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四川大学硕士学位论文 一株产几丁质酶细菌的分离鉴定及基因克隆 遗传学专业 研究生尹鸿翔指导老师杨志荣 第一章: 产几丁质酶细菌的分离和鉴定 从土壤中分离纯化得到一株几丁质酶活性菌株，其 4 8 h发酵液的 酶活力达到 1 1 0 u / m l e b i o l o g mi c r o s t a t i o n 全自动细菌鉴定系统通过对 其 9 6种碳源利用能力测试后认为，该菌属于粘质沙雷氏菌( s e r r a t i a m a r c e s c e n s ) 的某一亚型( s u b s p e c i e s ) 。再综合该菌菌体的显微形态观察 结果和平板培养的菌落特征，证实了细菌鉴定系统的鉴定结果，确认 该菌应为粘质沙雷氏菌的某一亚型。尝试将该菌与类产碱假单胞菌 ( p s e u d o m o n a s p s e u d o a l i g e n e s )等量混合后饲喂蝗虫， 发现在蝗虫的杀 灭上相对于单一类菌有一定的增效作用。经文献检索， 粘质沙雷氏菌与 类产碱假单胞菌联合灭蝗的研究为本文首次报道。 关键词:几丁质酶，自动细菌鉴定系统，鉴定，粘质沙雷氏菌，类产 碱假单胞菌 四川大学硕十学位论文 t h e i s o l a t i o n , i d e n t i f i c a t i o n a n d c o r r e s p o n d i n g g e n e c l o n e o f a b a c t e r i u m p r o d u c i n g c h i t i n a s e ma j o r i n g e n e t i c s y i n h o n g x i a n g d i r e c t e d b y y a n g z h i r o n g t h e i s o l a t i o n( 3 )基因或蛋白结构与其功能的相互关系:( 4 )转几丁质酶 基因植物和微生物的构建和应用;( 5 )通过定向突变改良 现有基因从而获得更 高酶活性和更强降解能力的菌株;( 6 )几丁质酶基因与其他具有生防意义的功 能基因联合表达以提高植物抵御病原真菌、害虫侵害的能力，扩大抗菌、抗虫 谱。 近年来，该领域各个方向的研究成果层出不穷。发现了不少具有降解能力 的微生物和多种几丁质酶系统，比如:环状芽抱杆菌( b . c i r c u l a n s w l - 1 2 ) 可产 生 六 种几丁 质酶u 、 巨 大芽 抱杆菌( b . m e g a r i u m ) 可产 生三种脱乙 酞 几丁 质酶1 2 1 链霉菌 ( s t r e p t o m y c e s s p )可产生两类几丁质酶lal 、地衣芽抱杆菌 ( b . l i c h e n i f o r m i s ) 可产生五种几t质酶15 1 ， 而粘质沙雷氏菌( s e r r a t i a m ces) 已 有五种几丁质降 解相关蛋白 质被相继发现10 1 (1 4 1 。 在生防利用方面， 1 9 8 6 年s c h l u m b a u m 等首次报道提纯的菜豆几丁质酶具有抗真菌活性后， 哈兹木 霉和绿粘帚霉( g l i o - c l a d i u m v i r e n s ) 等生防真菌提纯的几丁质酶对灰霉菌具有 抑 制作用. ， 、 粘 质沙雷氏 菌 ( s e r r a t i a m a r c e s c e n s ) 提纯的 几丁质 酶 对立枯 丝核 菌有抑制生长作用也被发现，而提纯的烟草、马铃薯、黄瓜、菜豆、豌豆、鹰 嘴豆、甜菜、水稻、小麦、大麦、玉米几丁质酶对立枯丝菌等2 0 多种真菌表现 出 体外抑菌活性不断被报道4 。 在转基因工程研究方面， 进展更加令人振奋: 1 9 9 1 年， b r o g l i e 等首次报道转几丁质酶基因的 植物抗真菌病。 他们将菜豆几丁质酶 基因置于c a m v 3 5 s启动子控制下，转入烟草和油菜，转基因植物组成型表达菜 豆几丁质酶基因， 死苗率大大降 低， 病情发展减慢(9 1 。 这一结果的发表触发了 更 多的研究者转向几丁质酶基因转移。到1 9 9 5 年底止，已有水稻、大麦、 烟草等 植物的几丁质酶基因被转入水稻、烟草、番茄等植物，一些转基因植物对立枯 丝核菌、 烟草蛙眼病菌( c e r c o s p o r a n i c o t i a n a ) 引起的病害显示了增强的抗病性 大只 。 在联合应用方面， 几丁质酶基因与其它基因如s - 1 , 3 - 葡聚糖酶基因【b 麦核糖体灭活性蛋白( r i p ) 基因组合有明显的增效作用 转入烟草c l a s s l 几r 质酶基因或只转入c l a s s l i 3 - 1 , 。 更加值得注意的是， 3 - 葡聚糖酶基因的番茄， 2 2 四川人学硕 学位论文 不抗镰刀菌( f . o x y s p o r u m f . s p l y c o p e r s i c i ) 枯萎病， 而同时转入两类基因的番 茄显著抗病。 粘质沙雷氏菌属肠杆菌科、沙门氏菌属，是革兰氏阴性菌，具有高效降解 几丁质的能力。在植物病原真菌和害虫的防治中具有潜在的利用价值，因而成 为当前重点研究的生防菌之一。由于其生防作用与其几丁质酶活性密切相关， 因而研究的重点集中于:几丁质酶系统的组成和功能;相关基因的克隆、分析 和表达;转基因工程植物、微生物的构建和生防应用。根据相关报道，粘质沙 雷氏菌拥有多达数十种亚型，其中 4 个亚型的几丁质酶系统的相关基因已经相 继被克隆和分析iq ， 如菌株b j l 2 0 0 。 研究发现粘质沙雷氏 菌至少产生3 类几丁 质酶 ( c h i a , c h i b , c h i c ) 。 其中c h i a的 研究最为深入， 酶蛋白的晶型结构已 被 测定， 结构与功能关系以及降解机制也得到充分的 探讨， 国外报道c h i a已 经被 转入荧光假单胞菌 7 1 和烟草，显著提高了 抵抗植物病原真菌的能力。国内 对于 几丁质酶的研究起步较晚，而对于粘质沙雷氏菌研究和应用的报道更少。最近 的有:2 0 0 3 年，河北大学生命科学学院张表等人从实验室保存的一株粘质沙雷 氏 菌中克隆到几丁质酶c h i a e 2 0 0 2 年河北省植物保护研究所冯书亮、 松本继 男等人利用一株粘质沙雷氏 菌对黄胫小车蝗进行防治， 取得了8 0 %以上的死亡 率【3 1 本实验室筛选的该株粘质沙雷氏 菌有较高的几丁质酶活性， 推测该菌的基 因 种类与结构应该与粘质沙雷氏 菌的其他亚型 ( 如菌株b j l 2 0 0 ) 相似， 可能具 备相当的研究和利用价值。基于此，本文参考国外相关研究结果，开展了对该 株粘质沙雷氏菌的几丁质酶基因 ( c h i b , c h i c 的克隆和分析，为该类基因的 后继应用研究提供了有价值的前期工作。 四川大学硕 卜 学位论文 1 材料与方法 1 . 1 材料 1 . 1 . 1 菌种: 粘质沙雷氏菌 ( s e r r a ti a m a r c e s c e n s ) ，由本实验室筛选得到。 1 . 1 . 2 培养基: 几丁质液体培养基 ( 1 0 0 0 m l ) :胶体几t质 1 2 .5 g , k 2 h p 0 4 0 ,7 g , m g s 0 4 7 h 2 0 0 .5 g , 酵母粉2 g , p h 7 . 0 1 . 1 . 3 试剂: 克隆载体:p b l u e s k ;转化受体菌株:大肠杆菌j m 1 0 9( 本实验室保存) 。 总d n a 抽提所需主要试剂:溶菌酶、蛋白 酶k , s d s ,氯仿、苯酚;电泳检测用 d n a m a r k e r ( d l 2 0 0 0 )均购自晶美生物工程公司。 p c r 扩增试剂: t a q 酶( 5 11 / 11 1 , 1 0 0 11 1 / 管) 、 p c r 1 0 x b u f f e r , m g c l , ( 2 5 m m o l / l ) , d n t p均购自t a k a r a 公司。 p c r 引物，由成都法码基因公司合成。 小量d n a 胶回收试剂盒，产自m b i 公司. 1 . 1 . 4 主要仪器: 恒温水域槽、 漩涡振荡器、 e p p e n d o r f 离心机、 t e c h g e n e 全自 动p c r 仪、 电泳装置、g e n e g e n i u s b i o i m a g i n g s y s t e m 凝胶成像系统。 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 粘质沙雷氏菌总d n a 抽提: 由于粘质沙雷氏菌属于革兰氏阴性菌，所以参照同属革兰氏阴性菌的大肠 杆菌总d n a 提取方 法w 粘 质沙雷氏 菌3 7 0 c , 1 8 0 r p m 培养 6 h ， 取适量培养液于 1 . 5 m l e p管中离心取菌体 ， 加入 2 0 g / l溶菌酶 5 0 0 11 1 , 2 0 g / l蛋白酶 k 1 0 11 1 ， 1 0 0 8 / l 的s d s 6 0 11 1 , 3 7 0 c 水浴过夜 苯酚、氯仿抽提 ， 取适量t e 溶解备用。 2 . 2 引物设计与合成: 根据查 自 n c b i数据库的包括全长编码区的同源序列，设计利用软件 2 4 四川大学硕 卜 学位论文 p r i m e r p r e m e r o . 0 进行。设计结果送交成都法码基因公司合成。 1 . 2 . 3 p c r扩增: 所有试样加入2 0 0 1 1 容积薄壁管，总体积2 5 11 1 ，反应体系组成如表 l : 表 1 : p c r 反应体系组分 试剂浓度 体积 ( p 1 )终浓度/ 活度 1 0 x b u f f e r2 . 5 1 x b u f f e r d n t p2 n m o l / l 2 . 5 2 0 0 p m o l / u 1 t a q 酶5 u / a 10 . 2 5l u m g c l z2 5 m m o l / l1 . 5 1 . 5 n m o l / u 1 正向引物l o p m o l / 1 12 . 5 l p m o l / 1 i 1 反向引物 l o p m o l / 1 , 1 2 . 5 l p m o l / 1 + 1 模板d n a0 . 2 5 d d h z 01 3 加完试剂后于4 0 0 0 r p m 离心5 s 使附着在管壁的试剂都聚集到管底。p c r 扩增循 环参数: c h i b : 热盖: 1 1 0 0 c ; 预变性: 9 4 0 c , 5 m i n ; 扩增: 9 4 0c , l m i n , 5 8 0 c , l m i n , 7 2 0 c , 1 . 5 m i n ; 循环数:3 0 :延伸:7 2 0 c , 1 0 m i n c h i c : 热盖: 1 1 0 0 c ; 预变性: 9 4 0 c 5 m i n ; 扩增: 9 4 0 c , l m i n , 6 0 0 c , l m i n , 7 2 0 c , 1 . 5 m i n ; 循环数: 3 0 ;延伸:7 2 c , 1 0 m i n 1 . 2 . 4 凝胶回收: 割下目 的凝胶块，置于 1 . 5 m l e p管中。按照 3 0 0 a l / 1 0 0 m g的比例加入 b i n d i n g b u f f e r , 5 5 水浴， 5 m i n( 每2 m i n 翻转混合一次) 。 加入4 11 1 硅胶悬 浮液，5 5 0 c 水浴，5 m i n( 每2 m i n 翻转混合一次) 。1 3 0 0 0 r p m 离心5 s ，弃上清。 加入5 0 0 “ 1 w a s h b u f f e r 漩涡混合然后1 3 0 0 0 r p m 离心5 s , 弃上清( 连续3 次) 。 四川人井 ll)l 学位论文 放入3 7 0 c 烘箱干燥2 0 m i n ，加2 0 p l 无 菌d d h , o ，悬浮硅胶沉淀，5 5 t水浴， 5 m i n , 1 3 0 0 0 r p m 离心5 s ，收集上清液于1 干净无菌e p 管中 ( 连续2 次) 。 1 . 2 . 5 p c r产物测序鉴定: 测序由上海生工生物工程有限公司完成。 1 . 2 . 6 c h i b , c h i c序列的分析: 通过n c b i 网上数据库提供的已知序列检索和同源性比对功能完成。 1 . 2 . 7 全长序列的限制性酶切位点分析: 利用软件 p r i m e r p r e m e r 5 . 0 进行。 1 . 2 . 8 c h i b , c h i c的大肠杆菌初步表达研究: p c r 产物c h i b , c h i c 纯化后采用h i n d u i 和e c o r i 双酶切， 然后与同 样用 h i n d i ii 和e c o r i 双酶切的载体p b l u e s k 连接 ( p b l u e s k 见图1 ) ，转化感受态大 肠杆菌j m 1 0 9 ， 进行初步表达，重组子利用蓝白 斑筛选和几丁质平板初步鉴定。 相关操作见分子克隆实验指南 t7 ，砚.尽互皿目端冬 弓召国巴 阵打叭又 ，势. 幼+ 誉一 言工 盯乙1出11牙旦 奋一 趁七翅奋-盖盆一 星.蕊竺1 架泣奋 忿给门 牛络- 之- 甘.1 告奥1 常- 翻自- 身- 言一 舍价-一 奋劝- 犷一 闷p+ 巨注- 图1 :载体p b l u e s k 结构及m c s 区限制性曲切位点组成 2 结果与分析 2 . 1 引物设计 由软件p r i m e r p r e m e r 5 . 0 引物分为两套， 第一套引物5 完成，引物的扩增区包括了预期的全部编码区。 端不设计酶切位点， 仅用于扩增和测序验证目的 2 6 四川大学硕士学位论文 针对粘质沙雷氏 菌几丁质酶酶学性质的研究资料显示，其a , b 类儿丁 质 酶主要表现出外切酶活性， 而c 类几丁质酶主要体现为内切酶活性。 所以c h i c 在几丁质平板上产生水解圈的能力很弱。相应的表达和酶活检测不能 通过简便直观的平板法来进行，这给重组子筛选带来 了一定困难。比 色法 ( 如b o l l e r 法) 可能是一个适宜的方法， 对其表达和检测的研究现正在进 行中。 3讨论: 3 . 1 p c r扩增的退火温度。 c h i b 对应正向引物的t m 值计算为 5 7 . 1 0 c ，反向引物 t m值为 5 9 . 0 0 c ，但 是其退火温度达到5 8 t时，扩增片段电泳检测仍然亮度很高，而且非特异扩增 的小片段明显减弱，显示该温度是适宜的退火温度。同样，c h i c 的正、反向引 物的计算 t m 值分别为5 6 . 8 0 c 和 5 6 . 4 0c ，但是退火温度升至 6 0 0 c时扩增片段依 然亮度很高，非特异扩增明显减弱，表明6 0 为适宜的退火温度。根据分子克 隆 试验指南提供的 操作方法， p c r 反应的 退火温度一般应低于引 物t m 值3 5 c w , 但是本试验中引物的适宜退火温度与t m值相近或高出，这似乎说明在计算 t m 值可靠的前提下，引物的退火温度更多的决定于引物序列设计是否合理，而受 t m 值的限制较小。 3 . 2外切酶和内 切酶的检测 同源性分析结果显示。 h i b 和c h i c 分别与粘质沙雷氏 菌b j l 2 0 0 的b 类和c 类几丁质酶基因高度同 源，可由 此推测二者的表达产物的性质分别与b类和 c 类几丁质酶高度相近。而b 类和c类几丁质酶据研究，分别表现出外切酶和内 切酶的活性，所以在对c h i b和c h i c 表达产物的检测中有必要考虑二者酶学性 质不同而采用不同的检测方法。c h i b 为外切酶，在几丁质平板上可产生可见的 水解圈，因而平板法就可以检测其酶活性的有无并用于筛选目 标重组子。c h i c 为内切酶，据相关的研究，内切酶在几丁质平板上产生的水解圈远不如外切酶 明显， 可以推测，这将给检测和重组子筛选带来困难， 平板法对c h i c 的检测也 许不适用。那么对于内切酶检测，比色法或许是一个适宜的选择。比色法 ( 如 第一章中采用的b o l l e r 法) 的步骤和操作与平板法相比 相对繁琐， 结果也不如 前者直观，但是优点也很明显，除可检测内切酶外，其灵敏度也高于平板法， 而且还可进行量化比较，这为重组基因的表达条件的优化也提供了方便。 3 5 四川人 学硕 i 学位论文 对于几丁质外切酶和内切酶的检测尚待一种统一且简便准确的方法，这将 是一个有意义的研究方向。 3 . 3 几丁质酶基因的同源性和多样性 3 . 3 . 1 同类基因的同源性 同源性分析结果显示c h i b 和c h i c 分别与粘质沙雷氏菌b j l 2 0 0 的b 类和c 类几丁质酶基因高度同源 ( 分别到达了9 6 % 和 9 7 % ) 。说明粘质沙雷氏菌不同菌 型之间的同类几丁质酶基因序列具有高度同源性。因为几丁质酶是参与将几丁 质降解为小分子寡糖和单糖( n a g ) 的关键酶， 承担着为粘质沙雷氏菌提供c 源、 n 源的重要生理功能，因而其在进化上必然是保守的， 这导致了不同菌型之间同 类基因序列高度的同源性。 3 . 3 . 2 同类基因的差异性 同时二者还分别存在 4 % 和 3 % 的差异，差异的产生主要来源于基因本身的 变异和测序过程中的误差。当前主要采用的是基于双脱氧链终止法原理的测序 技术， 技术本身的限制使得序列靠近5 和3 端的3 05 0 个碱基的准确度较低， 可靠性不高， 严重时可远至7 0 碱基， 成为产生差异性的一个原因。 而占 序列大 部的中间部分的差异主要来源于基因突变，又以单碱基的置换为主，这些突变 位点一部分由于氨基酸密码子的简并性而无法反映在酶蛋白的一级序列上，其 对于酶活性和功能的影响也得以消除。另一部分突变会造成氨基酸的改变，但 如果该位点氨基酸不在酶的催化区和底物结合区，影响也会大大降低。最终， 仅有极少量的突变可能会影响到酶特性和活性。综上所述，菌株之间序列的差 异对于酶活性产生影响的几率极小。所以，在一菌种不同菌型之间，同类几丁 质酶基因序列虽有差异，但其特性和催化功能基本相同，差异仅体现于酶活力 的相对高低，这一点也与公认的观点和研究结论一致。 3 . 3 . 3 粘质沙雷氏菌几丁质酶基因的多样性 但是c h i b 和c h i c 之间无任何显著同源性， 显示二者虽然来源于同一菌种， 却代表了根本不同的两类几丁质酶， 这反映了 粘质沙雷氏 菌几丁质酶的多样性。 对粘质沙雷氏菌菌株b j l 2 0 0 的研究发现其至少具有。 h i a , c h i b 和c h i c 三种几 丁质酶和一种与几丁质降解相关的小分子辅助蛋白。根据近年来几丁质酶的研 3 6 四川大学硕上学位论文 究报告，微生物几丁质酶的多样性是一个很普遍的现象，比如环状芽抱杆菌 ( b . c i r c u l a n s w l - 1 2 ) 具有六种几丁 质酶、 链霉菌 ( s t r e p t o m y c e s s p ) 拥有两类 几丁质酶，一种是外切酶，一种是内切酶。而且同种菌的各种几丁质酶的降解 能力，最适反应温度、p h 值，分子量，等电点，影响酶活性的金属离子都不相 同5 。 这些发现也有助于我们理解粘质沙雷氏 菌几丁质酶的多样性。 3 . 4 几丁质酶基因多样性的重要意义及其生防应用价值 微生物几丁质酶的多样性是一个有趣的问题， 微生物为什么会在进化过程 中使同一菌体拥有不同的多种几丁质酶?其最主要原因应该是对环境的适应和 生存的需要。研究发现，几丁质这种高分子化合物在自 然界很少单独存在，它 作为生物体的结构成分，往往位于细胞壁 ( 如真菌)或者是体表 ( 如虾、蟹、 昆虫) ，而且大多是同其他生物高分子如蛋白质、纤维素等形成紧密的复合体. 而且不同生物中结合的形式，结合物的种类，结合的紧密程度都不尽相同。不 同的几丁质复合体的降解相应要求不同性质的几丁质酶。微生物为了更多的利 用环境中的几丁质作为其生命活动的c源与能源，增强对环境的适应能力和生 存能力，在进化过程中逐渐形成了包括多种几丁质酶的酶系统，从而扩大了利 用几丁质的范围，增强了自 身的环境适应能力。当然，即便如此，每一种微生 物仍然不能降解自 然界中所有种类的几丁质复合物，因而表现出了自 身的降解 范围和针对性。 几丁质酶的多样性在植物病虫害防治中体现为几乎所有含几丁质的病原 生物都能找到其天敌微生物，但同时每种生防菌只对某种( 或几种) 病原菌有明 显的防治效果，而对其他病原菌效果不明显或无效，即具有特定的抑菌谱。如 粘质沙雷氏 菌提纯的几丁质酶对立枯丝核菌培养物有显著抑制作用;团集肠杆 菌可使棉立枯病减轻6 4 % -8 6 % ;而昆虫及昆虫病原菌来源的几丁质酶基因对病 原昆虫的抗性最好。其原因正是微生物几丁质酶基因的总体多样性和每一种酶 基因的结构特异性。 在生物防治中，应该充分考虑几丁质酶的多样性的特点，将产不同性质几 丁质酶的生防菌联合使用以便扩大抑菌、杀虫谱，同时，不同抑菌机制的生防 菌联合使用还有助于提高杀灭效果和减缓病原生物抗性的产生。 四川大学硕 1 _ 学位论文 结论 1以第一部分中筛选的具有较高几丁质酶活力的粘质沙雷氏菌 ( s e r r a t i a m a r c e s c e n s )为供体菌，以其总d n a为模板，根据n c b i 数据库提供的粘质沙 雷氏菌菌株 b 儿2 0 0的包括全长编码区的同源序列分别设计了针对其b类和 c 类几丁质酶基因的引物， 通过p c r扩增， 得到了预期大小的片段， 分别为c h i b , c h i c ，其大小分别为 1 . 7 k b和 1 .6 k b 。对二者全长测序，将测得序列再同n c b i 数据库中的粘质沙雷氏菌菌株b j l 2 0 0 相应几丁质酶基因序列进行对比分析， 发 现其同源性分别达到% 和9 7 %，证实了扩增片断的确为粘质沙雷氏菌的几丁 质酶基因。但 c h i b和 c h i c之间却无显著的同源性。比对结果说明粘质沙雷氏 菌不同菌型的同一类几丁质酶在进化上高度保守，而共存于同一菌株的不同类 的几丁质酶之间却缺乏同源性。 2将c h i b 与载体p b l u e s k 连接， 转化受体菌e . c o l i j m 1 0 9 ， 然后利用蓝白 斑筛选获得少量白 色重组子， 将重组子全部点种于几丁质平板上， 3 7 培养7 2 h 观察到部分菌落周围有水解圈产生， 表明c h i b 在大肠杆菌中可获得表达， 但其 水解圈的透明度弱于出 发菌株， 其原因可能在于:( 1 ) 单一几丁质酶的降解效 率低于几种几丁质酶的协同降解; ( 2 )酶重组表达后，分泌效率下降; ( 3 ) 表达条件还有待优化。 c h i c 也采用同样的方法进行重组和转化， 但是由于c h i c 几丁质酶是内切酶，平板法对于其酶活测定和重组子筛选可能不适用，拟采用 比色法，其具体的表达和检测方法的研究尚在进行中。 3由于c h i b 和c h i c已被确认为来自 粘质沙雷氏菌的几丁质酶基因，代表 两种不同的几丁质酶。对二者的表达研究将为该类基因在植物病虫害防治领域 的实用化提供前期准备工作和可行性的探讨。 四川人学6 ( i _ 学位论文 参考文献: 1分子克隆实验指南， 美 ， j 萨姆布鲁克 ， d w 。 拉塞尔著， 黄培党等译， 科学出 版社， 2 0 0 2 0 2张表，赵晓瑜，乔环宇，粘质沙雷氏菌 ( s e r r a t i a m a r c e s c e n s )儿丁 质酶基因克隆的筛 选及序列分析， 河北大学学报 ( 自 然科学版) ， 2 0 0 3 年6 月第23 卷第2 期:1 8 4 1 8 7 , 3 冯书亮， 松本继男， 范秀华等， 一株粘质沙雷氏菌菌株的鉴定及对黄胫小车蝗的毒力测 定，中国生物防治，2 0 0 2 年1 1 月，1 8 ( 4 ) : 1 5 8 - 1 6 1 0 4欧阳石文，谢丙炎，赵开军等，转几1 质酶基因研究进展，生物技术通报，2 0 0 1 年第 3 期:2 8 3 1 0 5冯波， 微生物几丁质酶的研究概况， 天津师大学报 ( 自 然科学版) ，1 9 9 8 年 9月第 1 8 卷第3 期: 5 0 - 5 6 , 6李继红，邵寒箱，郑学勤。烟草工 类几丁质酶和fl - 1 , 3 - 葡聚糖酶c d n a 在大肠杆菌中 的表达，生物工程学报，1 9 9 8 年7 月1 4 卷3 期:3 0 9 - 3 1 3 0 7 k o b y s , s c h i c k l e r h .t h e c h i t i n a s e e n c o d i n g t o- b a s e d c h i a g e n e e n d o w s p s e u d o m o n a s fl u o r e s c e n c e w i t h t h e c a p a c i t y t o c o n t r o l p l a n t p a t h o g e n s i n s o i l . j .g e n e , 1 9 9 4 , 1 4 7 ( 1 ) : 8 1 . 8 j e s u s d c 沐n t o n i o h g , j o s e n m. p u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f c h i t i n a s e fr o m 7 l i c h o d e r m a h a r z i a n u m.e u r j b i o c h e m, 1 9 9 2 , 2 0 6 : 8 5 9 - 8 6 7 9 b ro g l i e r , j .c e l l .b i o c h e m , 1 4 :2 7 6 , 1 9 9 0 . i o f u c h s r l . p u r i fi c a t i o n a n d p r o p e rt i e s o f c h i t i n a s e s fr o m s e r r a t i a m a m e s c e n s . e n v i ro mi c r o b i o l , 1 9 8 7 , 5 3 ( 7 ) : 1 7 1 8 - 1 7 2 0 . 1 1 t a k e s h i w , w a t a r u o , k a z u s h i s e t a l . c h it i n a s e s y s t e m o f b a c i l l u s c i r c u l a n s wl - 1 2 a n d i m p o rt a n c e o f c h i f n a s e a i i n c h i t i n d e g r a d a t i o n . b a c t e r i o l , 1 9 9 0 , 1 7 2 ( 7 ) : 4 0 1 7 - 4 0 2 2 . 1 2 p e l l e t i e r a s y g u s c h j , p u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e ri z a t i o n o f t h r e e c h it i n a s e s a c t iv it i e s fr o m b a c i l l u s m e g a t e r i u m p 1 .a p p l e n v i r o n m i c ro b i o l , 1 9 9 0 , 5 6 ( 4 ) : 8 4 4 - 8 4 8 1 3 b e y e r m, d i e k m a n a h .t h e c h i t i n a s e s s y s t e m o f s t r e p t o m y c e s s p . a t c c 1 1 2 3 8 a n d i t s s i g n i f i c a n c e f o r f u n g a l c e l l w a l l d e g r a d a t i o n .a p p l , m i c ro b i o l .b i o t e c h n o l . 1 9 8 5 , 2 3 : 1 4 0 - - 1 4 6 . 1 4 r o w e n a l p , e n r i c o c , s e r r a t i a m a r c e s c e n s c h i t i n a s e : o n e - s t e p p u r i f i c a t i o n a n d u s e f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f c h i t i n .a n a l b i o c h e m , 1 9 8 2 , 1 2 7 :4 0 2 - -4 1 2 . 1 5 t r a c h u k l a , r e v i n a l p s h e m y a k i n a . t m e t a l . c h it i n a s e s o f b a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s b - 6 8 3 9 : i s o l a t i o n a n d p r o p e rt i e s .c a n a d i a n j m i c r o b i o l , l 9 9 6 ,4 2 ( 4 ) : 3 0 7 - 3 1 5 . 四川大学硕士学位论文 文献综述 第一章:粘质沙雷氏菌的几丁质酶 摘要 :粘质沙雷氏菌是降解几丁质的最有效的细菌之一，几丁质是由 0 - 1 , 4 糖昔键连接而成的多聚n 一 乙酞- 0 - d - 葡萄糖( g 1 c n a c ) 。 粘质沙 雷氏菌中的几丁质酶至少包括四种酶和一种几丁质结合蛋白，对此酶 学及酶的结构研究为一系列几丁质酶的构成方式提供了理解方向。从 粘质沙雷氏菌中提取的几丁质酶可作为防治真菌和除虫的生物制剂加 以应用 。 前言 几丁质是由h - 1 , 4糖昔键连接而成的多聚 n一乙酞一0 -d-葡 萄糖 ( g 1 c n a c ) ，是自然界存在的含量仅次于纤维素的多聚物，它是 昆虫骨骼的甲壳质外壳的主要组成成分，同时也存在于多种真菌的细 胞壁中。与几丁质大量分布相对应的是几丁质酶也在从原核生物到人 类等多种生物体内被发现。在含几丁质的生物体中，几丁质酶在它们 正常的形体发育和细胞分裂周期中扮演了重要的角色，而植物产生几 丁质酶是作为其真菌防御机制的一部分。还有许多细菌和真菌分泌几 丁质酶，用于将几丁质转化成提供能量的化合物。 几丁质酶属于 1 8 和 1 9家族的葡萄糖昔水解酶。 第 1 8 族的酶存在 于多种原核和真核生物中， 但是第 1 9家族的几丁质酶仅在高等植物和 革兰氏阴性菌链霉菌中有发现，这两族都同时含有几丁质内切酶 ( 在 几丁质链中随机切割)与几丁质外切酶 ( 从几丁质链的还原性末端或 是非还原性末端开始切下几丁二糖，几丁三糖单位，两种外切酶分别 称为几丁二糖酶或 ( n , n 一 二乙酞几丁质外切水解酶)和几丁三糖酶或 ( n , n,n 一 三乙酞几丁质外切水解酶) 。除了几丁质内切和外切酶以外， 在降解几丁质的生物体内还存在一种几丁质酶 ( n 一 乙酞- 0 - d - 葡萄糖 昔酶) 。这第三种几丁质酶类可将几丁二糖转变为单糖。 几丁质酶类具有很大的生物工程价值 。首先，这些酶类可 以用与 将富含几丁质的生物质降解为有用的成分;其次，几丁质酶可被开发 用于植物的真菌和昆虫病害的生物防治;第三，几丁质酶抑制剂对含 几丁质的植物病原真菌和害虫的生长有潜在的抑制意义，因为它们的 正常发育需要几丁质酶的作用。 四川大学硕_ 卜 学位论文 革兰氏阴性菌粘质沙雷氏菌分泌包括几丁质酶类在内的多种胞外 酶，粘质沙雷 氏菌是降解几丁质能力最强的细菌之一。当此菌在有几 丁质的环境中培养时，可以检测到多种几丁质酶和几丁质结合蛋白。 仅用生化方法很难确定几丁质酶类的具体数 目。因为一些酶会以多聚 体形式存在，比如表现在 s d s聚丙烯酞胺凝胶电泳的条带上。几丁质 结合蛋 白的多样性是因为几丁质酶类都具有多结合域的结构特征，这 使得它们对蛋白质的部分降解产物很敏感。许多研究小组深入研究清 楚表明粘质沙雷氏菌会产生至少3 种几丁质酶 ( c h i a , c h i b , c h i c ) ， 一 种几丁质糖昔化酶和一种推测性的几丁质结合蛋白。尽管不能肯定， 但是可以设想， 此 5 种蛋白质代表了该细菌中降解几丁质的全部组件。 粘质沙雷氏菌中降解几丁质的整个组件 由于是 目前为止特性最优 良的 几丁质降解系统，因而具有巨大的价值。最近测定出的 c h i a , c h i b和 几丁质糖昔化酶 的晶型结构有助于对 自然界酶体系的构建的深入了 解 。 在本文中，我们会对当前得到的有关构建粘质沙雷氏菌中几丁质 溶解酶体系的基因和蛋 白质的知识作一纵览，主要集中于几丁质酶的 c h i a , c h i b , c h i c 。另外，一些关于此体系的有趣而尚未完全解决的问 题也会提出讨论。 与几丁质降解相关的蛋 白质 对受几丁质诱导的粘质沙雷氏菌产生的蛋白质进行的生化分析可 以得到许多相关的组分，在 s d s - p a g e凝胶电泳后可由其相对分子量 的差异得以辨别，后继的基因分析进一步揭示了细节部分的情况. c h i a最初作为一个有 5 6 3 个氨基酸残基的前体而产生，伴随其n 端信号肤的切割被分泌到胞外，最终得到一个有 5 4 0个氨基酸残基的 酶，相对分子量为 5 8 . 5 k d a 。尽管 c h i b最终也是要被运至粘质沙雷氏 菌胞外，除了切除n端的甲硫氨酸残基外，c h i b基因的原初产物似乎 无其他形式的加工，成熟的c h i b蛋白质含有4 9 8 个氨基酸残基，相对 分子量5 5 . 4 k d a a c h i c基因在粘质沙雷氏菌中产生多种具有差异的c h i c 蛋白，而在重组后的大肠杆菌中产生两种不同的差异蛋白。一种是有 重组大肠杆菌产生的完整长度的 c h i c 1 含有 4 7 9个氨基酸残基，相对 分子量为 5 1 . 6 k d a ;另一种称为 c h i c 2 ，其蛋白质的 c末端被切割过， 大约含有 3 2 5个氨基酸残基。( c h i c 2的精确长度在早前的两篇报道中 有差异) 。在粘质沙雷氏菌中，c h i c无伴随 n端信号肤切除的报道。 然而 n端非特异性的加工结果产生了一系列有微小差异的蛋白质，区 别为n端缺失了 8 - 1 2个不等的氨基酸残基。 对c h i a , c h i b , c h i c的一级结果的分析以及对其现有的三维立体构 型的对照显示这些酶类都有一种构造模式，此构造普遍存在于能降解 四川大学硕 卜 学位论文 诸如几丁质和纤维素等不溶于水的生物大分子的酶的结构中。所有着 三种粘质沙雷氏菌的几丁质酶均含有一个具有葡萄糖昔水解酶 1 8家 族特征的催化域 ( 例如 s x g g和 d x x d x d x e序列模体)另外，每一 类酶均推测含有底物结合区域。催化区域的线性序列有相对大量的长 段插入或缺失序列作为其特征 。一些该序列与额外区域的位置和多样 性有一定关系。 第 4个涉及几丁质降解的酶是相对分子量为 9 5 k d a的几丁质糖昔 化酶，他属于葡萄糖昔水解酶 2 0 家族。此酶产生于一种含有 8 8 5 氨基 酸残基的前体， 随着一种典型的2 7 氨基酸残基n端信号肤的剪切， 成 熟的酶被运往胞外，几丁质糖昔化酶有 4个区域，好些区域功能未知。 其催化域的整体折叠情况与属于 1 8家族的几丁质酶相同， 但是其活性 位点的构造有别。在几丁质的诱导下，粘质沙雷氏菌至少还会产生另 外一种不具催化 能力但能结合几丁质 的蛋 白质 。这个相对分子量为 2 1 k d a的几丁质结合蛋白由其 1 9 7氨基酸残基的前体得来，转运过程 中进行了典型的 n 端导肚 2 7氨基酸残基的切割。成熟蛋白质共 1 7 0 个氨基酸残基， 相对分子量为 1 8 . 8 k d a ， 此蛋白的氨基酸序列与链霉菌 中的一种几丁质结合蛋白有 4 5 %的相似性，其总体特征 ( 如芳香族氨 基酸的存在情况)类似于已知的纤维素酶中的纤维素结合域。 表 1 :粘质沙雷氏菌的几丁质脚及相关蛋白质 分子量( k d a )基因/ 蛋白质名称细胞定位n端信号肤 5 7 5 8 c h i a ( c h i a )胞外有 5 2 - 5 4 c h i b ( c h i b )周质/ 胞外无 4 8 -5 2 c h i c l ( c h i c i ) 胞外无 3 5 3 6 c h i c 2 ( c h i c 2 )胞外无 9 5ch b 周质有 2 1 - 2 2 c b p ( c b p 2 1 ) 胞外有 转运与定位 粘质沙雷氏菌中的几丁质溶解酶体系的转运与定位有许多有趣的 特征。c h i a和 c p b 2 1 含有的n端信号肚在此蛋白向培养基分泌的过 程中被切割. n端的信号肤是向周质分泌的分泌性蛋白质具有的特征。 当被转运的蛋白到达周质后，信号肤就会被周质信号肤水解酶切掉， c h i a和c p b 2 1 转运至细胞膜外的机制尚无知晓. 几丁质糖昔酶同样也 含有在转途中被切割掉的n端信号肤，最新数据表明它天然定位与周 质 。 c h i b和 c h i c在粘质沙雷氏菌的周质和培养基中均有发现，但此 4 2 四川大学硕学位论义 二类酶无典型的n端信号肤， 没有数据表明 c h i ll经过任何蛋白质切割 加工，而 c h i c的蛋白质切割加工似乎更像是某种非特异的而非与转运 相关的过程。在 e . c o l i 中，此两种酶都含有经历无 n端信号肤参与的 蛋白质加工，并且它们多被发现存在于胞质部分，由此粘质沙雷氏菌 似乎具有一种 e . c o l i 所不具有的转运机制。 粘质沙雷氏菌所知拥有非分泌依赖性的蛋白质分泌机制。 比方说， 蛋白酶 h a s a和p r t s m及脂酶 a的分泌需要类似 a b c的转运蛋白的介 导。但是，具一般认为，此类转运机制所需的序列特征迄今为止还未 在 c h i ll和 c h i c中找到，这意味着此二类几丁质酶的转运机制仍然未 知。也有报道在s p h i n g o m o n a s p a u c i m o b i l i s 存在无任何识别序列的蛋 白质转运。尽管可以确定 c h i ll和 c h i c都被运往胞外，此二酶的的精 确定位却无从知晓。免疫细胞化学法研究表明c h i ll定位于粘质沙雷氏 菌 b j l 2 0 0的周质成分中。细胞裂片研究也证实了 c h i ll主要存在于周 质成分中。但是另外有研究小组在培养基中发现了微量的 c h i ll ，从而 得出结论 c h i ll本来就是要分泌到细胞外的环境中的。可以想象，培养 条件和细胞分裂法所产生的假相是造成此观察区别的原因。c h i c认为 是胞外酶，但其定位不及 c h i ll定位研究细致。显然，c h i ll与 c h i c的 天然定位需要由更加严密的研究来证实，同时也用以辩明两类酶的转 运机制的差异。 概括而言，粘质沙雷氏菌中几丁质酶体系的通过至少两种不同的 转运方式来定位于周质和细胞外培养基环境中。大多数来自于其他细 菌的几丁质酶都是带有 n端信号肚的分泌酶类。 c h i a和 c h i ll的结构 单结合域的 1 8家族的几丁质酶和多结合域的粘质沙雷氏菌的 c h i a几丁质酶的晶体结构的发表是 1 8家族几丁酶研究的里程碑。 这些 结构表明 1 8家族几丁质酶的催化域具有一个 t i m一桶式折叠。 ，它们 揭示了催化中心的各个方面的情况。c h i a 结构的特殊性在于它的完 整。作用于不溶性底物如几丁质、纤维素的多结构域的酶类很少具有 完整结构。据猜测，其产生的原因在于该类酶具有承受多种酶切割的 潜能，单个结合域有大程度的可变性 ，这两种特性可以避免结晶化 。 1 9 9 4年至今，又有 3种 1 8家族几丁质酶的结构被发表，它们是:来 自枯草芽抱杆菌几丁质酶的 al 催化域， 来自真菌 c o c c i d i o i d e s i m mi t i s 的单结构域的几丁质酶的完整结构以及来 自粘质沙雷氏菌的二结构域 的几丁质酶 c h i ll的完整结构。 在图 2中展示的是 c h i a和 c h i ll的结构 质酶如何构建提供了