（分析化学专业论文）纳米材料应用于电流型癌胚肮原人和绒毛促性腺激素免疫传感器的研究.pdf

洲m l l l l l 矾 6 4 5 1 2 纳米材料概述2 1 2 1 纳米颗粒2 1 2 2 纳米微管3 1 2 3 复合纳米材料：4 1 3 本论文研究思路6 第2 章基于普鲁士蓝纳米复合膜及纳米金修饰的癌胚抗原免疫传感器研究7 2 1 实验部分7 2 1 1 仪器和试剂7 2 1 2m w h t s c s p d d a p b 纳米复合物的制备8 2 1 3 免疫电极的制备一8 2 1 4 检测方法一8 2 2 结果与讨论9 2 2 1 电极修饰过程的表征9 2 2 2 实验条件的优化l l 2 2 3 免疫传感器的响应特性1 2 2 2 4 传感器的稳定性、选择性和重现性1 3 2 2 5 回收测定l3 2 3 结论1 3 第3 章基于纳米金与二茂铁功能化的壳聚糖复合物固定癌胚抗原的电流型免疫 传感器研究15 3 1 实验部分l5 3 1 1 试剂和仪器一1 5 3 1 2l - 半胱氨酸 羧基二茂铁一壳聚糖复合物( f c c s s h ) 黼j 备1 6 3 1 3 修饰电极的制备1 6 3 1 4 检测方法1 6 3 2 结果与讨论一17 3 2 1 电极修饰过程的电化学表征l7 3 2 2 免疫传感器的信号放大作用18 3 2 3 实验条件优化18 j 1 l l l l 2 ti i 2 0 21 21 的研究一2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 2 3 2 3 2 3 2 4 4 2 3 实验条件的优化2 5 4 2 4 免疫传感器的响应特性2 6 4 2 5 免疫传感器的再生性2 7 4 2 6 免疫传感器的稳定性和重现性2 7 4 3 结论2 7 参考文献2 8 作者部分相关论文题录3 3 致谢3 4 两南大学硕十学伊论文 摘要 纳米材料应用于癌胚抗原和人绒毛促性腺激 素的电流型免疫传感器的研究 分析化学专业硕士研究生吕萍 指导教师袁若教授 摘要 电化学免疫传感器是将电化学分析方法与免疫学技术相结合而构建的一类生物传感器， 具有灵敏度高，分析速度快，操作简单，价格低廉及选择性好等优点，在生物分析、临床诊 断、环境监测等领域得到了广泛的应用。传感器的性能主要取决于生物活性物质的固定方法 和材料，电化学免疫传感器研究中的关键是如何将生物活性组分有效地固定在电极表面。纳 米材料具有比表面积大、吸附力强、生物相容性好等特性。本文将纳米金、纳米铂、碳纳米 管等纳米材料应用于免疫传感器，制备了一系列的电化学免疫传感器。并对免疫传感器的组 装过程进行了表征，以及研究了传感器的性能，结果表明，本文制备的传感器在一定的程度 上改善了传感器的灵敏度和稳定性，并且本文采用制备方法简单，操作简便。 本论文主要从以下几方面开展研究工作： 1 基于普鲁士蓝纳米复合膜及纳米金修饰的癌胚抗原免疫传感器研究 利用c s 和p d d a 保护p b ，并将具有空心管状结构的碳纳米管作为p b 的载体，可提高作为 媒介体的p b 固定量、稳定性并改善其电子的传递。将功能化的m w n t s c s p d d a p b 复合膜修 饰于玻碳电极表面。再利用c s 的氨基的结合作用和p d d a 的静电作用结合具有大的比表面积、 较强的吸附力以及良好生物相容性等优点的纳米金。然后再利用纳米金吸附抗体，制得了一种 性能优良的电流型c e a 免疫传感器。该传感器制备方法简单、成本低、灵敏度高、稳定性好 以及线性范围宽等特点。 2 基于纳米金与二茂铁功能化的壳聚糖合物固定癌胚抗原的电流型免疫传感器研究 利用e d c 和n h s 将l - c y s 与f c - c o o h 交联，并进一步将l - c y s f c 交联到壳聚糖上，从而制 备出的功能化的壳聚糖复合物既具有氧化还原活性又有活性基团( 氨基和巯基) ，再利用活性基 团( 氨基和巯基) 与纳米金的键合作用将纳米金吸附到电极表面，最后利用纳米金吸附抗体，制 成以纳米金功能化壳聚糖生物复合膜为基质的癌胚抗原免疫传感器。同时，利用g o d 代替b s a 作为封闭剂放大响应信号。该免疫传感器对癌胚抗原的检测线性范围为0 0 5 1 0 0n g m l ，检 测限为0 0 2n g m l 。 l 两南大学硕+ 学位论文摘要 3 基于纳米铂与酶作为二抗标记物的电流型免疫传感器的研究 利用铂纳米粒子和辣根过氧化物酶作为信号放大标记物标记二抗，构建了夹心式电流型 免疫传感器。利用功能化的m w n t s 和纳米金作为固载基质来固定抗体，可增大电极的比表 面积，从而提高抗体的【司定量，并且改善电极表面和生物分子间的电子传输能力。采用双抗 体夹心免疫分析模式，将h r p 和纳米铂标记的二抗结合到电极上，即制得免疫传感器，该免 疫传感器利用铂纳米粒子和h r p 的同时对h 2 0 2 催化放大作用，有效放大电流响应信号，提 高免疫传感器的灵敏度。此外，该免疫传感器具有良好的选择性、重现性和稳定性。 关键词：癌胚抗原免疫传感器纳米金多壁碳纳米管人绒毛膜 e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o r s ，w h i c hc o m b i n e dt h em e r i t so fe l e c t r o c h e m i c a lt e c h n o l o g y a n di m m u n o a s s a y , d u et ot h e i rh i g hs e n s i t i v i t y , f a s ta n a l y t i c a lt i m e ，a n ds i m p l em e a s u r e m e n t , l o w - c o s ta n dh i i g hs e l e c t i v i t y , h a v eb e e na p p l i e dt oaw i d er a n g eo fa n a l y t i c a l a r e a s ，i n c l u d i n g b i o a s s a y , c l i n i c a ld i a g n o s i sa n de n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n g a s f o rt h ec o n s t r u c t i o no f 柚 e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o r ，t h ek e yf a c t o ri st h em e t h o da n dm a t e r i a lu s e dt oi m m o b i l i z e b i o m o l e c u l e s n a n o - m a t e r i a l s ，w h i c he x h i b i t i n gl a r g es p e c i f i c s u r f a c ea r e a , s t r o n ga d s o r p t i o n c a p a c i t ya n dg o o db i o c o m p a t i b i l i t y , a r ef a v o u r a b l ef o rc o n s t r u c t i n gb i o s e n s o r s ，w h i c hn o to n l y r e t a i nt h eb i o l o g i c a la c t i v i t i e so fb i o m o l e c u l e s ，b u ta l s oe n h a n c et h es e n s i t i v i t ya n ds e r v i c el i f eo f t h es e l l s o r s i nt h i sp a p e r , w ef a b r i c a t e ds o m ei m m u n o s e n s o r sb i o m i m e t i ci n t e r f a c ec o m b i n i n g s e v e r a ld a n e m a t e r i a l sw i t hg o l dn a n o p a r t i c l e s ，p l a t i n u mn a n o p a r t i c l e s ，a n dc a r b o nn a n o t u b e sf o r t h ei m m o b i l i z a t i o no fb i o m o l e c u l e s i nt h i sa r t i c l e ，t h ei m m u n o s e n s o ra s s e m b l yp r o c e s s e s h a v eb e e ns t u d i e d ，a n dc h a r a c t e r i z a t i o no ft h es e n s o rh a v eb e e ne v a l u a t e d ，t h er e s u l t s s h o wt h a tt h es e n s i t i v i t ya n ds t a b i l i t yo ft h es e n s o r , i nac e r t a i ne x t e n t , h a v eb e e n i m p r o v e d ，a n dt h es e n s o ri ss i m p l et op r e p a r ea n do p e r a t e 1 1 1 em a i nw o r k sa r ei n c l u d e da sf o l l o w s ： 1 an o v e li m m u n o s e n s o rf o rc a r c i n o e m b r y o n i ca n t i g e nb a s e do np r u s s i a nb l u e n a n o p a r t i c l e sc o m p o s i t e sa n dg o l dn a n o p a r t i c l e s p bn a n o p a r t i c l e s 硒a l le l e c t r o nt r a n s f e r m e d i a t o r , h a v eb e e nc a s to n t oa g l a s sc a r b o ne l e c t r o d e s u r f a c eu s i n gc h i t o s a n ( c s ) a n dp o l y ( d i a l l y l d i m e t h y l a m m o n i u mc h l o r i d e ) ( p d d a ) a sp r o t e c t i v e m a t r i xa n dc a r b o nn a n o t u b ea st h ec a r d e r t h eh i i g hs u r f a c ea r e ai sp r o p i t i o u st ot h ei m m o b i l i z a t i o n o fp ba n dp r o m o t e se l e c t r o nt r a n s f e rb e t w e e nr e d o xc e n t e ro fp ba n de l e c t r o d es u r f a c e ，w h i c hw i l l i m p r o v et h es e n s i t i v i t ya n ds t a b i l i t yo fb i o s e n s o r g n p sw e r et h e na t t a c h e do n t ot h ee l e c t r o d e t h r o u g ht h ee l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o nb e t w e e nc a t i o n i cp d d aa n dn e g a t i v eg n p sa n ds t r o n gb i n d i n g i n t e r a c t i o n sb e t w e e ng n p sa n dt h ea m i n og r o u p so fc s t h e n ，t h ec a r c i n o e m b r y o n i ca n t i b o d y 1 1 1 j 两南大学硕十学位论文 a b s t r a c t ( a n t i - c e a ) w a sa d s o r b e do n t ot h es u r f a c eo fm o d i f i e de l e c t r o d e i nt h i se x p e f i m e n lt h e i m m u n o s e n s o ri ss i m p l et op r e p a r e ，e x h i b i t e dh i g hs e l e c t i v i t y , l o n g - t e r ms t a b i l i t ya n dd i s p l a y e d h i g hs e n s i t i v i t y , b r o a dl i n e a rr a n g ea n dl o wd e t e c t i o nl i m i tf o rc e a d e t e r m i n a t i o n 2 a m p e r o m e t r i ei m m u n o s e n s o r f o rc a r e i n o e m b r y o n i c a n t i g e n b a s e do ng o l d n a n o p a r t i c l e sa n dl - c y s t e i n e f e r r o e e n ef u n c t i o n a l i z e dc h i t o s a nc o m p o s i t e f e r r o c e n e - m o n o c a r b o x y l i c a n d l - e y s t e i n e w e r ec r o s s l i n k e d b y e d c a n dn h s ，t h e n l - e y s t e i n e ：f e r r o c e n ef u n c t i o n a l i z e dc h i t o s a n ( f c c s s h ) c o u l db es y n t h e t i z e db yt h ef o r m a t i o no f a n dt h ec a r b o x y lo fl - c y s t e i n e f ch y b r i d i z e dm a t e r i a l sa m i d eb o n db e t w e e nt h ea m i n oo fc s ， w h i c hf o r m e dt h ef u n c t i o n a lb i o m e m b r a n ew i t hg o o dr e d o xe l e c t r o c h e m i c a la c t i v i t ya n da c t i v e g r o u p s ( t h i o lg r o u pa n da m i n og r o u p ) n a n og o l dc a l lb ea d s o r b e dt ot h ee l e c t r o d es u r f a c eb yt h e a c t i v eg r o u p s ，a n dt h e na n t i c e aw a sa d s o r b e dt op r e p a r ec a r c i n o e m b r y o n i ca n t i g e ni m m u n o s e n s o l i i la d d i t i o nt og o dw a se m p l o y e d 豁b l o c k i n ga g e n ti n s t e a do fb s a ，w h i c hc o u l da m p l i f yt h e r e s p o n s eo fa n t i g e n - a n t i b o d yi n t e r a c t i o na n dc o u l dr e s u l ti nh i g h e rc u r r e n tr e s p o n s eb e c a u s eo f t h e e l e c t r o c a t a l y t i cc h a r a c t e r i s t i c so f g o d f o rg l u c o s e t h ec h a n g eo f d p v p e a kc u r r e n to f t h ep r o p o s e d i m m u n o s e n s o rw a sp r o p o r t i o n a lt ot h ec e ac o n c e n t r a t i o n si nt h el i n e a rr a n g ef r o m0 0 5t o10 0 n g m lw i t ht h ed e t e c t i o nl i m i to f0 0 2n g m l 3 a ni m m u n o s e n s o rf o rh u m a ne h o r i o n i c g o n a d o t r o p h i nb a s e d o nh o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e - p l a t i n u mn a n o p a r t i c l e s a sl a b e l ah i g h l ys e n s i t i v ea m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o rf o rd e t e c t i o no fh c gb a s e do n 阳岬sa n d e n z y m ea ss i g n a la m p l i f i e dl a b e l st ol a b e ls e c o n d a r ya n t i b o d y f u n c t i o n a lm u l t i w a l l e dc a r b o n n a n o t u b e s ( m w c n t s ) a n dn a n o - a uw e r em o d i f i e do nt h ee l e c t r o d e ，w h i c hc a nf a c i l i t a t et oe l e c t r o n t r a n s f e ra n de x c e l l e n tb i o c o m p a t i b i l i t ya n di n c r e a s e dt h ea m o u n to fa n t i b o d yd u et oi t sh i g h e r e x p o s e ds u r f a c ea r e a t h e n , t h ee l e c t r o d ew a si n c u b a t e dw i t ha n t i h c g ，h c ga n dr e a c t e dw i t ht h e s e c o n d a r ya n t i b o d yw h i c hw a sl a b e l e db yh r pa n dn a n o p t n a n o - p ta n dh r pi n d u c e dc a t a l y t i c o x i d a t i o no fh 2 0 2 ，w h i c hc o u l dr e s u l t si nt h eg r e a ta m p l i f i t i o no fc u r r e n ts i g n a la n dt h ei n c r e a s et h e o fm m u n o s e n s o rs e n s i t i v i t y m o r e o v e r ，t h ei m m u n o s e n s o re x h i b i t e dh i l g hs e l e c t i v i t y , g o o ds t a b i l i t y k e y w o r d s ：c a r e i n o e m b r y o n i ea n t i g e n ；i m m u n o s e n s o r ；g o l dn a n o p a r t i e l e s ； m u l t i - w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e ；h u m a nc h o r i o n i cg o n a d o t r o p h i n i v 来的，用于监控和检测抗原和抗体之间反应的一类生物传感器。它主要由生物识 别元件( 感受器) 和换能器等元件组成。由于免疫传感器是以抗原一抗体为分子识 别元件，抗体与抗原的结合具有高度的亲和性和分子识别性，因此具有优良的选 择性。相对其它的生物传感技术，免疫传感器减少了非特异性干扰，提高了检测 的准确性。根据产生信号的不同，其检测设置有四种类型：电化学型、温度型、 光学型、和质量型。根据检测信号的产生来源即是否使用标记物，免疫传感器又 分为直接型和间接型的免疫传感器。 1 1 2 免疫传感器工作原理 免疫传感器的工作原理属于固相免疫测试法，即把抗体或抗原固定在固相支 持物表面，通过固定化的抗体或抗原识别待测样品中与它相对应的抗体或抗原并 结合形成稳定的免疫复合物来实现对待测样品特定抗原或抗体的检测。利用抗原 一抗体的高度特异反应的特性，将反应时所产生的一系列化学、电学等响应，通 过换能器转变成可检测的信号，其信号大小与待测物的含量存在定量关系，从而 实现对待测物质的定量检测【2 】。免疫传感器不但能定量检测，由于传感与换能同步 进行，能实时监测到传感器表面的抗原一抗体反应，还能够对整个免疫反应过程的 动态变化进行实时监测，有利于对免疫反应进行动力学分析。 1 2 3 电化学免疫传感器 电化学免疫传感器是免疫传感器中种类最多的一个分支，相比其它免疫传感 器，它的研究最早，同时发展也较为成熟，它将免疫学技术与电化学分析方法相 结合，用于测量免疫反应前后引起的电化学信号变化。随着各种电分析技术的发 展，如电化学流动注射分析、循环伏安法、阳极溶出伏安法、液相色谱电化学检 测等方法，电化学免疫传感器的灵敏度得到了大大提高。除具有生物传感器快速、 灵敏、选择性高、操作简便等特点外，电化学免疫传感器还具有构制敏感电极方 法灵活，体系容易集成化、微型化，测定不受样品颜色、浊度的影响，可以在线 关系。其测定原理包括两种，直接测定法( 非标记) 和间接测定法( 标记) ，直 接测定法是通过免疫反应前后信号电流的变化来对待测物质进行定量检测。间接 测定法则需要采用标记物，抗原抗体的结合反应通过标记有标记物的免疫复合物 间接表现出来，通过对标记物的间接测定，实现对被测抗原或抗体的定量检测。 常用的标记物有酶和电活性物质。根据抗原抗体特异识别方式，间接测定法主要 有夹心法和竞争法两种。前者是在电极上固定抗体，加入含有抗原的待测样品， 与抗体结合，再加入酶标记抗体与抗原结合，形成夹心结构，催化氧化还原反应 产生电流值变化，利用酶的放大作用，可获得极高的灵敏度。后者是用未标记的 抗原与一定量的酶标记抗原竞争固定在电极上的抗体所提供的结合点。催化氧化 还原反应，引起电流变化，从而可测得样品中抗原浓度。 1 2 纳米材料概述 1 9 9 0 年在美国巴尔的摩召开的第一届国际纳米科学技术会议，正式标志着纳 米科学的诞生【们。纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围或由 它们作为基本单元构成的材料。一般来说，纳米材料的尺寸在1 1 0 0n m 范围内， 具有四大效应：表面效应、小尺寸效应、量子尺寸效应、宏观量子隧道效。这是 因为纳米材料的尺寸处在原子、分子为代表的微观世界和宏观物体交界的过渡区 域，这样的系统既非典型的微观系统亦非典型的宏观系统【7 】。纳米材料由于其结 构的特殊决定了纳米材料出现许多不同于传统材料的特性，如：大的比表面积、 正( 或负) 的电荷环境、较高的表面能量、优异的电子传输性、较强的吸附能力、 良好的生物相容性等。利用纳米材料的这些特殊性能可以研制出响应速度快、灵 敏度高、选择性好的各种不同用途的免疫传感器。使纳米材料成为应用于免疫传 感器方面最有前途的材料之一。 1 2 1 纳米颗粒 2 两南入学硕七学伊论文第1 章 纳米颗粒由于具有比表面积大、生物亲和性高、吸附能力强、催化效率高、 表面反应活性高、稳定性好等优异特性，在传感器的研究中发挥着重要作用。常 见的金属纳米粒子有a u 、p t 、i 洫、a g 和p d 等【8 。10 1 ，其中，金纳米粒子是研究的 较早较为成熟的纳米颗粒。 由于纳米颗粒具有极佳的比表面积，可用于生物分子的固定，能增大其固定 量，从而增强响应信号；同时它具有一定的生物相容性，能使生物分子较稳定地 存在。l i 等】利用纳米金的良好的吸附能力，构建了电流型甲胎蛋白免疫传感器， 该传感器的性能良好，其检出限为o 0 4n g m l 。详见图1 1 。 一 _ _ _ - _ _ 。_ - _ - - - _ _ _ _ - 搿噍i - a f p o _ _ - _ _ _ 。_ - _ - - _ 。- - n a n o - a u 图1 1 传感器的修饰过程 纳米颗粒不仅可以作为一种基质用于生物分子的固定，而且可以用于生物分 子的标记，从而实现信号的检测和放大。w u 1 2 1 等构建了一个纳米金作为标记物 的电化学信号放大的免疫传感器，该电极的线性范围4 1 2 0n g m l ，检测限为l n g m l ( 图1 2 ) 。 汹i 等匿半巨墨睾隧 彻。爸二| - 。1 + 砜i h ，l 事1 c h = ， 1 2 2 纳米微管 图1 2 免疫传感器的制备过程 1 留卜r i 荆，* n - 捌蝴 弼篓- 删嗍 q 一 礅璐疆羹 tliilliiitililifl麝bfik戥fi群l蠹iibel髦 攀c 瘢敢鼙 坩咻咐咐基t童i匿眭嚣鞋f掘 两南大学硕十学位论文第1 章 纳米微管在提高分子的固定效率的同时又保持生物分子的活性，而利用其尺 寸更小、比表面积更大的独特的纳米微结构，可以进一步改善生物传感器的性能。 关于纳米微管的研究报道很多，其中，以碳纳米管的研究最热。碳纳米管具有大 的比表面积，孔径大小可控制，独特的电子特性( 金属或半导体性质) ，是制作生 物传感器的理想材料。 y u b 1 等分别利用碳纳米管作为电极的固载基质和二抗的标记物，构建了高灵 敏的免疫传感器( 如图1 3 ) 。将碳纳米管作为固载基质，可以将大量抗体固定在 电极表面，而将碳纳米管作为标记物，可以吸附大量的酶于二抗上，极大地增强 传感器的响应信号，将该免疫传感器用于p s a 的检测，其检测限低至4p g m l 。 ? “o 铂嘲嘲t 嘛耐劳稍 _ 懈盼矗翻嘲疗钿，喊 图1 3 免疫电极的制备过程示意图 1 2 3 复合纳米材料 随着对纳米材料的研究不断深入，由两种或两种以上的材料，通过各种工艺 手段组合而成的新型复合纳米材料，成为材料科学领域研究的一个热点，引起人 们的广泛关注。这种新型复合纳米材料具有独特的力学、热学、光学和电学性质， 由于其良好的稳定性、独特的生物亲和性，以及其表面易基团功能化等特点，被 广泛地应用于敏感分子的固定、信号的检测和放大【1 4 。1 9 1 。 j i e 2 0 】等制备了硒化镉量子点与碳纳米管的复合物。首先将带正电荷的p a h 修饰到碳纳米管表面，再通过静电吸附作用将预先制备好的负电荷的硒化镉量子 点( c d s eq d s ) 固载到碳纳米管( c n t s ) 表面，从而形成为c d s eq d s c n t s 的复合 物。将该纳米复合材料作为电极的固载基质，制备了用于检测i g g 的免疫传感器。 该传感器的线性响应范围为0 0 0 2 - 5 0 0n g m l ，检出限为0 6p g m l 。具体过程见 图1 4 。 4 图1 4 ( a ) 为c d s eq d s - c n t s 的制备过程，( b ) 为免疫传感器的构建过程 c u i 等【2 1 1 首先制备了金碳复合纳米微球，如图1 5 ，首先在制备好碳纳米球 表面的修饰上p d d a ，利用带正电荷的p d d a 将纳米金溶胶修饰到碳纳米球表面， 从而制得金碳复合纳米微球。利用金碳复合纳米球标记二抗分子，该复合材料 具有较大的比表面积，可使电极上结合的h r p 量大大增加，极大提高该免疫传感 器灵敏度，将制得的免疫传感器对h i g g 进行检测，其检测限低至5 6p g m l 。 斟鞋 隆 h i o 攀豢等一图1 5 基于纳米金功能化碳纳米微球的免疫传感器制备过程示意图 5 iii隧甏嚣髦垂 攀 h n w w h h删删删 件p“!ppp髫隧髭睡髭匿匪鬣 薹t 两南大学硕十学位论文第1 章 1 3 本论文研究思路 ( 1 ) 利用p d d a 和c s 保护的p b 修饰具有独特空心结构的多壁碳纳米管 ( m w n t s ) ，得到普鲁士蓝功能化的多壁碳纳米管复合物( m w n t s - c s p d d a p b ) 。 然后将该复合物用于修饰电极，再吸附纳米金，进一步利用纳米金固定抗体，以 癌胚抗原为分析模型，构建免疫传感器。 ( 2 ) 利用二茂铁功能化壳聚糖复合物和纳米金固定c e a 抗体，同时用g o d 代替b s a 作为封闭剂来放大响应信号，制备电流型癌胚抗原免疫传感器。 ( 3 ) 采用双抗体夹心分析模式，来制备信号放大的电流型h c g 免疫传感器。利 用功能化的m w n t s 和纳米金作为固载基质来固定抗体，增大电极的比表面积，从 而提高抗体的固定量，并改善电极表面和生物分子间的电子传输能力。铂纳米粒 子与h r p 对h 2 0 2 的协同催化放大作用，可以有效放大电流响应信号，从而提高免 疫传感器的灵敏度。 6 碳纳米管- 于1 9 9 1 年被i i j i m a l 2 6 】发现以来，因其独特的物理、力学、化学及电子特性， 及其潜在的应用前景而倍受人们的关注，成为世界范围内的研究热点之一。其独特的空 心管状螺旋结构使碳纳米管既具有金属导电性，也具有半导体性能。由于碳纳米管直径 小、表面能高、原子配位不足的表面效应，使其表面原子活性高，易与周围的其它物质 发生电传递作用。利用碳纳米管独特的物理特性，可以在其表面修饰多种无机、有机及 生物分子来制备生物传感器，y a n g 2 7 】等将壳聚糖和纳米铂修饰在碳纳米管表面制得纳米 复合物，构建过氧化氢传感器，使得响应电流显著增大，同时稳定性得到提高。g u o 【2 8 1 等将d n a 修饰到多壁碳纳米管上，将复合物固定到电极表面，获得了良好的电化学响应。 普鲁士蓝( p b ) 纳米粒子，作为电子媒介体由于其具有大的比表面积，高的电催化活 性等特点，在生物传感器上起着重要的作用【2 9 , 3 0 。但由于p b 不稳定，易于从电极表面脱 落1 3 ，因此常用功能化的有机聚合物将其保护起来，如：聚二烯丙基二甲基氯化铵 ( p d d a ) 3 2 , 3 3 、壳聚糖( c s ) t 3 4 1 ，近来，我们研究小组采用p d d a 和c s 共同保护p b l 3 5 】，制 得的传感器，其性能较单一保护的传感器性能更好。因此，本文在此基础上制备了由 p d d a 和c s 共同保护普鲁士蓝多壁碳纳米管纳米复合膜( m w n t s c s p d d a p b ) 。将该 复合膜修饰到电极表面，再利用c s 的氨基和p d d a 的正电荷吸附带负电荷的金纳米粒 子，在增强p b 的氧化还原电化学活性的同时为抗体蛋白的固载提供具有更多结合位点、 具有更高表面能和生物相容性的金纳米层。然后利用纳米金层固定抗体，制得电流型癌 胚抗原免疫传感器。该传感器制备简单，具有良好的稳定性和较高的灵敏度。 2 1 实验部分 2 1 1 仪器和试剂 循环伏安测量采用c h i6 0 0 a 电化学工作站( 上海c h i 仪器公司) ；采用三电极体系 ( 工作电极，铂丝为辅助电极，饱和甘汞电极( s c e ) 为参比电极) ；超声采用 b m n s o n i c 2 0 0 超声清洗仪( 德国b r a n s o nu l t r a s c 地虬l 公司) ；质量的称量采用 a b 2 0 4 s 电子天平( 瑞士m e t i e r - t o l e d o 公司) ；电极表面的微观结构表征采用扫描电子显 微镜( s e m ，s 4 8 0 0 日本日立公司) 。 癌胚抗原( c e a ) 及癌胚抗体( a n t i c e a ) ( 郑州博赛生物技术研究所) ；多壁碳纳米管 7 两南大学硕十学伊论文第2 章 ( m w n t s ，中国科学院成都有机化学有限公司) ，使用前先用浓硝酸回流5h 以引入羧基 7 1 。柠檬酸钠，壳聚糖( c s ，m w ：1 0 0 ，0 0 0 - 3 0 0 ，0 0 0g t o o l ，7 0 8 5 ) ，聚二烯丙基二甲基氯 化铵( p d d a ，m w ；1 0 0 ，0 0 0 - 2 0 0 ，0 0 0g m o l ，2 0 水溶液) ，牛血清白蛋i 刍( b s a ) 和氯金酸( 美 国s i g m a 公司) ，不同p h 值的磷酸缓冲溶液( p b s ) f l do 1 m o l ln a 2 h p 0 4 ，o 1m o l l k h 2 p 0 4 和o 1m o l lk c l 配制；纳米金( g n p s ) 是由柠檬酸钠在1 0 0o c 还原0 5h 制得， 尺寸约为1 6 眦【3 6 1 。其它试剂均为分析纯试剂，实验用水为二次蒸馏水。 2 1 2m w n t s c s - p d d a p b 纳米复合物的制备 参照文献并做少量修饰得到纳米复合物【3 0 l ，在搅拌的情况下，缓慢的将4m l0 0 2 5 m o l l 的k 3 f e ( c n ) 6 滴入到1 6m l 包含6 2 5m m o l lf e c l 2 4 h 2 0 ，o 4 p d d a ，和0 1 5w t 的c s 溶液中。持续搅拌，得到深蓝色的混合液，离心，然后用1 醋酸和水至少洗3 次后，将收集的固体与适量的水混合于超声仪中分散。然后加入一定量纯化过的m w n t s 使其浓度为1 0m g m l ，再置于超声仪中分散即得纳米复合物。 2 1 3 免疫电极的制备 将直径为4i i l i i l 玻碳电极( g c e ) 分别经0 3 、0 0 5g ma 2 0 3 悬浊液抛光至镜面后，冲洗 除去抛光粉后，在蒸馏水中超声洗净，然后依次用蒸馏水、无水乙醇、蒸馏水超声5m i n ， 清洗后，自然晾干待用。 首先将一定量m w n t s c s p d d a p b 复合物滴加到电极表面，于室温下晾干，然后 于纳米金溶液，浸泡8h ，清洗晾干后，再置于a n t i c e a 溶液中，于4o c 下浸泡过夜，用 0 2 5 b s a 溶液来封闭电极上可能存在的非特异性结合位点，封闭2h 。冲洗晾干，将制 备好的免疫电极置于4o c 的冰箱中保存待用。( 图2 1 为免疫电极制备过程) y j 卜 2 1 4 检测方法 暖 国 - _ - - _ _ - _ - _ _ _ ，l ( b ) o n p s 够 - - - ( d ) b s a 图2 1 免疫电极的制备过程 8 喹曦 两南大学硕十学位论文 第2 章 电极制备过程的表征及对c e a 的检测采用循环伏安( c v ) 。该方法采用三电极体系， 修饰电极为工作电极，铂丝电极为辅助电极，甘汞电极为参比电极。整个实验的c v 的 电位范围为一0 4 + 0 6 v ，扫描速率为5 0m v s 。测试底液为o 1m o l lp b s ( p h6 o ) 溶液。 2 2 结果与讨论 2 2 1 电极修饰过程的表征 2 2 1 1s e m 表征 图2 2电极修饰过程s e m 表征图a 图：m w n t s - c s - p d d a - p b g c e ；b 图： g n p s m w n t s c s p d d a - p b g c e ；c 图：a n t i - c e a g n p s m 、7 t s c s p d d a - p b g c e 免疫传感器制备过程中电极表面不同组分的微观结构采用扫描电子显微镜( s e m ) 进 行表征( 图2 2 ) 。其中图2 2 a 为g c e 表面修饰m w n t s c s p d d a p b 复合膜的s e m 图，从 图中可以清晰的看到大量的的管状结构，说明复合膜成功的修饰于玻碳电极表面。图2 2 b 为g n p s m w n t s c s p d d a p b g c e 电极的s e m 图，可以清楚的看到金纳米粒子均匀的 分散在碳纳米管表面，说明纳米金被很好的吸附到复合膜上。图2 2 c 为 a n t i c e a g n p s m w n t s c s p d d a p b g c e 电极的s e m 图，其表面形态发生了明显变 化，大分子的云片状覆盖于修饰电极表面，表明抗体已成功地被固载于修饰电极表面。 2 2 1 2 电化学表征 电极的修饰过程的电化学性质采用循环伏安法进行表征。图2 3 中，曲线a 为修饰上 m w n t s - c s p d d a p b 复合物后的循环伏安图，可明显观察到一对氧化还原峰，这是