（遗传学专业论文）羟自由基诱导细胞凋亡及相关生物力能学研究.pdf

abs tract a p o p t o s i s o r p r o g r a m m e d c e l l d e a t h , i s a n e s s e n t i al l i f e p h e n o m e n o n i n c e l l s o r o r g a n i s m s w h i c h i s n o t o n l y i n v o l v e d i n c e l l p r o l i f e r a t io n , d i f f e r e n t i a t i o n , a g e i n g , c a r c i n o g e n e s i s a n d d e v e l o p m e n t e t c . n o r m a l p h y s i o l o g i c al p r o c e s s e s , b u t a l s o c l o s e l y r e l a t e d t o m a n y p a t h o l o g i c al p r o c e s s e s . i n r e c e n t t e n y e a r s , t h e m o l e c u l a r a n d c e l l u l a r m e c h a n i s m s o f a p o p t o s i s h a v e b e e n e x t e n s i v e i n v e s t i g a t e d . s e v e r a l a p o p t o t i c p a t h w a y s , p a rt i c u l a r l y c a s p a s e / c y t o c h r o m e c p a t h w a y , h a v e b e e n i d e n t i f i e d . h o w e v e r , i t i s q u i t e u n c l e a r t h a t w h a t a r e t h e k e y f a c t o r s c a u s e a c e l l t o d e c i d e t o c o m m i t s u i c i d e . t h e p r e s e n t s t u d y p a y s a t t e n t i o n t o t h e b i o e n e r g e t i c al m e c h a n i s m o f a p o p t o s i s . f i r s t , w e a p p l i e d a r e s e a r c h m o d e l f o r s t u d y i n g t h e m e c h a n i s m o f a p o p t o s i s b y t h a t t h e e x p o s u r e o f h e l a c e l l s t o e x o g e n o u s h y d r o x y l r a d i c a l s ( o h ) . h y d r o x y l r a d i c al s i n d u c e d t y p i c a l a p o p t o s i s i n h e l a c e l l s a s d e t e c t e d b y d a p i s t a i n i n g , t h e t u n e l p r o c e d u re , a n n e x i n v a s s a y , d n a f r a g m e n t a t i o n a n d fl o w c y t o m e t ry a n al y s i s s e c o n d , w e s t u d i e d t h e c h a n g e s o f b i o e n e r g e t i c s d u r i n g a p o p t o s i s o f h e l a c e l l s i n d u c e d b y t r e a t m e n t o f t h e e x o g e n o u s h y d r o x y l r a d ic al s . o u r s t u d y p r o v i d e d e v i d e n c e s f o r b e t t e r u n d e r s t a n d i n g t h e e a r l y d e c i s i o n o f a p o p t o s i s . r e s u l t s in d i c a t e d t h a t t h e m e t a b o l i s m o f c e l l e n e r g y / o x i d a t i o n - r e d u c t i o n h a d c h a n g e d d r a m a t i c al l y d u r i n g t h e e a r l y a p o p t o s i s a f t e r o h - t re a t m e n t . k i n e t i c a n a l y s i s s h o w e d t h a t d n a w a s n o t d e g r a d e d i n t o d n a l a d d e r s u n t i l t h e c e l l s o f h e l a t h e r m o d y n a m i c p r o c e s s s h i f t e d f r o m e x o t h e r m i c t o e n d o t h e r m i c s t a t e a n d t h e m i t o c h o n d r i al细j . w as c o m p l e t e l y c o l l a p s e d . a l l t h e re s u l t s e x h i b i t e d a p o s s i b l e a p o p t o s i s m e c h a n i s m t h a t d i s o r d e r o f e n e r g y m e t a b o l i s m a n d c h a n g e s i n o x i d a t i o n - r e d u c t i o n s t a t e c a u s e d b y o h - t r e a t m e n t m i g h t b e t h e e a r l y e v e n t s t h a t l e d t o c e l l a p o p t o s i s . t h i r d , w e s t u d i e d t h e i n h i b i t i o n o f t y p e i c o l l a g e n f r o m h y d r o x y l r a d ic al s i n d u c e d a p o p t o s i s . r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t t y p e i c o ll a g e n w a s a b l e t o , b y s c a v e n g i n g h y d r o x y l r a d i c al s , i n h i b i t e d t h e c h a n g e s o f b i o e n e r g e t i c s i n t h e i n i t i a l s t a g e o f a p o p t o s i s a n d p r e v e n t f r o m a p o p t o s i s i n d u c e d b y o h - t r e a t m e n t . f o u rt h , w e s t u d i e d t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t e l o m e r a s e a c t iv a t i o n a n d b c l - 2 e x p r e s s i o n i n s e v e r al c e l l l i n e s , a n d t h e e f f e c t o f e x p r e s s i n g e x o g e n o u s t e l o m e r a s e o n h o s t c e l l s ( h u m a n l u n g f i b r o b l a s t c e l l s , 2 b s ) . o u r r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e r e w a s a p o t e n t i a l l i n k a g e b e t w e e n t e l o m e r a s e r e a c t i v a t i o n a n d b c l - 2 e x p r e s s i o n , n a m e l y t h e o v e r e x p r e s s i o n o f t e l o m e r a s e c o u l d d o w n - r e g u l a t e d t h e b c l - 2 e x p r e s s i o n , a n d w e a l s o f o u n d t h a t e x p r e s s in g o f e x o g e n o u s t e l o m e r a s e c o u l d e n h a n c e t h e r e s i s t a n c e o f h o s t c e l l s t o a p o p t o s i s , d e l a y a g i n g a s w e l l a s b r i n g a b o u t t h e e n e r g y m e t a b o l i c a lt e r a t i o n a s e v i d e n c e d b y t h e m e as u r e m e n t s o n c e l l c y c l e s , c e l l o x y g e n c o n s u m i n g r a t e a n d m i t o c h o n d r i a l t r a n s m e m b r a n e p o t e n t i a l . f i f t h , w e i d e n t i f i e d t w o n e w g e n e s i n v o l v e d i n c e l l t r a n s f o r m a t i o n t h r o u g h a n a l y z i n g t h e e x o g e n o u s m u t a t e d p 5 3 o v e r - e x p r e s s i n g c e l l s , a n d s e t e d u p a s i m p l e a n d r e p r o d u c i b l e m e t h o d f o r s e p a r a t i n g d i f f e r e n t i a l e x p re s s i o n g e n e s . r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e a c t i v a t i o n a n d i n a t i v a t i o n o f g e n e s w e r e i n v o l v e d i n t h e p r o c e s s o f t h e s p o n t a n e o u s t r a n s f o r m a t i o n f r o m n o r m a l c e l l s ( r 6 # 1 3 - 6 ) t o t u m o r c e l l s ( t 2 ) . t h e m e t h o d w i l l s e r v e a s a n e w a n d e f f e c t i v e g e n e c l o n e t o o l f o r s t u d y i n g t h e r e g u l a t i n g m e c h a n i s m o f t e l o m e r as e o n a p o p t o s i s a n d c a r c i n o g e n e s i s . t o s u m u p , i t i n d i c a t e d t h a t t h e e n e r g y m e t a b o l i c d i s o r d e r c o u l d b e t h e p r i m a r y e v e n t d u r i n g a p o p t o s i s a n d t h e c o l l a p s e o f b i o e n e r g e t i c b a l a n c e m a y b e a k e y f a c t o r r e s u l t i n g i n c o m m i t s u i c i d e o f t h e c e l l s d u r i n g a p o p t o s i s i n d u c e d b y . o h - t r e a t m e n t . i t a l s o d e m o n s t r a t e d f i r s t l y t h a t t y p e i c o l l a g e n c o u l d s u p p r e s s t h e a p o p t o s i s i n d u c e d b y - o h - tr e a tm e n t b y s c a v e n g i n g f re e r a d i c a l s a n d b e f a v o r a b l e t o k e e p t h e e n e r g y b a l a n c e o f t h e c e l l s a s w e l l . o n t h e o t h e r h a n d , o u r re s u l t s i n d i c a t e d t h a t t h e n e g a t i v e c o r r e l a t i o n b e t w e e n t e l o m e r a s e re a c t i v a t i o n a n d b c l - 2 e x p r e s s i o n , a n d t h e e x p r e s s i o n o f e x o g e n o u s t e l o m e r a s e s i g n i f i c a n t l y c h a n g e d t h e e n e r g y m e t a b o l i s m o f t h e h o s t c e l l s . we h a d s e t u p a n e w m e t h o d f o r s e p a r a t i n g d i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n g e n e s a n d c l o n e d t w o n e w c a n c e r - r e l a t e d g e n e s . t o g e t h e r , w e p r o v i d e d v a lu a b l e c e l lu l a r b i o e n e r g e t i c a l i n f o r m a t i o n f o r u n d e r s t a n d i n g t h e m e c h a n i s m o f a p o p t o s i s a n d s o m e d i s e a s e s s u c h a s c a r c in o g e n e s i s a n d o f f e r e d c e rt a i n a v a i l a b l e t h e o r e t i c a l p r i n c i p l e s f o r h e a l t h c a r e a n d p r e v e n t i o n o f d i s e a s e s . k e y w o r d : h y d r o x y l r a d i c a l s a p o p o t o s i s e n e r g y m e t a b o l i s m t y p e i c o l l a g e n t e l o m e r a s e b c l - 2 p 5 3 盛 己 盛 p h .d c a n d i d a t e : j i n g c h e n d i r e c t e d b y : p r o f . j i a n y u z h e n g p r o f . g u o p i n g c a i ab bre vi a t i ons p cd ce d c a s p a s e bc l - 2 l p o ros oh pi dapt tunel d o c 6 ( 3 ) rh1 2 3 八 w gs h, m da mp t c y t c a p a f - i al f dp f hte r t trf r t 2 bs trap e cm es r p r o g r a m m e d c e l l d e a t h c e l l d e a t h a b n o r ma l c y s t i n e a s p a r t i c a c i d s p e c i fi c p r o t e a s e b c e l l l y m p h o m a / l e u k e m i a - 2 g e n e p r o d u c t l i p i d p e r o x i d a t i o n r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s h y d r o x y l r a d i c a l s p r o p i d i u m i o d i d e 4 , 6 - d i a m i d i n o - 2 - p h e n y l i n d o le t e r m i n a l d e o x y n u c l e o t i d y l t r a n s f e r a s e ( t d t ) - m e d i a t e d d u t p n i c k e n d l a b e l i n g 3 , 3 - d i h e x y l o x a c a r b o c y a n i n e i o d i d e rh o d a mi n e 1 2 3 m i t o c h o n d r i a l t r a n s m e m b r a n e p o t e n t i a l g l u t a t h i o n e m a l o n d i a l d e h y d e m i t o c h o n d r i a l p e r m e a b i l i t y t r a n s i t i o n c y t o c h r o m e c a p o p t o s i s p r o t e a s e a c t i v a t i n g f a c t o r - 1 a p o p t o s i s i n d u c i n g f a c t o r d e a t h p r o m o t i n g f a c t o r h u m a n t e l o m e r a s e r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e t e l o m e r i c r e p e a t - b i n d i n g f a c t o r r e v e r s e t r a n s c n p t a s e h u m a n l u n g f i b r o b l a s t s t e l o m e r i c r e p e a t a m p l i fi c a t i o n p r o t o c o l e x t r a c e l l u l a r ma t r i x e l e c t r o n s p i n r e s o n a n c e 第 1 章文献综述 第1 章文献综述 1 . 1细胞凋亡 1 9 7 2 年，k e r r 等提出了细胞凋亡的概念，细胞凋亡作为不同于细胞坏死的 另一种死亡类型逐渐得到了统一认识。所有的细胞都注定要死亡( d e a t h ) ，但死 亡的机制却不尽相同。 细胞坏死( n e c r o s i s ) 是指细胞在各种不利的因素和条件下， 发生的 被动性的 死亡; 而细 胞凋亡 ( a p o p t o s i s ) 或细 胞程序化死亡 ( p r o g r a m m e d c e l l d e a t h , p c d ) ， 则是通过触发细胞内 专门负责细胞死亡信号感知、调控和死亡效 应执行的一整套基因程序后而发生的具有特征性形态变化和生化改变的细胞主 动死亡过程( 1 .2 1 。 细胞的生存与死亡， 是基因 表达水平和相互作用最终平衡的结 果。 细胞凋亡之所以成为当前国内外生命科学研究的前沿领域和方兴未艾的热 点，是因为它是细胞及有机体发生的基本生命现象，不仅与细胞增殖、分化、 衰老、癌变及个体发育有密切关联，而且与许多病理过程有紧密联系。探讨细 胞凋亡的分子机制中某些关键性的环节以及它与细胞癌变的内在联系具有重要 的理论意义，而且在指导肿瘤的化疗和抗癌药物的开发上具有潜在的医学应用 前景。 如. 1 . 1 细胞凋亡的一般特性 如. 1 . 1 . 1形态学改变 细胞凋亡可由形态学和生物化学的特征加以判别。形态学上主要包括细胞 皱缩、染色体浓缩和凋亡小体的形成。细胞凋亡发生的形态变化不同于一般剧 烈损伤因子所致的细胞坏死形态，在短时间内，凋亡的细胞表现出核染色质广 泛凝集、边聚，细胞体积缩小，胞质浓缩，细胞表面特化结构丢失，细胞表面 的明显皱缩，随后整个细胞分裂成为由膜包裹的圆形或椭圆形碎片，即凋亡小 体 ( a p o p t o t ic b o d y ) (3 1 0 凋 亡 小 体 是 细 胞 凋 亡 时 的 特 征 性 形 态 学 表 现， 具 有 完整 的 膜结构，内含部分胞质、细胞器和碎裂的细胞核成分，一般在形成后 2 4 h内由 第 1 章文献综述 临近的正常细胞或吞噬细胞消除，同时并不因其内容物泻出而引起炎症反应。 1 . 1 . 1 .2生物化学改变 细胞凋亡中所发生的生物化学变化是相当复杂的，其主要特征包括:细胞 死亡特异蛋白的表达: 依赖细胞内大分子的合成; 核质d n a的内切退变成核小 体片段。 从鉴定的角度上， 最富特征性的改变是凋亡细胞的基因组d n a在琼脂 糖凝 胶电 泳中 出 现 典型的1 8 0 - 2 0 0 b p 的d n a la d d e r 4 1 。 这 是由 于 钙 一 镁依 赖性内 源性核酸内切酶裂解染色质核小体所引起的，此时的细胞从形态学上判断仍然 是完整的活细胞。 坏死细胞的d n a降解却是在细胞死亡的晚期才发生的， 主要 是溶酶体的蛋白酶和核酸酶对组蛋白和 d n a的非特异性消化。组蛋白的降解， 使整个d n a分子暴露于核酸酶的作用下，使d n a被降解成无规则的片段，电 泳图上呈弥散的d n a条带。 如. 1 . 1 .3调控细胞凋亡的相关基因 关于凋亡的机理目 前仍不清楚，但研究工作很多，尤其是与凋亡相关的基 因，学者们分别从许多不同的角度进行了大量的研究，主要有以下几个方面。 ( 1 ) i c e / c e d - 3 家族: 是细胞凋亡过程中的必需基因， 大部分在凋亡过程中 被活化。 其活性位点中都有半胧氨酸( c y s t e i n e ) ， 对靶位点的剪切都发生在特定 的天冬氨酸( a s p a r t i c ) 残基处，是进化上保守的半胧氨酸蛋白 酶家族，故把这类 蛋白 酶家 族统 称为c a s p a s e 。 其 大致 可分为三 个亚家 族包括 i c e ( c a s p a s e - 1 ) , i c h - 1 ( c a s p a s e - 2 ) 和c p p 3 2 ( c a s p a s e - 3 ) 。 其 活性位点的 氨基酸 残基是 保守的， 都为 q a c r g 5 肤， 都含分子量约为2 0 k d ( p 2 0 ) 和i o k d ( p 1 0 ) 两个亚单位s -7 1 。 这两个亚 单位是这些蛋白 酶发挥生物活性所必需的区域， 5 肤序列在p 2 0 亚单 位中。 s t e l l e r 等u 1 认为蛋白酶尤其是类i c e蛋白酶是细胞凋亡机制的核心成分。到目 前为止， 许多证据表明，早期凋亡事件可能是 t x - - i c e - - c p p 3 2 底物 p a r p顺序的蛋 白 酶切割过程8 ,9 ( 2 ) b c l- 2 基因家族:b c l - 2 被称为“ 细胞长寿基因” 。 b c l - 2 蛋白能阻断自由 基、 p 5 3 , c - m y c 、 谷 氨酸、 c a 2 , 葡 萄 糖 及去 除n g f 等 刺 激诱 导 的 凋 亡。 b c l - 2 家族成员包括 b c l - 2 , b c l - x l , b c l - x s . b a x , b a k和 b a d等。它们的保守序列为 b h 1 和 b h 2 两个重要的功能区。b c l - 2 家族基因是通过它们表达的蛋白一蛋白 间相互作用， 对细胞的存活与凋亡进行调节 1 0 1 ( 3 ) c - f o s 和c -j u n : c - f o s 编码的 蛋白 与c -j u n 编码的 蛋白 组 成异 源二聚体 j u n - f o s ，称为a p - 1 . a p - 1 是一个重要的转录因子，结合于d n a上，诱导细胞 凋亡或增殖。 第 i 章文献综述 ( 4 ) c - m y c : c - m y c基因的 产物 c - m y c蛋白与因子 m a x组成异源二聚体 c - m y c / m a x ， 和d n a结合， 控制诱导凋 亡所需的 转录 而对凋亡 进行调控。 ( 5 ) p 5 3 : 在细胞周期g , / s 期末限制点( c h e c k p o i n t ) 负调控细胞， 从而避免异 常细胞进入细胞周期。当环境或体内因素如电离辐射、抗癌药物等损伤细胞基 因 组d n a时， 能诱发p 5 3 基因 转录表达 增强， 使受损细胞阻 滞于g 1 期， 进行 d n a修复或及时启动凋亡系统，通过诱导凋亡清除无法修复的损伤细胞。 在细胞凋亡过程中确有一些基因表达发生了改变，但是关于这些基因在凋 亡信号传导以 及细胞凋亡的执行机制中的 确切作用尚 有待进一步研究1 1 1 , 1 2 1 。如 下对b c l - 2 基因家族和p 5 3 基因进行详细介绍。 一 b c l - 2 基因家族 细胞凋亡过程受到一系列相关基因的调节和控制。这种调节机制发生障碍 和紊乱与肿瘤、 艾滋病、 老年性痴呆和帕金森氏 病等发生密切相关 . b c l - 2 是 细胞凋亡过程中的一类调节因子，此基因家族包含两类功能相反的基因，一类 是抑制细胞凋亡的基因b c l - 2 , b c l - x l , b c l - w , m c l - 1 和a 1 等，另一类是促进 细胞凋亡的基因b a x , b a k , b o k 和b c l - x s 等。 1 . b c l - 2 的结构 b c l - 2 基因最早是从小鼠b 细胞淋巴 瘤分离出 来的0 4 1 ， 其基因 编码的蛋白 质 由2 3 9 个氨基酸残基组成，分子量为2 6 k d . b c l - 2 在进化过程中有高度保守的 倾向， 人和鸡的b c l - 2 基因同源性达7 0 %。 从人、 小鼠、 大鼠 及鸡中克隆的b c l - 2 的基因相比较， 最显著的一个特点就是梭基端由1 9 个氨基酸组成的疏水段， 紧 接其后为2 个带电荷的氨基酸残基， 这一特点表明这种蛋白质可能锚定在膜上。 突变研究表明， 疏水性的梭基末端的存在， 使b c l - 2 可以插入细胞膜中， 而大部 分则存在于胞质中， 提示b c l - 2 蛋白狡基末端插入膜内的结构特点， 可能是其阻 断细胞凋亡的结构基础。 2 . b c l 一家族成员的作用和功能 ( 1 ) b c l - x由2 4 1 个氨基酸残基组成， 与人b c l - 2 的 基因同 源性达7 4 % . b c l - x 由于其m r n a剪切方式不同，可产生两种大小不同的b c l - x分子，b c l - x的大 分子 ( b c l - x l ) 含有b c l - 2 的两个保守同 源区 ( b h 1 - b h 2 ) ，其功能与b c l - 2 相似，可以抑制细胞凋亡;而b c l - x的小分子 ( b c l - x s ) 缺少b h 1 和b h 2同源 区，其功能与b c l - 2 恰恰相反， 促进细胞凋亡 i 6 。 很显然， m r n a的剪切加工 是b c l - x产生抑制或促进细胞凋亡的关键控制点。 ( 2 ) b a x 是与b c l - 2 同源的另一个类似物， 是一种由1 9 2 个氨基酸基组成的、 第 工 章文献综述 分子 量 为2 1 1( d 的 蛋白 质。 b a x 蛋白 具 有 一 个 跨 膜 位点( t r a n s m e m b r a n e d o m a in ) , 与 b c l - 2 的同源性为2 1 %。在体内，b c l - 2 和 b a x 可以形成异二聚体。但是很有 趣的是b a x 和b c l - 2 的作用完全相反， b a x ba x 二聚体在体内过量表达时， 可促 进细胞凋亡 1 7 1 。 如 果以 点突 变的 方法使b c l - 2 的g l y 1 4 5 和t r p l 8 8 发生突变， b c l - 2 抑制去除几一 3 、 射线照射和糖皮质醇激素诱导的细胞凋亡的功能完全丧失， 且不能和b a x 形成异二聚体， 但b c l - 2 仍能形成同种二聚体。 提示 b c l - 2 行使其 功能是通过与b a x 形成异种二聚体 1 8 1 ( 3 ) b c l - 2 可以 抑制多种因素 ( 如x 一 射线、当 体激素、 抗t c r / c d 3 单克隆 抗体、各种化疗药物和癌基因等) 介导的细胞凋亡。 b c l - 2 分子的功能除了已被 证明是一个细胞凋亡阻遏的核心分子外， 近来已有实验表明， b c l - 2 还有其他生 物化学活性。 b c l - 2 在转基因动物中过量表达， 可干扰过氧化物的产生和脂膜的 过氧化作用， 从而抑制氧化物应激诱导的细胞凋亡。 b c l - 2 抗细胞凋亡的作用是 通过抑制氧化一 还原的 途径实现的 1 9 1 3 . b c l - 2 抑制细胞凋亡的机制 b c l - 2抑制细胞凋亡的机制是通过 抗氧化效应;阻止细胞内的钙离子 流动; 调节k - r a s / r a f 介导的 信号传导; 阻止p 5 3 和c - m y c 在核内的定位， 从而抑制半肤氨酸蛋白酶的活性，减少该蛋白酶的底物多聚腺漂吟二核昔酸核 糖聚合酶 ( p a r p )的降解2 0 1 线粒体通透性转换( p e r m e a b i l i t y t r a n s i t i o n , p t ) 孔开启所致线粒体内凋亡相 关物质释放对c a s p a s e 酶系的 激活是凋亡实 现的最基本的生物化学途径。 这些重 要发现和b c l - 2 主要定位于线粒体膜的特点， 使人们推测 b c l - 2 对细胞凋亡的抑 制可能通过对线粒体的调控而实现2 1 1 。 人们发现， 在分离线粒体的实验体系， b c l - 2 能够阻抑多种因素诱导的 w m 崩解; 在无细胞体系，b c l - 2 能防止c y t c 等 从 线 粒 体的 释 放 2 2 1 . c h in n a i y a n 和w u 等 2 3 发 现， b c l- 2 可 直 接 将 胞 浆 中 甚 至 已与c a s p a s e - 9 结 合的凋亡蛋白酶活化因子( a p o p t o s i s p r o t e a s e a c t i v a t i n g f a c t o r - 1 , a p a f - 1 ) 结 合 于 线 粒体 外 膜， 形 成 线 粒 体 一 b c l - 2 - a p a f - l - c a s p a s e - 9的四 聚 体复 合 物， 并 对a p a f - i 结 构进行调控， 使a p a f - 1 失 去 对c a s p a s e 酶系的活 化能力。 而 有的实验亦证明了b c l - x l 能抑制c y t c 从线粒体移向 胞浆的重新分布以 及线粒 体膜的去极化，并因而抑制了细胞凋亡2 4 1 二 p 5 3 基因家族 随 着 对p 5 3 基因、 蛋白 结构、 功能的 不断 研究， 对于p 5 3 蛋白 有了 更为深 入的认识。 p 5 3 虽然被归 类于抗癌基因 或核转录因子类癌基因， 但p 5 3 研究的意 第 1 章文献综述 义早已超出了肿瘤学的研究范围，而是d n a的损伤与修复、细胞生长与分化、 细胞周期与细胞程序化死亡等生命科学领域中重要的蛋白质分子。 1 . p 5 3 的 基因 结构 早在 1 9 7 9 年研究s v 4 0 病毒转化的细胞时，就发现一种与s v 4 0 t抗原紧 密结合的分子量约为5 3 k d 的细胞蛋白， 在腺病毒感染的细胞中也发现了这种蛋 白的存在，而且与e 1 6 病毒蛋白结合成复合物形式。当初并不太清楚其结构功 能，因而称之为p 5 3 蛋白。因为s v 4 0 病毒的t 抗原、腺病毒的e 1 6 蛋白 都与 正常细胞的恶性转化有关，因 而当时推测p 5 3 与 肿瘤的发生、发展具有密切的 关系。 1 9 8 4 年首先克隆了 人p 5 3 的c d n a 。 其全长为2 0 7 4 b p ， 含有单一的开放读 码框架， 其 5 一 端非翻译区为8 8 1 个核昔酸，之后的编码区由1 1 7 9 个核普酸组 成，可编码的p 5 3 蛋白由3 9 3 个氨基酸残基组成。 p 5 3 基因组d n a定位于1 7 p 1 3 . 1 位点上， 横跨1 6 - 2 0 k b 的一段d n a序列。 进化过程中p 5 3 基因是高度保守的， 对于来源于不同 种系生物系统p 5 3 基因序 列进行比较，有五段氨基酸残基序列是高度保守的，同源性高达 9 0 %以上。这 5 段序列分别是 1 3 - 1 9 , 1 1 7 - 1 4 2 , 1 7 1 - 1 8 1 , 2 3 4 - 2 5 8 和 2 7 0 - 2 8 6 位置上的氨基酸 残基序列。这5 段在进化上处于高度保守状态的序列是p 5 3 蛋白 功能的重要依 赖 区 。研究 表明 19 9 1野 生 型p 5 3 是 一 种d n a 序 列 的 专门 识 别 蛋白 ， 直 接 影 响 结 合区 域处的 调 节 序 列。 结 构 分 析 表明p 5 3 蛋白 由 三 个结 构 域组 成 11 0 0 1 : ( 1 ) 包 含 转录活性区域的n端;( 2 )高度保守的中央区，是大多数原癌基因突变位点所 在，也是s v 4 0 t 一 抗原接合处;( 3 ) c端能与d n a专一顺序结合。 2 . - p 5 3 蛋白的生理作用和功能 p 5 3 蛋白 的 生理作用是诱导 细胞周 期g 1 期阻 断、 诱导细 胞程序化死亡、 诱 导细胞分化、 保护基因组的完整性以 及抑制肿瘤细胞的生长等 1 0 1 1 许多研究表明， 具有天然结构的p 5 3的生化功能是一 种转录因子， 在细胞 的g 1 期监视细胞基因组的完整性。 其分子中有一个核定位信号， 所以一般都位 于 细 胞核内 1 0 2 ) . p 5 3 蛋白 可与 特异的d n a片 段 结 合， 调节 某 些基因 的 表 达。 如果细 胞核内d n a遭到 破坏， p 5 3 蛋白 便与 之结 合， 直到 损 坏的d n a得到 修 复为止。 如果修复失败， p 5 3 蛋白 便在g 1 后期升高， 使细胞停滞于g 1 期，并 有效地诱发细胞调亡，阻止产生具有癌变倾向的突变细胞。 第 1 章文献综述 3 . p 5 3 基因 对细 胞凋亡的 调控 如果p 5 3 基因发生突变， p 5 3 野生型蛋白 的生理功能不仅可能丧失， 突变型 p 5 3 蛋白 对于 野生型蛋白 作用 进行干 扰， 而且还有获得野生型p 5 3 蛋白 所没有的 新 功 能 10 3 ,10 4 1 。 人 们 最 早 注意 到， p 5 3 基 因 突 变与 肿 瘤的 发生 具 有密 切的 关系。 在研究p 5 3 基因缺失时， 发现p 5 3 等位基因的丢失或失活，甚至突变，可 影响肿瘤的形成能力。 利用缺失p 5 3 基因的小鼠 品系进行p 5 3 基因 突变的研究 结果显示，所有纯合子都能自 发产生肿瘤，特别是淋巴瘤。1 0 %的杂合子小鼠 在 9 个月龄时，可发生不同的肿瘤。 在研究p 5 3 与 肿瘤的关 系中， 人们 逐渐把它与细 胞凋亡相联系。目 前p 5 3 调节 细 胞 生 长 的内 在 机制已 阐明 ， 是由 于p 5 3 对 细 胞生 长 周 期的 调 控 所致1 0 5 1 p 5 3 的突变将使细胞受到辐射损伤及天然致癌物刺激时， 无法阻断细胞周期， 细 胞失去了对g 1 期的监控功能， 使d n a产生不可修复的损伤。细胞带着受损伤 的d n a继续分裂， 便加速了基因组的不稳定， 导致一系列突变的积累， 使细胞 抵抗各种凋亡诱导因素的能力也随之增长，最终转化成逃逸监控的癌性细胞。 在此， 突 变的p 5 3 基因 实 质上成了 一 种 癌基因。 肿瘤细胞中 经常 看到的非整倍 体染色体及染 色体扩增、重组及不正常染色体，可能都是由p 5 3 突变引起的。 p 5 3 突变还使肿瘤细胞获得了 抵抗各种抗癌药 物诱导凋亡的能力， 使许多正在使 用的抗癌药物疗效不理想。 p 5 3 是基因组损伤引起的细胞凋亡途径所必须的， 并不是所有细胞凋亡的途 径都需要p 5 3 的 表达。 尽管c - m y c 和e i a都不是直接使d n a损伤，但二者诱 导的细胞凋亡需要p 5 3 的表达，因 此p 5 3 在诱导细胞凋亡中的 作用不只限于对 d n a损伤的 应答反应。 p 5 3 也通过对b c l - 2 家族成员的表达调控，参与细胞凋 亡的调节。 b c l - 2 是细胞凋亡的 抑制因子， p 5 3 是细胞凋亡的效应因子。 p 5 3 对 b a x 的表达水平具有显著的诱导刺激作用， 已 经发现b a x 基因的 启动子区有p 5 3 蛋白 的结 合 位点， p 5 3 蛋白 对于b a x 启动子 具有直 接的 转录 激活作 用。 而b a x 是b c l - 2 的一种显性抑制因子，b a x 和b c l - 2 形成异二聚体行使对细胞凋亡的调 控。 显然， p 5 3 基因 在介导细胞逃逸凋亡 ( 使细胞生长停滞在g 1 期) 和决定细 胞走向死亡 ( 对d n a损伤的应答) 的两种完全相反的途径中， 都起着关键的调 节 功 能 ! 10 6 1 。 但p 5 3 究 竟 是 如 何 把 这 两 个 功 能 精 确 地 结 合 起来 ， 现 在 还 是一 个 谜。 特别是在细胞生长停滞和诱导 细胞凋亡过程中， 是否需要p 5 3 的反式激活作用， 更是一个哑 待回 答的问 题， 也是寻找治疗p 5 3 依赖性肿瘤需要了 解的问 题。 第 t 章文献综述 妇. 1 . 3细胞凋亡的生物力能学研究 妇. 1 .3 . 1线粒体参与凋亡信号传导 线粒体渗透性转换( p e r m e a b i l i t y t r a n s i t i o n , p t ) 是细胞凋亡的 先导。 线粒体 启动细胞凋亡的主要机制被认为与线粒体内膜的非特异性通道即线粒体 p t孔 开放有关。 p t孔的开启可引起一系列与细胞凋亡相关的重要