（遗传学专业论文）铜绿假单胞菌生物被膜形成早期相关基因的研究.pdf

南开大学博士研究生毕业( 学位) 论文 摘要 铜绿假单胞菌是一种重要的条件致病菌，它能在机体腔道、各种组织及体内 留置的生物医学材料的表面形成生物被膜，从而导致顽固性感染。据文献报导， 鞭毛介导的泳动和型菌毛介导的蹭动在被膜形成的早期起重要作用，这两种 运动能力丧失的突变子，不能在塑料表面形成生物被膜。本文以一株临床分离的 铜绿假单胞菌p a 6 8 做受体菌，应用m u 转座复合物技术从反向遗传学的角度对 鞭毛和型菌毛运动的相关基因进行研究。 m u 转座复合物技术近两年刚兴起尚未见应用到假单胞菌属的报导，本文 先以质粒p s m c 2 8 代替m u 转座复合物对p a 6 8 的电转化条件进行优化。详细研 究了细菌生长状态、感受态细胞的浓度和贮备方式以及电脉冲场强等参数对转 化效率的影响，结果表明：在细胞生长至对数期( o d 5 4 0 = o 7 0 8 ) 时收集菌体， 在低温条件下，制备成浓度为1 0 “c e l l s m l 的感受态细胞，设置高脉冲场强f 1 3 k v c m ) 电击，能获得1 6 8 x1 0 8 c f u u g d n a 的最高转化效率。选用生长时期和 电击电压两个主要参数验证m u 转座复合物对p a 6 8 的电转化条件，结果表明 m u 转座复合物与质粒的最佳电转化条件相一致。用筛选出的优化条件成功地将 m u 转座复合物转入到p a 6 8 中，得到3 6 6 x1 0 4c f u u gd n a 的高转化效率， 建立了菌株p a 6 8 的m u 转座突变文库。 对m u 转座突变子进行泳动和蹭动能力的检测，从约2 0 0 0 个突变子中，筛 选出泳动能力缺陷型突变子4 株，蹭动能力丧失或减弱的突变子1 l 株。 s o u m t h e m 杂交证实转座子均为单拷贝插入。将转座子及其侧翼的基因组序列克 隆到p u c l 8 载体上，以转座子末端的反向序列做引物，对其侧翼的基因组序列 进行核苷酸测序，并将测序结果在g e n b a n k 中进行b l a s t 比对，从而确定转座 子插入到基因组中的位置。结果显示，4 个泳动缺陷型突变子中，转座子分别插 入到u v r d 、p h z f l 、z w f 并dp a 0 1 7 14 个基因中；1 1 个蹭动缺陷型突变子中，转 座子分别插入到8 个不同基因的内部：有三个分别插入到p a 0 4 1 3 基因的前端， 中部和后端：有两个分别插入到p i l q 的不同位置；其它突变子中，转座子分别 插入到p i l v 、a l g r 、p a l 8 2 1 、p a l 8 2 2 、p a 4 9 5 9 和p a 0 1 7 1 中。上述1 1 个基因 中，有6 个基因属于i 类或i i 类基因，它们的功能己在铜绿假单胞菌或其它菌株 南开大学博士研究生毕业( 学位) 论文 中得到实验证实：p a 0 4 1 3 和p a l 8 2 1 属- t - i i i 类基冈，其功能是根据它们所编码 蛋白质的保守氨基酸基序或其基因序列与已知功能基因的相似性推测得出的，但 缺乏实验证据；p a 4 9 5 9 ，p a l 8 2 2 和p a 0 1 7 1 则属于类基因，但最新的一篇 研究报道证明p a 4 9 5 9 为一信号蛋白，参与铜绿假单胞菌的蹭动，p a o i7 1 和 p a l 8 2 2 的功能则完全未知。 对基因p a 0 17 1 和p a l 8 2 2 进行了核苷酸序列测定。序列比对发现p a l 8 2 2 的编码产物与一种信号传导蛋白p i l l 有定的同源性，p a 0 1 7 1 则与任何功能已 知或未知的基因都没有高同源性。利用反向互补实验进一步研究基因p a 0 1 7 1 和 p a l 8 2 2 的功能，结果表明，携带p a 0 1 7 1 基因的质粒p d n l 8 s 使突变子 p a 6 8 p a 0 1 7 1 ：m u 的蹭动和泳动能力均恢复至正常水平；而携带p a l 8 2 2 基因的 质粒p d n l 8 f 则使突变子p a 6 8 p a l 8 2 2 ：m u 的蹭动能力得以部分恢复。根据同 源重组原理，用插入失活的基因置换出染色体上的正常基因，在铜绿假单胞菌标 准株p a 0 1 中分别构建了基因p a 0 1 7 1 和p a l 8 2 2 失活的突变子。运动能力检测显 示，突变子p a 0 1 p a 0 1 7 1 ：g m r 丧失了泳动和蹭动能力；而突变子p a 0 1 p a l 8 2 2 ： g i n r 则没有蹭动能力。上述实验结果证明p a 0 1 7 1 基因参与了pa e r u g i n o s a 的泳 动和蹭动，p a l 8 2 2 基因则为蹭动所必需。 在电子显微镜下观察p a 0 1 7 1 突变子和p a l 8 2 2 突变子的细菌形态，结果表 明，p a 0 1 7 1 突变子有正常的鞭毛，但型菌毛缺失；p a l 8 2 2 突变子的鞭毛和 i v 型菌毛均完好存在，推测p a 0 1 7 1 可能为一调节基因，控制鞭毛和i v 型菌毛 的运动，同时控制1 v 型菌毛的生物合成。而p a l 8 2 2 可能是一个信号蛋白，能 够感受外界环境信号的刺激从而调节i v 型菌毛的运动。 本文首次将m u 转座复合物技术应用到假单胞菌的功能基因组的研究中，为 假单胞菌属的研究提供了一个新的遗传学手段。并首次证明p a l 8 2 2 和p a 0 1 7 1 基因与pa r e u g i n o s a 的运动有关，为透彻理解生物被膜的形成机制提供了实验 依据。 关键词：m u 转座复合物：铜绿假单胞菌： 泳动； 蹭动；遗传互补 南开大学博士研究生毕业( 学位) 论文 a b s t r a c t p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s ai sa ni m p o r t a n to p p o r t u n i s t i cp a t h o g e no fh u m a n st h eb a c t e r i ac a n c o l o n i z eav a r i e t yo fs u r f a c e sa n df o r mb i o f i l m ，w h i c hc a u s e sp e r s i s t e n ti n f e c t i o ni nt h eh o s t s w i m m i n gm o t i l i t ym e d i a t e db yf l a g e l l u ma n dt w i t c h i n gm o t i l i t ym e d i a t e db yt y p ei vp i l ip l a y v e r yi m p o r t a n tr o l e i nt h ei n i t i a t i o no fb i o f i l mf o r m a t i o n ，m u t a n t sd e f i c i e n ti n t w i t c h i n ga n d s w i m m i n g l o s sa b i l i t yo fi n i t i a t i n gb i o f i l mf o r m a t i o n i nt h i ss t u d y ，m u t r a n s p o s i t i o nc o m p l e x e s t e c h n i q u ew a s u s e dt os t u d yt h eg e n e si n v o l v e di nt w i t c h i n ga n ds w i m m i n go f p a e r u g i n o s as t r a i n p a 6 8 ，w h i c hw a si s o l a t e df r o map a t i e n tw i t hb r o n c h i e c t a s i s m u t r a n s p o s i t i o nc o m p l e x e st e c h n i q u eh a dn o tp r e v i o u s l yb e e na p p l i e dt op s e u d o m o n a ss p p s a n de l e c t r o t r a n s f o r m a t i o no ft h ec l i n i c a li s o l a t ep a 6 8h a dn o tb e e nd o n e p r e v i o u s l y , s ot h e e l e c t r o p o r a t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e df i r s t o p t i m u mc o n d i t i o n si n c l u d i n gg r o w t hs t a g eo f t h e s t r a i n ，e l e c t r i cf i e l ds t r e n g t h ，c o n c e n t r a t i o na n dp r e s e r v a t i o no fc o m p e t e n c ec e l l sw e r ed e f i n e d u s i n gp l a s m i dp s m c 2 8i n s t e a do fm u at r a n s p o s i t i o nc o m p l e x e s i ts h o w e dt h a tt h eh i g h e s t t r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c yo f p s m c 2 8c o u l db eo b t a i n e du pt o1 6 8x1 0 8c f u g gd n a u n d e rt h e o p t i m u m c o n d i t i o n si nw h i c ht h e c o m p e t e n t c e l l sw e r ec o l l e c t e da t l o g a r i t h ms t a g e ( o d 5 4 0 = 0 7 - 0 8 ) a n dc o n c e n t r a t e du pt oa b o u t1 0 “c e l l s m l ，f i e l ds t r e n g t hw a ss e tt ob e1 3k v c m t h eo p t i m a lc o n d i t i o nw a sc o n f i r m e du s i n gm u a t r a n s p o s i t i o nc o m p l e x e sa s w e l lw i t ht h e o p t i m a lc o n d i t i o n s ，m ut r a n s p o s i t i o nc o m p l e x e sh a v e b e e n s u c c e s s f u l l y i n t r o d u c e di n t op a e r u g i n o s as t r a i np a 6 8a n do b t a i n e de f f i c i e n c ya sh i g ha s3 6 6 x 1 0 4 c f u p , gd n a a n dap o o lo f 6 0 0 0m i n i _ m ui n s e r t i o nm u t a n t sw e r ee s t a b l i s h e d ，w h i c hi s l a r g ee n o u g h t oi s o l a t es w i m m i n go r t w i t c h i n gd e f i c i e n c ym u t a n t so f p a 6 8 4m u t a n t sd e f i c i e n ti ns w i m m i n g m o t i l i t ya n d11 m u t a n t sd e f i c i e n ti nt w i t c h i n gm o t i l i t yw e r e i s o l a t e do u to fa b o u t2 0 0 0m i n i m ui n s e r t i o nm u t a n t s s o u t h e r n b l o t t i n g c o n f i r m e dt h a tt h e i n s e r t i o n sh a do c c u r r e da s s i n g l ee v e n t s d n as e q u e n c i n go ft h er e g i o nf l a n k i n gt h ei n s e r t i o n r e v e a l e dt h a tt h em i n i - m u t r a n s p o s o nh a di n s e r t e di n t of o u rd i f f e r e n tg e n e s ( p a 0 17 1jw t p h z f l a n du v r d ) i ns w i m m i n gm o t i l i t yd e f i c i e n c ym u t a n t s ，a n d8 d i f f e r e n tg e n e s ( p a o i 7 1 ，p a 0 4 1 3 ， p a l 8 2 1 ，p a l 8 2 2 , p a 4 9 5 9 ，p i l v , p i l qa n d 口辔r ) i nt w i t c h i n gm o t i l i t yd e f i c i e n c ym u t a n t s t h e f u n c t i o no fs i xo f t h e s eg e n e sh a sb e e n p r e v i o u s l yd e m o n s t r a t e d ；w h i l et h ef u n c t i o no f p a l 8 2 1 a n d 3 南开人学博上研究生毕业( 学位) 论义 p a 0 4 1 3i sp r e d i c t e db yt h e i rp u t a t i v ep r o t e i ns t r u c t u r ef e a t u r eo rc o n s e r v e dm o t i f , b u ts h o r to f e x p e r i m e n t a le v i d e n c e ；p a 4 9 5 9i sr e c e n t l yp r o v e nt ob eas i g n a lp r o t e i nr e q u i r e df o rt w i t c h i n g m o t i l i t y t h er e m a i n i n g t w o g e n e s ，p a 0 1 7 1a n d p a l 8 2 2a r ee n t i r e l yn o v e lw i t hu n k n o w nf u n c t i o n t h e c o m p l e t e n u c l e o t i d e s e q u e n c e so fp a 0 1 7 1 a n dp a l 8 2 2w e r e d e t e r m i n e d a l i g n m e n t a n a l y s i ss h o w e dg e n ep a 0 1 7 1a n di t sp u t a t i v ep r o t e i nh a v en o s i g n i f i c a n th o m o l o g y w i t ha n yg e n e o rp r o t e i nw i t hk n o w nf a n c t i o ni n 尸a e r u g i n o s ao ro t h e rb a c t e r i a ，w h i l et h ep r e d i c t e dp r o d u c to f p a l 8 2 2s h o w s 5 1 s i m i l a r i t ya n d3 8 i d e n t i t yw i t has i g n a lt r a n s d u c t i o np r o t e i np i l l t h e t w i t c h i n gm o t i l i t yd e f e c ti nt h ep a l 8 2 2m u t a n tw a sp a r t i a l l yc o m p l e m e n t e db yp r o v i d i n g t h ep a l 8 2 2 g e n ei nt r a n s ，a n dt h et w i t c h i n ga n ds w i m m i n gd e f e c ti nt h ep a 0 17 1m u t a n tw a sf u l l y c o m p l e m e n t e dw h e np a o 7 1w a sp r o v i d e d ap a 0 1 7 1m u t a n ta n dap a l 8 2 2m u t a n tw e r e c o n s t r u c t e db yg e n er e p l a c e m e n ti nt h epa e r u g i n o s ap a 0 1s t r a i n ，m o t i l i t ya s s a ys h o w e dt h a t p a 0 1 p a l 8 2 2m u t a n td e f i c i e n ti n t w i t c h i n g ，w h i l ep a 0 1 p a 0 1 7 1 m u t a n tl o s st h e a b i l i t y o f t w i t c h i n ga n ds w i m m i n g f l a g e l l a a n dp i l ie x a m i n a t i o nw e r ep e r f o r m e du s i n gt r a n s m i s s i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p y t y p ei v p i l io f p a 0 17 1m u t a n tc 5 4c o u l dn o tb ed e t e c t e dw h i l ep a l 8 2 2m u t a n tk 2c o n t a i n sr e g u l a r t y p e i vp i l l ，b o t hc 5 4a n dk 2c o n t a i nf l a g e l l u mj u s tl i k e w i d et y p es t r a i n p a 6 8 ，s u g g e s t i n gt h a t p a 0 1 7 1i s p r o b a b l yar e g u l a t i o ng e n ew h i c hc o n t r o lb o t ht h eb i o g e n e s i so ft y p ei vp i l ia n d m o t i l i t yo fp a e r u g i n o s a ；p a l 8 2 2i sp r o b a b l yas i g n a lp r o t e i nw h i c hi n v o l v e di nt h er e g u l a t i o no f t w i t c h i n gm o t i l i t y i nt h i ss t u d y , m u t r a n s p o s i t i o nc o m p l e x e st e c h n i q u ew a sf i r s tt i m eu t i l i z e dt op s e u d o m o n a s s p p , w h i c hw i l lb ean e we f f i c i e n tm u t a g e n e s i ss t r a t e g yf o rp s e u d o m o n a s s p pg e n e t i c s t w on e wg e n e s i n v o l v e di n m o t i l i t yo fpa e r u g i n o s aw e r ei d e n t i f i e d ，w h i c hw i l lb et h ep o t e n t i a l t a r g e t s f o r d e s i g n i n gd r u g s t oi n t e r f e r ew i t hb i o f i l mf o r m a t i o n k e yw o r d s ：p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ；m u t r a n s p o s i t i o n c o m p l e x ；s w i m m i n gm o t i l i t y t w i t c h i n gm o t i l i t y ；t r a n s - c o m p l e m e n t a t i o n 4 南开大学博士研究生毕业( 学位) 论文 第一章绪论 长期以来，人们一直认为细菌主要是以单个的浮游生长的生命方式存在的。 经典细菌学研究的是浮游生长的细菌，药敏实验测定的也是液体培养的浮游菌对 抗生素的敏感性。然而，在临床上人们常发现，有些感染即使分离到病原菌，并 根据抗生素敏感实验选择有效的抗生素进行治疗，却往往导致治疗的失败。这种 现象曾经使临床医师们深感困惑。近年来，随着诊断技术和研究方法的进步，人 们终于发现，在这些难治性感染的病灶中，几乎都存在着细菌生物被膜( b i o f i l m ) 的感染源，正是由于细菌生物被膜对人体的免疫系统及抗菌剂固有的抵抗能力， 才导致了一些感染的迁延不愈和反复发作。进一步的研究表明，在自然界，在人 和动物体内，大多数细菌的生存方式都是以生物被膜为主，浮游生长为辅的。什 么是生物被膜? 生物被膜是如何形成的? 生物被膜对抗生素的耐药机制是什 么? 有那些基因参与了生物被膜的形成? 本章将结合国内外的研究现状对上述 问题进行探讨。 一1 生物被膜的概念及结构 1 1 生物被膜的概念及分布 生物被膜是指细菌附着于惰性或活性实体的表面，繁殖、分化，并分泌一些 多糖基质、将菌体群落包裹其中而形成的细菌聚集体膜状物( c o s t e r t o ne ta t 、 1 9 9 9 ) 。它可以由同种或多种微生物形成( d a v e ye t a l ，2 0 0 0 ) 。 细菌生物被膜广泛存在于含水或潮湿的各种表面上，包括自来水管道、工业 热交换系统、下水道、甚至病理状态下的人体组织器官等。被膜中细菌的代谢活 动及产生的一些物质可以腐蚀金属管道，造成管道淤塞：造成饮用水等系统的污 染和疾病的传播；还可以引起人体组织的慢性顽固型感染。 1 2 生物被膜的结构 在激光扫描共聚焦显微镜( c o n f o c a ls c a n n i n gl a s e rm i c r o s c o p e ，c s l m ) 诞生 以前，科学家们采用高分辨率的电子显微镜观察生物被膜的结构，由于标本的制 南开大学博七研究生毕业( 学位) 论文 作过程引起脱水，所以导致对生物被膜的认识存在偏差，在一段不短的时期内， 人们一直认为生物被膜只是由细菌和其外部包被着的胶囊状的外壳组成的。近年 来，由于c s l m 技术的发明( l a w r e n c e ，e ta 1 ，1 9 9 1 ) ，使人们得以在原位观察活 体细菌的生物被膜，从而获得了对生物被膜结构的客观认识( c o s t e r t o ne a 1 ， 1 9 9 5 ；d eb e e re ta 1 ，1 9 9 4 ，1 9 9 5 ) 。尽管在不同的环境条件下，由不同细菌形成的 生物被膜各有其独特的性质，例如，细菌在增殖时，可因菌种、营养、附着的表 面和环境条件不同，形成疏松或致密以及厚薄不等的生物被膜，但不管是单种细 菌还是多种细菌形成的生物被膜，其大体结构都是一致的：生物被膜的结构是不 均匀的，即存在不均质性( h e t e r o g e n e i t y ) ，细菌所形成的类似于蘑菇状的微菌 落是构成生物被膜的基本单位，微菌落之间和外部被大量的胞外多糖复合物包 被，多糖复合物密度不均一，上面分布着一些充满水的通道( w a t e rc h a n n e l s ) 。 这些水道相互交叉吻合形成复杂的网络，可以向被膜内运送氧气和养料等，并将 一些代谢产物和废物排出到被膜外( b e e re t a l ，1 9 9 4 ) 。因此有人将成熟的生物被 膜比喻为原始的循环系统( d a v e ye t a l ，2 0 0 0 ) 。 水道以及水道内液体对流的发现是生物被膜结构认识上的重大突破。细菌在 成熟的生物被膜中只占总体积的1 0 - - 2 0 ，其余的成分为胞外多糖基质、水道 以及水道内的水分等。此外，在其规律性排列的胞外多糖基质和细菌微菌落之间 还存在着许多有机物，例如核酸、蛋白质、脂、磷脂和小分子的信息物质等 ( c o s t e r t o ne t a l ，1 9 9 9 ，2 0 0 1 ) 。 - 2 临床常见的生物被膜感染 自从抗生素问世以来，细菌感染在相当长的一段时间内得到控制，尤其是急 性细菌感染，抗生素治疗往往收到很好的疗效。然而近些年人们发现，虽然新的 抗生素不断问世，抗生素的用量也不断加大，但疗效却往往欠佳，这主要与生物 被膜感染密切相关。越来越多的证据表明，人类健康正面临着细菌生物被膜的严 重威胁。 在l 临床上，几乎人体的每一个系统都可能发生细菌生物被膜感染，如由铜绿 假单胞菌生物被膜引起的顽固性肺炎( h o i b ye ta 1 ，2 0 0 1 ；k o b a y a s h i 2 0 0 1 ；y u 甜 a l ，2 0 0 1 ) ；由金黄色葡萄球菌和链球菌生物被膜引起的感染性心内膜炎( t o j r z j s 南开火学博士i i ，f 究生毕业( 学位) 论文 “以，1 9 9 0 ) ：由大肠杆菌生物被膜引起的感染性尿路结石( n i c k e l e la l ，1 9 8 9 ) 等。 此外，细菌可在隐形眼镜、静脉导管、人工心脏、导尿管、气管插管等多种体内 留置的治疗装置上形成生物被膜，引起局部或全身感染。病原菌则多种多样，有 铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌等 ( k u n i ne ta 1 ，1 9 8 8 ；t o l t z i s ，1 9 9 0 ；s t i c k l e re la l ，1 9 9 3 ；e l d e re ta 1 ，1 9 9 5 ；s h e r i d a n 甜a i ，1 9 9 5 ；g r i s t i n a e t a l ，1 9 9 8 ；d o u g h e r t y , i 9 9 8 ；s t i c k l e r , 1 9 9 7 ) 。 在美国，大约6 0 的院内感染是由细菌生物被膜引起的( o a v e ye ta ， 2 0 0 0 ) 。细菌生物被膜感染的严重性在于感染的顽固性和反复性，即难以根除。那 么，导致生物被膜菌如此顽固的原因是什么呢? - 3 细菌生物被膜感染的机制 3 1 对抗免疫清除作用 机体的免疫功能是所有抗病原微生物药物的作用基础。入侵机体的病原微生 物最终要靠机体的免疫防御系统来捕捉、中和、吞噬、杀灭或清除。因此，免疫 防御功能在机体抗感染反应过程中发挥着主导作用。但不管是特异性免疫还是非 特异性免疫，免疫系统与病原微生物的接触是非常重要的。而生物被膜作为一种 屏蔽可以保护细菌免受机体免疫系统的攻击。例如，在铜绿假单胞菌的生物被膜 感染中，直接与机体免疫系统接触的是微菌落外部包被的多糖基质藻酸盐以及由 细菌释放出来的各种抗原物质，它们刺激机体产生大量的特异性抗体( p e d e r s o n 1 9 9 2 ；h o i b ye la l ，2 0 0 1 ) ；而由于藻酸盐起着将细菌和免疫系统隔离开来的物理 屏障作用，使特异性抗体、致敏性t 细胞、吞噬a h 细胞、自然杀伤细胞以及溶 茵酶等对细菌的免疫攻击因接触不到细菌而难以奏效。而大量的抗体则与相应的 可溶性抗原形成免疫复合物沉积在感染部位及其附近，引起大量的中性粒细胞浸 润，造成局部组织损伤( h o i b ye t a l ，2 0 0 l ；c o s t e m 。1 9 9 9 ) 。 3 2 对抗生素的抗性增强 与浮游细菌相比，生物被膜细菌对抗生素的抗性可提高1 0 0 0 倍( m a h8 fd ， 2 0 0 1 ；s t e w a r t ，2 0 0 1 ) 。常见的抗生素耐药机制，如细胞膜通透性的改变、各种 抗生素灭活酶或钝化酶的产生，以及靶基因突变等并不能完全解释生物被膜细菌 南开大学博士研究生毕业【学位) 论文 的耐药性，因为即使是对抗生素特别敏感的细菌，一旦形成生物被膜后，对抗生 素的抗药性也大大增强。k i e v i t 等( 2 0 0 1 ) 使用绿色荧光蛋白报告基因技术观察 分析多重耐药泵m e x a b o p r m n m e x c d o p r j 在尸a e r u g i n o s a 型e 物被膜形成过 程中的表达，结果发现，与浮游菌相比，它们的表达不但没有升高反而下降。那 么，被膜细菌的耐药机制是怎样的呢? 目前普遍认为，生物被膜耐药可能与以下 两种机制有关。 3 2 1 弥散屏障 细菌生物被膜外部包被的多糖蛋白质复合物有效地阻滞外来大分子物质的 渗入，并且能吸附一部分抗菌药物；此外，被吸附到被膜外多糖复合物上的、由 细菌分泌的一些酶如b 一内酰胺酶、过氧化氢酶等也分解或钝化一部分抗生素； 生物被膜中的胞外多糖基质能够阻止抗生素的扩散，使抗生素在生物被膜中的扩 散速度要比在水中慢得多。上述三个因素共同作用的结果使进入到被膜内并接触 到被膜内细菌的抗生素浓度远远低于抑菌、杀菌浓度。从而使抗生素治疗失败 ( b r o o u n e ta 1 ，2 0 0 0 ；a n d e r le ta 1 ，2 0 0 0 ；l e w i se ta 1 ，2 0 0 0 ；c o c h r a ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 3 2 2 生物被膜内细菌生长的不均一性 几乎所有的抗生素均能有效地杀灭或抑制快速生长的细菌，其中有些抗生素 只对生长中的细菌有作用，如青霉素和氨苄西林，不能杀死非生长期的细菌，而 且杀灭率与细菌的生长率相平行。另一些抗生素，如头孢菌素类、氨基甙类和氟 喹诺酮类抗菌素虽也可以杀死非生长期的细菌，但它们对于快速生长的细菌更有 效。 生物被膜的一个重要特征是营养浓度的微量梯度变化( v r o o me ta 1 ，1 9 9 9 ) ，细 菌生物被膜内部是一个复杂的小生态环境，它从上至下，从表到里存在着不同物 质的浓度梯度( 例如氧气、营养物质和电解质等) 。因此，位于生物被膜不同层 面的细菌细胞的生存状态、营养状态均不尽相同。微电极记录显示，生物被膜表 层消耗了绝大部分的氧气，而其深层则为无氧环境。因此生长在表层和外层的细 菌，因为供养和营养物质充足，生长活跃；生长在生物被膜中心或基底部的细菌， 由于处于缺氧和营养匮乏状态，生长停滞；介于两者之间的细菌则生长缓慢。当 使用抗生素时，生长快速或表层的细菌最敏感，首先被杀灭；生长缓慢者敏感性 南开大学博士研究生毕业( 学位) 论文 下降，大部分被杀死；而生长停滞者则基本不受影响。当抗生素治疗停止后，残 存细菌利用死亡细菌作为营养源，迅速繁殖。p 需g z d , n ，就可以恢复原来的生 物被膜状态( c o s t e r t o ne t a l ，1 9 9 9 ；c o s t e r t o ne t a l ，2 0 0 1 ；m a l l a 1 ，2 0 0 1 ；e v a n se t a 1 ，1 9 9 1 ；b r o w ne t a l ，1 9 9 8 ) 。 除上述两个原因外，生物被膜中的细菌产生的生理适应过程也是导致抗生素 治疗失败的原因。这些影响抗生素抗性的表型改变包括新的抗生素外排泵的基因 表达，自身修饰和降解抗生素分子的酶量的增加以及抗生素作用位点的改变 ( a n w a re ta 1 ，1 9 8 9 ；h o y l ee ta 1 ，1 9 9 1 ；v e r g e r e se ta l ，1 9 9 2 ；x ue ta 1 ，2 0 0 0 ) 。最近 的一篇报道认为，被膜内细菌丧失了程序化死亡的能力( f i n e l l ie t a l ，2 0 0 3 ) ，从 而导致感染的难治性。 综上所述，无论是机体的免疫系统，还是抗生素治疗都不能彻底清除生物被 膜，被膜细菌成为内在的感染源，使用大剂量抗生素治疗时，浮游细菌和处于被 膜浅表部位的细菌被杀死，炎症消失。当停止抗生素治疗或机体免疫力下降时， 被膜内向周围环境缓慢地释放浮游菌，引起感染的反复发作。生物被膜究竟是怎 样形成的呢? _ 4 生物被膜的形成机制 生物被膜可由单菌种和多菌种形成。一般来说，在自然环境，如石油管道、 水底岩石上形成的生物被膜都是由多菌种细菌混合形成的；而人体内的一些顽固 性感染则通常是由单菌种形成的生物被膜所引起。因为在临床上具有极其重要的 意义，因此，单菌种细菌生物被膜形成的机制成为科学家们研究的热点。 研究生物被膜的形成过程大致可以分为如下几个步骤：首先用转座突变技术 构建细菌的突变文库；从文库中筛选不能形成生物被膜或被膜形成能力较野生株 明显减弱的突变子：再在相差显微镜下，观察这些突变子形成的生物被膜与野生 株在哪个时期表现不同；进而通过分子生物学、分子遗传学等手段对各个时期的 相关基因进行研究。 在最近的十多年时间里，美国、欧洲和澳洲的一些小组一直在研究生物被膜 的形成机制。目前主要以铜绿假单胞菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌、霍乱弧菌作 为模式菌进行研究并取得了很大的进展。研究表明，生物被膜的形成是由于细菌 9 翌茎奎兰堡主翌壅竺竺些! 兰垒! 笙墨 感受环境信号的京4 激后，改变原有的浮游状态，附着到一个表面并开始生长。生 物被膜的形成过程大致可分为三步：细胞在固体表面的吸附；微菌落的发育：包 被有多糖蛋白质复合物的成熟被膜的形成( o t o o l e ，e ta 1 ，1 9 9 8 ；c o s t e r t o n ，e ta 1 ， 1 9 9 9 ) 。我们将前两步定义为生物被膜形成的早期，最后一步称为生物被膜的成 熟期。 4 1 环境信号的作用 被膜的形成被认为是细菌感受特殊的环境信号而改变生存状态，使之从浮游 生长转到固体表面生长( s t a n l e y ，1 9 8 3 ；p o u l s e n ，e ta l 。，1 9 9 3 ；w a n g e ta l ，1 9 9 6 ； o t o o l ee la 1 ，1 9 9 8 ；2 0 0 0 ) 。控制这种转变的环境信号因菌种不同而有很大的差 异，如1 7a e r u g i n o s a 在大多数能够生长的条件下均能形成生物被膜( o t o o l ee t 口，1 9 9 8 ) ；有些细菌如ec o l i k l 2 在基础培养基上不能形成生物被膜，当补充 氨基酸后则可以引起生物被膜的形成( p r a t te ta 1 ，1 9 9 8 ) ；e c o l i0 1 5 7 ：h 7 只有在 低营养条件下才能形成生物被膜( d e w a n t ie ta 1 ，1 9 9 5 ) ；荧光假单胞菌 ( p s e u d o m o n a s f l u c o s e n c e ) 在各种条件下均能形成生物被膜，有趣的是，它有多 种遗传途径启动生物被膜的形成，如有的突变株在葡萄糖中不能形成生物被膜， 当在培养基中补充枸橼酸盐时，则突变株恢复形成生物被膜的能力，提示1 7 f l u c o s e n c e 有依赖于枸橼酸盐的生物被膜形成途径( 0 1 t o o l ee ta 1 ，1 9 9 8 ) ：霍乱弧菌 则根据它附着的表面不同面启动不同的被膜形成途径，例如，在体内，它利用t c p 菌毛附着于肠道内表面形成生物被膜( h e r r i n g t o ne t a l ，1 9 8 8 ) 。此外，其它一些 环境信号如渗透压、p h 、氧压力、铁离子浓度以及温度等均可以引起细菌由浮 游生长转变为附着生长( p r a t t 甜a 1 ，1 9 9 8 ；o t o o l e ，1 9 9 9 ，2 0 0 0 ) 。 尽管生物被膜的形成过程会因菌种不同而异，但毫无疑问，环境信号在细菌 由浮游生长转为附着生长方面起重要的作用。 4 2 生物被膜形成的早期 用9 6 孔塑料板作为生物被膜固着的表面，筛选不能与塑料孔黏附的突变子， 从而鉴定与被膜形成早期有关的因素。这种方法目前已被用于筛选不同菌种生物 被膜形成缺陷的突变子( p r a t te ta 1 ，1 9 9 8 ；g e n e v a u xe ta 1 ，1 9 9 6 ；h e i l m a n ng f “f j9 9 6 ；m a c ke t a l ，1 9 9 4 ) 。0 t o o l e 等使用塑料徽孔板法从尸a e r u g i n o s a 的突变文库 1 0 南开大学博士研究生毕业( 学位) 论文 中筛选出不能与塑料板结合的突变子，并将它们命名为s a d ( s u r f a c ea t t a c h m e n t d e f e c t i v e ) 。这些不能在塑料表面形成生物被膜的突变子可分为两组，一组突变 子的鞭毛运动能力丧失，相差显微镜观察表明，这些细胞似乎被阻断了与表面的 相互作用，不能结合到塑料微孔板上：另一组突变子没有i v 型菌毛，这种突变子 虽能结合到塑料板上，但只能形成单层细胞，而且单层细胞的数量比野生株还多， 但它不能像野生株那样形成多层细胞，即不能发育成微菌落( o t o o l ee ta 1 1 9 9 8 ； p r a t t ，e t a l ，1 9 9 8 ) 。 进一步的研究表明，在附着到固相表面之前，铜绿假单胞菌借助鞭毛的泳动 ( s w i m m i n gm o t i l i t y ) 向固相表面靠近，细菌的表面和固体表面一般都带负电 ( d u r m ee ta 1 ，2 0 0 2 ) ，细菌可能是借助鞭毛的运动克n - - 者之间的排斥力，找到 一个合适的固着位点。然后借助鞭毛、i v 型菌毛或纤毛吸附到固体表n ( o ，t o o l e e ta 1 ，1 9 9 8 ；v a l l e te ta 1 ，2 0 0 1 ；f i n e l le ta 1 ，2 0 0 3 ) ，当多个细菌在表面形成了单层 菌膜之后，它们开始分裂、繁殖，并在固体表面开始移动。此时，细菌不再依赖 鞭毛介导的泳动，而是依赖于型菌毛的伸展和收缩，推动或牵引自身在固相表 面向前或向上移动，这种运动，称为蹭动( t w i t c h i n g m o t i l i t y ) ( b r a d l e y ，1 9 8 0 ) 。 细菌通过这种运动形成了由数层细胞组成的微菌落。由此可见，鞭毛和i v 型菌毛 及它们所介导的运动在被膜形成的早期起着必不可少的作用。 在铜绿假单胞菌中，除了鞭毛和i v 型菌毛之外，细胞表面蛋白粘附素和脂多 糖也在细胞和固相表面的相互结合中起重要作用( p r a 仕e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。脂多糖的改变 能够改变细菌的粘附行为。pa e r u g i n o s a 产生两种脂多糖( a 带和b 带) ，失去b 带脂多糖的突变子与野生型相比减少了在亲水表面的吸附，而对疏水表面的吸附 则得到增强( m a k i ne ta 1 ，1 9 9 6 ) 。脂多糖的改变也影响pf l u o , e s c e w 与表面的结合 ( w i l l i a m se ta l ，1 9 9 6 ) 。 此外，c r c 基因也被证实与被膜形成的早期有重要的关系( 0 t o o l ee ta 1 2 0 0 0 ) 。有机酸是假单胞菌所喜爱的碳源和能源，在有机酸存在的情况下，c r c 蛋 白能抑制糖的代谢。现在发现c r c 蛋白还能通过调节i v 型菌毛合成基因p f 删和p d b 的表达，参与生物被膜的起始过程。尽管c r c 蛋白通过什么途径来同时调节碳代 谢n l v 型菌毛的合成还是一个未知数，但至少可以知道营养的获得与生物被膜的 形成是有内在联系的