（遗传学专业论文）鹰嘴豆孢克鲁维酵母分泌表达系统的构建及菊粉酶的高效分泌表达.pdf

i 卫土学博士后 站论文 鹰嘴豆孢克鲁维酵母分泌表达系统及菊粉酶的高效分泌表达研究 摘要 建立一种高效酵母分泌表达系统对利用酵母生产异源蛋白是十分重要的。在 己经建成鹰嘴豆孢克鲁维酵母c b s 4 8 5 7 宿主y 1 7 9 u ，载体p u k l 、p u k d 和 p u k d s 的基础上，利用克鲁维酵母菊粉酶基因启动子和终止子作为表达元件， 采用酿酒酵母的a 因子信号肽作为分泌信号，并以人0 2 a 干扰素作为试验基因构 建了表达质粒p u k l p i t 、p u k d p i t 和p u k d s p i t 。转化子y 1 7 9 u p u k l 一p i t ， y 1 7 9 u p u k d - p i t 和y 1 7 9 u p u k d s p i t 成功地分泌表达了人c t - 2 a 干扰素，其 中转化子y 1 7 9 u p u k d s p i t 具有最高的干扰素表达水平，每毫升发酵上清液 可分泌表达干扰素1 3 1 0 6 i u ；经过对培养条件的初步优化，在摇瓶培养条件下 干扰素分泌表达量可达到6 0 m g l 以上。 考虑到菊粉酶信号肽能够在克鲁维酵母中有效指导大量的菊粉酶分泌，文献 也曾报导该信号肽能够指导异源蛋白分泌表达，我们在天然菊粉酶信号肽编码序 列的基础上，通过引入无义突变( 将编码缬氨酸的密码子g t t 突变为g t g ) ， 从而得到引入限制性酶切位点b c l l 的菊粉酶信号肽；在此基础上利用p u k d - s 载体和克鲁维酵母菊粉酶基因启动子、终止子表达元件构建了干扰索分泌表达质 粒p u k d s i p i t ；该质粒转化鹰嘴豆孢克鲁维酵母y 1 7 9 u 后，转化子也成功地 分泌表达了干扰素，但是表达量低于采用q 因子信号肽指导分泌表达的转化子； 利用上述两种信号肽的表达质粒转化到乳酸克鲁维酵母y 16 6 中得到了类似的结 果。此外，在酿酒酵母和毕赤酵母中利用改造的菊粉酶信号肽进行了干扰素的分 泌表达尝试，但是均未能检测到分泌表达的干扰素。 利用菊粉酶基因的启动子、终止子作为表达元件，分别利用因子信号肽、 天然的菊粉酶信号肽和改造的菊粉酶信号肽，以p u k d s 载体为基础上构建了三 种菊粉酶分泌表达质粒：p u k d - s - f - p h l u t 、p u k d - s - c s s - p l n u t 和 p u k d s i p l n u t ，将这三种表达质粒分别转化鹰嘴豆孢克鲁维酵母y 1 7 9 u 和乳 酸克鲁维酵母y 1 6 6 ，转化子都能够有效地大量分泌表达菊粉酶，其中带有两种 复重土学博士膏 站论文 菊粉酶信号肽的表达质粒转化子在分泌表达菊粉酶的能力上明显优于带有q 因 子信号肽表达质粒的转化子：鹰嘴豆孢克鲁维酵母转化子表达菊粉酶的量明显高 于乳酸克鲁维酵母。与此同时，以p h c l l 和p p i c 9 k 为基础也同样利用不同的 信号肽分别构建了用于转化酿酒酵母和毕赤酵母的各三种菊粉酶分泌表达质粒： p h c c t f - p l n u t 、p h c i p l n u t 、p h c c s s p i n u t 和p p i c 9 k - a f p i n u t 、 p p i c 9 k c s s p i n u t 、p p i c 9 k b j p i n u t 。上述两组质粒分别转化酿酒酵母d c 0 4 和毕赤酵母g s l l 5 和s m d l l 6 8 后，实验证实酿酒酵母转化子只分泌表达少量菊 粉酶，而毕赤酵母转化子则能大量分泌表达菊粉酶，与鹰嘴豆孢克鲁维酵母转化 子分泌表达水平相当，每升发酵液中菊粉酶都可达克级水平。进一步的分析表明 在克鲁维酵母和毕赤酵母中分泌表达的菊粉酶与天然表达的菊粉酶糖基化型式 相同，均为n 一糖基化。 利用k c u r a 3 基因片断，对y 1 7 9 u 进行h i s 3 基因中断，得到了h i s 3 突变 株y 1 7 9 h 。y 1 7 9 h 在生长性状上优于y 1 7 9 u 。以y 1 7 9 h 为宿主菌也成功地分泌 表达了人a 2 a 干扰素和菊粉酶，但表达水平没有进一步提高。 总之，通过本研究我们可以得出以下结论： 1 我们建立的鹰嘴豆孢克鲁维酵母分泌表达系统，已经成功地分泌表达了人c t 2 a 干扰素和菊粉酶，其表达量已经达到很高的水平。因此，鹰嘴豆孢克鲁维酵 母分泌表达系统可以认为是一个有潜力的基因工程表达系统。 2 经改造的菊粉酶信号肽能在鹰嘴豆孢克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、酿酒酵 母和毕赤酵母中成功地指导菊粉酶的分泌表达，说明该菊粉酶信号肽具有一 定的通用性。 3 鹰嘴豆孢克鲁维酵母和毕赤酵母系统分泌表达菊粉酶的水平已具有明显的开 发应用价值。 关键词：鹰嘴豆孢克鲁维酵母表达系统分泌信号肽菊粉酶 u 墨兰查! ! 兰苎兰竺兰 s t u d i e so n s e c r e t o r ye x p r e s s i o ns y s t e mo f y e a s t 五c i c e r i s p o r u sa n d h i g hl e v e le x p r e s s i o no fi n u l i n a s e a b s t r a c t t od e v e l o pa g o o ds e c r e t o r ye x p r e s s i o ns y s t e mi sv e r yi m p o r t a n tf o r h e t e r o l o g o u sp r o t e i np r o d u c t i o ni ny e a s t b a s e do no u rp r e v i o u sc o n s t r u c t e dh o s t s t r a i ny 17 9 u ，d e r i v e df r o mk l u y v e r o m y c e sc i c e r i s p o r u sc b s 4 8 5 7 ，a n dv e c t o r sp u k l ， p u k da n dp u k d - s ，as e r i e so fe x p r e s s i o np l a s m i d s ，p u k l - p i t p u k d p i ta n d p u k d - s - p i tw e r ec o n s t r u c t e db yu s i n gp r o m o t e ra n dt e r m i n a t o ro fk c l n u lg e n et o c o n t r o lt r a n s c r i p t i o no fh u m a na 2 ai n t e r f e r o ng e n e ，a n daf a c t o rs i g n a lp e p t i d et o d i r e c tp r o t e i ns e c r e t i o n t h et r a n s f o r m a n t sy 17 9 u p u k l 一p i t y 17 9 u p u k d p i ta n d y 17 9 u p u k d - s - p i ta l ls u c c e s s f u l l ys e c r e t e di n t e r f e r o ni nc u l t u r em e d i u m ，o fw h i c h t r a n s f o r m a n t sy 1 7 9 u p u k d s - p i te x p r e s s e dt h eh i g h e s tl e v e lo fi n t e r f e r o n t h e a n t i v i r a l a c t i v i t y o fc u l t u r e s u p e r n a t a n tw a sa s s a y e d t ob e1 3 1 0 6 i u m l f u r t h e r m o r e ，e x p r e s s i o nl e v e lw a se v a l u a t e dt ob em o r et h a n6 0m e d l i np r e l i m i n a r y o p t i m i z e df l a s kc u l t u r e c o n s i d e r i n go ft h ef a c tt h a ti n u l i n a s es i g n a lp e p t i d ec o u l de f f e c t i v e l yd i r e c th i g h a m o u n to fi n u l i n a s es e c r e t i o ni n 芷c i c e r i s p o r u sc b s 4 8 5 7a n di tw a sr e p o r t e dt h a t i n u l i n a s es i g n a lp e p t i d ec o u l db eu s e dt od i r e c th e t e r o l o g o u sp r o t e i n ss e c r e t i o n ，w e c o n s t r u c t e dam o d i f i e ds i g n a ls e q u e n c eo ti n u lb yc h a n g i n gv a lc o d o nf r o mg t tt o g t c ta st h er e s d t ，ab c lir e s t r i c t i o ns i t ew a si n t r o d u c e di nt h es i g n a ls e q u e n c eo f 刷叫b yr e p l a c i n gs i g n a ls e q u e n c eo f a f a c t o rw i mm o d i f i e ds i g n a ls e q e n c eo f l n u l t h ee x p r e s s i o np l a s m i dp u k d - s i - p i t 、糯c o n s t r u c t e da n dt h e nt r a n s f o r m e di n t oh o s t s t r a i ny 1 7 9 u c o r r e s p o n d i n gt r a n s f o r m a n t sy 1 7 9 u p u k d - s i - p i ta l s oc o u l ds e c r e t i n t e r f e r o n h o w e v e r , t h ee x p r e s s i o nl e v e lw a sr e l a t i v el o w s i m i l a r l yr e s u l t sw e r ea l s o f o u n di n 芷l a c t i st r a n s f o r m a n t sy 1 6 6 p u k d s - p i ta n dy 1 6 6 p u k d - s i p i t t h e p o s s i b i l i t y o fu s i n gt h em o d i f i e di n u l i n a s e s i g n a l t os e c r e ti n t e r f e r o ni n s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ea n dp i c h i a p a s t o r i sw e r et e s t e d ，b u tf a i l e d u s i n gp r o m o t e ra n d t e r m i n a t o ro f k c i c e r i s p o r u s1 n u l ，af a c t o rs i g n a ls e q u e n c e ， n a t u r e i n u l i n a s es i g n a ls e q u e n c ea n dm o d i f i e di n u l i n a s es i g n a l s e q u e n c ew e r e s e p a r a t e l yc o n s t r u c t e dt og i v ep l a s m i d sp u k d - s - a f - p i n u t , p u k d - s - c s s p l n u t a n d p u k d s i - p l n u tc o r r e s p o n d i n g l y , w h i c hw a su s e dt ot r a n s f o r m 五c i c e r i s p o r u s y 1 7 9 ua n d 足l a c t i sy 1 6 6 a l lt r a n s f o r m a n t ss u c c e s s f u l l ye x p r e s s e dh i g ha n m u n to f i 复卫土学博士后出站论文 i n u l i n a s ei nc u l t u r es u p e r n a t a n t ，w h i l et h o s et r a n s f o r m a n t s 、 r i mb o t hi n u l i n a s es i g n a l e x p r e s s e dm u c hm o r ei n u l i n a s et h a nt h o s ew i t h 旺f a c t o rs i g n a l i tw a sf o u n dt h a t e x p r e s s i o nl e v e lo f 足c i c e r i s p o r u st r a n s f o r m a n t sw e r em u c hh i g h e rt h a nt h o s eo f 托 l a c t i st m n s f o r m a n t s a tt h es a l n et i m e ，t w os e r i e so fp l a s m i d s ，p h c - a f - p i n u t , p h c - i - p i n u t , p h c - c s s - p i n u t a n d p p i c 9 k t t f p i n u p p i c 9 k - c s s p i n u t , p p | c 9 k - b j p i n u tw e r e6 2 r t h e rc o n s t r u c t e db yu s i n gt h r e ek i n d so fs i g n a ls e q u e n c e t h e yw e r et h e nt r a n s f o r m e di n t os a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ed c 0 4a n dp i c h i a p a s t o r i sg s l l 5 ，s m d l l 6 8r e s p e c t i v e l y i tw a sf u r t h e rv e r i f i e dt h a ta l lsc e r e v i s i a e t r a n s f o r m a n t ss e c r e to n l yal i u l ei n u l i n a s e ，w h i l et h o s ep p a s t o r i st r a n s f o r m a n t sc o u l d s e c r e tam u c hh i g h e ra m o u n ti n s t e a d t h e e x p r e s s i o nl e v e lo f 尸p a s t o r i s t r a n s f o r m a n t sw a sc l o s et ot h o s eo fk c i c e r i s p o r u st r a n s f o r m a n t s ，b o t hr e a c h e dg r a m s c a l ep e rl i t e ro fc u l t u r es u p e m a t a n t t h er e s u l t so fg l y c o s i d a s e fa n a l y s i si n d i c a t e d t h a ta l le x p r e s s e di n n l i n a s ei nkc i c e r i s p o r u s , 置l a c t i sa n dp p a s t o r i ss h a r e dt h e s a m en g l y c o s i d em o d i f i c a t i o n u s i n gk c u r a 3f r a g m e n t ，t h eh i s 3i ny 1 7 9 uw a sd i s r u p t e dt og i v et h eh i s 3 m u t a n ts t r a i ny 17 9 h t h en e wh o s ts t r a i nd o e sn o ti m p r o v ep r o t e i np r o d u c t i o no f f o r e i g ng e n e s ，a l t h o u g hi t sg r o w t hc h a r a c t e r i s t i c sa r eb e t t e rt h a ny 1 7 9 u t h ec o n c l u s i o no f t h i sw o r ki s 船f o l l o w i n g s ： 1 b yu s i n gs e c r e t o r ye x p r e s s i o ns y s t e mo f k c i c e r i s p o r u s ，t h eh u m a n i n t e r f e r o na 2 a a n di n u l i n a s eh a v e b e e ns u c c e s s f u l l ye x p r e s s e di nh i 【g hl e v e l i tc o u l db e c o n s i d e r e da sag o o dp o t e n t i a le x p r e s s i o ns y s t e m 2 t h em o d i f i e di n u l i n a s es i g n a lp e p t i d ec o u l dd i r e c ti n u l i n a s es e c r e t i o nn o to n l yi n k c i c e r i s p o r u s ，b u ta l s oi nk 1 a c t i s , p p a s t o r i sa n ds c e r e v i s i a e i tm e a n st h a tt h e i n u l i n a s es i g n a lp e p t i d em a yb e u s e di naw i d e rr a n g eo f o r g a n i s m s 3 t h el e v e lo fi n u l i n a s ee x p r e s s e db yr e c o m b i n a n tk c i c e r i s p o r u sa n dp p a s t o r i si s 1 1 i g he n o u g ha n dv a l u a b l ef o ri n d u s t r i a ld e v e l o p m e n t k e y w o r d s ：k l u y v e r o m y c e sc i c e r i s p o r u $ ，e x p r e s s i o ns y s t e m ，s e c r e t i o n ，i n u l i n a s e 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导f 进行的研究j ：中】及取得的研究成果。论文中除了特别加以 标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对 本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明亓表示了谢意。 作者签名 日期 论文使用授权声明 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的 复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩 印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。 作者签名：导师签名：日期 复卫土学博士后研竟工作瓤专 第一章非常规酵母基因工程表达系统的研究 ( 综述) 随着七十年代d n a 重组技术的出现而引发了生物技术的飞跃发展，随后由 于技术的不断完善和发展，带动了生物技术产业的巨大进步，涉及到了医药、轻 工、食品、饲料、以致环境等传统生物技术相关产业的突飞猛进，产生了巨大的 经济效益。生物技术的核心是基因工程技术，至今已建立了多种基因工程表达系 统，如：大肠杆菌表达系统、枯草杆菌表达系统、酵母菌表达系统、链霉菌表达 系统、昆虫表达系统、哺乳动物细胞表达系统等，到2 0 0 4 年已有大约3 0 多种利 用基因工程表达系统生产的药物用于治疗，市值约为5 0 0 - - 6 0 0 亿美元，另有约 3 0 0 种药物即将上市【”。这些表达系统均在基础和应用研究中发挥了各自的重要 作用，但是又各有利弊。原核基因工程表达系统主要以大肠杆菌表达系统为代表： 大肠杆菌基因结构简单，易于进行基因操作，而且它生长迅速，周期短，营养需 求简单，适于工业化生产。但同时该系统又存在很多缺陷：由于是原核生物，缺 少真核生物的翻译后加工过程，影响外源基因产物的生物活性：它表达的蛋白多 以包含体形式存在，纯化表达产物时需要经过变性和复性，过程复杂；它产生的 杂蛋白较多，不易纯化；此外，大肠杆菌表达产物经常会含有内毒素，去除内毒 素的过程又会增加生产成本。昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统都是真 核细胞表达系统，它们可以进行多种蛋白的转录后加工，很适合于真核基因的表 达；但是由于遗传背景复杂，操作困难，易污染，生产成本高，并且容易导致病 毒感染，所以大规模生产难度较高。 酵母是单细胞低等真核生物，因而其表达系统兼有上面两类表达系统的优 势：既便于培养，基因操作简单，细胞繁殖快，生产成本低，又可对真核基因产 物进行翻译后加工，得到正确折叠、有活性的蛋白。1 。所以近年来，以酿酒酵 母为代表的酵母表达系统因其具有的独特生物学特性而成为有效表达外源基因， 服务于基础研究、工业和医药应用的重要工具。 酵母菌是一类低等的真核生物，它既具有类似原核生物的生长特性，又具有 一般真核生物的分子和细胞生物学特征。经过长期生理生化和遗传学研究，关于 酿酒酵母的生物学特征已经积累了大量的资料，并且被认为是一种安全的生物 ( g r a s ) 。特别是近年来随着酿酒酵母基因组测序的完成，对其分子生物学的 研究也已经非常成熟，因此大量利用酿酒酵母系统进行的基因功能研究得以广泛 开展。自从1 9 8 1 年h i t z e m a n 首次在酿酒酵母中表达了人0 l 干扰素【7 】，之后有多 种不同得基因得到表达，如白细胞介素、多肽类激素、乙型肝炎病毒表面抗原及 复卫太学博士后竹竟工作椎音 核心抗原；艾滋病病毒抗原、凝乳酶、淀粉酶、甜味蛋白、血浆蛋白等1 2 ，引。第 一个由酵母表达的基因工程药物乙型肝炎病毒表面抗原也已于1 9 8 6 年进入市 场，现在已有十余种重组蛋白药物采用了酿酒酵母系统进行生产，可见酿酒酵母 基因工程表达系统除了对基础研究起了很大的作用外，也为基因工程药物和疫苗 的产业化作出了巨大的贡献【8 。们。然而，近年的研究也发现酿酒酵母表达系统存 在有不可忽视的局限性。首先酿酒酵母是种以葡萄糖发酵为主的酵母，发酵时 会产生乙醇，在常规的发酵条件下很难得到高的细胞密度，而高密度培养必须采 用补料的发酵方法，在常规条件下，外源基因的表达水平不高。其次，酿酒酵母 表达产物的分泌也不够理想，对于大于3 0 k d 的蛋白几乎不分泌。此外，在翻译 后加工方面酿酒酵母与高等真核生物有所不同，经常出现过度糖基化的现象。因 此，从某种意义上来看，酿酒酵母不能算作表达外源基因的理想宿主i l ”。 酵母菌是真核生物中很大的一个类群，包括至少8 0 个属，7 0 0 个种，1 0 0 0 0 个独立菌株。然而，多年来研究的重点主要是集中在酿酒酵母和粟酒裂殖酵母上， 而对其他酵母的生理和遗传特性还不是十分清楚或者正在研究之中，因此通常将 酿酒酵母和粟酒裂殖酵母之外的酵母菌统称为非常规酵母。与酿酒酵母表达系统 的研究类似，大量关于粟酒裂殖酵母表达系统的研究也得以开展，并取得了相应 的进展“”“1 。近年来，为了开拓酵母这一广泛的生物资源，非常规酵母的研究及 其表达系统的构建也越来越受到重视，已经开展了大量的研究工作，构建有多种 新型表达系统【1 5 】。其中研究较多的非常规酵母表达系统有：p i c h i ap a s t o r i s 、 h a n s e n u l ap o l y m o r p h a 、c a n d i d a u t i l i s 、y a r r o w i a 坳o l y t i c a 、k l u y v e r o m y c e s l a c t i s 等多种表达系统。通常情况下，表达系统的构成包括：理想的宿主菌、适 当的载体( 表达元件) 、恰当的选择标记和简便、高效的转化方法。以下围绕表 达系统的构成、分别就几种非常规酵母表达系统的研究进展做一综述。 一、甲醇酵母表达系统： 甲醇酵母是指可利用甲醇作为唯一碳源的酵母，其代谢甲醇的第一步是在醇 氧化酶的作用下甲醇被氧化成甲醛，调节这种酶的启动子是强启动予并严格受甲 醇诱导，因此可用于调控外源蛋白表达：同时甲醇酵母能在无机盐培养基中快速 生长，易进行工业化生产，便于高密度培养，干细胞量可达到l o o g l 以上。此外， 甲醇酵母在转化、基因替换、基因敲除等基因操作技术上与酿酒酵母相似，简单 易行，而外源蛋白的表达量则增加1 0 一1 0 0 倍。作为一种真核表达系统，能对重 组蛋白进行翻译后必要的剪接、正确的折叠和修饰，糖基化也更接近高等真核生 物甚至人类。这些特点使得甲醇酵母成为一种很有潜力的表达系统，也是近年来 发展非常迅速的外源蛋白质生产系统【1 5 ，1 6 1 。甲醇酵母分属假丝酵母( c a n d i d a ) ， 董卫土学博士后研究工作簟告 汉逊酵母( h a n s e n u l a ) ，毕赤酵母( p i c h i a ) 和球拟酵母( t o r u l o p s i s ) 4 个属“。 已开发的甲醇酵母表达系统主要有p i c h i a p a s t o r 坦hp o l y m o r p h a 、c a n d i d a b o d i n i i ，其中p i c h i a p a s t o r i s 作为基因表达系统使用得最多，与以往的基因表达系 统相比，它具有无可匹敌的高表达特性，被认为是最具有发展前景的蛋白质生产 工具之一【1 5 18 1 。 1 、p i c h i a p a s t o r i s t h ep h i l l i p sp e t r o l e u mc o m p a n y 最早开发7 p i c h i a p a s t o r i s 酵母利用甲醇的培 养基和培养工艺，通过连续培养细胞密度可以达至u 1 3 0 9 l ( d c w ) 1 1 9 ，因而在 1 9 世纪七十年代被广泛的用于高密度工业化生产单细胞蛋白。随后伴随七十年代 后期石油危机的出现和基因工程技术的发展，p h i l l i p sp e t r o l e u m 和s a l ki n s t i t u t e b i o t e c h n o l o g y i n d u s t r i a la s s o c i a t e si n c 开始合作开发毕赤酵母用于外源蛋白的表 达系统。醇氧化酶基因及其启动子的克隆促进了相应的载体构建、转化方法、选 择标记和培养工艺等一系列研究，从而发展成为一种有效的基因表达系统”1 。 在巴氏毕赤酵母中，甲醇利用途径的第一个酶是醇氧化酶( a l c o h o lo x i d a s e ， a o x ) ，编码彳0 蛹泊句有两个基因有两个，即a o x l 和a o x 2 ，其表达产物约占细胞 可溶性蛋白质的3 0 以上。a o x l 基因的编码产物在氧化过程中起主要作用，甲 醇可以诱导一d 肼q 合成，而甘油和葡萄糖则抑带忸n = | 珀勺产生，该过程在转录水平 严格控制。只有在去除其它能源后，用甲醇诱导才能启动a o x l 基因的信号转录 和翻译。根据甲醇利用的特性，毕赤酵母又有三种表型m u t + ，m u g 和m u f ；利用 该菌的这一系列特点，已经开发了多种载体一宿主系统和一系列商品化的表达试 剂盒。 由于毕赤酵母没有内源质粒，其表达系统通常是利用同源熏组将外源基因整 合到染色体：构建好的表达载体可选用适当的限制性内切酶线性化，然后通过电 转化导入宿主，以h o x 或h i s 4 为同源序列发生单交换或双交换，从而将外源基因 替换到宿主染色体上，这种整合型表达比内源性质粒表达稳定性高，而且连续培 养1 0 0 代外源基因也不易丢失；此外，由于毕赤酵母的高密度培养工艺比较成熟， 高表达量就成为其主要的优点之一，许多外源基因的表达量能够达到其它如细 菌、昆虫或哺乳动物细胞等表达系统产量的10 - 100 倍，许多蛋白表达量能够达 到克级，例如鼠胶原蛋白的表达量可达1 5 9 l 臼踟，破伤风毒素蛋白的表达量能够 达至l j l 2 9 l “”，人血清白蛋白和白介素2 均可达l o g l ，h e u ab m s i l i e n s i s 羟睛裂合 酶的表达水平甚至高达2 2 9 l 瞄1 。毕赤酵母系统的另一个优点是分泌能力强，通 过分泌途径将外源蛋白分泌到胞外培养基中可以减轻大量表达产物对宿主细胞 的代谢负荷，同时在分泌过程中，能够进行成熟加工、糖基化和二硫键的形成以 及正确的折叠等翻译后加工，使分泌蛋白更接近于天然蛋白构象和活性，而且其 复旦支学博士后一竟工作瓤毒 糖基化适度，接近于真核生物，抗原性明显低于sc e r e v i s i a e 表达产物，更适于 临床治疗使用；并且由于目的蛋白分泌到培养基中，相对的杂蛋白很少，这为基 因工程下游的分离纯化非常有利。对胞内表达蛋白的分选和区域化是毕赤酵母系 统的另一重要优点。外源蛋白经核基因编码翻译后，可被转运入过氧化物酶体存 储，使之区域化，这种过氧化物酶体不同于大肠杆菌胞内表达所形成的包涵体， 它可以使分选入其中的表达蛋白免受胞内的蛋白水解酶降解，增加其稳定性，特 别是表达有毒性的蛋白，区域化可减少对宿主菌的毒害作用。这为一些特殊蛋白， 如膜蛋白、毒素蛋白、不稳定的酶和受体蛋白等结构和功能的研究提供了较为理 想的体系。再综合毕赤酵母培养成本低、工业放大容易、工艺成熟等一系列优势， 毕赤酵母成为近年来最受关注的非常规酵母系统之一，日益成为一个高效的外源 蛋白表达平台【2 6 ，2 7 1 。到目前为止，国内外已有4 0 0 多种的外源蛋白在p p a s t o r i s 中获得表达，并且许多复杂的真核基因工程产品，包括多种动、植物和微生物的 酶、抗体、激素等生物活性蛋白，都采用该表达系统进行了研究和生产，已有多 种重组蛋白进入或即将进入临床研究，其中乙肝表面抗原做为亚单位疫苗已在南 美上市。总的来说，毕赤酵母表达的外源蛋白主要可以分成以下几种：( 1 ) 疫苗 抗原，如破伤风毒素片段c 、乙型肝炎表面抗原、百e t 咳抗原p 6 9 、h i v - l 外膜糖 蛋白g p l20 、登革热病毒e 蛋白等；( 2 ) 细胞因子，如肿瘤坏死因子( t n f ) 、表 皮生长因子、内皮素抑制因子、巨噬细胞抑制细胞因子、人和鼠的内因子 ( i n t r i n s i cf a c t o r ) 等：( 3 ) 酶类，如人溶菌酶、a 一葡萄糖苷酶、乙醛氧化酶、人胃 促胰酶、人肝单胺氧化酶、人胎盘碱性磷酸酶等：( 4 ) 蛋白类激素，如胰岛素前 体、人绒毛膜促性腺激素、人旁甲状腺激素等；( 5 ) 抗体及单链抗体、受体等生 物活性蛋白；( 6 ) 用于结构分析、鉴定的蛋白。 毕赤酵母的转化方法以电转化最为常用，该法能够达到相当高的转化效率， 基本上取代了常用的l i a c 和原生质体转化法。近年来，对于毕赤酵母系统的表达 元件，尤其是其它新型启动子的研究也有了很大的进展。a o x i 、a o x 2 1 2 8 都被用 于指导外源蛋白的有效表达，尤其是前者应用最为广泛【l9 ，”j 。但是由于在爿o x l 系统中必须以甲醇作为诱导物，这样就有引发火灾的危险，另外利用甲醇的系统 用于生产食品相关蛋白也不适宜。因此其它不利用甲醇诱导的启动子的寻找就很 有意义。g p 启动子【2 ”0 】是一种组成型表达的强启动子，在葡萄糖培养基中其启 动子强度相当于4 0 x 1 启动子，可以解决甲醇诱导和更换培养基的弊端，但是由 于是组成型表达，p 删p 不适合于表达对宿主细胞有毒害作用的外源蛋白；p p m a i 是另外一种有效的组成型启动子；另一种有效的启动予是p 凡d l 【3 ”，它除了能 以甲醇为诱导物外，同样能以甲胺进行诱导，而甲胺是一种没有毒害作用且不易 挥发的氮源；某些情况下，外源基因并不需要过强的表达，或者是由于外源蛋白 4 复旦太学博士后竟工作瓤告 对宿主的毒害作用，或者是由于表达过高会导致大量产生翻译后修饰中产生错误 的加工、折叠、定位等，因此开发出一些温和的启动子来表达外源蛋白也是必须 的。为此，毕赤酵母p e x 8 3 4 1 、y p t l 【3 5 i 和i c l l l 3 6 1 的启动子近年来也开始受到重视 ”j 。除启动子外，分泌信号肽对于蛋白的分泌表达也是至关重要的因素，应 用于毕赤酵母系统的系统主要是来源于酿酒酵母的0 l 因子( a f ) 信号肽、s u c 2 信号肽和来源于毕赤酵母的p h o l 信号肽，曾被广泛用于分泌表达多种蛋i ! i 3 7 】； 并且多种异源蛋白自身信号肽在毕赤酵母中也能很好的起作用，甚至一些外源信 号肽如人血清白蛋白( h s a ) 的p r o 序列等也能用于指导多种蛋白的分泌；来源 于植物的信号肽如：p h a e 信号肽【3 8 】等也得到应用；近年来，利用杂合信号肽【3 9 】 和人工合成信号肽也能够有效指导外源蛋白的分泌。 选择标记分为两种，一种是营养缺陷型标记，用于互补宿主的营养缺陷；另 一种则为抗生素选择标记。由于巴氏毕赤酵母的研究时间相对较短，对其遗传背 景不太清楚，因此在该表达系统中可以用的选择标记也较少，般常用的营养缺 陷型标记只有衄舛和彳r g 4 ，为了克服这一缺憾，近年来又发展了以一d e 、u r a 3 等选择性标记，相应的缺陷型宿主也得到开发。最近，a r g l ，a r g 2 ，a r g 3 ，h i s l ， h i s 2 ，h i s 5 ，h i s 6 等一系列基因也得到了克隆，并获得了相应的缺陷型宿主菌， 有望用于表达系统的选择性标记【4 0 1 。抗生素选择标记目前有两种，抗氨基糖普 类g 4 1 8 的卡那霉素抗性基因( k a n a m y c i n ，简称k a n 来源于t n 9 0 3k a n j 基因) 或抗 争光霉素类z e o c i n 的s h6 e 抗性基因( 来源于印度斯坦链异壁菌 s t r e p t o a l l o t e i c h u sh i n d u s t a n u s ) ，这些抗性选择标记对表达盒多拷贝插人的 转化子的筛选十分有用“州。 至于宿主菌。目前的毕赤酵母宿主均来源于n r r l - y1 1 4 3 0 ( n o r t h e r n r e g i o n a lr e s e a r c hl a b o r a t o r i e s ，p e o r i a , i l ) ，大多含有一种或几种的营养缺陷，除 了常规应用的m u t + 菌株g s l l 5 之外，根据不同目的也有一系列甲醇利用能力不同 的菌株可选。除此之外，目前已有一系列的蛋白酶缺失菌株，可用于表达易于被 蛋白酶降解、失活的目的蛋白。 近年来，巴斯德毕赤酵母表达系统在研究和开发领城中已被广泛应用，该系 统专利由r e s e a r c hc o r p o r a t i o nt e c h n o l o g i e s ( t u c s o n ，a z ，u s a ) 所拥有，已有多种 商品化的成套k i t 出售。并且和其它表达系统一样，巴斯德毕赤酵母表达系统同 样有其局限性，如分泌产物的不均一性，包括聚合体的存在，信号肽加工不完全， 修饰功能欠完善以及内部降解等现象，给外源蛋白的纯化和工业化带来了一定的 困难。此外，目前广泛应用的甲醇诱导发酵工艺不能很好的被接受，尤其是食品 相关领域；发酵周期长是毕赤酵母系统的缺点之一，因此还有待于进一步的完善 和优化。 蕾卫土学博士后唧竟工作曩告 2 、h a n s e n u l a p o l y m o r p h a 多形汉逊酵母( h a n s e n u l a p o l y m o r p h a ) 是另一类甲醇营养型酵母，与其它甲 醇酵母不同，其具有耐高温的生理特性，最适生长温度为3 7 4 3 ，最高生长温 度可达4 9 。c 。尽管与巴氏毕赤酵母有许多相似的特性，如：都存在强的诱导型启 动子：重组菌在非选择性培养基上有丝分裂稳定；可进行大规模培养和发酵等。 多形汉逊酵母中甲醇代谢的第一个酶是甲醇氧化酶，由m 似基因编码。m n y 启 动子也是强诱导启动子，但与爿m 等醇氧化酶启动子不同，该启动子对葡萄糖的 阻遏不敏感，在葡萄糖限制或缺乏的条件下，能够被甲醇诱导，因此从培养向诱 导的转换非常容易，在实际应用中有很大的优越性，其表达量通常高于其它的酵 母表达系统，同样被认为是最理想的外源基因表达系统之一1 。 汉逊酵母的电转化法早在1 9 9 4 年就以建立【4 2 】，能够达到1 7 1 0 6 u g d n a ， 足以达到转化子筛选的要求，如今也已成为常规的转化方法。构建巴斯德毕赤酵 母重组菌时通常使外源d n a 通过同源重组整合到用酣基因或其中一个彳勰囡 中，多数情况下只能整合单拷贝的外源序列( 9 0 以上) ；而多形汉逊解母的表 达载体多为穿梭质粒，利用自主复制序列“1 删a r s ，或p a r s ，通过自我复制引导外 源基因进入宿主，并且能在非同源区整合到染色体，5 0 以上的重组子是多拷贝， 可以获得拷贝数为1 0 0 以上的重组菌株；有些删r 辩列如h a r s 3 6 不仅利于质粒 的染色体外扩增，还能提高转化和整合的效率便于高拷贝转化子的筛选。此外， 表达载体也可以利用r d n a 的重复序列引导外源基因熬合到染色体上，从而获得 高拷贝数的重组菌。同时在同一个宿主中表达多个基因时通常是把多个基因的表 达盒串联在一个表达载体转化到宿主表达，这不仅会增加表达载体的构建难度， 而且基因的表达剂量多为1 ：1 ，难以广泛应用。由于h a n s e n u l a p o l y r a o r p h a 能够 形成高拷贝数的重组子，就可以把多个基因相继整合到染色体上共同表达，并筛 选到各基因拷贝数合适比例的重组菌，使各基因在重组子中按预期的剂量表达， 这样，重组菌可按最佳的化学计量比生产酶以生成高效的生物催化剂，这在其它 甲醇酵母中未见报道。 作为甲醇代谢途径的强启动子，m o x , f m d 和d h a s 基因的启动子常被用来 调控外源基因的表达“。”。删。它们受甲醇的强诱导，受葡萄糖和乙醇阻遏，但在 低浓度甘油或葡萄糖中可解阻遏。由于有相似的调控机制，巴斯德毕赤酵母的醇 氧化酶0 0 x i ) 基因启动子，也可以用来调控多形汉逊酵母中基因的诱导表达“”； 胺氧化酶6 4 m o ) 基因1 、磷酸酶基因( p h 0 1 ) “”启动子也是一种类似的可调控 型启动子；另外，3 种硝酸吸收基因( y n t i ，y n r l 和玎忆i ) 的启动予都可以用作诱 导性启动子呻刚。此外，汉逊酵母的磷酸甘油醛启动子( p 鲋p ) 是一种强的组成 型启动子，能够有效的指导h s a 等蛋白高效表达。近年来，新的启动子元件例 复卫土学博士后舛竟工作簟眚 如来源于膜a t p 一质子泵的p 删j 启动子1 5 3 1 和来源于转录延长因子的p r 酣，胍f 2 【5 4 l 也 开始被应用。汉逊酵母的分泌