显著升高。研究还表明，大强度、短时间运动后的运动性蛋白尿主要是肾小球、。肾小管混合型；而在低、中强度长时间运动后的运动蛋白尿则是以肾小球型占优势1 1 4 j 。2 1 2 3 运动与血尿运动性血尿可表现为镜下血尿和肉眼血尿。其出现率与运动量大小有密切相关，男性运动员发生较多，在运动项目中以跳跃类和球类项目为多，运动性血尿出现后一般不超过3 天，各项肾功能指标正常且预后良好。运动性血红蛋白尿呈褐色，但不同于运动性血尿的是镜下少见或未见红细胞，常发生于青年男性，主要发生在行军、跑步等运动后，亦发生在手掌拍击物体后，尿中伴有蛋白，而其他检查正常，常常有自愈趋向【1 7 1 。运动引起肾脏结构和功能的变化是相互联系相互影响的。一方面，大强度运动后，肾小球滤过膜形态结构改变和通透性增加、肾小管上皮细胞形态和结构改变及能量代谢过程障碍导致肾小管重吸收功能改变，从而引起运动性蛋白尿和血尿的发生。另一方面，蛋白尿具有肾毒性，它会引起肾脏结构的改变。蛋白尿可直接损伤肾小球毛细3不同强度运动对大鼠肾脏b c 卜2 蛋白表达及细胞凋亡的影响2 0 0 8 年武汉体育学院硕士学位论文血管壁，蛋白分子在通过肾小球毛细血管基底膜致密层易被截留，从而损伤肾小球毛细血管基底膜。蛋白分子可促进足突细胞胞饮，继而发生空泡变性。经肾小球毛细血管基底膜滤出的蛋白由副系膜区进入肾小球系膜，大量蛋白可使系膜细胞吞噬超负荷，结果促进系膜细胞增生，基质扩展，系膜硬化。2 1 3 运动对肾脏损伤的机制研究表明，运动对肾脏损伤的可能机制主要有以下几种：2 1 3 1 肾上腺素和去甲肾上腺素的作用运动时由于交感神经兴奋，通过交感一肾上腺髓质机制，引起肾上腺素、去甲肾上腺素增加，肾小动脉收缩，肾血流量减少。有人向人体内注射肾上腺素，可使蛋白尿排泄量增加。说明肾上腺素、去甲肾上腺素使肾血流量减少是导致蛋白尿出现的重要因素。2 1 3 2 肾素一血管紧张素系统处于运动状态时，一方面由于肾小球旁细胞受交感神经、儿茶酚胺及促肾上腺皮质激素的刺激，诱发血浆中肾素活性增加；另一方面肾脏血流动力学变化又影响肾素的释放，当平均脉压差加大时，肾素释放率增加，运动越剧烈，脉压差越大。激烈运动时，肾素的活性比安静时高4 倍。肾素是一种特异性蛋白酶，它催化血管紧张素原分解为血管紧张素i ，后者在血管紧张素转换酶的作用下生成血管紧张素i i ，血管紧张素i i 是一种目前已知的使肾血管收缩最强的物质，它作用于肾脏，使肾小动脉收缩，滤过率增加。2 1 3 3 激肽释放酶它是体内的一种蛋白酶，可使某些激肽原分解为激肽，激肽释放酶可以分解为血浆激肽释放酶和组织激肽释放酶，组织激肽释放酶作用于低分子量的激肽原，产生一种十肽，称为赖氨酰激酶，也称血管舒张素。后者失去赖氨酸成为缓激肽，激肽可使毛细血管的通透性增加，从而导致蛋白尿。2 1 3 4 氧自由基在运动过程中，由于肾脏缺血再灌注将导致细胞内大量的自由基产生，从而引起脂质过氧化，滤过膜的通透性增加。体外实验也发现氧自由基可以分解基底膜的胶原成分，证实了氧自由基对滤过膜的损伤作用。氧自由基除了导致肾小球滤过膜的形态结构和通透性改变外，还会引起肾小球毛细血管壁负电荷丢失，使其电荷屏障处于瘫痪状态，增大了负电荷蛋白的透过。大量自由基诱发的脂质过氧化还对肾小管的重吸收造成影响。力竭运动后，电镜观察发现近曲小管线粒体肿胀，嵴减少，微绒毛有融合现象。并且这些形态上的变化在时间上与肾组织内脂质过氧化物的浓度增加平行。说明肾小管功能的减退同脂质过氧化相关。2 。2 运动与b c l 一2 蛋白2 2 1 运动对b c i 一2 蛋白表达的影响细胞凋亡是细胞的程序性死亡，需要启动细胞内的特殊基因，转录及合成特殊的蛋白质，这些特殊基因产物主要包括b c l 2 蛋白家族1 1 引、c a s p a s e 家族成员【1 9 】、i g f4不同强度运动对大鼠肾脏b c 卜2 蛋白表达及细胞凋亡的影响2 0 0 8 年武汉体育学院硕士学位论文家族成员、具有抑癌功能的“死亡基因 p 5 3 、f a s f a s l 系统1 2 u j 等。其中，b d 2 家族成员是在细胞凋亡过程中起重要作用的一类蛋白质，也是目前运动与细胞凋亡研究中研究最多的蛋白质。b c l 2 即b 细胞淋巴瘤基因2 ( bc e ul y m p h o m ag e n e2 ) 的缩写，最早由t s u i i m o t o ( 1 9 8 5 ) 从伴有1 4 、1 8 染色体易位的淋巴瘤细胞中发现。在正常人体内位于1 8 号染色体，在淋巴瘤患者，则易位于1 4 号染色体。b c l 2 是目前发现的与凋亡关系密切的原癌基因之一，能够编码b c l 2q ( 2 6 l ) 和b c l 2b ( 2 2 k d ) 两种蛋白质，是膜的整合蛋白，主要存在于线粒体外膜、核膜及部分内质网中，它很少与其他生化机制已清楚的蛋白同源。b c l 2 蛋白在正常组织自身稳定方面起重要作用，多出现在胸腺髓质细胞、记忆b 淋巴细胞、及寿命长的干细胞群里，如皮肤、结肠、前列腺和子宫内膜中，但很少出现在分化末期的上皮细胞中。b c l 2 的功能相当于线虫中的c e d 9 ，保护细胞，使之不进入凋亡程序。根据b c l 2 蛋白家族在细胞凋亡中的作用，分为抑凋亡蛋白( a n t i - a p o p t o t i c ) 和促凋亡蛋白( p r o a p o p t o t i c ) 1 2 1 j 。已在哺乳动物发现的抑凋亡蛋白有a 1 、b c l 2 、b c l w 、b c l x l 、b o o 、m c l 1 、n r 1 3 等7 种；在细菌中发现的有b h r f 1 、e 1 8 1 9 k 、k b c l 2 、l m w 5 h l 、o r f l 6 等5 种，c e d 9 是在线虫中发现的。已在哺乳动物发现的促凋亡蛋白有b a d 、b a k 、b a x 、b c l r 啪b o 、b c l x s 、b i d 、b i k 、b i m 、b l k 、b n i p 3 、b o k 、h r k 、n i p 3 等1 3 种，线虫中发现e 9 1 1 。b c l 2家族蛋白成员均含有保守的q 螺旋结构域，它们在蛋白质一级结构n 端到c 端的排列顺序依次是b h 4 、b h 3 、b h l 、b h 2 【2 2 j 。大多数抑凋亡蛋白，仅含b h l 和b h 2 两个保守结构域。b h 3 是两性的、具致死性的结构域1 2 引。只有与b c l 2 高度同源的抑凋亡蛋白才同时含有b h l 、b h 2 、b h 3 、b h 4 四个结构域。促凋亡蛋白不含b h 4 结构域。在b c l x l 的三维结构中，b h l 、b h 2 、b h 3 结构域的q 螺旋形成伸长的疏水裂缝，其它蛋白成员的两性q 螺旋b h 3 区域可插入该裂缝中，与其形成异二聚体。这说明b h l 、b h 2 、b h 3 结构域在b c l 2 家族成员之间二聚体的形成中具有重要作用。b d 2 家族的大部分抑凋亡蛋白被肽链c 末端的疏水性跨膜结构域引导，插入在线粒体膜、内质网膜和核膜的脂质双分子层中。若除去b c l 2 蛋白的跨膜结构域，b c l 2只能定位于胞液，抑凋亡活性减弱或丧失。促凋亡蛋白b i d 没有此结构域，故以非活性形式分布于胞液。当细胞受到死亡信号刺激时，促凋亡蛋白在酶的作用下，发生构象变化，从胞液和微丝、微管等细胞骨架转移到细胞器的膜结构上，与抑凋亡蛋白相互作用，使抑凋亡蛋白丧失对细胞凋亡的抑制活性，引起细胞器功能散失和各种促凋亡因子的释放，最终导致细胞皱缩，细胞外膜突出，凋亡小体形成，染色体d n a 裂解成梯状片段，由膜包裹的细胞碎片最后被邻近细胞吞噬。抑凋亡蛋白b c l 2 含2 3 9个氨基酸，分子量2 6 k d ，位于部分正常组织细胞及多种肿瘤细胞的线粒体外膜，b c l 2通过其b h 3 结构域与b c l 2 家族的促凋亡蛋白b a x 等形成异二聚体，使促凋亡蛋白不产生活性，抑制细胞色素c 的释放1 2 4 j ，保护细胞不进入凋亡程序；b c l 2 通过细胞内抗氧化作用，能阻断氧自由基损伤引起的细胞死亡。线粒体在细胞凋亡中起着关键作用，调节着线粒体膜内外c a 2 + 的浓度，而b c l 2 蛋白的主要作用位点就是线粒体膜，对线粒体膜的融合和破裂及膜内c a 2 + 的稳态起调节作用【矧。b c l 2 抑制c a 2 + 跨膜转运，b c l 2 高表达时，抑制钙泵处理的细胞中c a 2 + 内流和内质网储钙池中的c a 2 + 释放，降低c a 2 + 依赖性核酸酶的活性并阻断凋亡的发生。细胞凋亡时，b c l 2 家族的促凋亡蛋白与其它成孔蛋白相互作用，在线粒体膜上形成巨大的线粒体通透性转变孔，使大量c a 2 + 涌入到线粒体基质中，造成外膜破裂，膜间隙中的细胞色素c 、凋亡诱导因子和胱冬肽酶原释放到胞液中。细胞色素c 可能具有凋亡起始因子作用。有研究表明，5不同强度运动对大鼠肾脏b c 卜2 蛋白表达及细胞凋亡的影响2 0 0 8 年武汉体育学院硕士学位论文女子足球运动员大强度训练后血淋巴细胞c a 2 + 浓度显著增多，细胞凋亡率明显增高1 2 6 j 。在细胞色素c 作用下，凋亡诱导因子( a p o p t o s i si n d u c i n gf a c t o r ，灿f ) 从线粒体释放后，直接作用于细胞核染色质，在胱冬肽酶依耐性去核糖核酸酶的催化下，引起d n a 裂解为1 8 0 2 0 0 b p s 的片段，裂解d n a 的内源性内切酶有d n a s ei ，d n a s e i i ，n u c l 8 ，n u c 1 ，n u c 4 0 ，n u c 5 8 1 2 7 1 等。有研究表明，未经训练的大鼠，一夜轮形笼自发跑步后，骨骼肌细胞凋亡显著高于有训练组，肌纤维b c l 2 含量减少【2 8 】。提示运动导致骨骼肌细胞b c l 2 含量下降，抑凋亡基因的保护作用减少，骨骼肌细胞凋亡加速。运动量和运动强度是影响骨骼肌细胞凋亡程度的因素。金其贯1 2 9 j 等的研究表明，运动是引起心肌细胞凋亡的重要因素。不运动组大鼠的心肌组织未见凋亡细胞，每天1 h 运动组1 2 5 的心肌组织出现凋亡细胞，过度运动组6 6 7 的大鼠心肌组织出现细胞凋亡。对照组、1 h 运动组和过度运动组b c l 2 均表达，而过度运动组b c l 2 的表达显著低1 h 运动组，几乎与对照组相等。b c l 2 的低表达和细胞凋亡的高出现，提示长期不运动和长期过度运动，对心脏的影响都将是负面的。而长期过度运动，心肌组织细胞凋亡增加，可能是早期运动性心肌损伤的机制之一。杨胜利等观察到，体外培养的心肌细胞缺氧复氧后，部分心肌细胞凋亡；缺氧2 4 h 以后复氧，心肌细胞凋亡增加1 3 u j 。曾志勇等对猫心肌细胞凋亡的研究表明，心肌无论怎样预处理，缺血6 0 m i n 后再灌注9 0 m i n ，均有凋亡发生川。科学系统的运动能增强体质，使骨骼肌发达，心脏适应良好，血细胞新陈代谢旺盛。用细胞凋亡的理论来探讨这些问题，对运动健身以及训练的科学安排，过度训练的预防和调整有着重要意义。2 2 2b c 卜2 蛋白家族与细胞凋亡机体内存在多条细胞凋亡的信号转导途径，其中“线粒体途径 是最重要的途径之一，b c l 2 家族蛋白是该途径的关键调节因素【3 2 】。研究发现，b c l 2 家族能够调节线粒体膜上通透性转换孔( m i t o c h o n d r i a lp e m e a b i l i t yt r a n s i t i o np o r e ，m p t p ) 的启闭。m p t p 是横跨在线粒体内外膜之间的一种非选择性通道，主要由位于线粒体外膜的电压依赖性阴离子通道、位于线粒体内膜的腺嘌呤核苷酸转位酶和位于线粒体内腔的环孢菌素a 受体d ( c y d o s p h i l i n d ，c y p d ) 所构成。各种凋亡诱导因素( 如缺血、缺氧、辐射、) 通过多种信号转导途径可导致m p t p 不可逆开放，引起线粒体跨膜压( m i t o c h o n d r i at r a n s m e m b r a n ep o t e n t i a ，l 1 l r m ) 下降，细胞色素c 通过m p t p 释放到细胞质中。释放到细胞质中的细胞色素c 与胞质中的凋亡蛋白酶激活因子1 ( a p o p t o t i cp r o t e a s ea c t i v a t i n gf a c t o r - 1 ，a l p a f 1 ) 和c a s p a s e 9 酶原相结合形成凋亡酶体( a p o p t o s o m e ) ，生成有活性的c a s p a s e 9 而触发凋亡蛋白酶的级联反应，引起细胞凋亡的发生，此即“线粒体途径”。另外通过m p t p ，线粒体还释放其他一些细胞因子如灿f 、s m a c ( s e c o n dm i t o c h o n d r i a d e r i v ed a c t i v a t o ro fc a s p a s e ) 等引起细胞凋亡的发生。现已明确b c l 2 蛋白具有稳定m p t p 的作用，使m p t p 的功能保持正常。以非活性形式存在于胞质中的b a x 蛋白会在凋亡诱导因素作用下发生构型变化，从细胞质移位到线粒体膜与b d 2 形成异源二聚体抑制b c l 2 的活性，使m p t p 不可逆开放，启动和维持细胞凋亡的“线粒体途径”。g u p t a 等【3 3 j 发现，胞质中b a x 与热休克蛋白6 0 ( h e a ts h o c kp r o t e i n6 0 ，h s p 6 0 ) 结合为复合物，缺氧等凋亡诱导因素能引起复合物解离，游离的b a x 遂移位到线粒体膜与b c l 2 结合。另外，介导细胞凋亡发生的途径还有“死亡受体途径”和“内质网途径 等，b c l 2 家族也可通过其他信号转导途径影响细胞凋亡的发生。6不同强度运动对大鼠肾脏b c 卜2 蛋白表达及细胞凋亡的影响2 0 0 8 年武汉体育学院硕士学位论文2 3 运动与细胞凋亡细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 是由k e r r 等人1 3 4 j 于1 9 7 2 年首次提出的。但这个概念当时并未引起注意。白2 0 世纪8 0 年代w v l l i e 【3 5 j 揭示了细胞凋亡独特的生物学特征，即1 8 0 2 0 0b p s 单体或寡聚核小体d n a 片段，其电泳谱为典型的“梯形带”以来，细胞凋亡的研究倍受世人关注且得到了蓬勃发展。近来对细胞凋亡分子机理研究显示，细胞凋亡是一个遗传性的程序性过程，是细胞在基因调控下有序死亡的形式1 3 6 j 。由于细胞凋亡的研究在很多方面己取得了重大的突破和进展，特别是在机体疾病发生发展中的重要作用及治疗上的潜在意义，细胞凋亡已成为生物医学领域研究的热点和前沿之一。随着研究的深入，细胞凋亡逐渐被引入到运动医学、运动人体科学等领域中，并认为细胞凋亡是导致运动损伤和运动疲劳的又一因素。适度的运动可以促使衰老的及功能差的细胞发生凋亡，从而从整体上提高身体的机能，有益于人体的健康和运动水平的提高，达到锻炼的目的；也可通过提高细胞内各种抗氧化酶的活性，抑制细胞过度凋亡，从而对人体起到保护作用。大强度的运动训练易导致细胞凋亡大量增加，从而造成组织器官的损伤。相信随着对细胞凋亡研究的深入将有助于提高人们对运动损伤的认识，对如何防治运动损伤提供新的思路。过度训练，特别是长期不合理的训练会造成运动损伤，大量研究表明剧烈运动后骨骼肌收缩机能下降，代谢紊乱。以往认为运动可造成机体一定的损伤，引起细胞坏死，但近来越来越多的证据表明，运动时不仅存在细胞坏死还存在细胞凋亡的现象。探讨细胞凋亡与运动的关系正同益受到人们的重视。凋亡细胞与正常细胞相比有独特的形态学和生物化学特征。形态学表现与特征：细胞体积变小，胞膜完整，胞浆浓缩，细胞器减少；核染色质密度增高，凝聚在核周边，核裂解，并被包裹形成凋亡小体。凋亡小体是凋亡细胞特征性的形态学变化。生物化学特征：保持较低的能量代谢，染色质丝状破裂，被内切核酸酶降解，形成长度为1 8 0 2 0 0 b p s 的d n a 片段，凝胶电泳表现为梯状条带。2 3 1 过度运动对某些器官细胞凋亡的影响2 3 1 1 过度运动对免疫系统细胞凋亡的影响过去发现人们在长时间、大强度的运动训练后，往往出现免疫抑制现象，易感染一些疾病，如上呼吸道感染，但其具体原因不很清楚，近来研究证实过度训练后免疫细胞因为发生凋亡而大量减少 + 从而造成机体免疫力下降。早在2 0 世纪9 0 年代初，就有人对胸腺细胞等淋巴组织细胞在运动条件下发生细胞凋亡的情况进行了一些研究工作。c o n c o r e t 等人1 1 】对力竭运动的w i s t a r 大鼠胸腺细胞的凋亡情况进行了研究，发现两次力竭运动后、一次力竭运动后以及中等强度f 相当于一次力竭运动强度的一半1 运动，其胸腺细胞都出现典型的凋亡特征型d n a 梯形电泳条带，而且这种凋亡发生部分地受糖皮质激素受体的介导。l i 掣3 7 j 对连续两天以1 3 8 m m i n 6 0 9 0 m i n d 的强度运动后的大鼠胸腺细胞进行了研究，观察到典型的d n a 断裂等细胞凋亡特征，同时发现若运动前7 d 大鼠服用抗氧化剂b h a ( 2 3 丁基4 羟基茴香醚) 可阻断运动诱发的d n a 断裂，提示活性氧等自由基可能在运动诱发的胸腺细胞的细胞凋亡中扮演角色。n a v a l t a 等l 础j 让1 4 位受试者在跑台上进行不连续的，强度从3 8 v 0 2 m a ) 【、6 1 v 0 2m a x 、7 6 v 0 2m a x 、8 9 v 0 2m a x 、1 0 0 v 0 2m a x 逐渐增加的跑步运动，并对受试者的淋巴细胞的凋亡率进行检测，发现运动强度在3 8 v 0 2 m a x 时，淋巴细胞的凋亡7不同强度运动对大鼠肾脏b c 卜2 蛋白表达及细胞凋亡的影响2 0 0 8 年武汉体育学院硕士学位论文率与运动前相比无变化，强度在6 1 v 0 2m a x 细胞凋亡增加，以后凋亡率随运动强度的增加而增加。认为淋巴细胞凋亡与运动强度有关，且存在一个运动强度的阈值，此阈值就4 0 v 0 2 m a x 一6 0 v 0 2m a x 。加拿大学割3 9 j 也研究发现大鼠肠系膜淋巴细胞在剧烈运动后出现明显凋亡现象，数量减少。以上结果在某种程度上说明，运动可以诱发淋巴细胞的凋亡，这可能是长时间、大强度运动后淋巴细胞减少，进而免疫力下降的原因之一。熊国胜i 加j 等对不同强度运动对大鼠淋巴细胞凋亡的影响，结果显示，力竭运动和大强度运动后细胞凋亡率明显高于安静对照组，表明大运动量可诱导细胞凋亡增加，同时与安静对照组相比s o d 的活性降低，m d a 的含量升高，s o d m d a 比值降低，认为机体的抗氧化能力下降可能是凋亡发生的机制之一。2 3 1 2 过度运动对心肌细胞凋亡的影响出生后的心肌细胞属于终末分化细胞，是一种不具备增殖能力的成熟细胞。心肌细胞凋亡在维持心脏正常形态结构方面具有十分重要的意义。过去认为，细胞凋亡在不具备再生能力的细胞如成熟的心肌细胞、神经细胞中不再发生。但近些年的研究表明，细胞凋亡同样存在于心肌细胞中，年龄增加可引起心肌细胞凋亡，并占心肌细胞缺失的3 0 【4 。细胞凋亡被认为是心脏由代谢性变化向病理性变化发展的细胞生物学基础。由于方法学的进步和细胞凋亡研究的深入，科研工作者的研究不但深入到心脏病中，同时也涉入到运动医学和运动人体科学的研究，探讨运动对心肌细胞的凋亡。研究表明，过度训练和一次性力竭运动都可造成心肌细胞凋亡的增加【4 2 j 。c a r r a r o等1 4 3 j 和袁海平等的研究也表明，长期超负荷运动和力竭运动及过度训练都可引起心肌细胞凋亡增加，但其可能的机制尚未阐述。这提示心肌细胞凋亡有可能是心脏实质细胞的丢失，说明心肌细胞凋亡参与了由于运动超负荷而致的病理性失代偿心脏转变过程，并在此过程中起重要作用。袁箭峰、常芸等1 3 j 应用流式细胞技术对不同强度及力竭训练后大鼠心肌细胞凋亡情况进行了观察，发现大强度及力竭训练组大鼠较对照组大鼠心肌细胞凋亡率明显增加，中等强度训练组大鼠心肌细胞凋亡增加不明显，证明训练可造成心肌细胞凋亡，且与运动强度密切相关，并认为细胞凋亡可能是运动性心肌微损伤发生、发展的病理机制之一。金其贯等【2 9 j 也通过检测力竭性游泳训练的大鼠心肌，得出同样的结果，因此认为长期大负荷的运动训练可引起心肌细胞发生凋亡，心肌细胞凋亡增多可能是早期运动性心肌损伤的主要表现。2 3 1 3 过度运动对骨骼肌细胞凋亡的影响-，近几年运动医学界对骨骼肌细胞凋亡开展了一些研究。有关运动导致的肌肉损伤是否与骨骼肌细胞凋亡有关目前已有一些证据证明运动性肌肉损伤与骨骼肌细胞凋亡有关。s a n d r i 掣4 5 j 在对成年小鼠进行运动性肌纤维损伤研究时发现正常小鼠和肌营养不良小鼠在进行一夜轮形笼自发跑步后，均检测出凋亡的肌细胞，而未运动组则没发现，说明运动训练造成的肌肉损伤有细胞凋亡的存在。p o d h o r s k a o k o l o w 等【4 6 j 用成年小鼠进行运动性肌纤维损伤实验来对骨骼肌细胞凋亡的时间进程进行分析，他们在小鼠进行一夜轮形笼自发跑步之后发现，在进行该自发跑步之前未经历运动训练的小鼠，在自发跑步后骨骼肌的凋亡细胞明显高于运动组，且在4 d 后减少。同时肌纤维中b c l 2 含量减少，但b a ) 【、f a s 、i c e 和泛素随凋亡肌细胞核的变化而改变表达类型。凋亡的内皮细胞出现在跑后即刻，4 d 后增加2 倍。未经运动的小鼠在自发跑后凋亡肌细胞核和凋亡的内皮细胞数量均增加。周未艾【47 j 等运用原位末端标记技术检测不同强度运动后大鼠股四头肌的细胞凋亡情况，实验结果表明，在不同速度的运动状8不同强度运动对大鼠肾脏b c 卜2 蛋白表达及细胞凋亡的影响2 0 0 8 年武汉体育学院硕士学位论文态下，运动后即刻即有散在的t u n e l 阳性细胞核检测出，提示在训练期间有肌肉细胞发生凋亡，而且随着训练强度的增加，凋亡的肌肉细胞也有增多的趋势。王长青【删等用流式细胞术和t u n e l 法也观察到运动过程中骨骼肌细胞凋亡增加，且和运动时间有关。郑师陵【4 9 】在进行不同运动训练量与骨骼肌细胞凋亡的实验研究中发现，大鼠进行游泳训练，第一周细胞凋亡率最高，第二、三周下降，但与对照组相比仍有显著性增加。2 3 1 4 过度运动对肝脏细胞凋亡的影响袁海平通过对大鼠进行不同强度的游泳训练，观察运动后肝脏的细胞凋亡情况。结果显示：游泳训练6 天组肝s o d 活性升高，m d a 含量增加，肝组织凋亡细胞比例显著增加；训练1 2 天组肝s o d 活性下降显著、m d a 含量显著增高，观察到的凋亡细胞数量减少，并出现细胞坏死；训练1 8 天组s o d 活性开始回升，m d a 含量开始回落，自由基的产生和清除开始趋于动态平衡，此时电镜观察到的凋亡细胞比例增加，而坏死细胞减少，提示可能处于恢复过程。认为，运动可造成肝细胞的凋亡，且和自由基过度产生及清除有关1 2 j 。还有研究发现长时间低强度运动可降低血浆t g 、t c 、l d l c 含量，升高l d l 广c 含量；而高强度短时间运动使大鼠血浆t g 、t c 、l d l ，c含量升高。提示，长时间低强度运动可促进血浆脂质代谢，高强度短时间运动则导致脂质异常的发生，同时对肝细胞凋亡进行了检测，结果大鼠肝细胞均出现不同程度的凋亡，且高强度短时间运动组细胞凋亡比例明显升高，提示高强度运动时肝细胞凋亡的异常增加有可能是血浆脂质代谢异常发生的原因之一【删。李善妮【5 l j 等测定s d 大鼠不同强度一次性力竭运动后肝脏线粒体中c a 2 + 的含量及肝细胞凋亡，结果为不同强度运动至力竭，各组间细胞凋亡有显著性差异，并认为线粒体内c a 2 + 的大量积聚可能激活了细胞凋亡的启动程序，这使得中等强度至力竭更易于导致肝细胞凋亡。2 3 1 5 过度运动对肾脏细胞凋亡的影响肾脏是维持内环境稳定的重要器官之一，急性运动对肾功能的影响主要表现为运动后尿蛋白排泄异常。目前，学者们关于运动对肾脏凋亡的影响的研究不多，现有的研究认为细胞凋亡是引发