（遗传学专业论文）调控过氧化物酶体生物合成与增殖的mirna分析与鉴定.pdf

摘要 摘要 m i c r o r n a ( m i r n a ) 是一类小分子非编码r n a ，长度为1 7 2 5 个核苷酸， 主要在转录后水平参与基因调控。它们在细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、形 态建成、个体发育、激素分泌与信号转导等一系列生命活动中起重要作用。过 氧化物酶体是由一层单位膜包裹的囊泡状细胞器，参与多种代谢过程，是细胞 中极为重要的细胞器。过氧化物酶体的生物合成与增殖受到过氧化物酶体增殖 激活物受体( p e r o x i s o m ep r o l i f e r a t o r - a c t i v a t e dr e c e p t o r , p p a r ) 和p e x 基因家族的 调控，这些基因突变或表达异常，会导致脑肝肾综合症、新生儿脑白质营养不 良等严重疾病。因此，深入研究过氧化物酶体生物合成与增殖的分子基础，揭 示其调控机制，对于阐明过氧化物酶体生物合成与增殖的调控网络具有重要意 义。 本研究以过氧化物酶体生物合成与增殖相关的p e x 基因和p p a r 基因的 m r n a 为靶分子，利用t a r g e t s c a n 、m i r a n d a 、m i c r o c o s mt a r g e t s 、p i c t a r 等四 种m i r n a 靶位点分析软件，预测可能靶向这些m r n a 的m i r n a s ，然后用双萤 光素酶报告基因法( d u a l 1 u c i f e r a s ea s s a y ss y s t e m ) 对软件预测结果进行实验验证， 结果小结如下： 1 、以1 1 个p e x 家族成员o e x l 、p e x 2 、p e x 3 、p e x 5 、p e x 6 、p e x 7 、 p e x l 0 、p e x l 2 、p e x l 3 、p e x l 6 、p e x l 9 ) 和3 个p p a r 基因( p p a r a 、p p a r g 、 p p a r b ) m r n a 的3 u t r 为靶序列，利用四种m i r n a 靶位点分析软件搜索可能 调控这些转录物的m i r n a 。其中，t a r g e t s c a n 预测到的m i r n a 有1 7 5 个，m i r a n d a 预测到的有3 8 4 个，m i c r o c o s mt a r g e t s 预测到的有5 5 9 个，p i c t a r 预测到的有 4 4 个。在m i r n a 中，至少被2 种以上软件预测到的有1 2 9 个，被3 种以上软件 预测到的有2 6 个，被4 个软件预测到的有4 个。 在1 2 9 个被2 个以上软件预测到的m i r n a 中，可能调控p e x l 的有4 个， 可能调控p e x 3 的有1 8 个，可能调控p e x 5 的有2 2 个，可能调控p e x 6 的有1 3 个，可能调控p e x 7 的有3 1 个，可能调控p e x l 2 的有3 个，可能调控p e x l 3 的有7 个，可能调控p e x l 9 的有4 个，可能调控p p a r a 的有1 3 个，可能调控 p p a r g 的有1 4 个，未发现可能调控p e x l 、p e x 2 、p e x l 0 、p e x l 6 、p p a r b 的m i r n a 。 摘要 2 、利用m i r b a s e 数据库，分析2 6 个至少被3 个软件预测到的m i r n a 的保 守性，发现大部分m i r n a 都很保守，例如m i r - 1 9 a b 、m i r - 1 5 a b 、m i r - 1 6 、m i r - 2 9 a b 等在至少2 0 种以上的后生生物中存在。 3 、通过文献挖掘，发现m i r - 1 5 a 、m i r - 1 6 、m i r - 1 9 a 、m i r - 2 7 a 、m i r - 2 9 a 、m i r - 1 9 5 、 m i r - 3 0 1 等的组织表达特异性与候选靶基因的呈正相关，因此迸一步用实验方法 验证这些m i r n a 的功能。 4 、在鼠胚胎神经干细胞( m o u s ee m b r y o n i cn e u r a lp r o g e n i t o rc e l l ，m e n p c ) 中共表达候选m i r n a 与携带候选靶基因3 u t r 序列的双萤光素酶报告基因， 利用d u a l 1 u c i f e r a s ea s s a y ss y s t e m ，分析海肾萤光素酶+ ( r l u c ) 报告基因的表达 水平，发现m i r - 1 9 a 能够下调携带有p p a r a 3 u t r 区域的r l u c 表达；m i r l s a 和 m i r l 6 1 能够下调携带有p e x l 3 3 u t r 区域的r l u c 表达；m i r 2 9 a 能够下调携带 有p e x 5 3 u t r 区域的r l u c 表达；m i r - 2 7 a 能够下调携带有p p a r g - 3 u t r 区域的 r l u c 表达。 以上结果提示我们，m i r n a 可能参与了过氧化物酶体生物合成与增殖过程 的调控，并可能通过靶向转录因子p p a r ，从而调节脂肪细胞分化、脂类代谢、 糖代谢等生命活动。 本研究为进一步探讨m i r n a 在过氧化物酶体的生物合成和增殖中的作用和 调控机制奠定了基础，并为开发新的过氧化物酶体疾病治疗方案提供了新的思 路。 关键词：m i r n a ，p e r o x i n , p p a r , 生物信息学预测，荧光素酶报告基因 i i a b s t r a c t a b s t r a c t m i r n a sa r es m a l ln o n c o d i n gr n a sw i t h17 - 2 5n u c l e o t i d e si nl e n g t ha n d b e l i e v e dt ob ei n v o l v e di nab r o a dr a n g eo fb i o l o g i c a lf u n c t i o n , i n c l u d i n gc e l l p r o l i f e r a t i o n ，c e l ld i f f e r e n t i a t i o n ，c e l la p o p t o s i s ，d e v e l o p m e n t ，r e s p o n s e st od i s e a s e s a n ds i g n a lt r a n s d u c t i o n ，b yb a s e - p a i r i n gw i t hc o m p l e m e n t a r ys i t e so ft a r g e tt r a n s c r i p t t on e g a t i v e l yr e g u l a t eg e n ee x p r e s s i o na tt h ep o s t t r a n s c r i p t i o n a ll e v e l p e r o x i s o m e s a r eu b i q u i t o u se u k a r y o t i co r g a n e l l e si n v o l v e di nv a r i o u so x i d a t i v er e a c t i o n s t h e b i o g e n e s i s a n d p r o l i f e r a t i o n o f p e r o x i s o m e a r e r e g u l a t e db y p e r o x i s o m e p r o l i f e r a t o r - a c t i v a t e dr e c e p t o r ( p p a r ) f a m i l ya n dp e x ( e n c o d i n gp e r o x i n ) g e n e f a m i l y m u t a n to ra b e r r a n te x p r e s s i o no ft h e s eg e n e sw i l ll e a dt o d i s o r d e ro f p e r o x i s o m eb i o g e n e s i sa n dv a r i o u ss e r i o u sd i s e a s e s t h eb i o g e n e s i sa n dp r o l i f e r a t i o n o fp e r o x i s o m ea r er e g u l a t e di nv a r i o u sw a y s ，b u ti ti ss t i l laq u e s t i o nt h a tw h e t h e r m i r n a si n v o l v e di n i nt h i ss t u d y , w eu s e dab i o i n f o r m a t i c sa p p r o a c ht oi d e n t i f yc o n s e r v e dm i r n a s w h i c hc a nc o m p l e m e n tw i m3 u n t r a n s l a t i o nr e g i o no ft a r g e tt r a n s c r i p t si n v o l v e di n p e r o x i s o m eb i o g e n e s i s a n d p r o l i f e r a t i o n ，t h e s e m i r n a sw e r ev a l i d a t e d b y d u a l l u c i f e r a s er e p o r t e rs y s t e m t h ef o l l o w i n gi st h es u m m a r i z a t i o no fo u rr e s u l t ： 1 、a f t e ru s i n gf o u rk i n d so fm i r n at a r g e tp r e d i c ts o f t w a r et oa n a l y z e11m e m b e r s o f p e xf a m i l y ( p e x l ，p e x 2 ，p e x 3 ，p e x 5 ，p e x 6 ，p e x 7 ，p e x l 0 ，p e x l 2 ， p e x l 3 ，p e x l 6 、p e x l 9 ) a n d3m e m b e r so fp p a rf a m i l y ( p p a r a ，p p a r g ， p p a r b ) ，w ef o u n dn u m e r o u sm i r n a ：m r n ab a s e p a i r i n gi nt h e3 u t ro ft h e s e g e n e s ：1 3 7m i r n a s w a s p r e d i c t e db yt a r g e t s c a n , 1 4 1m i r n a s w a sp r e d i c t e db y m i c r o c o s mt a r g e t s ，3 0 6m i r n a sw a sp r e d i c t e db ym i r a n d a ，4 4m i r n a sw a s p r e d i c t e db yp i c t a r a m o n gt h e s er e s u l t s ，12 9b a s e p a i r i n go fm i r n a sa n dt h e i r t a r g e t sp r e d i c t e db yt w os o f f w a r e s ，2 6b a s e - p a i r i n go fm i r n a sa n dt h e i rt a r g e t s p r e d i c t e db yt h r e es o f f w a r e s ，4b a s e - p a i r i n go fm i r n a sa n dt h e i rt a r g e t s p r e d i c t e db yf o u rs o f f w a r e s i no u rr e s u l t e s ，4b a s e p a i r i n gw a sf o u n di np e x l ，1 8 i np e ) ( 3 ，2 2i np e x 5 ，1 3i np e x 6 ，3 1i np e x 7 ，3i np e x l 2 ，7i np e x l 3 ，4i np e x l 9 ，1 3 i np p a r a ，14i np p a r g n ob a s e p a i r i n gd e t e c t e di nt r a n s c r i p t so fp e x1 、p e x 2 、 i i i a b s t r a c t p e x l 0 、p e x l 6a n dp p a r b 2 、u s i n gm i r b a s et oa n a l y z et h ec o n s e r v a t i s mo f2 6m i r n a sp r e d i c t e db yt h r e e s o f t w a r e ，w ef o u n dt h a tm o s to ft h e ma r ec o n s e r v e d ，s u c h 嬲m i r - 19 怕、 m i r - 1 5 a b 、m i r - 1 6 、m i r - 2 9 a ba r ec o n s e r v e di n2 0s p e c i e so f m e t a z o a n 3 ，b a s e do nl i t e r a t u r em i n i n g 。w ef o u n dm i r - 15 a ，m i r - 16 ，m i r - 19 a ，m i r - 2 7 a ，m i r - 2 9 a ， m i r - 19 5 、m i r - 3 01e t cw e r ep o s i t i v ec o r r e l a t e dw i t ht h e i rt a r g e tm r n a ，a n dt h e s e m i r n a sw e r ei d e n t i f i e de x p e r i m e n t a l l y 4 、a f t e rc o - t r a n s f e c t i n go fm i r n a se x p r e s s i o nc o n s t r u c t sa n dp s i c h e c k 2 t a r g e t 3 u t rc o n s t r u c t st om e n p c ，t h ea c t i v i t yo fr e n i u al u c i f e r a s ew a sm e a s u r e db y g l o m a x t m m u l t i + a n df i r e f l yl u c i f e r a s ew a su s e da si n t e r n a lc o n t r o lt on o r m a l i z e r e n i l l al u c i f e r a s ed a t a 1 1 1 er e s u l t e ss h o w e dt h a t ：m i r - 19 ac a nd o w nr e g u l a t e p p a r a ；m i r - 15 aa n d m i r - 1 6 - 1c a nd o w nr e g u l a t ep e x l 3 ；m i r - 2 9 ac a nd o w nr e g u l a t ep e x 5 ；m i r - 2 7 ac a n d o w nr e g u l a t ep p a r g ，s u g g e s t i n gt h a tm i r n a sa r ei n v o l v e di nt h eb i o g e n e s i sa n d p r o l i f e r a t i o no fp e r o x i s o m e o u rw o r k sl a i dt h ef o u n d a t i o no f u n c o v e r i n go f t h ef u n c t i o na n dm e c h a n i s m a b o u tm i r n ai nt h eb i o g e n e s i sa n dp r o l i f e r a t i o no fp e r o x i s o m e ，a n dm a k ean e w t h i n k i n ga b o u tt h ed e v e l o p m e n to ft h e r a p yo fp e r o x i s o m e - b i o g e n e s i sd i s o r d e r s k e yw o r d s m i r n a ，p e r o x i n ，p p a r ，b i o i n f o r m a t i cp r e d i c t i o n ，d u a l l u c i f e r a s e r e p o r t e r i v 目录 目录 第一章前言l 1 1 引言l 1 2m i r n a 的生物学特点与合成机制1 1 2 1m i r n a 的基因组位置与结构。2 1 2 2m i r n a 合成的一般过程2 1 2 3 动植物中m i r n a 合成的差异3 1 3 m i r n a 的功能3 1 3 1m i r n a 的作用机制3 1 3 2m i r n a 的功能4 1 4m i r n a 靶位点分析与鉴定6 1 4 1 计算机分析m i r n a 靶位点的原理与应用6 1 4 2m i r n a 靶位点的鉴定7 1 5 过氧化物酶体与过氧化物酶体疾病8 1 5 1 过氧化物酶体8 1 5 2 过氧化物酶体生物发生与增殖9 1 5 3 过氧化物酶体相关疾病1 1 1 6 本论文的研究目的与意义1 l 第二章材料1 3 2 1 使用的数据库及分析软件13 2 2 细胞和质粒l4 2 3 实验动物。16 2 4 主要仪器设备1 6 2 5 试剂与耗材1 7 2 6 引物序列18 第三章方法2 0 3 1调控过氧化物酶体生物发生与增殖的m i r n a 预测2 0 v 目录 3 1 1 选择调节过氧化物酶体生物合成与增殖的基因作为研究对象2 0 3 1 2m i r n a 靶位点确定2 0 3 1 3预测结果的可靠性分析2 0 3 1 4 候选m i r n a 与候选靶基因的组织表达特异性相关性分析2 0 3 2 预测结果的实验验证2 1 3 2 1m i r n a 表达载体构建2 1 3 2 2 构建携带靶基因3 u t r 的p s i c h e c k 2 质粒。2 4 3 2 2 细胞培养2 9 3 2 3 转染m e n p c 细胞3 0 3 2 4 利用双萤光素酶报告系统检测m i r n a 对携带靶位点序列的萤光 素酶报告基因表达的影响3 0 第四章结果与分析3 1 4 1 调控过氧化物酶体生物合成与增殖的m i r n a 预测3 l 4 1 1 m i r n a 靶位点确定。31 4 1 2 靶位点保守性分析3 5 4 1 3 预测结果的可靠性分析3 9 4 1 4 候选m i r n a 与候选靶基因的组织表达特异性相关性分析4 0 4 2m i c r o 表达载体构建4 1 4 2 1m i r n as t e m l o o p 序列扩增4 l 4 2 2 茵落p c r 鉴定m i r n a 表达载体4 1 4 2 3m i r n a 表达载体测序4 2 4 3 携带靶基因3 u t r 的p s i c h e e k - 2 质粒构建4 4 4 3 1 小鼠基因组d n a 提取4 4 4 3 2 靶序列扩增_ 4 5 4 3 3 菌落p c r 鉴定各p m d 1 9 u t r 阳性克隆4 6 4 3 4 阳性克隆测序鉴定4 6 4 3 5 酶切验证阳性p s i c h e c k 2 重组质粒4 7 4 4 报告基因检测4 7 第五章讨论。：4 9 v l 目录 5 1过氧化物酶体生物合成与增殖在细胞中可能受到m i r n a 的复杂调控 z 1 9 5 2 计算机预测是m i r n a 功能研究的重要方法4 9 5 3m i r n a 靶位点预测应考虑m i r n a 与靶基因的表达变化相关性5 0 致谢5 5 参考文献5 6 攻读学位期间的研究成果5 9 v i i 第一章前言 第一章前言 1 1引言 m i r n a s ( m i r n a s ) 是一类长约2 2 n t 的非编码r n a ，广泛存在于各种后生生物 中【1 1 。m i r n a 与靶m r n a 通过碱基互补配对结合，降解m r n a 或抑带i j m r n a 的翻 译，从而调控基因表达。m i r n a s 的生物功能非常广泛，预计人有三分之一的基 因是受到m i i a s 调控的【2 1 。已证实m i r n a s 涉及到细胞周期调控、个体发育、细 胞分化、肿瘤发生、表观遗传、免疫应答、干细胞多能性维持、物质代谢等多 种重要生命活动。2 0 0 3 年x u 等在果蝇中发现m i r - 1 4 与两种脂肪酸甘油三酯和 甘油二酯的水平呈反比【3 】。2 0 0 6 年，又有学者发现在脂肪细胞分化过程中也出现 了m i i 矾a 表达谱变化【4 】。以上结果表明，m i r n a s 在脂肪代谢中有重要作用。 脂代谢中，超长链脂肪酸无法进入线粒体，需要先被氧化成较短的脂肪酸， 这个过程发生在过氧化物酶体( p e r o x i s o m e ) q b 。过氧化物酶体是一种有单层膜结 构的球状细胞器，属于微体家族( m i c r o b o d yf a m i l y ) 。绝大多数生物都具有过氧化 物酶体，其功能存在种属差异和细胞类型差异，但均具有三个基本功能：长链 脂肪酸氧化、抗氧胁迫作用、分解过氧化氢等有毒过氧化物。当过氧化物酶体 生物合成与增殖出现缺陷时，会引起诸如脑肝肾综合症、肢根软骨发育不良、 新生儿脑白质营养不良等一系列严重的疾病【5 j 。因此，深入研究过氧化物酶体生 物合成与增殖过程的分子机制，有助于寻找新的药物靶点以治疗过氧化物酶体 合成紊乱性疾病。 m i r n a s 在脂代谢中的作用深远，但对于过氧化物酶体生物合成与增殖的调 控作用和机制目前尚未见报道。本研究尝试通过生物信息学分析，筛选并鉴定 调控过氧化物酶体生物合成与增殖的m i r n a s 及其靶位点，揭示m i r n a s 对过氧 化物酶体生物发生与增殖的调控机制，为进一步阐明过氧化物酶体生物合成与 增殖的分子机制提供一条新的途径。 1 2m i r n a 的生物学特点与合成机制 1 9 9 3 年，l e e 等在线虫中发现了一个可以调节发育时序的小分子r n a ：l h 卜4 ， 其长度为2 2 n t t 6 1 。l i n - 4 在线虫幼虫l 1 后期表达，抑制了其靶r m r n a ：l n l 4 的翻 第一章前言 译，推动线虫幼虫自l l 向l 2 期转化。当时人们认为l i n 4 是唯一的内源性小砌蛆， 直至u 2 0 0 0 年才有人发现了第二个此类小砌叮a ：l e t 7 ，它能促进线虫幼虫向成虫转 变1 7 。此后，人们在各种真核生物中发现了数百个类似的小r n a ，其作用涉及到 细胞分化调控、细胞周期调控、物质代谢、肿瘤发生等等。这种小对临，作用 非常广泛，序列高度保守，其表达具有时空特异性。因其长度在1 7 - 2 5 n t 之间， 故被称为m i c r o r n a ( m i r n a ) 。 1 2 1m i r n a 在基因组中的位置及结构特点 目前在各物种中发现的全部m i r n a 基因有1 0 8 8 3 个( m i r b a s ev 1 4 0 ) ，按其相 对于蛋白编码基因的位置可分为2 类：一类m i r n a 基因位于两个蛋白编码基因之 间，称为基因问m i r n a ，大部分的m i r n a 属于此类：另一类m i r n a 位于蛋白编 码基因的内含子中，称为内含子m i r n a ，约有1 4 的m i r n a 属于此类。基因间 m i r n a 有独立的启动子，而内含子m i i 矾a 则与宿主基因共用一个启动子，因此 与其宿主基因表达谱具有一致性。无论是基因间m i r n a 还是内含子m i r n a ，它 们的成熟体都具有类似的结构：长约1 7 2 3 n t 的单链，具有3 - o h 和5 p ，3 端核 苷酸具有u 偏好等等，说明它们的合成与加工过程是相同的。 1 2 2m i r n a 合成的一般过程 m i r n a 的合成有以下5 个步骤： 第一，m i r n a 基因被转录出来成为p r i m i l a 。m i r n a 的转录需要r n a 聚合酶i i 和或i i i 【8 ，9 1 。内含子m i r n a 是由r n a 聚合酶i i 转录产生，这与其所 处的基因组位置一致。基因间m i r n a 的转录过程则尚不清楚，无论是r n a 聚 合酶i i 还是i i i 都有相应的证据支持。而且给m i l 埘a 加上聚合酶i i i 的启动子， 不会影响m i 砌q a 的转录和功能，因此有观点认为p r i m i r n a 由哪个r n a 聚合 酶转录与m i r n a 加工成熟以及行使功能并无关联。 第二，p r i m i r n a 被加工成具茎环结构的大小约8 0 1 2 0 n t 的单链r n a ，称 为p r e - m i r n a 。该过程发生在细胞核中，由微处理体进行加工。微处理体主要 成分包括d r o s h a 和p a s h a ，前者具有r n a 酶i i i 活性i l o 】，能将p r i m i r n a 切割 成3 有2 m 突出的茎环结构，即p r e m i r n a 。p a s h a ( p a r t n e r o f d m s h a ) 又名d i g e o r g e 综合症关键区域8 ( d g c r 8 ) ，是一种双链r n a 结合蛋白，它识别v r i m i r n a 并 帮助其在微处理体中定向【1 1 】。必须注意的是，d r o s h a 蛋白切割位点具有一定特 2 第一章前言 异性，它的活性依赖于p r i m i r n a 茎环结构的序列、茎环结构基部二级结构以 及茎环结构基部周围1 2 5 n t 左右范围内的序列【1 2 。因此p r i m i r n a 加工位点的 特异性在其转录后便已决定了。 第三，p r e m i r n a 通过e x p o r t i n 5 转运出核【1 3 1 4 1 。e x p o r t i n 5 是一种依赖于 r a n g t p 的核转运蛋白，能识别在3 端具有2 n t 突出的且 1 4 b p 的r n a 双螺旋 结构。该蛋白与r n a 的结合不具有序列特异性，因此其能将t r n a 、s h r n a 、 p r e m i r n a 以及腺病毒v a lr n a 等具有此类结构的r n a 从核中转运到细胞质 中。 第四，d i c e r 切割p r e m i r n a ，产生1 7 - 2 5 n t 的成熟m i r n a 1 5 。1 7 】。转运至细 胞质中的p r e m i r n a ，被具r n a 酶i i i 活性的d i c e r 蛋白识别并切割成为3 有 2 n t 突出、5 端磷酸化的d s r n a 。d s r n a 的两条链中，在转录组中稳定存在的单 链，称为m i r n a ，另外一条单链稳定性不高，称为m i r n a * 1 8 】。一般认为m i r n a * 会被降解，但近来有人发现m i r n a * 也可以被a g o 蛋白结合，发挥基因调控功 能1 1 9 1 。 最后，成熟的m i p n a 与a r g o n a u t e 蛋白结合，组装成r n a 介导的沉默复合 体( m q a i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x ，r i s o ，执行相关功能【2 们。 1 2 3 动植物中m i r n a 合成的差异 植物m i r n a 合成过程与动物中的大同小异：都需要先转录出p r i m i r n a ， 然后被加工成茎环结构的p r e m i r n a ，继而形成双链的m i r n a ：m i r n a * - - 聚体， 最后产生成熟的单链m i r n a 。不过植物中并不存在d r o s h a 或其类似物， p r i m i r n a 的加工是依靠d i c e r 的同源物d c l l 进行的【2 1 1 。而将p r e m i r n a 切割 成d s r n a 的过程，也是在核中由d c l l 执行的。之后，由h e n l 将d s r n a 的3 端加上2 - o c h 3 【2 2 1 ，这种d s r n a 被e x p o r t i n 5 的同源物h a s t y 识别而转运出核 【2 3 1 。 1 3m i r n a 的功能 1 3 1m i r n a 的作用机制 目前发现m i r n a s 主要在转录后水平调节基因的表达，新近也有人发现 m i r n a 能通过直接介导d n a 甲基化而在转录水平调节基因表达【2 4 】。 3 第一章前言 m i r n a 一般与靶m r n a 的3 u t r 结合，进行转录后调控。主要作用机制 有两种：m r n a 降解和翻译抑制。采取哪种机制，取决于m r n a 和m i r n a 碱 基互补配对的程度：如果m i r n a 与m r n a 完全互补，则导致m r n a 被降解： 如果m i r n a 与m r n a 不能完全互补，则导致m r n a 的翻译被抑制1 2 引。 植物中绝大部分的m i r n a 是通过与靶位点完全互补来指导m r n a 的降解 来调节基因表达的，且其靶位点散布于整个m r n a ，而不仅仅是在3 u t r 上。 比如m i r - 1 7 2 在a p 2 基因m r n a 上的靶位点定位在c d s 区而非3 u t r ，且与靶 位点序列完全互补却引起翻译抑制【2 6 ，2 刀。动物中m i r n a 主要是通过与靶m r n a 不完全互补，形成m i r n a ：m r n a 复合体来抑制翻译，但并不影响m r n a 的水 平。 上述过程的具体机制未能彻底揭示，但已知该机制是由r n a 诱导的沉默复 合物( r n a i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x ，r j s c ) 完成的，其成分尚未完全解析。通 过免疫共沉淀生物素标记的s i r n a ，m a r t i n e z 等发现a r g o n a u t e ( a g o ) 蛋白是 r i s c 成分之一 2 8 】。a g o 蛋白家族是一个高度保守的家族，具有两个特征结构 域：r n a 酶h 活性结构域p i w i 和小r n a 识别结构域p a z l 2 引。m i r n a 的3 端 插入p a z 结构域的沟中，其余部分与靶位点结合，引导m r n a 接近p i w i 结构 域而被切割。针对a g o 进行紫外交联免疫沉淀( c r o s s l i n k i n g i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ) 实验的结果表明，m i r n a 参与形成m i r n a ：a g o ：m r n a 三 聚体的部分主要是5 端2 7 位碱基【3 0 l 。该区域与之前计算机分析得出的m i r n a 的种子区( s e e dr e g i o n ) - - 致，计算机分析发现该区域在m i r n a ：m r n a 配对中特 别保守，是m i r n a 识别并结合靶位点所必须的。 1 3 2m i r n a 的功能 1 、m i r n a 与生物发育 m i r n a 最早被发现的功能是调节动物的生长发育。比如最早发现的两个 m i r n al n 一4 和l e t - 7 ，分别推动线虫从l 1 向l 2 变化以及从幼体向成体转变【6 , 7 1 。 在果蝇中，b a n t a m 基因产生一个类似于线虫m i r - 8 0 8 2 的m i r n a ，能抑制h i d m r n a 的翻译 3 h 。h i d 是细胞凋亡的主要激活因子，因此b a n t a m 通过下调h i d 而抑制果蝇幼虫中的细胞凋亡，并促进细胞增殖。m i r n a 参与了神经系统发育 调节，如斑马鱼中一半左右的m i r n a 在中枢神经系统中存在时空特异表达。比 如斑马鱼m i r - 2 0 0 家族调节了嗅神经发生，该家族的缺失，会产生类似敲除d i c e r 4 第一章前言 的结果，使得嗅神经前体细胞无法最终分化为嗅神经细胞【3 2 1 。脊椎动物中m i r n a 对发育的调控很普遍，d e e p a ks r i v a s t a v a 等人发现，m i r 1 2 在心肌中特异表达， 将其删除后，小鼠会产生一种常见的先天性心脏发育疾病：心室中隔缺损 ( v e n t r i c u l a rs e p t a ld e f e c t ) ，并且导致心脏的传导功能受损，且m i r - 1 1 的表达也 无法补救m i r 1 2 缺陷表型【3 3 1 。人脂肪干细胞的分化也受到m i r n a 的调控，下 调m i r 1 4 3 会阻碍脂肪细胞特异基因表达，并伴随脚 5 蛋白水平上升，该蛋 白是e r k 5 m a p k 信号通路成分，对于细胞的增殖和分化是必须削3 引。 m i r n a 对于植物的生长发育也具有极为重要的价值，比如拟南芥中具有 g r a s 结构域的s c l ( s c a r e c r o e l i k e ) 转录因子家族成员如s c l 6 i i 、s c l 6 i i i 和s c l 6 i v 就是m i r l 7 1 的靶分子，m i r o l 7 1 通过调节这些转录因子来控制花 的发育和根系发育1 3 5 。 2 、m i r n a 与细胞周期调控 细胞从一次有丝分裂结束，到下一次有丝分裂结束所需要的时间，称为细 胞周期。细胞周期是一个被精确调控的过程，多种m i r n a 参加了这个过程，其 突变很可能导致细胞凋亡或发生肿瘤。e 2 f 作为细胞周期关键因子，与m i r n a 存在相互作用。比如m i r 1 7 9 2 基因簇成员m i r 2 0 a 和m i r - 1 7 5 p ，它们均靶向一 e 2 f ，而e 2 f 又能激活m i r 1 7 9 2 基因簇。由此二者形成一个反馈环，通过防止 e 2 f 异常积累而精密调控增值信掣蚓。 多能干细胞自我更新能力的维持也有赖于m i r n a 的调节，m u r c h i s o n 等敲 除了鼠e s 细胞中的d i c e r 后发现，e s 细胞增殖缓慢，多处于g 1 和g o 期，提 示m i r n a 参与了e s 细胞的周期调控 3 7 1 。p 2 7 蛋白是p 5 3 蛋白的直接靶基因， 对脑胶质瘤的研究表明，过量产生的m i r - 2 2 1 2 2 2 通过抑制p 2 7 蛋白产生，削弱 p 5 3 的促凋亡作用，从而加速了肿瘤细胞增殖。其他肿瘤如前列腺癌和甲状腺乳 头状癌也存在相同的突变，这些肿瘤的恶性增殖都依赖于m i r 2 2 1 2 2 2 的异常表 达【3 洲。 3 、m i r n a 与染色质修饰 d n a 甲基化和组蛋白乙酰化是染色质的两种重要修饰，也是表观遗传学的 两个重要研究领域。基因组d n a 的胞嘧啶甲基化，和组蛋白去乙酰化，导致染 色质结构趋向紧密，形成异染色质，使得位于此处的基因沉默。相反，当d n a 胞嘧啶去甲基化，组蛋白乙酰化程度上升，则使得染色质结构松散，形成常染 色质，位于此处的基因开始转录。m i r n a 参与了染色质修饰的调节。f a b b r i 等 5 第一章前言 通过萤光素酶报告基因分析证实了m i r 2 9 家族通过直接靶向d n m t 3 而调节全 基因组甲基化水平1 4 。而且增强外源性m i r 2 9 表达，会降低全基因组甲基化水 平，从而促进抑癌基因表达，达到抑制肿瘤的目的。哺乳动物中m i r - 2 9 0 可以抑 制r b l 2 的表达，而r b l 2 的表达水平又与d n m t 的活性正相关，因此m i r - 2 9 0 通过抑制r b l 2 来调控基因组整体甲基化水平【4 2 j 。有的m i r n a 还能通过r n a 介 导的甲基化途径来维持d n a 甲基化。如拟南芥中的m i r - 1 6 5 1 6 6 ，在细胞质中成 熟后又返回核中，与刚转录出来的p h b 基因m r n a 结合，并招募相关因子聚集 于结合位点附近，最终导致结合位点处形成染色质重塑复合物，使得p h b 基因 甲基化 4 3 j ，从而使该基因沉默。m i r n a 也调控了组蛋白修饰，如小鼠中m i r - 1 4 0 就以组蛋白去乙酰化酶为靶，通过调节组蛋白修饰而影响相关基因的表达】。 4 、m i r n a 与病毒抵抗 m i r n a 与s i r n a 有着极大的相似性，而s i r n a 被认为是细胞抵抗病毒侵染 的重要途径