（遗传学专业论文）黑龙江地区天然红松种群遗传多样性的issr分析.pdf

学位论文独创性声明 i i i i iii lli ll1 1 1 1illill1i i l i i i i i i i ii i i i i y 17 9 5 2 4 5 本人承诺：所星交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别加以标注和 致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的 启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名： 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权 辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：指导教师签名：喇躲 签名日期：1 力p 年上月9 日 辽宁师范大学硕士学位论文 摘要 本文应用i s s r 技术对黑龙江红松1 3 个种群2 3 8 个个体的遗传多样性及遗传分化进 行研究，揭示该地区红松种群的遗传多样性水平、遗传结构，探讨遗传分化机制，为东 北红松林的资源有效保护和合理利用提供理论依据。主要研究结果如下： 1 、通过筛选出的1 3 个扩增条带清晰、多态性丰富的i s s r 引物对黑龙江1 3 个种群 进行p c r 扩增，共检测出1 3 9 个位点，多态位点数9 6 个，多态位点比率( p ) 6 9 0 6 ， n e i 多样性指数( 肋平均值为0 2 4 0 3 ，s h a n n o n 多样性指数( d 平均值为0 3 5 9 8 。说 明该地红松具有较高水平的遗传多样性。 2 、种群间遗传分化系数g s t 为0 3 4 0 4 。种群内的遗传多样性占总群体的6 5 9 4 。 种群间的遗传多样性占总群体的3 4 0 6 ，说明黑龙江红松遗传变异主要存在于种群内； 种群间的基因流施为0 9 6 8 9 ，表明红松种群间基因交流基本正常，但基因流不是很高， 在种群间形成了一定程度的遗传分化。推测黑龙江红松资源遭受破坏多是人为所致使生 境破坏和种群片段化，针对这种现状，我们提出了红松资源的恢复建议。 3 、对1 3 个种群聚类分析，可以将其分为3 大组，主要集中在小兴安岭和张广才岭。 某些种群早在第四冰期前就已经分化，当第四冰期来临时在黑龙江省的小兴安岭和张广 才岭形成我国天然红松的避难所。 关键词：红松：i s s r ：遗传多样性：黑龙江 辽宁师范大学硕士学位论文格式规范 g e n e t i cd i v e r s i t yo f p i u n sk o r a i e n s i sp o p u l a t i o n sf r o mh e il o n g j i a n ga r e a r e v e a l e db yi s s ra n a l y s i s a b s t r a c t w i t hi s s rm e t h o d , t h ep a p e rs t u d i e dg e n e t i cd i v e r s i t ya n dg e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o no f2 3 8 i n d i v i d u a l si n13p o p u l a t i o n so fp u n sk o r a i e n s i sp o p u l a t i o n sf r o mh e i l o n 萄i a n ga n d r e v e a l e dt h eg e n e t i cr e l a t i o n s h i pa n dm e c h a n i s mo fg e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o no ft h i sa r e a , i n q u i r e di n t ot h eg e n e t i cs t r u c t u r ea n dp r o v i d e dt h er a t i o n a l eo ft h ee f f e c t i v ep r o t e c t i o na n d r e a s o n a b l eu s e 1 1 1 em s e a r c h f u lr e s u l t sa sf o l l o w s ： l 、t h i r t e e ni s s r - p c rp l i m e i 芯t h a th a dv i v i d a m p l i f i c a t i o nb a n da n da b u n d a n t p o l y m o 甲h i s mh a db e e ns o r e e = n e d t h i r t e e np r i m e r sw h i c hw e r es c r e e n e do u t 谢mi s s r t e c h n i q u ew e i ea b l e t og e n e r a t e13 9l o c ii nt o t a l , t h e r ea r e9 6p o l y m o r p h i cl o c ia n dt h e p e r c e n t a g eo fp o l y m o r p h i cl o c ii s0 6 9 0 6 n e i si n d e xi s0 2 4 0 3 ，a n dt h es h a n n o n si n d e xi s 0 3 5 9 8 t h er e s u l ts h o w st h a tt h e r ea r em o r eg e n e t i cv a r i a t i o n si nh e il o n g j i a n gp r o v i n c e 2 、c o e f f i c i e n to fg e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o ni s0 3 4 0 4 g e n e t i cd i v e r s i t ya m o n gp o p u l a t i o n s p o s s e s s e d6 5 9 4 o f t h et o t a la n dg e n e t i cd i v e r s i t yb e t w e e np o p u l a t i o n sp o s s e s s e d1 9 9 9 w eo a nc o n c l u d et h a tg e n e t i cd i v e r s i t ym o s t l ye x i ti np o p u l a t i o n s ；n mi s0 9 6 8 9w h i c h m e a n st h a tt h eg e n ef l o wi sn a t u r e h o w e v e r , i ti sn o th i g h ah i g h e rl e v e lo fg e n e t i c d i f f e r e n t i a t i o nw a sd e t e c t e da m o n gp o p u l a t i o n s ow ec a nc o n f e rt h a tt h er e s o u l eo ft h e p i u n ak o r a i e n s i sw a sd e s t r o y e do fm a n k i n d ，s ot h eh a b i t a tw a sd e s t r o y e da n dt h ep o p u l a t i o n w a sf r e g m e n t r a y a i m e da tt h i ss i t u a t i o n , w ea d v a n c et h es u g g e s t i o no ft h e p r o t e c t i o no f p i u n sk o r a i e n s i sr e s o u r c e 3 、p i u n sk o r a i e n s i sp o p u l a t i o n sf r o mh e il o n 萄i a n gg a sb em e a s u r eo 行3a r e a so f t h e1 3 p o p u l a t i o n s t h e ya m a i n l yf a s t e no nx i a oh i n g g a nl i n ga n dz h a n gg u a n g c a il i n g w ec a n s p e c u l a t et h a tn a t u g a lp i u n sk o r a i e n s ii nc h i n ah a v eb e e nd i f f e r e n t i a t e da se a r l ya st h e q u a t e r n a r yi c ea g eo c c u r r e d , t h er e g i o n sm a yb et h er e f u g ef o rn a t u r a lp i u n sk o r a i e n s i si n x i a oh i n g g a nl i n ga n dz h a n gg u a n g c a il i n go fh e il o n g i i a n g k e yw o r d s ：p i u n sk o r a i e n s i s ；i s s r ：g e n e t i cd i v t , = l s i t y | h e il o n g j i a n g i i 辽宁师范大学硕士学位论文 目录 摘 要i a b s t r a c t i i 绪论1 l 红松简介l 1 1 红松的地理分布1 1 2 红松的生物学特性2 1 3 红松的生活史特征。3 1 4 红松针阔混交林的异龄性特征3 1 5 红松的价值4 1 5 1 生态学价值4 1 5 2 经济学价值4 2i s s r 标记技术5 2 1i s s r 标记技术的概述5 2 2i s s r 标记技术的原理5 2 3i s s r 标记技术的步骤。6 2 3 1 引物设计。6 2 3 2 模板6 2 3 3 反应体系7 2 3 4 循环参数( 反应温度与时间) 7 2 3 5p c r 产物的检测和数据统计分析7 2 4i s s r 标记技术的应用7 2 4 1 遗传作图与基因定位：7 2 4 2 亲缘关系和遗传多样性的研究。7 2 4 3 分子标记辅助育种8 3 实验材料与方法9 3 1 实验材料。9 3 2 实验试剂及仪器9 3 2 1 试剂9 3 2 2 仪器1 1 3 3 实验方法1 1 辽宁师范大学硕士学位论文格式规范 3 3 1 红松总d n a 的提取。l l 3 3 2d n a 浓度检测1 2 3 3 3 模板d n a 的纯化。1 2 3 3 4 红松i s s r 引物的筛选1 2 3 3 5i s s r - p c r 反应体系及条件1 3 3 4 数据统计和分析1 7 3 4 1 种群遗传结构及遗传多样性的分析1 7 3 4 2 聚类分析1 7 4 实验结果与分析l8 4 1 植物基因组提取结果1 8 4 1 1 粗提纯后的实验结果1 8 4 1 2 纯化后的实验结果1 9 4 2i s s r 扩增结果。1 9 4 2 1 多态位点比率1 9 4 2 2 用s h a n n o n 和n e i 7 s 指数判定不同群体红松的遗传多样性2 6 4 2 3 红松群体内和群体间的遗传分化2 7 4 2 4 红松群体间的遗传距离和一致度及聚类分析2 8 5 讨论31 5 1 关于植物基因组d n a 的提取3l 5 2i s s r - p c r 体系的建立。3 2 5 2 1 模板对i s s r - p c r 的影响3 2 5 2 2d n t p 浓度对i s s r - p c r 的影响3 2 5 2 3t a qd n a 聚合酶用量对i s s r - p c r 的影响3 2 5 2 4m ：9 2 + 浓度对i s s r - p c r 的影响。3 3 5 2 5 退火温度对i s s r p c r 的影响3 3 5 2 6 引物浓度对i s s r p c r 的影响3 3 5 3 黑龙江天然红松林遗传多样性分析3 3 5 3 1 红松的遗传多样性3 3 5 3 2 红松种群的遗传分化和基因流3 4 5 3 3 聚类分析3 4 5 4 黑龙江省红松种群资源特点及恢复建议3 5 5 5 生物多样性就地保护的对策和建议。3 5 辽宁师范大学硕士学位论文 5 5 1 自然保护区的建设和管理3 5 5 5 2 阻止红松物种灭绝、停止红松采伐3 5 5 5 3 重建原始红松林维护红松林的多样性3 6 结 论3 7 参考文献3 8 攻读硕士学位期间发表学术论文情况。4 1 致 谢4 2 一v 一 辽宁师范大学硕士学位论文 1 红松简介 绪论 1 1 红松的地理分布 红松( p i n u sk o r a i e n s i ss i e b e tz u c c ) 是寒温带针阔混交林的主要树种。在世界版 图上，红松分布的北界在北纬5 2 。n ( 俄罗斯) ；南界在北纬3 3 。5 07 ( 日本) ；东界 在东经1 4 0 。2 0 ( 俄罗斯) ；西北界在北纬4 9 。2 8 ，东经1 2 6 。4 07 ( 中国) ；西南 界在东经4 l 。2 0 ( 中国) 。在国外，红松分布于朝鲜半岛、俄罗斯远东南部，在日本 的本州、四国也有间断分布n 1 。在我国东北地区的长白山、张广才岭、完达山和小兴安 岭是红松主要分布区域。小兴安岭的北坡( 约北纬4 9 。2 1 ) 为其北界，辽宁省宽甸县( 约 北纬4 0 。4 57 ) 为其南界，黑龙江省饶河县( 约东经1 3 4 。) 为其东界，辽宁省本溪县( 约 东经1 2 4 。4 5 ) 为其西界。长白山林区是红松主要垂直分布地带，一般多在海拔5 0 0 - 1 2 0 0 m 间，在完达山和张广才岭林区，一般分布在海拔5 0 0 - - - , 9 0 0 m 之间，在纬度4 7 。 4 8 。2 07 小兴安岭地区，一般分布高度3 0 0 - 6 0 0 m 之间，散生的红松可达8 0 0 m 。 黑龙江地区天然红松种群遗传多样性的i s s r 分析 扩_ 萄铲矗l i m - - - 叫缸蚣连娃铮每再 x鼻被分弗 瓣红钕韩的务审1 一- 中辞红捡锋南北弹 j 。m 。，礁j 狻 图1 1红松在本世纪初的分布 f i g1 1 t h ed i s t r i b u t i o no f p o i u sk o r a i e n s i s io ft h eb e g i n n i n go ft h ec e n m ，, 1 2 红松的生物学特性 红松为高大乔木，树干圆满通直。在天然红松林内树高多为2 5 , - - - ，3 0 m ，胸径4 0 - - - 8 0 锄，寿命长达1 2 0 , - - , 3 0 0 年，在条件适宜的地方有时树高可达4 0 m ，胸径达2 0 0t - m ，寿 命长达5 0 0 年，具有个体大，寿命长的特点。成年树顶分叉；树皮红褐色，块状脱落； 小枝暗褐色，密被黄褐色绒毛。芽长卵圆形，叶5 针一束，长6 - 1 7 血，横断面三角形， 2 辽宁师范大学硕士学位论文 两面有白色气孔，呈暗绿色。叶内具一维管束，脂道3 个位于中间，叶鞘早落。球果大， 卵状圆锥形，长1 0 - 2 0 锄，成熟时种鳞不张开，种鳞先端反曲，鳞脐顶生，不显著。 种子生于种鳞部下的凹槽中，一般两个，三角状卵形，无翅，长1 2 - 1 5 衄。叶边缘有 细锯齿，叶鞘早落。松针一般3 年脱落，幼树针叶4 - - 5 年脱落。红松在前1 0 年其直径、 树高、积材生长缓慢，1 5 年后生长速度加快。生长大致经历五个阶段：初生期、缓慢期、 速生期、下降期、终止期。 红松是浅根系树种，主根不发达，根系基本上分布在3 0 e r a 以上的表层土中。 红松是一个典型的温带湿润气候条件下的树种。红松的耐寒力强，在小兴安岭冬季 一5 0 低温下，无论老龄或幼壮龄树木都无冻害现象。因此，红松在近海湿润地区，可 以分布到北纬5 2 。的寒冷地区。 1 3 红松的生活史特征 红松是异花风媒传粉植物，其生活史对策是k 对策圆。k 对策是具有进化成发育缓 慢，生殖延迟，多次生殖，大种子、小收获量和寿命长特点的植物的生活史对策【3 1 。花 为雌雄同株异花，无花被，胚珠裸露。红松在开花的当年授粉后并未发生受精作用，而 为花粉管的生长期。红松的花粉管生长期很长，自开花年的6 月起经过漫长的冬季至翌 年5 月以后才开始受精。花期在6 月，开花翌年的9 月果熟。 红松球果重而无翅，成熟后由于种鳞不张开，不能自由散落开来，是随球果一起落 地。红松种子的传播需要依赖动物的协同作用：落入地面上的种子不能第二年发芽，其 种子需要度过一个后熟期，隔一年后才可发芽。而在此过程中，动物的取食，又降低了 红松种子发芽的可能性，且在自然环境中，微生物和昆虫又增加了种子腐烂的可能。天 然更新中的红松幼苗大多是有动物例如灰鼠、花鼠、林姬鼠、茶腹鸭和星鸦等在取食、 搬运和贮藏中丢失或遗弃的种子萌发而来的【4 】。 1 4 红松针阔混交林的异龄性特征 红松在幼年时期具有较强的耐荫性，随着年龄的增长，其耐荫性逐渐减弱，需在全 光下才能发育正常。而高生长以稍加庇荫的8 0 光照较好。由于针叶林内郁闭度较大， 土壤被针叶树酸化度较大，整个林内自我更新较差，所以在母树下红松很难进行天然更 新。而阔叶混交林下的红松一般更新情况就明显好于针叶林内，其原因在于各个树种生 长参差，顶冠稀疏，混生的阔叶树放叶的时间迟于红松。红松通常5 月初开始生长，混 生的阔叶树在5 月下旬才放叶。故使红松在此期间内可获得较多的光照，并且林内冬季 积雪较厚，春季融雪较早，给红松苗的生长提供了大量水分，保证了适宜的温度。此外， 阔叶树对土壤有较强的代谢和有机物积累的作用，使得阔叶林下的土壤肥沃，促进红松 黑龙江地区天然红松种群遗传多样性的i s s r 分析 幼苗茁壮生长。所以红松的天然更新常常是在发育程度较完善的阔叶林内进行，形成多 世代并存的异龄林，年龄变化范围可在6 0 年至3 0 0 余年。 1 5 红松的价值 1 5 1 生态学价值 红松是中国东北地区温带针阔也混交林的主要建群树种。其稳定的环境与条件最适 合某些动物的栖息，如东北虎、紫貂、猞猁等名贵动物，这些动物是红松林的典型栖息 者，它维护着生态平衡。在自然界中，红松种子是动物的重要食物来源，由于红松球果 及种子的特点，决定了红松要依赖动物帮助完成种子扩散，实现天然更新。 此外，流经红松林分布区内有松花江、黑龙江、乌苏里江和鸭绿江等河流，因此红 松林的存在，具有重要的水源涵养的意义。松花江的水位比较低、含沙量较少的原因就 是因为其上游有丰富的阔叶红松林。红松林从林冠到地表就像一层很厚的海绵体吸收和 保存着大量的水分，起着巨型水库的作用，保证江河水位的稳定，使之大雨不涝，无雨 不旱，促进农业高产稳产。同时也起着净化空气，保护环境的作用。因此，红松林生态 系统对于各种气候因素有重新分配功效，对防风固沙，水资源调节都起都了必不可少的 作用。 1 5 2 经济学价值 红松材质轻软，加工容易，木材有光泽、美观，而且不易开裂，不易变形。所以红 松木材工艺价值很高，是用材部门最欢迎的树种之一。它广泛应用于建筑、交通、矿山、 机械以及国防工业等各个方面。 红松蕴含着宝贵的农副产品，其富含的树脂含量高于东北地区的其他针叶树种，树 脂是提炼松香、松节油等的原料。红松的针叶可以提炼出松针油，是机械润滑油和高级 化妆品的原料。红松花粉可以作为药剂和保健食品，有润心肺、益气、除风、止血的功 效。红松是最优良的木本粮油树种，种粒含油量高，可以榨油，含有丰富的蛋白质、不 饱和脂肪酸及各种矿物质，因此还是很好的滋补品。王振宇【5 】等还研究发现松籽油具有 一定的调节血脂的作用。红松林区出产人参、贝母、天麻、鹿茸、五味子等名贵药材， 以及木耳、蘑菇、榛子、蜂蜜、山葡萄、野菜( 刺龙牙、蕨菜等) 均是有名的土特产品。 这些都为广泛开展林区副业活动提供了有利条件。 辽宁师范大学硕士学位论文 2ls s r 标记技术 2 1 l s s r 标记技术的概述 真核生物基因组d n a 由重复不等的序列组成，有些序列成簇集中在染色体d n a 的某些部位，如染色体的着丝粒或染色质。有些重复序列分散存在于基因的各个部位。 主要分3 类，分别为高度重复序列：如卫星d n a ( s a t e l l i t ed n a ) ；中度重复序列。 如：小卫星d n a ( m i n i s a t e l l i t ed n a ) ；低度重复序列：微卫星d n a ，又称简单重复 序列( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，s s r ) 或简单串联重复序列多态性( s h o r tt a n d e mr e p e a t p o l y m o r p h i s m , 简称s t r p ) 。重复序列仅2 6 个b p ，分布于常染色质。微卫星d n a 是真 核生物基因组重复序列中的主要组成部分，主要由串联重复单元组成，每单元长度在1 1 0 b p 之间，1 个s s r 的总长度可达几十到几百个b p 。每个微卫星d n a 都由核心序 列和侧翼序列组成，其核心序列呈串联重复排列。侧翼d n a 序列位于核心序列的两端， 为保守的特异单拷贝序列，能使微卫星特异地定位于染色体常染色质区的特定部位。s s r 两端有一段保守的d n a 序列。通过这段序列可以设计一段互补序列的寡聚核苷酸引物， 对s s r 进行扩增，s s r 多态性仅由简单序列的重复次数的差异引起，呈共显性遗传。 微卫星序列在生物个体之间具有高度的变异和高度的多态性，是基因组作图中一类重要 的分子标记。i s s r ( i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t ) 是在s s r 的基础上发展起来的，与 s s r - p c r 相比，i s s r - p c r 引物设计更为简单，应用更为方便删。 ， 2 2i s s r 标记技术的原理 i s s r 是一种以p c r 技术为基础的分子标记，由z i e t k i e w i c ze 【2 订等于1 9 9 4 年首先提 出，其基本原理就是在s s r 的3 或57 端加锚i - - - 4 个嘌呤或嘧啶碱基，然后以此为引 物，对两侧具有反向排列s s r 之间的一段d n a 序列进行扩增，而不是扩增s s r 本身， 然后进行电泳。根据条带的有无及相对位置，来分析不同样品之间i s s r 标记的多态性。 它在引物的设计上比s s r 技术简单得多，不需要知道d n a 序列，即可用引物进行扩增。 i s s r 技术的原理和操作与s s r 、r a p d 非常相似，但其产物多态性的丰富度远远优于 r f l p 、s s r 、r a p d ，可以提供更多的关于基因组的信息；由于其退火温度相对来说较 高，实验重复性也更好n 嘲。 黑龙江地区天然红松种群遗传多样性的i s s r 分析 5 3 5 螬镥定引钳3 麓铸定引静 5 越i c i 删芦i m 冒 3 棚a c b o m d 弭i m 薯 g 蜩e m m 姐e d n a d n a 舞高n n 一( c a ) , i 、，吗- 1 o 3 镥定引物的p ( ：鼢七镌 民：r 伽饯h ，c 乜o f3 鲫d 删珥蛔 5 麓馈定引物的p ( = r 产钧 l 弋泉朋旧锄o f5 缸耐阳晒 图2 1i s s r 扩增示意图 3 5 ， 注：在( c a ) n 两端锚定和n n n ，构成5 端锚定引物n n ( c a ) n 和3 端锚定引物( c a ) n n n n 。两 个引物( 不同箭头表示) 分别对基因组d n a 进行扩增，扩增片段为两个方向相反( c a ) n 重复单元 之间的区域，且p c r 产物长度不等。 f i g2 1 s c h e m a ti cd i a g r a mo fi s s r s s rp c r 【7 】 n o t e ：a ( c a ) ar e p e a t , a n c h o r e de i t h e ra tt h e3 w i t h ( n n n ) o ra tt h e5 e n dw i t h ( n n ) 2 su s e dt oa m p l y g e n o m i cs e q u e n c ef l a n k e db yt w oi n v e r s e l y ( c a ) ne l e m e n t 2 3i s s r 标记技术的步骤 2 3 1 引物设计 引物设计是i s s r 技术中最关键、最重要的一步。因此，引物应分别与待测d n a 的两端互补，为了扩增出单一的、特异性的d n a 片段，所设计的引物序列应位于基因 组d n a 的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。这样可减少引物与基因组的非特异 结合，提高反应的特异性。此外，引物长度以1 5 一- 3 0 b p 为宜，过短或过长均可使反应 的特异性下降。再者，内部之间不应该有互补序列，否则会形成发夹或引物二聚体结构， 影响p c r 产率。g + c 含量一般为4 0 - - - 6 0 。 2 3 2 模板 样本采集后，经过粗提与提纯，得到基因组d n a 。模板保存与2 0 1 2 冰柜内，分装 成小管，避免反复融冻对d n a 造成损伤。 辽宁师范大学硕士学位论文 2 3 3 反应体系 p c r 反应体系中包括引物、d n a 的模板、t a x i 酶，以及d n t p 、m ：9 2 + 、b u f f e r 缓冲 液，p h = 8 3 9 0 ；需要做预备试验优化p c r 条件，以获得清晰可重复易于统计的条带瞄】。 2 3 4 循环参数( 反应温度与时间) 在标准反应中，将模板d n a 加热至9 0 - 9 5 ，使双链d n a 变性，再快速冷却至 4 0 - - - 6 0 1 2 使引物退火并结合到互补靶序列上，然后升温至7 0 - - 7 5 ，在t a q d n a 聚合 酶的作用下渗入单核苷酸，使引物沿模板延伸。每一步的时间从反应达到要求的温度后 计算 2 3 - 2 4 。 2 3 5p o r 产物的检测和数据统计分析 p c r 产物由1 - 3 的琼脂糖凝胶电泳或6 p a g e 分离，经过e b 染色或者银染。 统计条带时有条带记作“1 一，无条带记作“0 ，对于不确定的模糊带记作“一最后 应用统计软件进行分析。 2 4l s s r 标记技术的应用 i s s r 技术由于引物较长，退火温度较高，增强了实验的可重复性，同时实验操作 简单、快速高效，而且i s s r 标记还可以揭示整个基因组的一些特征，并呈孟德尔式遗 传，因此该技术一问世，就在遗传分析中得到广泛应用，尤其是在植物遗传分析中。 2 4 1 遗传作图与基因定位 用遗传重组实验来确定真核生物染色体上连锁排列的一些基因间的相对位置，这种 方法就称作遗传作图。此方法由摩尔根的学生斯特蒂文特( s t u r t e v a a t ) 于1 9 1 3 年建立。 k o j i m a t 2 5 】等首先将i s s r 标记用于小麦遗传作图，目前已有桃【2 6 1 、大麦【2 7 】、橘子【2 8 1 用 i s s r 标记进行遗传作图。a m m i r a j u e 2 9 】等利用i s s r 技术找到了与小麦籽粒q t l 连锁的 分子标记，3 个标记与小种子性状连锁，4 个标记与大种子性状连锁。 2 4 2 亲缘关系和遗传多样性的研究 基因型不同的品种，或不同亲缘关系的物种，基因组内核苷酸序列存在差异，当使 用同一i s s r 引物对不同基因组体外扩增时，基因组上与引物互补的d n a 片段( 模板) 的数目、位点是不同的，因而其扩增产物的大小、数目也不同，亦即扩增产物便显出多 态性。当使用一系列不同的i s s r 引物扩增时，这种多态性更加丰富。这种扩增产物的 多态性反映了被测材料的遗传多样性。江树业等【3 0 1 以光敏核不育水稻“农垦5 8 s 及其 黑龙江地区天然红松种群遗传多样性的i s s r 分析 原始株“农垦5 8 核d n a 为模板，进行了i s s r 多态性分析。结果表明，在可扩增的 7 8 个i s s r 引物中，7 个i s s r 引物的扩增产物表现出d n a 多态性。 进一步通过i s s r 标记与其他遗传分析手段，还可以对不同亲缘物种间的分类、遗 传距离、系统发育、亲缘关系等进行研究。b l a i r 等【3 l 】在水稻研究得出的遗传差异表明， i s s r 标记可以在亲缘关系较近的品种间检测遗传变异，评估不同品种间的异质性。 2 4 3 分子标记辅助育种 植物育种中分子标记辅助选择是通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记来判断 目标基因是否存在的。通过i s s r 分析可筛选出与目标基因( 性状) 紧密连锁的d n a 片段，作为辅助育种的分子标记。利用分子标记不仅可以定位目标基因，也可以利用与 目标基因连锁的分子标记追踪目标基因。应用这些分子标记进行间接选择，将得到事半 功倍的作用。目前利用i s s r 筛选出的目标基因有镰孢菌抗性基因等【3 2 】 辽宁师范大学硕士学位论文 3 实验材料与方法 3 1 实验材料 所用材料采集于黑龙江省生态保护区，共采集到1 3 个红松种群，选取其中的样本 2 3 8 个( 表3 1 ) 。取刚萌发的幼叶用保鲜袋封好于叫条件下带回实验室，2 0 保 存备用。 表3 1 ：本研究中红松各种群的采集地 t a b 3 1 ：l o c a t i o na n ds a m p l es i z eo f p i n u sk o r a i e n s i ap o p u l a t i o n si np r e s e n ts t u d y 3 2 实验试剂及仪器 3 2 1 试剂 u b c 引物1 3 个( 大连宝生物公司合成) 黑龙江地区天然红松种群遗传多样性的i s s r 分析 t a qd n ap o l y m e r a s e 、b u f f e r ( m 9 2 + f r e e ) 、d n t pm i x t u r e 、m g c l 2 ( 2 5m m o l l - 1 ) 、 6 l o a d i n gb u f f e r 、d l l 5 0 0 0 、d l 2 0 0 0 等( 大连宝生物公司) c t a b 提取缓冲液p h = 8 0 ( h e x a d e c y lt r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e ；c e t r i m o n i u m b r o m i d e ) ； c t a b ( 十六烷基三甲基溴化铵) ：2 0 9 ； t r i s ( 三羟甲基氨基乙烷) ：10 0m m o l l 1 。提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； n a e l ( 氯化钠) ：1 4m m o l l - 1 。提供一个高盐环境，使d n p 充分溶解，存在于液 相中； e d t a ( 7 - - 胺四乙酸) ：2 5m m o l l 。螯合m 9 2 + 或m n 2 + ，抑制d n a s e 活性； p v p ( 聚乙烯吡咯烷酮) ：2 w v ； p - 巯基乙醇：l m l ( 最后加入) 。有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 基因组d n a 。 以上六组份定容至1 0 0 0 m l 。 7 5 乙醇：无水乙醇7 5 0 m l ，双蒸水定容至1 0 0 0 m l c i 溶液氯仿：异戊醇- 2 4 ：1 t e1 0m m 0 1 l t r i s1m m 0 1 l 1e d t ap h = 8 0 蛋白酶kd l 2 0 0 0 ，d l l 5 0 0 0m a k e r 购于大连宝生物公司 液氮 1 0 1 1 3 ep h = 8 o 作用：主要是维持合适的p h ，另外是使溶液具有一定的导电性，以利于d n a 分子 的迁移。 特点：缓冲能力强，长时间电泳时可选t b e ，并且用于电泳小于l k b 的片段时分离 效果更好。t b e 用于琼脂糖凝胶电泳时易造成高电渗作用，并且因与琼脂糖相互作用生 成非共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使d n a 片段的回收率降低，所以不宜在回收电 泳时使用。 组分：t r i s 1 0 8 9 硼酸 5 5 9 e d t a 7 9 4 5 9 ( m 9 2 + 的螯合剂，防止电泳时激活d n a 酶以及放置 m g + 离子与核酸生成沉淀的作用) 以上三组定容至1 0 0 0 m l 辽宁师范大学硕士学位论文 3 2 2 仪器 冷冻离心机 琼脂糖凝胶电泳系统( 北京六一) 凝胶成像系统( 日本柯达) a p c r 仪( 杭州博日科技有限公司t c 9 6 g h ( b ) ) 研钵，恒温水浴箱，加样器 快速混匀器( 江苏金坛医疗器械厂s k - i ) 2 0 冰柜 d k d y 6 2 0 s 稳流稳压电泳仪( 南京新校园生物技术研究所) 电子天平 3 3 实验方法 3 3 1 红松总d n a 的提取 只有提取较高质量的总d n a ，才能在以后p c r 扩增中得到清晰稳定的条带，使本 研究顺利进行。本研究采用张恒庆等【5 】的实验方法提取红松总d n a ，具体操作如下： ( 1 ) 取样。从2 0 冰柜中每次取出一个样品，记录编号，快取快放回。 ( 2 ) 研磨。选取较嫩的松针部分约2 0 0 r a g ，放入研钵中，倒入液氮，液面刚没过 样品即可。用力多方向快速研磨至细粉末状。液氮的作用是使材料在冷冻状态下研磨脆 化，并且破碎细胞壁，迅速释放细胞内含物，其次抑制核酸水解酶的活性，防止d n a 酶降解。 ( 3 ) 水浴。将记录好对应编号的离心管内加入5 m l6 0 预热的c t a b 提取缓冲液， 用擦拭干净的药匙取2 3 匙粉末状样品，放入离心中，颠倒摇匀，再放入6 0 恒温水浴 箱内，保温3 0 分钟，并每间隔3 5 分钟摇晃一次。 ( 4 ) 加c i 。加入等体积的c i 溶液，颠倒混合3 0 分钟。 ( 5 ) 离心。配平，继而4 c 5 0 0 0 9 离心l o 分钟。 ( 6 ) d n a 的析出。小心吸取离心管上清，加入2 倍体积的4 c 预冷无水乙醇，充 分混匀直至出现絮状d n a 沉淀，4 放置2 0 分钟。 ( 7 ) 离心。4 c1 0 0 0 0 9 ，离心1 0 分钟，沉淀d n a 。 ( 8 ) 清洗沉淀。用7 5 乙醇清洗d n a 沉淀2 次，在室温下干燥后将其溶于5 0 0 t l t e 溶液中，4 c 备用。 黑龙江地区天然红松种群遗传多样性的i s s r 分析 3 3 2d n a 浓度检测 ( 1 ) 电泳。将5 此粗提d n a 溶液与2 1 x l6 x l o a d i n gb u f f e r 混匀，点入含0 5 m g m l e b 的0 8 琼脂糖凝胶孔中，再在中间的孔处点入作为标准分子量的d l l 5 0 0 0 m a k e r ， 电泳约l h ，电压i o o v ( 2 ) 成像。将胶板小心放入紫外凝胶成像仪内，根据点样孔中荧光强弱估计d n a 纯度及样品有无s m e a r 现象。 3 3 3 模板d n a 的纯化 ( 1 ) 除残余蛋白。向5 0 0 1 x l 粗提d n a 中加入4 此蛋白酶k ，3 7 水浴保温9 0 m i n 。 ( 2 ) 补充等体积的c i 溶液轻轻颠倒混匀5 0 m i n 。配平，4 。c 9 0 0 0 9 离心1 0 m i n 。 ( 3 ) 小心吸取上清，再加入c i 重复抽提1 次。重复上一步骤2 次，继续抽提纯化。 ( 4 ) 沉降d n a 。上清液加入等体积的2 0 c 的无水乙醇，4 c1 0 0 0 9 ，离心5 m i n 。 ( 5 ) 用7 5 乙醇清洗d n a 两次，倒净乙醇，室温下干燥d n a 。 ( 6 ) 保存。干燥后的d n a 溶于2 0 0 p l 0 1x t e 中，短期保存置于4 c 冰箱中备用， 长期保存置于2 0 或8 0 冰柜中。 3 3 4 红松ls s r 引物的筛选 本研究采用的引物是根据加拿大哥伦比亚大学公布的序列 ( h t t p ：l l w w w b i o t c c h u b c c a s e r v i c e s n a p s p l r i m e r s p r i m e r s p d f ) 设计