（遗传学专业论文）基于issr、rapd分子标记的葎草雌雄株基因组差异研究.pdf

摘要 萑草( h u m u l u ss c a n d e n sl ) ，大麻科( c a n n a b a c e a e ) ，薇草属，是一种常见的雌雄 异株杂草。蓓草雄株的遗传组成为2 n = 1 7 ，具有三个较大的性染色体即x y l y 2 ，雌株的 遗传组成为2 n = 1 6 ，性染色体为x x ，可以作为研究雌雄异株植物性别决定、性别分化， 尤其是性染色体起源与进化的模式材料。然而，目前关于蓰草的性别决定机制、性染色 体的起源与进化模式仍不清楚。 本文以律草为材料，首先萑草的性染色体的形态特征、性染色体在减数分裂中的配 对及分离进行观察，分析x 和y 染色体形态及减数分裂中的分离行为特征。其次采用i s s r 分子标记和r a p d 分子标记分别对蓰草进行雌雄株之间的差异比较研究，筛选与性别相 关的分子标记，将i s s r 分子标记和r a p d 分子标记转化成稳定性更好的s c a r ( s e q u e n c e c h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n s ) 标记，并应用s o u t n e m 杂交技术初步分析其在基因组中的 分布特征，为通过色体荧光原位杂交定位以及探寻性染色体起源与进化的线索提供一定 的实验基础。研究取得的结果如下： 1 、以萑草花粉母细胞为材料，采用传统的核型分析方法对其减数分裂过程中终变 期的性染色体进行了研究，结果发现捧草花粉母细胞在减数分裂终变期存在7 个二价体 和1 个三价体，有的三价体末端结合，有的三价体其中两条整体配对并与第三个末端配 对，推测雄株有三条性染色体。 2 、利用简单重复序列间扩增( i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，i s s r ) 技术对蓰草雌雄株 性别的基因组差异进行了比较研究。在6 2 条i s s r 引物中，4 0 个引物均扩增出了稳定 的条带，共产生了3 0 2 条带。引物1 6 4 在蓰草中扩增出一条雄性连锁条带，经克隆测序， 发现该片段长度为5 5 3b p ，a t 含量为6 4 3 ，属于富含a t 的序列，根据测序结果设计 特异引物，成功的将该标记转化为稳定性更好的s c a r 标记。 3 、利用随机扩增多态性d n a ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，r a p d ) 技术对 獯草雌雄株的性别差异进行了比较研究。在所有筛选的引物中，引物s 2 1 4 2 在萑草中扩 增得到一条雄性相关的r a p d 标记，它的长度为7 6 2b p ，a t 含量为5 4 7 。根据序列分析 结果设计特异引物将该片段转化为重复性和特异性更好的s c a r 标记，经检测发现这个 标记是非常稳定的雄性萑草的分子标记，并经s o u t h e r n 杂交分析发现该片段为基因组中 一低拷贝重复序列。 关键词：萑草，性染色体，s c a r ，r a p d ，i s s r a b s t r a c t h u m u l u ss c a n d e n s ( l o u r ) m e n ( c a n n a b a c e a e ) i sa l li m p o r t a n tp e r e n n i a l ，d i o e c i o u sp l a n t t h e c h r o m o s o m en u m b e ro fm a l ei s2 n = 1 7 ，w i t ht h r e es e xc h r o m o s o m e sx y l y 2 ，a n dt h ec h r o m o s o m en u m b e r o ff e m a l ei s2 n = 1 6 ，w i t ht w o xc h r o m o s o m e sx x ，s oi ti sam o d e l p l a n tu s e df o rr e s e a r c hi n t ot h es e x d e t e r m i n a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o n , e s p e c i a l l yo r i g i na n de v o l u t i o no ft h es e xc h r o m o s o m eo fd i o e c i o u sp l a n t h o w e v e r , l i t t l eh a v eb e e nr e p o r t e da b o u tt h em e c h a n i s mo ft h es e xd e t e r m i n a t i o n , o r i g i na n de v o l u t i o no f t h es e xc h r o m o s o m eo f h u m u l u ss c a n d e n s i nt h i sp a p e r ，t h em o r p h o l o t ya n dc h a r a c t e r i s t i co ft h es e xc h r o m o s o m e so fh u m u l u ss c a n d e n sw a g o b s e r v e df i r s t l yt os t u d yt h em o r p h o l o g yo fxa n dya n dc h a r a c t e r i s t i co fc h r o m o s o m es e g r e g a t i o ni n m e i o s i s s e c o n d l y ，t h ed i f f e r e n c e sa m o n gf e m a l ea n dm a l eh u m u u ss c a n d e n sw e r es t u d i e dt h r o u g ht h e a n a l y s i so fi s s ra n dr a p do fg e n o m i cd n a ，s oa st of i n dt h ed i f f e r e n c e sb e t w e e nt h eg e n o m eo fm a l e a n df e m a l ep l a n t sa n ds c r e e nt h em o l e c u l a rm a r k e r sl i n k e dt ot h es e x t h es e x - l i n k e dm a r k e r sw e r e c o n v e r t e dt os c a r ( s e q u e n c ec h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n s ) m a r k e r s ，a n ds o u t h e r nh y b r i d i z a t i o nw a g e m p l o y e dt oa n a l y s et h ec h a r a c t e r i s t i co ft h ed i s t r i b u t i o no ft h em a r k e r s ，i no r d e rt om a k er e a d yf o rt h e l o c a l i z a t i o no nc h r o m o s o m eu s i n gf i s h ( f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ) ，a n dt ol a yaf o u n d a t i o nf o r r e s e a r c hi n t ot h ed e r i v a t i o na n de v o l u t i o no fs e xc h r o m o s o m e ，i no r d e rt op r o v i d et h et h e o r ya s s u r a n c ef o r t h er e s e a r c hi n t ot h ee v o l u t i o na n dt h es t r u c t u r eo fs e xc h r o m o s o m e si nh u m u l u ss c a n d e n s t h em a i n r e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 u s i n gk a r y o t y p ea n a l y s i st e c h n o l o g y ，m e i o s i sb e h a v i o r sf r o mt h ei n f l o r e s c e n c e so ft h em a l e h u m u l u ss c a n d e n sw e r eo b s e r v e d ，a n dt h ec e l l sw i t hc h r o m o s o m ed i s p e r s i n gw e lla tm e i o s i sd i a k i n e s i sa r e i i i o b s e r v e do i le l e c t r o n i cm i c r o s c o p et of u r t h e rd e t e r m i n et h es e xc h r o m o s o m e t h er e s u l t ss h o wt h a tt h e c e i l sc o n t a i ns e v e nb i v a l e n ta n do n et r i v a l e n tc h r o m o s o m e ，s o m eo fw h i c hc o m b i n ea tt h ee n d ，a n ds o m eo f w h i c hp a i ro v e r a l l ，t h u ss u p p o s i n gm a l eh a st h r e es e xc h r o m o s o m e s 2 t h ei n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a to s s r ) t e c h n i q u ew a se m p l o y e dw i t ht h ec o m p a r a t i v es t u d y o ft h es e xd i f f e r e n c ei nh u m u l u ss c a n d e n s at o t a lo f 6 2p r i m e r sw e r et e s t e dw i t ht h es a m ep c r c y c l i n g p r o c e d u r e s ，a n d4 0p r i m e sg e n e r a t e d3 0 2b a n d st o t a l l y am a l e l i n k e df r a g m e n tw i t hal e n g t ho fa b o u t5 5 3 b pw a sg e n e r a t e dw i t h1 6 4p r i m e r t h ef r a g m e n tw a sc l o n e da n ds e q u e n c e d ，f i n d i n gi tw a sa b u n d a n ti n a t ( 6 4 3 ) t h em a l e - l i n k e d e dm a r k e rw a sc o n v e r t e di n t os c a rm a r k e r 3 w i t ht h et e c h n i q u e so fp a r d ，ac o m p a r a t i v ea n a l y s i sw a se m p l o y e do nt h eg e n o m ed i f f e r e n c e b e t w e e nm a l ea n df e m a l eh u m u l u s $ c a r l d e n $ o ft h ea l lp r i m e r ss c r e e n e d ，o n l y $ 2 1 4 2p r o d u c e da s e x - l i n k e db a n do n l yf o u n di nt e s t e dm a l e s ，w i t ht h el e n g t ho f7 6 2b pa n dt h ea tc o n t e n to f5 4 7 t h e m a l e l i n k e d e dd o m i n a n ts c a rm a r k e r sw a sa l s oo b t a i n e d t h er e s u l to fs o u t h e r nh y b r i d i z a t i o ns h o w e d t h a ti tw a sal o w - c o p yr e p e t i t i v es e q u e n c e k e yw o r d s ：h u m u l u ss c a n d e n sl ，s e xc h r o m o s o m e ，s c a r , r a p d ，i s s r i v 缩略语 r 舯d p c r c 1 ：久b e d t a s d s i s s r a f l p s n p p v p r a 毋 l 心l p s s r ，r e t a p o d s 缩略语表( a b b r e v i a t i o n ) 英文全称中文全称 r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a 随机扩增多态性d n a p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 c e t y lt r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e溴代十六烷基三甲胺 e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基磺酸钠 i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t简单重复序列间扩增 a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s 扩增片段长度多态性 s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e 单核苷酸多态性 聚乙烯吡咯烷酮 r a n d o ma m p l i f i e dm i c r o s a t e l l i t ep o l y m o r p h i s m s 随机扩增微卫星多态性 r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 限制性片段长度多态性 s i m p l es e q u e n c er e p e a t 简单重复序列 饿s e d 翻b u f f e r t i t r a t a b l ea c i d p e r o x i d a s e t e 缓冲液 可滴定酸 过氧化物酶 t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 i x 独创性声明 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河南师范大学或其他教育机构的学位或证书 所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了谢意。 签名： 盘施玄。日期：垒塑z 车笸盆2 旦 关于论文使用授权的说明 本人完全了解河南师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河南师 范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 6 1 l 前言 1 前言 1 1 雌雄异株植物的性别研究概述 性别是自然界中最引人注目的生物性状之一，从低等生物到高等动植物都存在这一 性状。人类在农业生产实践中，早在三千多年前就知道植物有性别差异，但由于植物的 性别比较复杂，与动物的性别研究相比，植物的性别分化研究较晚，研究也不够深入， 但无论在理论上，还是在应用上这一研究都有重大意义。真正认识植物的性别问题，实 际是在1 7 世纪末。c a m e r a ：z i u s 发现桑树在附近无雄株时，雌株只能形成败育的种子。他 由此获得启发，进而用一年生山靛( m e r c u r i a l i sa n n u a ) 及其他的植物进行雌雄隔离试 验，得到同样的结论，写就“植物的性 的著名论文，并与1 6 9 4 年出版了关于植物的 性别通信一书，总结了有关植物的性问题，确认了植物性别的存在【l 】。 植物的性别表现是多样的。大多数被子植物的雌、雄器官，即雌蕊和雄蕊，着生在 同一朵花里，这类植物称为雌雄同花植物；在某些植物中，雌、雄蕊分别着生在不同的 花里，成为单性的雌花和雄花；但雌花和雄花同时出现在同一植株上，这类植物为雌雄 同株异花植物，如玉米和瓜类等。在另一些植物中，雌雄花分别着生在不同植株上，为 雌雄异株植物，如千年桐、大麻、银杏、蓰草等。此外还有许多中间类型，有的在同一 植株上既有雌雄蕊同在一朵花中的两性花，又有仅具雌蕊或雄蕊的单性花。由于决定花 或个体性别的遗传和外遗传因素在不同的植物物种间有着很大的差异，因此不同的植物 物种在性别表达方面也存在着显著的差别。 雌雄异株植物为植物性染色体的起源于进化以及性别决定的研究提供了一个较为 理想的研究系统，但它在植物界所占比例甚少。在自然界中，高等植物多数为雌雄同株。 在显花高等植物中雌雄异株的仅占5 嘣2 1 。据统计，在植物中约有7 1 的属和3 8 的科中 的一些物种属于此类【3 1 ，其中在遗传学方面研究较为清楚的有单子叶植物中的百合科 ( l i l i a c e a e ) 和薯蓣科( d i o s e o r e a e e a e ) 以及双子叶植物中的毛茛科( r a n u n c i _ t l a c e a e ) 、桑科 ( m o r a c e a e ) 、蓼科( p o l y g o n a c e a e ) 、石竹科( c a r y o p h y l l a c e a e ) 、藜科( c h e n o p o d i a e e a e ) 、苋 科( a m a r a n t h a c e a e ) 、猕猴桃科( a c t i n i d i a c e a e ) 、葫芦科( c u c u r b i t a c e a e ) 、番木瓜科 基于i s s r 、r a p d 分子标记的薇草雌雄株基冈组差异分析 ( c a r i c a c e a e ) 、蔷薇科( r o s a e e a e ) 、葡萄科( v i t a c e a e ) 、大戟科( e u p h o r b i a c e a e ) 等中的雌雄异 株植物 4 1 。而雌雄异株现象在常见树种中也广泛存在，常见的种类有银杏科 ( g i n k g o a c e a e ) 、罗汉松科( p o d o e a r p a c e a e ) 、三尖杉科( c e p h a l o t a x a c e a e ) 、红豆杉科 ( t a x a c e a e ) 、麻黄科( p h e d r a c e a e ) 、杨柳科( s a l i c a c e a e ) 、杜仲科( e u c o m m i a c e a e ) 、柿树科 ( e b e n a c e a e ) 。 从研究发展的过程和手段来看，对雌雄异株植物的性别研究已经从最初的形态结构 描述发展到生理、生态和生化分析；研究方法也从运用简单的测量工具进行观测计数， 发展到运用电导仪、光合仪、叶绿素荧光仪、碳同位素技术等多种仪器和方法对雌雄个 体之间进行生理生化指标的定量测定与分析。 由于雌雄异株植物在植物性别决定尤其是性染色体进化研究中具有重要地位f 矧， 目前通过对一些雌雄异株模式植物如白麦瓶草( s i l e n el a t i f o l i al ) 、酸模( r u m e xa c e t o s a l ) 、芦笋( a s p a r a g u so f f i c i n a l i sl ) 等的遗传及分子生物学的研究，获得了一些与性染色 体相关的分子标记和基因，使我们对雌雄异株植物的性别决定系统、性染色体的起源与 进化、性别决定与分化的机理和机制有了更加深入的了解。 1 2 雌雄异株植物雌雄性别的染色体差异 雌雄异株植物的染色体由常染色体和性染色体组成，雌雄株基因组之间的差别也主 要体现在性染色体的差异上。然而植物的性染色体比较年轻，不像人类的性染色体进化 到了一定的成熟阶段，因此有些雌雄异株植物的性染色体从形态上不容易区分，有些植 物甚至还没有进化出性染色体，仅仅在某个常染色体上存在着性别决定位点。雌雄异株 植物是研究性染色体遗传与进化的有利体系。首先，单性花植物相对于两性花植物来说， 是独立进化发育的，为研究不同的性别决定机制提供了条件。其次，许多雌雄异株植物 的近缘种是可育的两性花植物，可以进行性别决定机制的比较研究和性染色体从常染色 体的起源研究。如芦笋、酸模、买瓶草的性染色体结构的研究中，这些研究使我们对性 染色体的起源与进化、分子结构及其基因功能有了进一步的了解。 1 2 1 植物性染色体的起源与进化 1 9 1 7 年a l l e n 在钱苔属( s p h a e r c a r p u s ) 植物中首先发现了植物的性染色体。之后又相 继在其他植物中发现有性染色体存在。根据目前对雌雄异株植物性染色体的雄性特异区 2 1 前言 域的遗传学和基因组学的研究，提出了性染色体进化较为完善的模式【7 罐】。根据最新的 资料，性染色体进化被划分为五个阶段( 图1 1 ) 【9 】。 第一阶段，在性染色体上发生了雌性或雄性的不育突变，并在这个位点附近开始发 生重组抑制，但是y y 基因型植物是可育的。菠菜和芦笋的性染色体属于同型性染色体 ( 图1 2 ) ，x 染色体和y 染色体的差异仅存在于性别决定位点临近区域。最近发现菠菜 x 染色体上存在一个4 5 s 的r d n a 位点，但在y 染色体上并不存在【1 0 1 。然而在构建菠菜遗 传图谱的时候发现一个微卫星分子标记s 0 4 距离性别决定位点仅1 9 e m t l l 】，性别决定位 点与临近的分子标记之间的重组表明性染色体并没有完全退化，而是像常染色体一样进 行重组，在芦笋中也发现了这种现象。啤酒花的性染色体是异型性染色体，y 染色体比 x 染色体小，d a p i 染色分带也明显不同【1 2 1 。然而性别决定位点附近的分子标记研究结果 表明：性染色体上的重组抑制仅局限于一个很小的区域内【1 3 】。 第二阶段，重组抑制扩展到其他的连锁位点，导致了一小段染色体的退化，在原始 y 染色体上形成雄性特异区域。尽管原始的性染色体在细胞学上是同型的，而y 染色体 上基因的大量丢失导致y y 基因型的植物无法存活。番木瓜的性染色体进化正处于这个 阶段【1 4 1 ( 图1 2 ) 。番木瓜的性染色体可以看作是性染色体进化的下一个阶段，y 染色 体的退化仅局限于m s y 区域( 雄性特异区域) ，位于性别决定位点附近，分子标记研究表 明性别决定基因的重组受到严重抑制。这个m s y 区域大约占整个染色体的1 0 1 5 ，序 列分析表明m s y 区与x 染色体上的相应区域明显不同1 1 4 】。 第三阶段，转座单元的积累和雄性特异区域的复制使y 染色体的序列不断扩展，非 重组区扩展到y 染色体的大部分区域，退化进一步增强。在这一阶段，x 和y 染色体是异 型的，y 染色体明显大于x 染色体。白麦瓶草是雌雄异株植物异型性染色体的典型代表 ( 图1 2 ) 。其性别决定是有活性y 染色体控制的。雄性染色体组成为：2 n = 2 2 + x y ，而 雌性为：2 n = 2 2 + x x 。性染色体是核型中最大的染色体，其中y 染色体是触发雄性发育 的主要因素。3 个不同的性别决定位点分别位于y 染色体上，一个抑制心皮的发育，另两 个促进花药发育和雄性可育。整个x 和y 染色体几乎不发生重组，仅在一个很小的末端 假常染色体区域发生【l5 1 。将x 和y 染色体上的基因和分子标记绘制成图谱并进行比较发 现y 染色体上发生了大范围的染色体重排，与人类y 染色体上发现的相似。 第四阶段，y 染色体严重退化导致了大量基因功能的缺失，而基因的缺失使y 染色 体的体积逐渐减小。在植物中不存在进化到第四阶段的y 染色体，但哺乳动物中第四阶 基于l s s r 、r a p d 分子标记的獐草雌雄株基因维差异分析 段的y 染色体却很明显，当然也有另一种可能即植物中这个阶段的性染色体并没有减小 而是继续增大直至第五阶段染色体的丢失。然而，任何一种情况下，性染色体仍有一小 段进行重组，以保证x 和y 染色体的配对。 第五阶段，重组抑制扩展到整个y 染色体，y 染色体的进一步减小，重组的假常染 色体区域完全缺失。y 染色体丢失，性别决定由x 染色体与常染色体的比例决定。一个 新的y 染色体进化形成，但是在性别决定上并不起作用。啤酒花，酸模旧，性染色体 都属于这一阶段。酸模的y 染色体是植物中退化程度最高的染色体之一( 图i - 2 ) 。其性 别决定是有基困平衡决定的。雌性染色体组成为：2 n = 1 2 + x x ，而雄性为：2 n = 1 2 + x y l y 2 ， 性染色体大干常染色体，x 染色体比两个y 染色体都要大一些。两个y 染色体具有相似的 细胞遗传学绩构，；茵度异染色质化，并由常染色质异化而来，也不存在性别决定基因。 这很有可能暗示了在不同的植物中性染色体退化速度是不同的，或者是种类特异的 性染色体行为彻底改变了性染色体进化的过程。 - 常疑色体 p 7 。t 。x m - l m ， 簟= 阶段 x 蕾三阶段 x 簟四阶段 x 第五阶段 y 膏壤色律畦假膏轻色体区 y 染色体上的雄性特异区域 x 染色体上雄性特异区域相对应区域 中心粒 圈l - l 性染色体进化的五个阶段横式田 f i 9 1 - ls c h e m a t i c d i a g r a mo f l h e f i v es t a g e s o f s e xc h r o m o s o m ec v o l u d o n 前言 x y r ； ；寻矗= j 三弓 藏摹 芦， t 木瓜 ；品二鲨= 盂二；- a 懈 譬竺竺! 1 2 1黼 y 2o i 口缸 ；二二：；习 蝴 州弄的鼻艇袅摹鞋重复 口性接色悼和常箍色体上的审联量蔓 口辖诈串疆鼻 i i y 牦傩和x 臻色体上的雄性性特异区域 田1 2 不同筐相中x 和y 染色体的分子结构模式田 f i g1 - 2s c h e m a t i c d i a g r a mo f t h e m o l c c u l a rs 仃i i d m o f xa n d y c h r o m o s o m e s i n d i f f e r e n tp l a n ts p e c i e s 12 2 雌雄异株植物的性别决定系统 通过对雌雄异株植物性染色体的观察，性别决定基因及其调控方面的研究，发现植 物中存在三种性别决定系统，由性染色体( 活性y 染色体) 决定性别、基因平衡( x 染色体 常染色体组比例) 决定性别、性别决定基因决定性别等三共性别决定系统( 表1 - 1 ) 。 白麦瓶草是研究植物性别决定和性别分化的模式植物，其性别决定完全由性染色体 控制，性染色体中y 染色体比x 染色体大，x - b y 染色体的同源区域只占染色体长度的很少 一部分( 图卜3i v ) ，其余为假同源区。在y 染色体上具有雄性活化基因( 图卜31 1 ) 、雌 性抑制基因( 图1 3 i ) 及对花粉的存活与育性起关键作用的雄性可育性基因( 图卜3 ) 。雌性抑制基因与雄性活化基因表现完全连锁。x 染色体上缺乏上述基因。但具有雌 性特异基因( 图1 3v ) 。因此，在雄性个体中由于y 染色体的存在抑制x 染色体上的雌 性特异性基因的表达。通过与人类y 染色体进行比较发现其y 染色体有相似之处： d o n n i s o i l 认为其雄性育性基因与睾丸特异表达的基因家族相当【】”。 基于i s s r 、r a p d 分子标记的蓰草雌雄株基因组差异分析 6 表1 1 雌雄异株植物性别决定的遗传学机制 t a b l el - lg e n e t i c sm e c h a n i s mo fs e xd e t e r m i n a t i o ni nd i o e c i o u sp l a n t s 蕊圜i 玖 霹潦毽壤一 雏瞧翔铡 綦嚣 壤链潢纯 蕊瑷 雄经珂霄毪 蒸嚣 图1 3 白麦瓶草性染色体结构 f i g 1 - 3s t r u c t u r eo fs e xc h r o m o s o m eo f s i l e n el a t i f o l i al 有些雌雄异株植物虽有性染色体，但其性别并不完全由性染色体决定。这些植物在 工 且 越 攫 1 前言 进化过程中形成了基因平衡决定的性别决定系统，即x 染色体与常染色体之间的比值决 定着植物的性别。典型的例子有寥科( c h e n o p o d i a c e a e ) 及大麻科( c a n n a b i n a c e a e ) 的植物种 类，如酸模、捧草( h u m u l u ss c a n d e n sl ) 、大麻( c a n n a b 括s a t i v al ) 、啤酒花( h u m u l u sl u p l z l u s l ) 等。其中啤酒花是相当严格的雌雄异株植物，但有时雌性植株上形成不育雄花，究其 原因发现这与植物体细胞内x 染色体与常染色体组比例有关。酸模属中一些x y n 型性别 决定的种类也采用了基因平衡的性别决定系统，但机理更复杂。如酸模属的一个亚属中， 有十几个物种的雌雄异株植物具有明显的性染色体，二倍体雌性个体的染色体组成为 1 4 ，x x ，雄性为1 5 ，x y l y 2 。在配子体形成过程中，雌性个体形成7 个双价体，而雄性 个体则形成6 个常染色体二价体和1 个性染色体三价体，从而导致x 和y l 十y 2 的分离，后 代群体中，具有性染色体三体( x x , o 和多体渊l y 2 ) 的二倍体植株为雌性可育f x y a = 1 0 ) 。在多倍体植株中，当x a 1 0 时，植株表现雌性可育，此比例 矿矿 团 9 ， 【 一l ；诤 田3 - 3 律草花粉母细胞减数分裂的终变期( 箭头示三价体) f i g3 - 3t h e m e i o s i s d i a k l n e s i s o f p o l l e n m o t h e rc e l l s i n h u m u u s8 c 珊i d 0 1 5 ( l o u t ) m c r r a m ) w s i n d i c a t i n g t h e 讲v e l e n t 一为 ab 瞳3 4 缚变期性染色体配对行为的电子显徽键观察 f 嘻3 - 4s e x c h r o m o s o m ep a i r i n g o f d 蛐s i su s i n g e l e c c o n m i c r o s c o p e 3 2 萑草基因组d n a 提取和质量检测 按照c t a b 法提取的蓓草总d n a 经琼脂糖凝胶快速电泳检测，结果发现，电泳条 带清晰完整，没有拖尾或弥散现象。样品经紫外分光光度计检测，其0 d 2 眦值在l5 - 2 2 之间，因此，样品d n a 纯度高，且分子较完整，结果表明其基因组d n a 为大分子( 约 2 1 k b - 2 3 k b ) ，完全符合做为r a p d 和i s s r 分子标记分析模扳的质量要求( 圈3 5 ) 。 3 3 律草基因组i s s r _ 结果与分析 3 3 1i s s r 反应体系的优化结果 为了获得最佳i s s r 扩增结果，对本研究条件下的i s s r 扩增体系中的模扳浓度、镁 3 结果与分析 一 田3 - 5 瞢草叶片总d n a 疆腔电津用 m ( m a r k e l ( x d n m e e a r i + h i n d n o ) r i g 3 - 5 e i c a _ k m 随g o f f o ee x h a 倒z 胁妇s c w s t e n s d n a f r o m l e a v 船0 1 1 a t 笋o s e 离子浓度、烈t p 浓度、退火温度进行了优化。结粜表明，采用2 0 r i g - 2 0 0 n g 模板量时， 所扩增到的条带几乎都没有区别。当m 矿浓度为2 0 n m a o l l 时，所扩增的条带数最多， 而且比较清晰，故最终确定其为本实验最适的镁离子浓度( 图3 - 6 ) 。 m12345m12345 b 国3 - 6 f c r 反应体系的优化结果 m f + 浓度梯度i s s r 电泳图谱b ：模板浓度拂度i s s r 电溶图谱m ：分子量标准 f i 晷3 - 6 t h er e s u l bo f p c r 0 p b m i z i n g i n 片州妇s c a r , d e n sl at h er e s u l t so f p c r w i t h d i f f e r e n t m f c o n c e n t r a t i o nb ：t h er e s u l t s o f p c r w i t h d i f f e r e n t d n ac o n c e n t r a t i o nm ：m a r k e r ( d 5 l d at a k a r a ) 永l ，l m m m ；2 15 m m ：3 ，2 0 m m ：4 25m ：5 ，30 m m ： b ：i ，i - 2 0 n g ；2 - 2 4 0 r i g ；3 3 - 6 0 ”昏4 t4 - 1 0 0n 毋5 5 - 2 0 0a g ； 基于i s s r 、r a p d 分子标记的蓰草雌雄株基因组差异分析 科t p 浓度为2 0 0j a n o l l 时所扩增的条带数较多，而且也较为清晰，所以确定本 实验最适d n t p 浓度为2 0 0t t m o l l 。此外，退火温度也是影响p c r 反应的另一重要因素 经多次试验发现本反应体系退火温度为5 2 时，所扩增到的条带较为稳定和清晰( 图 3 7 ) 。 根据p c r 反应体系优化结果，本研究采用的i s s r 扩增反应的p c r 反应体系( 总体 积为2 5 1 1 1 ) 为；1 0 扩增缓冲液2 5 i i l ，m g c b ( 2 5 r e t o o l l ) 20 m ，d n t p s ( 1 0 m m o l l ) 0 5 i i l ， 引物( 1 0 岬o l l ) 1 m ，模板d n a ( ! 2 5 - 2 0 n g p 1 ) 2p l ，t a g d n a 聚合酶( 2 5 u ) 0 3 山，退 火温度为5 2 。 ml2345 m 3 - 7 遇火瀑度对i s s p , 豆应的影响( 引糟1 2 6 ) 津道1 - 5 温度：5 1 、5 2 c 、5 3 c 、5 4 c 、5 5 c ， f i g 3 - 7 t h e e f f e c t o f a n r , e a l i n g t e m p e r a t t n o n i s s r a m p l i f i c a t i o n ( u s i n g p f i m e t l 2 6 ) l a n e i - 5 ：t h e 蛔n 畔r 蛳孵o f 5 1 、5 2 c 、5 3 c 、5 4 c 、5 5 c ， 3 3 21 s s r 引物的筛选 首先对i s s r 引物进行初筛( 图3 8 ) ，随后再用选出的引物对雌雄混合池d n a 进 行比较筛选( 图3 - 9 ) 。对能够在雌雄株间扩增出差异条带的引物，再进行雌雄单株扩 增。结果发现，在选用的6 2 个i s s r 引物中，2 2 个引物没有扩增出任何条带，为无效 引物，其余的4 0 个引物均扩增出了稳定的条带引物最多的扩增出9 条带，最少的扩 增出3 条带，共产生了3 0 2 条带，平均每个引物大约产生75 5 条带。 3 结果与分析 m1234567891 0 1 l 1 21 31 41 51 61 71 81 92 0 围3 - 8 部分 s s r l 将的初筛 ( 数宇代表不同的引袖) f i g3 - 8p a r to f a m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s o f p r i m a r i l y 辩r o i n g i s s r p r i m e r ( t h e n u m b e r m r e s d i f f c r e a t p r i m e r s ) m12 3 4 5 678 围3 9 部分i s s r b i 糟的复筛 c 数字代表不同的引物) f i g3 - 9p a r to f a m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s o f s e c o n d l ys c r e e n i n g i s s rp r i m e r ( t h en u m b e rr e p r e s e n td i f f e r e n t p r i m e r s ) 3 331 s s r 雄性相关片段的克隆与测序 在所选用的6 2 个i s s r 引物中，引物1 6 4 ( a g a g a g a g a g a g a g a g c g ) 在律草 雄株中扩增到一条雄性连锁的片段。为了验证实验的准确性，用同样的方法进行重复实 验均得到了同样的结果( 图3 1 0 ) 。 1 6 4 扩增的p c r 产物经lo 的琼脂糖凝胶电泳后，将目的带回收井克隆进p u c m t 3 l 基于i s s r 、r a p d 分子标记的萍草雌雄株基田组差异分析 载体，然后转化大肠杆菌d h s a ，经a m p 筛选挑单苗落提取质粒。用p c r 方法检测表 明克隆获得相应的条带( 图3 - 1 1 ) 。经测序发现，该雄性连锁片段序列长度为5 5 3b p ， a t 含量为6 43 为一富含a t 的序列。经核苷酸b l a s t 检索，没有发现有与其高度 同源的序列( 图3 - 1 2 ) 。 早m 图3 - 1 0 引物1 6 4 扩增所得的雄性特异性片段( 箭头示特异性片段) m ：分子量标准( 0 5 1 4 a ，t a k a r a ) f i g 3 1 0 m a l e - s p e e i l 记d n a f r a g m e n “p r o d u c e d b y p c r w i t h l 6 4 州m e r s i n d i f f c r t a l t p l a n t s ( a r r o w s i n d i e a t l n g * l m f r a g m e n m ) m ：m a r k e r ( d s l 4 a t a k a r 曲 6 0 0b p 4 0 0 b p 围3 - 1i 重组质粒r ( 1 6 4 ) 的p c r 扩增检测 m ：分子量标准( d 5 1 4 a ，t a k a r a ) f i 9 3 1 la m p l i 目i n g o f t h er e e o m b i n a m p l a s m i d mm a r k e r ( 0 5 1 4 a ，t a k a r a l 3 结果与分析 a g a g a g a g a g a g a g a g c g a ga a a g g g t a t