（遗传学专业论文）壳聚糖酶产生菌的发酵条件及酶学特性的研究.pdf

浙江大学硕士论文 摘要 通过富集培养从自然界中筛选出一批产壳聚糖酶的菌株，根据在胶体壳聚糖 平板上产生透明圈的大小，挑选出一株产壳聚糖酶最强的菌株k - 9 。经1 6 s r d n a 序列分析该细菌与r a l s t o n f a b a s i l e n s i s 的同源性高达9 9 。通过研究，确定 了k 一9 产酶的最适发酵条件：培养温度3 0 ，底物壳聚糖浓度1 ，装量为5 0 0 m l 三角瓶装l o o m l 培养基，培养基初始p h 6 0 。在上述培养条件下，第4 d 时摇瓶 中发酵液的最高酶活力达1 3 6 u m l 。k - 9 能产生诱导型的胞外壳聚糖酶。采用 ( n h ) ：s 0 。盐析法和凝胶过滤层析对k - 9 的壳聚糖酶进行分离提纯，得到一种壳聚 糖酶，酶经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 分析，结果显示该酶的分子量 约为4 1 3 k d ；壳聚糖酶最适反应p h 值均为p h 4 0 ，在p h3 0 5 0 的酸性环境 中保持稳定。酶的最适反应温度为4 0 ：m n ”、n a + 、k + 对该酶的活性有促进作 用。c u ”，f e ”和a g + 则对该酶的活性都有抑制作用。 关键词：壳聚糖，壳聚糖酶，酶的分离纯化，p c r ，同源性，1 6 s r d n a ，s d s - p a g e 发酵条件 s c r e e n i n ga n d i d e n t i f i c a t i o no fac h i t o s a n o l y t i cb a c t e r i u m a n d a n a l y s i so ft h ef e r m e n t a t i o np r o d u c t s a b s t r a c t as t r a i np r o d u c i n gc h i t o s a n a s ew a si s o l a t e df r o ms o i ls a m p l e sa n dn a m e dk - 9 ， t h er e s u l to ft h e1 6 s r d n as e q u e n c ea l i g n m e n ti st h a ti th a d9 9 h o m o l o g i cw i t h r a l s t o n i ab a s y l e n s y s 。t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rk 一9 p r o d u c i u g c h i t o s a n a s ew e r ei n c u b a t e da t3 0 。c ，i n5 0 0 r r de r l e n m e y e rf l a s kc o n t a i n i n g10 0 m l m e d i u m ( p h6 0 ) w i t h1 0 c h i t o s a na ss u b s w a t e t h ec h i t o s a n a s ea c t i v i t yo f f e r m e n t e db r o t hw a s1 3 6 u m lw h e nk 一1 9w a sc u l t u r e du n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s 1 浙江大学硕士论文 a t4 d ai n d u c i b l ea n de x t r a c e l l u l a rc h i t o s a n a s e ss e c r e t e db yk 一9w e r ep u r i f i e db y a m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o na sw e l la sg e lf i l t r a t i o n t h ep u r i f i e de n z y m e sh a d m o l e c u l a rm a s s e so f4 1 3 k d ab ys d s - p a g e t h ec h i t o s a n a s eh a v ea na c i d i cp h o p t i m u m ，w h i c hw e r e4 0 t h ee n z y m e sw e r es t a b l eo v e rt h ep hr a n g e3t o5 t h e o p t i m u mt e m p e r a m r e sf o rh y d r o l y s i so f t h ec h i t o s a n a s e sw e r ed e t e r m i n e dt ob e4 0 。c ， m e t a li o n so f m n 2 + ，n a + 、k + a c c e l e r a t et h ee n z y m e sa c t i v i t ya n dc u 2 + ，f e 3 + a n da g + i n h i b i t e da c t i v i t y , k e yw o r d s ：c h i t o s a n ，c h i t o s a n a s e ，p u r i f i c a t i o no f e n z y m e ，p c r ，h o m o l o g y ， 1 6 s r d n a ，s d s p a g e ， 刖雷 几丁质( c h i t i n ) ，别名甲壳质、甲壳素，是聚一n 一乙酰一d 一( 1 4 ) 糖苷键 连接而成的线性聚合物，平均分子量为1 0 3 1 0 6 2 5 1 0 6 ，是地球上除纤维 素外数量最多、除蛋白质外含氮量最高的天然有机化合物。是很多低等节肢动物， 如虾、蟹及少数真菌细胞壁的重要成分，自然界每年的生物合成量多达上千亿吨， 可以说是一种取之不尽的生物能源。几丁质是白色或灰白色、半透明、无定型固 体，相对分子量约为i 0 3 1 0 6 2 6 1 0 6 ，具有高度疏水性，不溶于水、稀酸、 稀碱、浓碱和一般有机溶剂，但可溶于9 m o l 1 的h c i 或4 5 m o l 1 的h 。s o 。中“。“。 壳聚糖( c h i t o s a n ) ，又名脱乙酰几丁质、可溶性甲壳素等，是几丁质脱乙酰 化得到的产物，化学名为1 3 一( 1 ，4 ) 一2 一氨基一2 一脱氧一d 一葡聚糖。壳聚糖广泛 存在于节肢动物，如虾、蟹及少数菌类、藻类的细胞壁中，在高等植物中还未发 现壳聚糖的存在。壳聚糖也是白色无定型、半透明、略有珍珠光泽的固体。因原 料和制备方法的不同，相对分子量从数十万至数百万不等，不溶于水或碱，可溶 于稀的盐酸、硫酸等无机酸“5 1 。 几丁质、壳聚糖的分子结构与纤维素非常相近，都是由1 3 一d 一( 1 4 ) 糖苷键 连接而成的多糖聚合物，只是c 一2 位上由乙酰氨基( 或氨基) 代替羟基。几丁质、 壳聚糖的分子结构见图1 。 新江大学硕士论文 r p 唰1 黼h 、hh 引 h m i c h ， ”c i 】( 刮“ 几丁质( c h i 血)壳聚糖( c h i t o s a n l 图l 几丁质、壳聚糖分子结构 虽然几丁质、壳聚糖的来源丰富，用处广泛，但由于它们分子量大，具有紧 密的晶体结构，不溶于水和普通容剂，这使它们的应用受到很大限制，所以要选 择经济、实用的方法，将它们降解为具有多种生理功能的几丁寡糖和壳寡糖，再 加以利用。目前降解几丁质和壳聚糖常用的方法有化学法、生物酶法、辐射法等。 几丁质的传统生产方法是以水产加工业废弃的虾壳和蟹壳为原料，通过脱蛋白 质、脱钙和脱色获取。常用方法有三步法( 脱钙、除蛋白、脱色) 、五步法( 二 次脱钙、二次除蛋白、脱色) 、酸碱交替法( 二次脱钙和二次除蛋白过程交鸷进 行) ，其中以酸碱交替法效果最佳。将几丁质进行脱乙酰处理可制得壳聚糖，壳 聚糖脱乙酰度的大小直接影响至0 它的理化性质及应用。 化学法中影响脱乙酰度的主要因素有碱液浓度、反应温度和时间。一般而言， 提高碱液浓度、反应温度和反应时间可提高脱乙酰度，但同时主链也会降解，从 而影响产品的粘度和分子量。生物法可分两种，一种是在几丁质的基础上利用几 丁质脱乙酰酶的作用制备出高品质的壳聚糖。利用微生物发酵技术和几丁质脱乙 酰酶作用相合的方法是制备壳聚糖的另一类新途径，可直接得到壳蒙糖而无须单 独的脱乙酰步骤。 n 一胱乙酰度和粘度是壳聚糖的两项主要性质指标。通常n 脱乙酰度低于7 0 的就称为几丁质。粘度在1 0 0 0 1 0 1 p a s 以上的( 1 壳聚糖乙酸溶液) 称为 高粘度壳聚禧，粘度在( 1 0 0 0 1 0 0 ) 1 0 p a s 的称为中粘度壳聚糖，粘度在 i 0 0 1 0 p a s 以下的称为低粘度壳聚糖“1 。 甲壳低聚糖( 几丁寡糖、壳寡糖) 是几丁质或壳聚糖部分降解的产物，是一 类由乙酰氨基葡萄糖或氨基葡萄糖通过b - 1 ，4 糖苷键连接起来的低聚合度的水 溶性糖类“”。 几丁质、壳聚糖、几丁寡糖及壳寡糖简单流程图： 浙江大学硕士论文 甲壳动物 0 除蛋白、脱矿物质、脱色 几丁质 脱乙酰化 厂髁糖 完全水解 n 一乙酰氨基葡萄糖氨基葡萄糖 卜 部分水解 壳寡糖几丁寡糖 i 应用一 图2 几丁质、壳聚糖及水解产物简单流程图 作为性能优良的天然高分子材料，几丁质、壳聚糖具有许多优良特性，如生 物相容性、生物降解能力、无毒性、吸附性等。几丁质、壳聚糖资源的开发与应 用范围涉及工业、农业、医药卫生、食品保健、日用化工、环保、印染以及功能 材料等诸多领域“”。 l 医药方面的应用几丁质和壳聚糖不仅无毒、可被生物降解，而且具有抑 制真菌繁殖等多种医学功能和药理作用，作为一类无毒且有效的生物药剂广泛应 用在医药和卫生保健领域“”。 1 1 生物医用材料和膜。壳聚糖可以用于制造吸收性手术缝合线、防止组织 粘连材料、人工韧带、人工骨和止血材料等。用壳聚糖纤维制成的缝合线，在预 定时间内有很强的抗张强度，在体内有良好的适应性，尤其是经过一定时间，壳 聚糖缝合线能被溶菌酶所降解，被人体自行吸收。多肽溶液与几丁质或壳聚糖溶 液混合制成的薄膜均匀、透明、手感柔软，具有良好的弹性和强度，可以透过尿 素、肌酐等水溶性有机物，但不能透过n a + 、k + 、c 1 等无机离子及血清蛋白，透 4 浙江大学硕士论文 水性好，是一种理想的人工肾用膜“。 1 2 人造皮肤。壳聚糖或几丁质是制造人造皮肤的理想材料，它质地柔软、 舒适，与创面的贴合性好，不仅具有抑菌消炎作用，还有抑制疼痛、止血和促进 伤口愈合的功能。 1 3 药物载体。壳聚糖无毒，易吸收，在低p h 值时可形成膜，具有抗酸、 抗溃疡能力，可以内服而无副作用，从而能作为理想的药物缓释膜材料，减缓药 物对胃的刺激。 1 4 抗肿瘤作用。壳聚糖不仅具有很好的生物相容性，在体内能降解，而且 本身就具有一定的抗肿瘤作用和抗菌作用。几丁质或壳聚糖水解生成的d 一2 一氨 基葡萄糖在体内对某些癌细胞有明显的杀灭作用，而对正常组织几乎没有影响， 因此几丁质和壳聚糖都可作为癌症的化疗药物。壳寡糖的抑瘤率远高于其他来源 的寡糖，能提高机体的免疫活性和抗癌能力。研究表明，聚合度为3 8 的壳寡 糖生物活性较高，其中以六糖为最高，而单糖或二糖活性则很低。壳寡糖可以通 过活化人体中的淋巴细胞，抑制癌细胞的繁殖和扩散来达到抗癌作用。壳寡糖在 人肠内形成的小分子基团容易被肠道吸收，抑制癌毒素在体内的释放。同时壳寡 糖作为一种良好聚电解质，能被吸附在血管壁细胞的表面，抑制癌细胞转移“1 。 1 5 非病毒的基因载体。壳聚糖是一种价格较低、生物相容性好、可降解、 低毒的阳离子天然高分子聚合物，易与d n a 结合，形成聚电解质复合体，使d n a 具有更强的抵抗核酸酶降解能力，因此壳聚糖及其衍生物可能成为一种安全有效 的阳离子聚合物基因释放载体，替代病毒和脂质体进行基因转染。将定的糖基 联结到壳聚糖上，得到靶向的基因载体系统：乳糖基化的壳聚糖可作为一种专门 转染表达半乳糖特异性膜凝集素的细胞的靶向基因载体；半乳糖基化壳聚糖可作 为转染肝细胞( 表达脱唾液酸糖蛋白受体) 的靶向基因载体，这些载体可用于肿 瘤的基因治疗譬”1 。 2 在农业方面的应用 2 1 饲料添加荆。研究发现，在饲料中加入1 0 几丁质，能使小鸡对照组增 重。 2 2 种子处理剂。壳聚糖可用作粮食、蔬菜作物种子的表面处理剂，激发种 子提前发芽，促进作物生长，提高抗病能力，从而提高粮食和蔬菜产量。壳寡糖 具有良好的抗病虫害功能，且有安全、微量、高效、成本低等优势，能使水果、 浙江大学硕士论文 蔬菜、粮食增产1 0 3 0 ，因而可以应用于生物农药产品，部分替代化学农药。 用壳寡糖溶液对小麦拌种可以防止地下霉菌对种子的危害，提高抗病能力和抗倒 伏能力 1 4 3o 壳寡糖还可作为植物调节剂，刺激植物的免疫系统反应，激活防御反 应，产生具有抗病害的活性物质，抑制病害的形成和增强植物对病虫害的防御。 壳寡糖的诱抗活性与壳寡糖的聚合度及脱乙酰度密切相关，低聚合度及高脱乙酰 度的壳寡糖诱抗活性高“。 2 3 液体土壤改良剂。将壳聚糖与可溶性蛋白合成液体土壤改良荆，具有较 好的稳定性和可降解性，降解以后是优良的有机肥料，可供作物吸收。它们不仅 可以抑制壤中病原菌的生长和繁殖，同时能有效地改善土壤的团粒结构，是一 种比较理想的液体土壤改良剂。 3 在食品工业中的应用 几丁质和壳聚糖由于成本低廉、资源丰富，无毒副作用，在食品工业中获 得了十分广泛的应用，其中以作为液体处理剂、食品添加剂和功能材料3 个方面 的应用最为广泛“”。 3 1 液体处理剂。壳聚糖作为絮凝剂应用于食品工业有其独特优点，无毒无 味，可生物降解，不会造成二次污染，适合用于食品工业的要求。壳聚糖是理想 的糖汁絮凝剂，可以净化原料糖和废糖蜜。糖汁中添加2 、5 0 p p m 壳聚糖，能使糖 汁中的悬浮物迅速凝集，形成的凝集物颗粒大、沉降迅速且易于过滤，同时还能 控制果汁的酸度。 3 2 食品添加剂。多作为食品的增稠剂和稳定剂，用于改善食品的风味、流 动性和食品结构形状、粘度的控制，增加纤维含量等。几丁质和壳聚糖能够阻止 消化系统吸收胆固醇和甘油三酯，促进这些物质排除体外，增加抗体数量，提高 机体免疫力。壳寡糖具有比壳聚糖更优越的生物活性，无毒、无副作用，可被人 体快速吸收。它能改善肠道微生物的区系分布，刺激有益菌的生长，其药理活性 是同等重量壳聚糖的1 4 倍。以壳寡糖为主要原料生产的保健食品能提高机体免 疫力，活化细胞，促进肠道双歧杆菌等有益菌的增生，并抑制有害菌的生长。实 验证明，壳寡糖应用于乳制品，可使双歧杆菌增生1 2 0 倍“。 3 3 外包装材料。由于几丁质和壳聚糖具有显著抑制真菌生长繁殖作用和天 然成膜性，可以作为理想的果蔬成膜保鲜材料。壳寡糖产品无毒、无味、具有良 好的水溶性，可作为食品防腐剂广泛应用于食品包藏，延长食品货架期，又不影 浙江丈学硕士论文 响食品原有的风味。 4 在工业中的应用 4 1 在日用化学工业和造纸工业中的应用。几丁质特别是壳聚糖经有机酸或 磺酸处理形成的衍生物不仅具有良好的增粘保湿性、加工柔软性和成膜性，而且 对皮肤无毒、无刺激性，因而被广泛用来配制香波、润肤荆、固发液摩丝等。壳 寡糖具有优良的保湿增湿性能，同时可抑制皮肤表面细菌，活化表皮细胞，增强 皮肤弹性；与传统的保湿增湿剂相比，保湿效果佳，从而应用于美容、化妆、护 肤、抗衰老等精细化工领域。壳寡糖的绿色天然特性符合世界日化产品的发展趋 势，顺应回归自然、科学美容的消费趋势，具有很大的发展潜力“”。 4 2 在废水处理中的应用。目前几丁质和壳聚糖作为絮凝剂或吸附剂在废水 处理中的应用研究取得了巨大的进展。壳聚糖带有阳离子，可作为功能性多聚阳 离子促凝荆，与废水中的金属离子形成共价配位键。几丁质和壳聚糖作为重金属 离子的螯合剂和活性污泥絮凝剂，絮凝作用强、无毒，不会产生二次污染，而且 能被生物作用分解，是一种理想的废水处理絮凝剂材料，在废水处理方面具有广 阔的应用前景o 。 5 功能材料 几丁质、壳聚糖是少数天然产物中带有强大电荷的高分子物质，均可以发 生交联与接枝、酰化、醚化、氧化、硫酸酯化、羟乙基化、羟甲基化、氰基化、 烷基化、硝基化和磷酸化等反应生成一系列各具特殊功能的新材料。目前，这类 改性几丁质或改性壳聚糖作为新型膜材料或固定化载体己在反渗透膜、渗透膜、 仿生膜、酶固定化等高新技术领域的应用中崭露头角。 几丁质与壳聚糖相比，壳寡糖具有更加十分突出的优点：水溶性好，易被人 体吸收，无毒副作用；无抗原性；在宿主细胞内较弱的累积效应等；具有抑菌、 抗肿瘤、调血脂、调节免疫及活化肠道双歧杆菌等多种生理功能。“。 目前，壳寡糖的制各大体可分为3 大类：化学降解法、物理降解法和酶降解 法1 。 化学法。酸水解法。酸水解法是降解几丁质和壳聚糖的传统方法，包括盐 酸水解法、磷酸水解法酸一亚硝酸盐降解法。硝酸降解法相对水解法来说， 反应条件温和、速度快，得率可达9 0 以上，降解产物的分子量可以通过改变 n a n o ：加入量来控制，制备聚合度为5 9 的壳寡糖比较有效。氧化降解法。氧 祈江大学硕士论文 化降解法是近年来国内外研究比较多的壳聚糖降解方法，尤其是关于h 。o ：氧化降 解壳聚糖的研究，该方法具有反应速度快、产率高、反应物无毒等优点，是一种 理想的化学降解方法。一般是将一定量的壳聚糖溶于1 或2 醋酸溶液中，加 入一定浓度的心0 。溶液进行均相降解反应，然后用n a o h 溶液中和，加入过量无 水乙醇沉淀，最后分离得到降解产物。通过化学方法制备壳寡糖不仅工艺复杂、 成本高，而且易污染环境，使壳寡糖的应用范围受到限制。微生物壳聚糖酶可以 用来大规模生产壳寡糖，并且细菌壳聚糖酶在维持生态平衡、在生物化学和分子 水平上研究壳聚糖水解机制方面有着重要作用。 物理法。物理法包括微波法、辐射法和超声波法。与化学法和酶法相比较， 物理降解法操作简单，可控性好。 酶降解法。酶法制备壳寡糖，就是用特定的酶对几丁质或壳聚糖进行降解， 它可以选择性切断壳聚糖分子中的的8 - 1 ，4 糖苷键，从而制得特定的寡糖，产 品均一性好。与化学降解相比，酶降解法不发生副反应，反应条件温和，工艺较 易控制，是一种理想的降解方法。酶降解法分为非专一性酶降解法和专一性酶降 解法。 非专性酶包括纤维素酶、糖酶、蛋白酶和脂肪酶。相对于专一性酶，非专 一性酶的降解效果较差，降解程度有限，到一定程度后，即使再增加酶量也难以 提高水解程度；而且降解产物分子量较大，成份复杂，不易分离，酶量使用大， 成本高汹1 。 专一性酶主要包括溶菌酶( 1 y s o z y m e ，e c 3 2 1 1 7 ) 、几丁质酶 ( c h i t i n a s e ，e c 3 2 1 1 4 ) 、壳聚糖酶( c h i t o s a n a s e ，e c 3 2 1 1 3 2 ) 和 几丁质脱乙酰酶( c h i t i nd e a c e t y l a s e ，e c 3 5 1 4 1 ) 。溶菌酶具有水解b - 1 ， 4 一糖苷键的能力，它能以几丁质和部分n 一乙酰化壳聚糖为底物，水合正碳离子 中间产物并使其进行转糖苷化反应，其降解程度不如壳聚糖酶。“。壳聚糖酶是分 解壳聚糖的专一性酶，主要存在于真菌和细菌细胞中，在单子叶和双子叶植物的 不同组织中也发现存在壳聚糖酶。几丁质脱乙酰酶也是分解壳聚糖的专一性酶 f z s l o 壳聚糖酶分布广泛，到目前为止，已经从多种微生物包括细菌( b a c i l l u s 、 y x o b a c t e r 、e n t e r o b a c t e r ) ，放线菌( s t r e p t o m y c e s 、n o c a r d i o i d e s ) ，霉菌 ( a s p e r g i l l u s 、p e n i c i i i i u 痂，病毒( c m o r e l l av i r u sp b c v l 、c v k - 2 ) ，植 塑婆查兰堡圭堡苎一 物组织中检测到壳聚糖酶。在微生物壳聚糖酶中，有关细菌壳聚糖酶的报道很 多，有的已经深入到基因克隆和蛋白质三级结构水平。但是有关真菌壳聚糖酶酶 学性质及壳聚糖酶基因克隆的报道比较少，只在有限的几种真菌中有过壳聚糖酶 分离纯化和酶学性质的报道：岛青霉( p e n i c i l l i u mi s l a n d i c u m ) ”，鲁氏毛 霉( 胁c o r ，d 谢j ) 嘲，红酵母属( r h o d o t o r u l ae r a c i l i s ) 1 ，腐皮镰孢霉 ( f u s a r i u m 占d l a n if s p p h a s e o l i ) 。”，小刺青霉( ps p i n u l o s u m ) ”“，烟 色曲霉( a s p e r g i i u s f u m i g a t u s k h - 9 4 ) ”“，木霉( t r i c h o d e r m a r e e s e i p c 3 7 ) 【3 3 】，曲霉( a s p e r g i l l u ss p y 2 k ) 3 ，米曲霉( o r y z a ei a m 2 6 6 0 ) 1 ，球 孢白僵菌( b e a u v e r i ab a s s i a n a ) 。，烟色曲霉( 爿f u m i g a t u sk b 一1 ) ”“。各 种真菌壳聚糖酶的主要酶学性质见表1 。 表i 真菌壳聚糖酶的主要酶学性质 菌株 ( k d a )d h温度p i激活剂 抑制剂 mr o u x i i 尼g r a c i l i s fs o l a n i fs p 砌a s e o l i ps p i n u l o s u m af u m i g a t u s k h - 9 4 tr e e s e ip c - 3 - 7 a s p e r g i l l u ss p y 2 k 爿 o r y z a e i a m 2 6 6 0 bb a s s i a n a ， 7 65 0 5 54 9k + h 9 2 + ，c u ”，m 矿， 5 8 5 , 05 0 4 7c 矿p b 2 t ，s n “ 1 0 04 5 4 5n dm n 2 + h 矿，c 矿 3 6 5 , 64 0 m dn d n d n d5 05 5 2 2 55 5 7 0 - 8 0 1 0 8 4 5 5 55 0 - 6 0 9 3 4 + 05 0 2 56 56 5 7 0 4 0 1 3 5 3 6 5 5 5 5 4 0 5 0 5 0 6 0 n d 7 r 3 4 8 n d 8 4 n d n d n d n d m n 2 + m n 2 + n d m n 2 + ， c u 2 + n d n d f 矿 a f i n l a i g a t u sk b 1 1 1 1 2 36 , 5 6 0n d n d n d h 9 2 + c u 2 + h 9 2 + ，c u 2 + n d h 9 2 + c d 2 + n d n d c u 2 + ，p b 2 + ，h 9 2 + ， n i 2 + a g + ， v l n 2 + b i 2 + c u ”，f e 2 + ， f e 3 + ，h 9 2 + ，m n 2 i m 0 6 + 2 3 3 85 , 5。7 0n d n d c u “，h g ”，m 0 6 + 一、i 蒜丽一 由于几丁质脱乙酰酶催化几丁质脱乙酰化转变为壳聚糖其条件比较温和，无 9 浙江大学硕士论文 污染等优点己引起了全世界的关注。 自1 9 7 5 年首次报道真菌的鲁氏毛霉( m u c o rr o u x i i ) 产几丁质脱乙酰酶后， 已先后从多种微生物中分离与纯化了几丁质脱乙酰酶。但相对与几丁质酶 ( c h j t i f 自s ，e c 3 2 1 】4 ) 与壳聚糖酶( c h i $ o s s d s e ，e c 3 2 1 1 3 2 ) 的研究， 来自微生物的几丁质脱乙酰酶的研究的报道还是较少，且集中在真菌中，如蓝色 犁头霉( , 4 b s i d i ac o e r l e a ) 。”、构巢曲霉( a s p e r g e l l u sn i d u l a n s ) 3 、盘孢 菌( 6 0 l l e t o t r i c h u m i n d e m u t h i a n u m , c o i e t o t r i c h 蚴 a g e n a r i u m ) “。”。”1 、 毛霉( 彪r o u x i i 、彪r a c e m o s u s ) ”1 、黑根霉( r h i z o p u sn i g r i c a n s ) 1 、 酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) “”。研究表明，真菌的几丁质脱乙酰酶 是一种糖蛋白，如表2 所示，各生物几丁质脱乙酰酶的分子量在2 7 1 5 0 k d a 之间， 最适酶促反应p h 为4 5 1 2 ，最适酶促反应温度为5 0 一6 0 * ( 2 。酶催化所需要底物寡 聚糖的最小聚合度为2 3 。在来自cl i n d e m u t h i a n u m 和a s n i d u l a n s 的几丁质脱 乙酰酶的研究中，发现其活性不会被乙酸抑制，而乙酸恰好是脱乙酰化的产物， 这一特性使得这些c d a 酶在应用上有很大的意义。“1 。 表2 来自各种真菌的几丁质脱己酰化酶的性质 一旦鱼! ! ! 些塑! 竺巫盟堕堕! 垦尘ndeacetylasesf r o mv a r i o u ss o u r c e s 一 来源 ? 三量 等点电最适p h晟适温度分泌性参考文献 妊u a 在研究几丁质脱乙酰酶的作用模式时发现，真菌几丁寡糖“蚓的长度对酶 的作用效率十分重要，来自彪r o u x i i 的几丁质脱乙酰酶不能有效地作用于n 乙酰氨基葡萄糖三聚体以下的底物。对于三聚体以上的底物，酶首先从凡丁质寡 聚体的非还原端残基上去除乙酰基，然后按照递进模式催化水解下一个乙酰氨基 基团。此外，几丁质脱乙酰酶在特殊的条件下还能够催化脱乙酰基的逆反应，来 自e i n d e m u t h i a n u m 的几丁质脱乙酰酶在3 m 醋酸钠存在的条件下，能够将游 】o 新扛大学硕士论文 离的氨基糖残基乙酰化”。总之，酶解几丁质和壳聚糖聚合物是严格受限制的反 应，不同于化学法，在化学法中，脱乙酰基是一种随机的方式，因此酶法脱乙酰 基为制备特定的壳聚糖聚合物提供了可能。 目前，来自彪r p u x d j “”，j 刀如础肋妇m d 吲和sc e r e ，l s i a e 3 的几 丁质脱乙酰酶基因已经被克隆和定性，其他一些真菌几丁质脱乙酰酶的核苷酸与 氨基酸序列也已登录在基因文库中，如s e h j z o p h y j j u mc o 蚴n n 8 ，g o n g r o n e j a b u t l e r i 。 纳y c o m y c e sb l a k e s e e a n u s 。 c r y p t o c o c c u sn e o f o r m e n sn 酞 n e o f o r 斯a n s ，b l u m e r i a g r m m 力j s ( 表3 ) 。经比较发现这些几丁质脱乙酰酶具有 高度的同源性，在酶的基因中普遍存在一个保守区域( 图3 ) ，这个区域与根瘤 菌的结瘤蛋白m ”1 、微生物的乙酰木糖脂酶和木糖酶。2 1 “、b a c i j l u ss p 的几个 未定性的开放阅读框有显著相似性，这个保守区域被称为n o d b 同源域。根据 h e n r i s s a n t 对糖苷水解酶的分类m “3 ，几丁质脱乙酰酶( e c3 5 1 4 1 ) 、根瘤菌 的n o d b 、几丁质寡糖脱乙酰酶( e c3 。5 。1 。一) 、肽聚糖n 一乙酰氨基葡糖脱乙酰酶( e c 3 】1 一) 、乙酰木糖脂酶( e c3 1 1 7 2 ) 、术糖酶a 、c 、o 、e ( e c3 2 1 8 ) 等 由于具有这个n o d b 同源区而被归于碳水化合物脂酶家族4 。n o d b 蛋白特异从n 一乙 酰氨基葡萄糖寡聚体的非还原末端残基上去除n 一乙酰氨基，为后来的n 一乙酰化提 供了必要的自由氮基基团1 。c e l l u l o m o n a s 疗耐和c o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m 木糖聚酶的n o d b 的同源区域对木糖有脱乙酰基的活性，有助于木糖聚酶有效地水 解乙酰化的木糖鲫“。研究显示，在酶解水溶性几丁质类的底物时，酶序列中的 几丁质结合区并不是反应所必须的嘶3 ，而c o + 的存在能极大的提高的酶的作用效 率。 表3 几丁质膳乙酰化酶的分子生物学特性 t a b l e2m o l e c u l a rb i o l o g yo f c h i t i nd c a c e t y | a s e 来源序列号氨基酸数n o d b 同源区( a a ) s c h i z o p h y l u mc o l l e f l u i t e a a f 7 5 2 8 03 2 19 2 - 2 4 0 m u c o rr o u x f ic a a 7 9 5 2 54 2 11 4 8 - 2 8 9 s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ec d a l a a s 5 6 2 7 73 1 21 1 2 - 2 4 7 s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ec d a 2 a a $ 5 6 2 7 43 0 1t 0 2 - 2 3 7 g o n g r o n e l l ab u t l e r i a a n 6 5 3 6 2 4 3 01 3 7 2 7 8 p h y c o m y e e sb l a k e s l e e a , l u s b a b 0 3 5 9 54 5 91 4 0 2 9 l c 理f 。c c 淞h g q 向h m 。札 a a k 5 0 7 7 0 n e o l o r m a n s b l u m e r i ag r a m i n i s a a k 8 4 4 3 8 4 5 8 3 2 4 1 4 0 2 9 0 9 0 - 2 3 8 浙江大学硕士论文 几丁质脱乙酰酶主要发现于真菌与昆虫中，在真菌细胞中，该酶被认为具有两种 生物功能：一是参与细胞壁的合成。在膨r o u x i i 的细胞壁合成研究中发现几丁 质合成酶和 1t d i t s c e e k m h w g v s f d d g p a r f t g f v l 】k y l d e n ( j l 一h a t f f v v 2 d d i s k c p e p e t w g l t y d d g p n c s h n a f y d y l q e q e i 一一k a s m f y 工 3d d v y t c s k 一一一l s q t f d d g p s a s t t f l l i r l k h 一一一一- n s t f f 一一一一n l 4d d v t s c f k l s q t f d d g p a p a t e a l l k k l r 0 一一r t t f f v l 5 a d 工y k c p e p d t w g l f y d d g p n c s h n a f y ne 、l q e q n l 一r a s m f y 工 6 s d i s y c p n a g d w g l t y d d g p f n p t g n s a v d k y a e i ，n l y n f l a t t n q k s t l f y 工 7a d i = i v p e p m t w g l g f d d g p n c s h n a l y w l l s f n n g 一k a t m f f 工 8e g i y n c a n a g d v a l t f d d g p g p y t s h i l o v l d r l n a 一k a t f f ls g n n n a 工 q一v v a l t f d d g p n p a t t p q v l e t l a k yl 、i 一k a t f f v l 1 0v n h t s g q e a r c v y l t f d d g p n p f c t p q t l d v l a e h n v 一p a t f f a i 1 1a f y l g d p s k k e i y l t f d n g y e n g y t s k 工l d v l k k h i j v 一h a t f f v t 1 2一l t f d d g p s g s t q s l l n a l r q n g l 一r a t m f 一一一n o l 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 l o 1 1 1 2 g s r v i e r p e il l e e y m a g h d 工s v h t w s h r p l t s l t y e q v v a 罹l g 盯a r h a 工0 0 v l g s n v v d w p y g a m r g v v d g h h 工a s h t w s h p q m t t k t n o e v l - 取e f y y t q k a 工k l a t g v n i v q h p d i y q r m q k e g h l i g s h t w s h v y l p n v s n e k i i a q 工e w s 工w a m n a t g g i n t v n y p d i y e h i l e r g h l 工g t h t w s h e f l p s l s n e e i v 社0 工e w s l w a m n a t g g s n v m n w p y g a m r g v q d g h h 工a f h t w s h q s 玉门t l t n q e g l a e f y y t q k m 工h l a t g s n v a t f p a a a o r a l n d g h v l c v h t w s h p o m t s q s n i q v v 垂霉l ：z w t l r a i k e a t g s n v m d w p l q a m r a h d e g h q x c v h t w s h q y m t a l s n e v y f i ；耩l x y t q k a 王k a v l d t a n l p w p e l 工r r m y n s g h q v a s h t w s h a n l g n i j n s a e r h d e m y k n e m a l r n 工l g k n v s g n e d l v k r i k s e g h v v g n h s w s h p i l s q l s l d e a k k q i t d t e d v l t k v l g s y v k d h p e l t r r l v a e g h d v a n h t m t h p d l a t c d p k d v k r 器工d e a h o a 工v s a c g h y l k t a p d l v k r m v k e g h i v g n h s w s h p d m t t i s a d k i k k e l d a v s d k v k e l t g q y a a q n p s l v r a q v d a g m w v a n h s y t h p h m t q l g q a q m d s e i s r t q q a i a g a g g v t p t t m r p p y g d i d d r v r a i s l 。a 创g m v p l i w s r g s s g e s f d t n d w k 工a g g v g l t p r y w r p p y g d 工d d r v r w 工a s q l g l t a v i w n l 一一一d t d d w s a g v t t n h t p k w f r p p y g g 工d n r v r a 工t r q f g l q a v l w d h 一d t f d w s l l l n d k h f p k y f r p p y g a i d n r v r a 工v k q f g l t v v l w d l 一d t f d w k l i t n d g v t p r y w r a p y g d v d d r v r w i a t o l n l t t i l w d y d t n d w q a g d g v g i t s r c w r p p y g d v d d r v r a i a w q m g l r t 工l w d e 一一d t n p w d m p g e g g v t p 一0 c w r p p y g d v d n r v r m i a g a l n 王j t t i i w s d 一d t d d w a a g t d g g v ip t y m r p p y s s c s a e s g c e a d m n n l g y h v t y f d l d t q d y l n d s p d g s s s k l m r p p y g a 工t d d 工r n s l d l s f i m w d v d s l d w k s k n e a p q a l v r h l r a p y g v w t e d v l s a s v r r g l g a v h w s a 一d p r d w s c p g v d g o e g t v y v r p p r g i f s e r t l a l s e k y g y r n if w s l 一一一a f v d w k v n e o k g g r q 一一a v p a a v r q t n a t l r s v e a k y g l t e v i w d v 一一一d s q d w n n a s t d l3 4 i9 c l4 8 】3 8 79 i 9 2 j9 【3 0 1 99 5 5 1 0 l 7 9 。8 8 2 44 2 0 2 19 7 2 3 3 2 4 6 2 4 5 1 9 7 3 5 3 j0 9 1 51 ) l 3 3 4 0 28 9 2 4 7 2 3 2 78 2 9 2 9 0 2 3 8 39 8 1 55 2 0 j i 7 ? 图3 来自各种真菌的几丁质脱乙酰化酶与其他蛋白的氨基酸序列对比 f i g 1c o m p a r i s o no f c h i t i n d e a c e t y l a s e s f r o m w j o u s 劬面w i t ho t h e r p r o t e i n s 1 - 8 ，c h i t i nd e a c e t y l a s e ：l ，& i z o p h y l l u mc o m m u n e ；2 ，m u c o rr o u x i i ；3 。s a c c h a r o m y c e $ c e r e v i s i a e c d a l ；4 ，c e r e v t s i a ec d a 2 ；5 ，g o n g r o n e l l ab u t l e r i ；6 ，p h y c o m y c e sb l a k e s l e e a n u s ；7 ， c r y p t o c o c c u sn e o f o r g a a n $ v a t n e o f o r m a n s ；8 ，b i u m e r i ag r a m i n i s ；9 ，n - a c e t y l g u c o s a r n i n e d e a c e t y l a s ef r o msp n e u m o n i a ( c a b 9 6 5 5 2 ) ；1