（遗传学专业论文）金色链霉菌发酵条件优化及高产菌株选育的新方法.pdf

浙江大学硕士毕业论文 金色链霉菌发酵条件优化及高产菌株选育的新方法 摘要 本文对金霉素( c h l o r t e t r a c y c l i n e ，c t c ) 工业生产菌株3 - 1 1 9 3 、h c t c 一5 和5 1 1 3 在进行产抗性能比较的基础上，选定5 1 1 3 为出发研究菌株，对该菌株 进行了培养条件优化，建立了高产菌株遗传选育的新方法，并对该方法的分子机 制进行了初步探讨。 培养条件优化结果显示，淀粉、酵母粉和无机盐的品种和浓度都对金色链霉 菌( s t r e p t o m y c e sa u r e o f a c i e n s ) 的产抗能力产生重要影响，a - 淀粉酶的存在也会 影响金霉素发酵。不同菌株产抗性能比较分析显示，h - c t c - 5 和5 1 1 - 3 在相同 发酵培养基中的效价比3 - 1 1 9 3 高，稳定性好。5 1 1 _ 3 在各种培养基中都长势良 好，产抗能力强，是高产金霉素的优良菌株，并将其作为进一步研究的材料。 研究了培养温度对链霉菌孢子的紫外诱变正向突变率及突变幅度的影响。经 u v 诱变的5 1 1 - 3 菌株孢子悬浮液涂平板，分组置于适宜生长温度3 6 、略低于 适宜生长温度的3 3 ，和接近抑制生长的胁迫温度3 0 、3 9 。c 下培养。结果表 明：在3 0 下培养获得的子代菌株，产c t c 的正向突变子所占的比例和总体产 抗水平均明显高于其他温度组。正向突变子占总子代菌株数的百分率从3 6 培 养组的2 9 。8 5 提高到3 0 c 培养组的4 7 6 9 ，丽3 9 。c 培养组的高产率也高于3 6 培养组。用s p s s i o 0 统计软件对各温度组下子代菌株产抗水平进行分析。结 果显示从3 0 至3 9 各个温度组下平均产抗水平分别为9 7 2 4 9 、8 6 8 1 7 、7 9 1 4 6 和7 6 6 7 2 单位，方差检验f 值为5 5 8 4 ，说明各个培养温度组间的突变子代产 抗水平差异显著。随机挑选各个温度组的菌株，进行同工酶电泳分析，结果显示 不同效价的菌株，其脂酶同工酶酶谱确实存在差异；用1 2 对随机引物对出发菌 株与u v 诱变后的予代菌株进行总d n a 的r a p d 分析，同样表明，不同效价的 菌株在d n a 多态性上也存在较大差异。这些表明，用诱变后的胁迫培养温度作 为突变形成的条件之一所获得的高产菌株确实在遗传背景上发生了可稳定遗传 的变化。因此这一方法较大幅度地提高了金色链霉菌5 1 1 3 紫外诱变育种的工作 效率，同时也为链霉菌紫外诱变后突变形成机制的进一步研究提供了新途径。 关键词：金色链霉菌，金霉素，诱变育种，正向突变率，r a p d 3 浙江大学硕士毕业论文 s t u d i e so no p t i m i z a t i o no ft h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nw i t h s t r e p t o m y c e sa u r e o f a c i e n s a n dn o v e lm e t h o df o rs e l e c t i o no f h i g h - y i e l d i n gc h l o r t e t r a c y c l i n es t r a i n a b s t r a c t b a s e do nt h ef e r m e n t a t i o nr e s u l t so fs t r e p t o m y c e sa u r e o f a c i e n sn a m e d5 1 1 3 、 3 - 1 1 9 3a n dh c t c - 5 w es e l e c t e d s t u d y t h e o p t i m a l c o n d i t i o nf o r c h l o r t e t r a c y c l i n e ( c t c ) f e r m e n t a t i o no fs t r a i n5 1 1 3 a n df o u n dah o v e im e t h o df o r s e l e c t i o no fh i g h y i e l d i n gc t cs t r a i n s t u d i e so nt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo ft h e n o v e lm e t h o dw e r ec a r r i e do u t t h ee f f e c to fi n o r g a n i cp h o s p h a t e 、a m y l u ma n dy e a s t f l o u ro nc t c b i o s y n t h e s i sw e r ea l s os t u d i e d i no r d e rt oi m p r o v et h ea n t i b i o t i c - p r o d u c i n gt r a i to fs t r a i n5 1 1 3 ，w ee x p o s e di t s p r o t o p l a s t sa n ds p o r e st ou v a n di s o l a t e dm u t a n ts t r a l n s t h ea n t i b i o t i c st i t e ro ft h e m u t a n t sf e r m e n t e db r o t hw a s4t i m e sa sh i 【g ha st h ep a r e n ts t r a i nt h r o t 【曲o d 4 4 0d a t a a n di t sh i g hc a p a c i t yf o rp r o d u c i n ga n t i b i o t i cr e m a i n e ds t a b l ea f t e r4t i m e so f s u b c u l t u r e s i tw a sa l s of o u n dt h a tt h ee f f e c to fp r o t o p l a s t s u vm u t a g e n i cb r e e d i n g w a sb e t t e rt h a ns p o r e s 。 u vi r r a d i a t e ds p o r e so fs t r a i n5 1 1 3w e r ei n c u b a t e da t3 3 、3 6 a n dc l o s et o i n h i b i t i n gg r o w t ht e m p e r a t u r e3 0 c a n d3 94 c r e s u l t ss h o w e dt h a ta m o n gt h e o f f s p r i n gf r o mu vi r r a d i a t e ds p o r e sg r o w na t3 0 。c ，t h ea m o u n to ff o r w a r dm u t a n t s w h o s ea n t i b i o t i c s p r o d u c i n ga b i l i t yw e r eo v e rt h eo r i g i n a ls t r a i n sw e r em a n ym o r e t h a nt h a ta tt h eo t h e r st e m p e r a t u r e s t h ep e r c e n t a g eo ft h ef o r w a r dm u t a n t sw a s 2 9 。8 5 a t3 6 ( 2a n d4 7 6 9 a t3 0 r e s p e c t i v e l y t h ei s o z y m ee l e c t r o p h o r e s i s a n a l y s i so ft h ep r o g e n ys t r a i nw a sc a r r i e do u t ，i tw a sc o n c l u d e dt h a tt h ed i v e r s i t yo f t h ep r o g e n ys t r a i n st i t e rw e r ec a u s e db yt h em u t a t i o no fs t r a i n sd n a t o t a ld n a o f t h ep r o g e n ys t r a i na n dt h eo r i g i n a ls t r a i nw a st e s t e db yr a p dw i t h1 0p r i m e r s - i tw a s d e m o n s t r a t e dt h a tt h ev a r i a t i o n so c c u r r e di nt h ec h r o m o s o m a ld n a o ft h ep r o g e n y s t r a i n sg r o w na t3 0 cw e r em o r et h a nt h a ta tt h eo t h e r st e m p e r a t u r e s t h i sm e t h o d i m p r o v e dt h ee f f i c i e n c yo fu vm u t a g e n i cb r e e d i n ga n dp u tf o r w a r dan e ww a yi n r e s e a r c h i n gi n t ot h em e c h a n s m so f m u t a t i o nf o r m a t i o ni ns t r e p t o m y c e sa u r e o f a c i e n s c e l l si r r a d i a t e db yu v k e yw o r d s ：s t r e p t o m y c e sa u r e o f a c i e n s ，c h l o r t e t r a c y c l i n e ，b r e e d i n g ，f o r w a r d m u t a t i o nr a t e ，r a p d 4 浙江大学硕士毕业论文 前言 抗生素是且前最重要的生物技术产品之一。早在1 9 8 1 年，全世界抗生素产 品的销售额就已经达到8 0 亿美元( a n 格拉泽，2 0 0 2 ) 。大多数来自原核生物的 抗生素是由属于放线菌类的生物体产生的，而链霉菌( s t r e p t o m y c e s ) 是其中最 主要的产生菌。除生产抗生素之外，链霉菌生产酶的潜力也不可忽视。链霉菌可 以产生如蛋白酶、纤维素酶、木质素酶等多种酶，其中，作为葡萄糖异构酶的天 然产生菌，链霉菌在工业生产中已经占有重要的地位( h o p w o o d d a ，1 9 8 4 ) 。此 外，链霉菌还能产生动物生长促进剂和除草剂等其他重要的次级代谢产物。随着 生物技术的不断发展，目前许多重组d n a 技术已经可以成功应用到链霉菌 ( k e s e r t ，2 0 0 0 ) 中，所以链霉菌也可以用作宿主来生产外源蛋白( g e l b e r tm ， 1 9 9 5 ) ，如胰岛素、干扰素、白介素和重组疫苗等( k i e s e rt ，1 9 8 6 ) 。因此链霉 菌在工业生产中已经占有重要的地位，也是生物技术界一种十分重要的菌种资源 ( b u l o c kj d ，1 9 8 2 ) ，而链霉菌的育种研究以及寻找新的链霉菌资源的工作也因此 成为十分活跃的领域之一。 抗生素作为一门应用科学，是以青霉素的正式生产和临床应用为开始发展的 标志，至今已有几十年的历史( 曾小龙，2 0 0 3 ) 。抗生素是以低微浓度能抑制或影 响活的机体生命过程的次级代谢产物及其衍生物。它包括抗微生物，抗癌，抗细 胞毒性，抗病毒，杀昆虫，杀螨，杀腺虫，抗寄生虫，驱肠虫，植物毒性，植物 的生长调节剂，除草剂，农业杀虫剂等的所有天然产物。现在已知抗生素总数不 少于9 0 0 0 种。 金霉素是一种重要的抗生素，为杜茄耳氏于1 9 4 8 年从金白链丝菌中分离获 得的四环素类抗生素，学名为氯四环素，四环索金霉素是一种广谱抗生素，对多 种病原微生物皆有抑制作用。故自它被发现后，就得到重视和相继广泛应用于医 学，农学，饲养业等方面。最初金霉素作为抗生素应用于临床，后来随着其他抗 生素的应用，它主要作为兽用抗生素。在农业方面，用作菌肥，可以促进农作物 生长，增加体重，节约饲料。很多实验研究证明，少量金霉素( 只占饲料总量的 1 3 的1 0 0 0 单位金霉素) 就能提高动物增重率1 0 ，缩短育肥期十分之一， 两者综合考虑，全期可以节约饲料7 左右。如现在的甲鱼人工饲养重就少不了 浙江大学硕士毕业论文 金霉素和土霉素作为饲料添加剂。金霉素还能显著提高幼雏的成活率，饲喂成鸡 可提高卵率。稍大剂量的金霉素( 占饲料的5 1 0 ) 对某些常发生的畜禽疾病， 如鸡球虫，猪丹毒，鸡瘟病，马腺疫，各种败血症，肺炎，放线菌病，拉稀等疾 病，都有良好的防治效果。能取得明显的经济效益。在医学上，金霉素对于革兰 氏阳性细菌有强烈的抑制作用，而且细菌不易对金霉素产生抗药性，口服或注射 时极易被吸收，疗效显著。在工业上，金霉素可作为食品保藏剂，用来保存鲜肉， 乳品，蔬果等，防腐杀菌能力强，实验证明从肉类分离出来的9 2 种微生物中金 霉素可抑制其中的8 1 种，并且用量甚少，百万分之五金霉素冰藏鲜鱼可延长保 藏期一倍。当然，在其他领域如基础科学领域中，金霉素也有很大的应用空间。 随着抗生素产业的不断发展，金霉素的应用范围在逐步扩大，农业和畜牧业 仍将是金霉索的最大应用领域和产品销售市场。因此，提高金霉素发酵效价具有 很高的经济价值和实际意义。在这方面前人已做了大量的工作，也找到了不少有 价值的规律。1 9 4 8 年d u g g a r 首先发现金霉素产生菌( 工a u r e o f a c i e n s ) ，当时 原菌发酵水平仅为1 6 5 u m 1 ，当使得无氯培养基或加入抑氯剂时，只能合成9 5 左右的四环素。在工业生产中，提高抗生索产量最重要的途径是通过育种改良生 产菌种，而一直有效的方法是诱变，如紫外，氮芥，乙烯亚胺，放线菌素k ，n t g 等。7 0 年代发展起来的原生质体融合技术成为抗生素生产菌选育菌种的重要途 径之一，但由于菌株需带标志，选育费时费力，所以我们采用简便快捷的孢子紫 外诱变和温度胁迫筛选。诱变完成后，菌株放在不同的条件下培养，将不同培养 条件作为筛选条件，进而获得效价较高的菌株，应用该方法已经取得不错的效果。 随着我国加入世贸组织，中国医药行业面临巨大挑战，原来主要仿制国外产 品，具有知识产权的品种非常少，因此开发具有知识产权的新的抗生素生产技术 是迫在眉睫的。更重要的是，入世之后，医药行业中不涉及知识产权的一些老品 种由于抗生素发酵的效价水平较低，难以与国外同类产品的技术水平抗衡，因此 亟待提高抗生素的发酵水平。但目前抗生素高价菌株的选育仍然以传统低效的诱 变育种为主。用基因工程研究抗生素生物合成的机制和提高抗生素发酵水平由于 目前技术上存在一些问题，效果不尽人意。因此建立高效抗生素高产菌株的选育 技术，研究相关抗生素生物合成的代谢机制，采用分子生物学的方法提高抗生素 合成相关基因的表达水平，是我国医药工业迫切需要解决的难题。 6 浙江大学硕士毕业论文 本实验室多年从事链霉菌工业应用研究，本文以金色链霉菌作为研究材料， 对该菌株进行发酵条件的优化，以降低工业发酵成本。根据多年的实践经验，以 胁迫温度作为紫外诱变后形成突变子的培养条件，建立简便快捷且高效率的高产 菌株筛选方法，在一定程度上祢补了基因工程方法及原生质体融合等高产菌株构 建手段的不稳定性，这不仅对金色链霉菌，对其他链霉菌的工业遗传育种同样具 有重要的参考价值，对我国医药工业的发展也具有重大的意义。 7 浙江大学硕士毕业论文 材料与方法 1 菌株 1 15 1 1 3 ：实验室保藏菌株，本文研究的主要材料。 1 23 - 1 1 9 。3 、h c t c - 5 ：实验室保藏菌株。 2 培养基和试剂 2 1 孢子固体培养基 ( n h 4 ) 2 h p 0 40 0 1 5 k h z p 0 4o 0 1 m g s 0 4o 0 0 5 麸皮3 o 琼脂2 0 p h7 6 ，1 2 1 c 灭菌2 0 r a i n 2 2 种子培养基 淀粉3 5 酵母粉0 7 黄豆饼粉2 3 蛋白胨0 5 c a c 0 3o 3 5 ( n h 4 ) 2 s 0 4 0 3 5 k h 2 p 0 40 0 3 m gs 0 40 0 2 n a c l0 1 豆油0 。4 p h6 5 ，1 2 1 。c 灭菌2 0 m i n 灭菌后p h 为6 0 6 1 装量3 0 m l 2 5 0 m l 三角瓶 2 3 发酵培养基 培养基成分2 号3 号 淀粉 1 31 3 酵母粉0 8 0 8 黄豆饼粉 2 3 2 3 蛋白胨 0 3 70 3 7 玉米浆 1 5 1 5 c a c 0 3 1 01 0 ( n i g ) 2 s 0 40 7 n h t c l 0 5 8 9 n a c l0 2 5o 2 5 m g s 0 4 0 0 1 5 o 0 1 5 4 号 1 6 o 8 2 3 0 3 7 1 5 1 0 0 7 5 号 1 6 2 3 0 3 7 1 5 1 o 0 7 6 号 1 3 0 8 2 3 0 3 7 1 5 1 0 o 7 7 号8 号 1 31 6 o 80 8 2 32 3 0 3 70 3 7 1 5 1 o1 o 0 7o 7 0 2 50 2 50 2 50 2 50 ，2 50 2 5 0 0 1 50 0 1 50 0 1 50 0 1 50 0 1 50 0 1 5 8 号6 3 5 d 7 9 1 2 o 1 1 0 浙江大学硕士毕业论文 k h 2 p 0 4 c a c l 2 a 淀粉酶 豆油 调节p h = 6 5 0 0 10 0 10 0 1 0 0 50 0 50 0 5 0 0 t0 0 10 0 1 0 1 5 0 1 5 0 1 5 1 2 19 c 灭菌2 0 分钟后， 0 0 10 0 1 o 0 5o 0 5 o 0 l0 0 6 5 0 1 50 1 5 p n 大约为6 0 。 o 0 10 0 10 0 1 0 0 5o 0 50 0 5 0 0 10 0 6 50 0 1 0 1 50 1 50 1 5 表中的浓度单位为 备注：2 5 号是可溶性淀粉，6 - 9 号是玉米淀粉 2 号发酵培养基 3 号氯化铵培养基 4 号高糖培养基 5 号高糖培养基( 无酵母粉) 6 号发酵培养基( 与2 号相比，a 一淀粉酶量减少) 7 号在2 号培养基基础上不加玉米浆 8 号高糖培养基( 与4 号相比，a 一淀粉酶量减少) 9 号在4 号基础上不加酵母粉 2 4 葡萄糖一酵母膏培养基 葡萄糖1 o 酵母膏1 0 p h7 2 7 6 ，1 1 5 c , 灭菌3 0 m i n 2 5s r 再生培养基 蔗糖1 0 3 酵母粉o 2 ( 崔大鹏，1 9 9 9 ) 葡萄糖0 2 m g c l 2 6 h 2 01 0 1 2 l 广h i s0 0 7 7 6 琼脂1 8 2 6 微量元素液( m 鲫) z n c | 2 4 0 m n c l 2 4 h 2 0 1 0 酪蛋白水解物o 4 c a c l 2 2 h 2 00 2 9 l 广g l u0 2 5 d h7 2 ，1 1 5 c 灭菌3 0 r a i n f e c l 3 6 h 2 01 0 n a 2 8 4 0 7 1 0 h 2 01 0 蛋白胨0 2 k h 2 p 0 40 0 0 5 h e p e s0 5 9 5 微量元素1 5 0 0 ( v v ) c a c l 2 2 h 2 0 1 0 ( n i - h ) 6 m 0 7 0 2 4 4 h 2 01 0 9 浙江大学硕士毕业论文 2 7 p 缓冲液( 酊) ( h o p w o o dd a ，1 9 8 9 ) 蔗糖1 0 3 k 2 s 0 4o 2 5 m g c l 2 6 h 2 02 0 2 微量元素液2 m l 蒸馏水8 0 0 m 1 分成8 0 m l 的等份，1 1 5 x 2 灭菌3 0 m i n 。使用前每瓶加经过单独灭菌的 k h 2 p 0 4 ( 0 5 ) l m lc a c l 2 2 i - i z ( 3 6 8 ) 1 0 m lt e s ( 5 7 3 p h 7 2 ) 1 0 m l 2 8 同工酶提取主要试剂( 张修军，1 9 9 9 ) 1 0 m m o l l 的t r i s h c l 缓冲液，p h7 41 6 2 m m o l l 的t r i s h c l 缓冲液，p h 6 8 置冰上提取，4 0 w 超声波 2 9 脂酶同工酶染液( 张修军，1 9 9 9 ) 磷酸缓冲液p h 6 4 肛醋酸萘脂0 0 7 2 1 0 垂直蛋白电泳试剂 电泳上样缓冲液 a 液 b 液 c 液 a p 电泳液( 非变性) t e m e d 2 1 1d n a 提取用主要试剂 t e 缓冲液 2 0 s d s ( w v ) r n a 酶 坚牢蓝r r 盐0 1 丙酮 a 醋酸萘脂0 0 7 乙酸0 7 2 0 甘油，o ，2 w l 的溴酚蓝，与样品1 ：1 混合 a c r3 0 9 ，b r i s 0 8 9 加水至1 0 0 m l l m o l l h c l4 8 m 1 + 3 6 3 9 i r i s ，定容1 0 0 m l ，p s 8 9 l m o l lh c l 4 8 m 1 + 5 9 8 9t r i s ，定容1 0 0 m l ，p h 6 7 1 0 的过硫胺酸，现配 3 0 9 t r i s + 1 4 4 9 甘氨酸，定容1 0 0 0 m l ，p h8 3 d d h 2 0 ( f r e d e r i c km ，1 9 9 8 ) 5 0 r a mt r i s h c l - 5 r a me d t a ，p h8 0 2 4 ：1 氯仿异戊醇( v ：v ) 平衡酚 无水乙醇 1 0 浙江大学硕士毕业论文 2 1 2r a p d 实验用试剂( f r e d e r i c km ，1 9 9 8 ) t a qd n a 聚合酶 1 0 p c rb u f f e r d n t p 1 0 b pr a p dp r i m e r 琼脂糖t b e 缓冲液 e bd n a 加样缓冲液：0 2 5 溴酚蓝，4 0 蔗糖 来自博亚的1 2 种1 0 b p r a p d p r i m e r 序列 2 1 3 其他试剂 1 0 m g m l 溶菌酶 1 0 3 蔗糖溶液 0 9 生理盐水h e p e s 路哥( l u g o ) 氏碘液0 0 1 s d s 2 1 4 链霉菌抗性、耐酸性培养基 在孢子固体平板培养基中，加入相应浓度的金霉素，制备成1 0 0 u g m l 、 1 5 0 u g m l 、2 0 0 u g m l 、2 5 0 u g m l 、3 0 0 u g m l 等5 个浓度的金霉素抗性培养基；调 节孢子固体培养基的p h 值，分别为3 5 、4 0 、4 5 、5 0 、5 5 、6 0 ，制备成梯度 耐酸性培养基。 3 主要仪器设备 恒温培养箱、恒温摇床、高速台式离心机、磁力搅拌器、光学显微镜、7 2 1 型分光光度计、透射电子显微镜、扫描电子显微镜、热循环仪( p e r k i n e l m e r 公 司9 6 0 0 型) 、d y y 1 2 型电脑三恒多用电泳仪、d y c p 3 1 d 型水平电泳槽、p c r 仪器 浙江大学硕士毕业论文 4 实验方法 4 1 金色链霉菌发酵条件的优化 4 1 1 金色链霉菌发酵条件优化： 将新鲜的孢子从固体培养基接种到液体种子培养基，在摇床中以3 2 、 2 0 0 r p m 预培养1 8 2 4 h 后，按约1 0 的接种量转接到配好的8 种发酵培养基中， 每个发酵瓶重复三次，继续振荡培养1 3 4 h 。测金霉素效价，比较金色链霉菌在 各种培养基的发酵优劣。 4 1 2c t c 效价标准曲线的绘制 精确称取c t c 标准品( 有质检提供) 适量，以蒸馏水稀释成1 0 0 0 u m l 的标 准品备用。精确吸取1 0 0 0 u m l 的c t c 标准液各0 2 、0 4 、0 6 、0 8 、1 0 、1 2 、 1 4 m l ( 即相当于2 0 0 、4 0 0 、6 0 0 、8 0 0 、1 0 0 0 、1 2 0 0 、1 4 0 0 个单位) 于7 组5 0 m l 容量瓶中，每组3 个，各取一个做空白，立即加2 n 的盐酸5 m l ，并加蒸馏水稀 释至刻度，摇匀。另外2 个做样品，加入2 n 盐酸5 m l ，沸水加热5 r a i n ，冷却后 加水稀释到刻度，摇匀，于7 2 1 型分光光度计上4 4 0 h m 处读取吸光值，以单位 为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 4 1 3c t c 效价的测定 取发酵液，经p h 计测定此时的p h ，记录。加入草酸调节p h 至1 2 1 4 ，充 分酸化3 0 m i n ，使c t c 充分释放到胞外。经过3 0 0 0 r p m 离心1 0 v m i n ，取上清液， 稀释l o b 倍。分别吸取稀释滤液l m l 于2 只5 0 m l 容量瓶，各加2 n 盐酸5 m l ， 其中一个作空白，立即加蒸馏水稀释至刻度，摇匀；另外一只经沸水浴加热5 m i n ， 迅速冷却至室温，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀。用预热过的分光光度计于4 4 0 r i m 处测吸光值，根据标准曲线读取效价。 浙江大学硕士毕业论文 4 2 金色链霉菌诱变育种 4 2 1 链霉菌孢子悬浮液的制备( h o p w o o dd a ，1 9 8 8 ) 在新鲜成熟的菌株5 1 1 3 斜面上加入无菌水，用接种环副取培养物表面的 孢子，制成粗制的孢子悬液。将此悬液倒入装有玻璃珠的三角烧瓶中振荡以打散 孢子，然后用装有脱脂棉的试管过滤悬液，3 0 0 0 r p m 离心5 m i n 后复悬于无菌水 中，得单孢子悬液。各好的孢子悬液作进一步研究。 4 2 2 链霉菌孢子紫外诱变致死曲线的绘制 将之前制备的孢子悬浮液在1 5 w 紫外灯下3 0 c m 处分别照射5 s 、1 0 s 、2 0 s 、 4 0 s 、6 0 s 和1 0 0 s 。在每一时间段处取0 5 m l 悬浮液，加入到装有4 5 m l 无菌水 和少量玻璃珠的试管中，分别以1 0 一、1 0 一、1 0 1 、l o 、4 个梯度涂于孢子固体平 板上，避光培养6 天，选择合适梯度下的平板统计单菌落个数，与对照平板对比， 计算百分率，绘制孢子紫外诱变致死曲线。 4 2 3 链霉菌孢子的紫外诱变 采用已经过条件优化的方法：孢子悬液用0 9 的生理盐水调整到浓度为1 0 8 个m l 。加5 m l 于直径为6 c m 的平皿中，开盖置于1 5 w 紫外灯下3 0 c m 处照射，恒 速搅拌。照射2 0 s 后，经过适当稀释，涂布于孢子固体平板上，避光培养6 d 。 4 2 4 原生质体的制备、再生和纯度检测( h o p w o o dd a ，1 9 8 8 ) 以2 5 m l 2 5 0 m l 的装量，接o 1 m l 菌株a p l 9 1 的单孢子悬液入菌丝生长培养 基( h 培养基) ，2 8 、2 0 0 r p m 培养2 4 h 。然后以5 的接种量转接到添加了0 5 甘氨酸的新鲜h 培养基中继续培养1 8 h 。 取1 0 m l 培养液，3 0 0 0 r p m 离心1 0 r a i n 收集菌体，复悬于1 0 m l1 0 3 的蔗糖 溶液中，离心收集菌体，重复一次，得菌丝沉淀。 将沉淀菌丝悬于2 m l 溶菌酶溶液中( 用p 液配置，经滤膜过滤除菌) ，3 0 保温1 h ，并不时振荡。酶处理完后，用脱脂棉过滤，除去菌丝体，3 0 0 0 r p r n 离 浙江大学硕士毕业论文 心7 m i n ，沉淀复悬于1 0 m lp 缓冲液中，得原生质体悬液。用血球计数板计数， 计算原生质体悬液的浓度。 原生质体再生：将原生质体悬液分别用p 缓冲液稀释到适宜浓度，涂布到 s r 再生平板上，2 8 培养。 原生质体悬液纯度的检测：将原生质体悬液分别用p 缓冲液和0 0 1 s d s 稀 释1 0 倍后，在光学显微镜下观察两种稀释液的差异。 4 2 5 原生质体紫外诱变 原生质体的紫外诱变：将菌株5 1 1 3 的原生质体悬液用p 缓冲液稀释调整到 浓度为1 0 8 个细l 。加5 m l 原生质体悬液于直径为6 c m 的平皿中，开盖置于1 5 w 紫外灯下3 0 c m 处照射，在磁力搅拌机上恒速搅拌。分别照射5 s 、1 0 s 、2 0 s 、4 0 s 、 7 0 s 、l o o s 后，用p 缓冲液稀释到适宜浓度，涂布于s r 再生平板，2 8 c 避光培养 7 d 。 4 2 6 诱变菌株的筛选 挑选发酵液的金霉素效价较高的诱变菌株，连续转接4 代，分别测定各代菌 株的抗生素相对效价。那些抗生素相对效价提高较多，而且具有遗传稳定性的菌 株即为诱变筛选得到的菌株。 4 2 7 不同培养温度对孢子紫外诱变后的正向突变率影响的研究 按照上面提到的方法进行孢子的紫外诱变。将诱变后的孢子悬液梯度稀释几 个浓度，分别在3 0 c 、3 3 c 、3 6 。c 、3 9 。c 避光培养6 d 。用严格随机取样法挑选 各种培养温度下形成的单菌落共1 2 0 个，进行发酵培养并测定各菌株的抗生素效 价。实验重复3 次。用统计分析软件s p s s1 0 0 对结果进行统计分析。文中正变 率( p e r c e n t a g eo ff o r w a r d - m u t a n t s ) 指诱变菌株中抗生素发酵效价高于出发 菌株( 对照株) 的诱变株所占的比例。 浙江大学硕士毕业论文 4 2 8 对照实验 将未诱交的孢子悬液如上所示，分别置于3 0 c 、3 3 * 0 、3 6 。c 、3 9 。c 温度组 避光培养6 d 。用同样的方法进行发酵并测定效价，以观察不同培养温度组下子 代菌株效价的差异，从而验证各温度组间的差异并不是单纯的培养温度引起的。 4 3 突变株的同工酶电泳检测 4 3 1 金色链霉菌粗蛋白的提取 将新鲜孢子接种到葡萄糖一酵母膏培养基，培养2 4 小时，5 0 0 0 r p m 离心收集 菌丝体。用1 5 倍的1 0 m m o l l 的t r i s - h c l 缓冲液( p h 7 4 ) 洗涤两次，然后悬 浮于两倍体积的1 6 2 m m o l l 的t t i s h c l 缓冲液( p h 6 8 ) ，置冰上，用4 0 w 的 超声波间断处理3 r a i n ，再于冰上静置2 0 m i n ，1 3 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，收集上清 液于2 0 0 备用。 4 3 2 突变菌株同工酶电泳 不连续聚丙烯酰胺凝胶非变性电泳，以p h 8 3 的t r i s 一甘氨酸缓冲液为电泳 液，浓缩胶和分离胶浓度分别为5 和1 0 ，上样量为3 0 l l l 每孔。溴酚兰为指示 剂，溴酚兰在浓缩胶时，电流强度为1 0 m a ，当指示剂到达分离胶时，电流变为 2 0 m a ，尽量使电泳在4 * 0 下进行。浓缩胶和分离胶的配置如下： 试剂 a 液 b 液 c 液 a p d d h 2 0 t e m e d 浓缩胶 1 0 m l 5 0 u i 3 4 5 m l 1 0 u 1 分离胶 5 m l 1 0 0 u l 6 1 5 m l 1 0 u l 浙江大学硕士毕业论文 4 4 随机扩增引物多态性分析( r a p d ) 检测 4 4 1 链霉菌基因组d n a 的提取 取菌株5 1 1 3 的新鲜培养液( 用预发酵培养基培养2 4 h ) l m l ，6 0 0 0 r p m 离 心5 m i n ；用l m lt e 缓冲液洗涤沉淀，6 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ；沉淀复悬于4 0 叽1 5 0 r a mt r i s h c l - 5 m me d t a ( p h8 o ) 。 加入4 靴l8 m g m l 的溶菌酶溶液，3 7 。c 水浴4 5 m i r a 加入5 叻i2 0 s d s ，6 0 水浴1 0 m i n 。 加入等体积的氯仿异戊醇，混匀，1 2 0 0 0r p m 离心1 0 m i n ，上清转入新的离 心管中，加入等体积的酚氯仿异戊醇，混匀，1 2 0 0 0r p m 离心1 0 m i n ，将上清转 入新管中。 加入2 倍体积的冰无水乙醇，轻轻混合直到d n a 沉淀下来，1 2 0 0 0 r p m 离心 沉淀，用7 0 乙醇洗涤沉淀后再离心5 m i n ，d n a 沉淀在室温下干燥1 5 2 0 m i n 。 加入t e 缓冲液1 0 陬l ，并n a 犁lr n a 酶( 1 叫g p 1 ) 。用0 7 的琼脂糖凝胶 电泳检测d n a 样品的纯度，稀释到合适的浓度后，作为r a p d 反应的模板。 4 4 2 利用r a p d 方法检测培养温度对紫外诱变的影响 随机挑选野生型菌株5 株，用1 2 种1 0 b p 的随机引物进行r a p d 扩增，用 来筛选引物，同时检测野生型菌株间的相似性。 利用经过筛选的引物，随机挑选经紫外诱变后3 0 c 、3 3 c 、3 6 c 、3 9 c 四 个温度组的诱变菌株共1 6 株，与作为对照的野生型菌株一起，进行r a p d 扩增， 检测不同处理组与对照菌株之间的r a p d 扩增条带相似性。 r a p d 扩增体系( 2 吮1 ) 参照文献( c a r lw d ，1 9 9 8 ) ： 1 6 浙江大学硕士毕业论文 结果 1 。链霉菌孢子和原生质体紫外致死曲线的绘制 按方法制备链霉菌孢子悬浮液，按5 s 、1 0 s 、2 0 s 、4 0 s 、6 0 s 和1 0 0 s 各个时 间段进行紫外诱变，结果如下表1 。 表1 孢子和原生质体的紫外致死结果 原生质体和孢子的致死率都在7 0 8 0 左右。根据以往的文献报道，7 0 8 0 的致死率适合于数量性状的诱变剂量，而9 0 以上的致死率是质量性状的诱变程 度。因为抗生素生产菌株的诱变是属于数量性状的诱变，所以我们选择致死率为 7 5 的2 0 s 照射时间作为金色链霉菌紫外诱变育种的时间。 将链霉菌原生质和孢子的紫外照射致死条件绘制标准曲线，横坐标代表紫外 照射时间s ，纵坐标代表致死率。 1 0 0 0 0 9 0 0 0 8 0 0 0 7 0 0 0 6 0 0 0 5 0 0 0 4 0 0 0 3 0 0 0 0l o2 03 04 05 0 6 07 08 0 9 0 1 0 0 图1 链霉菌紫外诱变致死标准曲线 备注：系列1 代表链霉菌孢子紫外致死曲线，系列2 代表原生质紫外致死曲线。 2 c t c 效价标准曲线的绘制 c t c 标准曲线的准确性直接影响本实验最终结果的准确性与科学性。因 】7 浙江大学硕士毕业论文 此，c t c 标准曲线的绘制至关重要。用国家卫生部生物制品检验所提供的标准 c t c 为样品，按表2 的梯度配置标准液，绘制的标准曲线显示了较严格的浓度 梯度线性关系，见图2 。 表2 不同单位的金霉素在o d 4 4 0 下的吸光值 效价 2 0 04 0 0 6 0 0 8 0 01 0 0 01 2 0 01 4 0 0 【吸光度均值0 0 7 50 1 5 00 2 0 5o 2 9 50 3 7 0o 4 4 40 s 2 2 图2 显示，一定范围内的c t c 效价和0 d 4 4 0 存在着线性关系，x 轴为c t c 效价单位纵坐标为o d “o 的光吸收值，斜率为p 1 ，p 2 为截距。 图2c t c 效价标准曲线图 3 金色链霉菌发酵培养基的优化及优良菌株的筛选 3 0 个不同的菌株经过多次的筛选，初步获得3 个金霉素( c i ) 效价较高的 菌株：3 - 1 1 9 - 3 、h - c t c - 5 和5 1 1 3 。将这孑个菌株作为本实验出发菌株，分别 培养于不同配方的培养基中，以筛选高产c t c 的菌株和经济高产的培养基配方。 本实验通过改变传统培养基中的c 、n 源及部分无机盐，目的是能获得优良 高产的培养基配方，同时又能降低生产成本，如能应用于工业的大批量生产，必 浙江大学硕士毕业论文 将节省大量材料，降低生产成本，提高工业经济效益。另外，针对目前市场上的 酵母粉来源多样化，本实验培养基优化的基础上，继续研究了不同来源的酵母粉 对c t c 效价的影响。 3 1 金色链霉菌发酵条件的优化及优良菌株的筛选 以3 - 1 1 9 3 、h c t c - 5 、5 1 1 - 3 为实验菌株，2 - 8 号培养基作为筛选培养基。 结果见图表。 表3 可溶性淀粉培养基的发酵结果 从表3 可见，不管是5 1 1 - 3 还是h c t c 5 ，在4 号培养基中的发酵结果都 高于2 号培养基的发酵效价，说明提高淀粉含量有助于金色链霉菌的发酵。结合 表4 ，可以进一步比较8 种不同成分的培养基对金色链霉菌发酵效价的影响。 结合表3 、表4 一起分析，发现不同品种的淀粉，及淀粉浓度都对金色链霉 菌发酵产生一定的影响。而培养基中的无机铵盐、a 淀粉酶和酵母粉都对金霉素 的发酵产生影响。我们发现，玉米淀粉比可溶性淀粉更容易被金色链霉菌利用， ( n h 4 ) 2 s 0 4 也n h 4 c l 更适合金霉素发酵。a ，淀粉酶的加入有利于帮助金色链 霉菌分解淀粉长链，但数据表明，过量的a 淀粉酶反倒会抑制金霉素的发酵。值 得注意的是，表3 、4 中，不添加酵母粉的培养基不但没有降低金霉素的发酵效 价，反而表现出较高的金霉素发酵能力。 浙江大学硕士毕业论文 表4 玉米淀粉培养基中的发酵结果 基 淀粉酵母粉。一淀粉酶 。值 倍数价 3 2 不同酵母粉对金霉素发酵影响及酵母粉有效成分研究 以筛选出的优良菌株5 1 1 3 作为研究菌株，研究了不同来源的酵母粉对金霉 素发酵的影响，结果见图3 。 图3 不同品种酵母粉对金色链霉菌发酵的影响 s 1 值得注意的是，因为此次发酵批量小，选择了5 0 0 m l 的大三角瓶发酵，因 浙江大学硕士毕业论文 此出现了效价大幅度上升的现象，虽然这样不利于纵向的比较分析，但仍然不影 响我们横向比较不同品种的酵母粉对金霉素发酵效价的影响。从图中可以看出， h m 、y p 、g y 和o y 种类酵母粉对金霉素发酵具有良好的作用。 为进一步研究酵母粉在金霉素发酵中究竟起什么作用，我们以h m 酵母粉 为例子，着重研究酵母粉中的发酵有效成分。我们分别在培养基中加入酵母粉、 从酵母粉提取的核酸，酵母粉和核酸各5 0 ，以及不加酵母粉和核酸，每次发酵 重复6 次，分析四种不同培养基下，金霉素发酵效价的变化，结果见表5 。 表5 酵母粉的有效发酵成分研究结果 从表中可知，添加0 5 酵母粉和2 9 m g 核酸的培养基发酵效价最好，不加酵 母粉的培养基效价最低，添加酵母粉的培养基比只添加核酸的培养基明显要高。 如图4 所示。 图4 酵母粉在金霉素发酵过程中起作用的因素分析 备注：l 代表不加酵母粉和核酸的培养基，2 代表添加来自h m 的2 9 r a g 核酸的培养基， 3 代表添加0 5 的h m 酵母粉的培养基，4 代表0 5 酵母粉和2 9 r a g 核酸。 0 蚰鲫m 浙江大学硕士毕业论文 4 不同培养温度对孢子紫外诱变正向突变率影响的研究 4 1 不同培养温度对紫外诱变后的效价影响 制备金色链霉菌5 1 1 3 的孢子悬浮液，经紫外照射2 0 s 后，致死率约为7 6 左右，稀释到合适的浓度，涂于孢子固体培