（细胞生物学专业论文）羽髓干细胞生物学特性及其永生细胞系研究.pdf

浙江火学博十学位论文 中文摘要 羽毛具有超强的能力进行周期性更换和再生。在鸟类，这些附属器官的更 新是靠位于羽囊基底部的羽髓干细胞( f k s c s ) 扩增和分化来实现的。f k s c s 连 接于上皮，真皮、皮肤衍生物、肌肉和神经纤维之间，影响这些细胞的分子活 动、细胞行为以及功能形态。为了阐明f k s c s 的生物学特性，并进一步了解 f k s c s 的扩增、分化和转分化潜能及其参与组织更新代谢的过程，本研究进 行了f k s c s 分离、培养和鉴定；开展了多向分化诱导和体外组织重建试验； 探索了异源表达人端粒酶逆转录酶基因( h t e r t ) 和绿色荧光蛋白基因( e g f p ) 对f k s c s 复制性衰老的影响。结果表明，f k s c s 能够形成克隆、具有自我更 新和扩增能力，特异性表达i n t e g r i n g l 和c d 4 9 e ，同时也表达其它细胞蛋白分 子，如角蛋白k 1 5 和k 1 9 。f k s c s 能够诱导分化为脂肪细胞、神经细胞和角 质化细胞，在体外能够形成类组织状结构。通过异源表达h t e r t e g f p ，f k s c s 成为永生化细胞，并且在传代过程中未发生细胞转型现象，保持原代f k s c s 的 生物学特性，能够参与鸡胚多胚层发育。本研究首次建立了羽髓干细胞系，阐 明了羽髓干细胞生物学特征，探讨了羽髓干细胞在参与羽毛组织体外重建和体 内胚胎组织胚层分化过程中所起的作用。通过异源表达h t e r t ，建立了永生化 干细胞系，为了解人端粒酶在不同物种中的作用提供了新的理论依据，并为研 究端粒酶在调控组织损伤恢复和衰老中的作用提供了新思路。 关键词：羽髓干细胞，细胞多向分化，再生，端粒酶逆转录酶，细胞永生化。 浙江大学博士学位论文 a b s t r a c t t h ec o n t i n u e dr e n e w a lo ff e a t h e r si na v i a ns p e c i e si sm a i n t a i n e dt h r o u g ht h e p r e s e n c eo ff e a t h e rk e r a t i n o c y t es t e mc e l l s ( f k s c s ) ，w h i c hl i n km o l e c u l a ra c t i v i t y a n dc e l l u l a rb e h a v i o rt ot h ef u n c t i o n a l m o r p h o l o g yo ft h ee p i d e r m i s ，d e r m i s ， a p p e n d a g e s ，m u s c l ea n dn e r v ef i b e r s i no r d e rt oc h a r a c t e r i z ef k s c sa n d u n d e r s t a n dt h ep r o l i f e r a t i o na n dt r a n s - d i f f e r e n t i a t i o np o t e n t i a l si n v o l v e di ns u c h r e l a t i o n s h i p s ，w ed e v e l o p e dan o v e lc u l t u r es c h e m et os e l e c tf k s c sf r o mc h i c k f e a t h e rf o l l i c l e sa n dc h a r a c t e r i z e dt h e s ef k s c s w ef u r t h e ri n v e s t i g a t e de f f e c t so f t h ee c t o p i ce x p r e s s i o no fh u m a nt e l o m e r a s er e v e r s et r a n s c r i p t a s e ( h t e r t ) o nt h e r e p l i c a t i v es e n e s c e n c eo fc h i c k e nf e a t h e rk e r a t i n o c y t es t e mc e l l s t h er e s u l t s s h o w e dt h a tf k s c sw e r ec a p a b l eo fs e l f - r e n e w a la n dp r o l i f e r a t i o n t h e s ec e l l s w e r ep o s i t i v ef o re p i d e r m a ls t e mc e l l s p e c i f i cm o l e c u l e ss u c ha s i n t e g r i n l 31 ， c d 4 9 c ，k e r a t i n15 ( k15 ) a n dk e r a t i n19 ( k19 ) f k s c sh a dm u l t i p o t e n t i a l so f d i f f e r e n t i a t i o ni n t oa d i p o s e ，n e u r a lc e l l sa n dt e r m i n a l l yd i f f e r e n t i a t e dk e r a t i n o c y t e a si n d i c a t e db yt h ee x p r e s s i o no fc e l l l i n e a g e - s p e c i f i cm a r k e r s 。n ef o r m a t i o no f o r g a n i z a t i o n l i k e s t r u c t u r e sf r o mf k s c sw a sa l s o a n a l y z e d w ee s t a b l i s h e d i m m o r t a l i z e dh t e r t - e g f p - f k s c se e l ll i n e s t h ee c t o p i ce x p r e s s i o no fh t e r ti n n a t i v ef k s c si n c r e a s e dt h ep r o l i f e r a t i o np o t e n t i a lo ff k s c s t h ec e l l st r a n s d u c e d w i t hh t e r tg r e wi n d e f i n i t e l y nv i t r o t h ec e l ll i n e se x p r e s s e dh t e r t e g f p g e n e sw i t h o u tt u m o r i g e n i ct r a n s f o r m i n ga c t i v i t ya n ds u s t a i n e ds o m ep a r e n t a l c e l l u l a rc h a r a c t e r i s t i c s nv i v ot r a n s p l a n t a t i o no fh t e r t e g f p f k s c ss h o w e dt h e m u l t i l i n l e a g ed i f f e r e n t i a t i o np o t e n t i a li nd e v e l o p i n gc h i c k e ne m b r y o s 1 1 1 ea b o v e d a t ap r o v i d ean o v e lf r a m e w o r kf o ru n d e r s t a n d i n gt h et e l o m e r ea c t i v i t yi nd i f f e r e n t s p e c i e sa n ds u g g e s tt h en e wi n s i g h tf o rm a n i p u l a t i n gt e r tf o rt h e r a p e u t i c p u r p o s e si nt r e e i n gt i s s u ei n ju r ya n da g i n g k e y w o r d s ：f e a t h e rk e r m i n o c y t es t e mc e l l s ，m u l t i l i n e a g ed i f f e r e n t i a t i o n ， r e g e n e r a t i o n ，t e l o m e r a s er e v e r s et r a n s c r i p t a s e ，i m m o r t a l i z a t i o n 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙婆太堂或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者挠戳签字吼叫年石月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 浙江太堂有权保留并向国家有关部门或 机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权也 参量l 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播， 可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：( 刍乏书乒一 导师签名：易复钐 签字日期：叫年占月f 日 抖嗍7 “月j 日 浙江人学博士学位论文 致谢 值此论文完成之际，谨向给予我专业指导的导师王金福教授、席咏梅副教 授致以崇高的敬意和衷心的感谢! 本论文从科研设计到论文的撰写无不凝聚着 两位导师的悉心教导和辛勤耕耘。您们开阔的学术视野、敏锐创新的科学思维 和身体力行的工作作风，严格严谨的治学态度、忘我的工作精神，宽厚正直、 实事求是的做人品格，严谨求实、刻苦敬业的专业精神都使我耳濡目染，受益 终身。在此表示忠心的感谢和崇高的敬意! 感谢浙江省杭州市常青养殖场为本实验提供实验标本! 感谢浙江大学动科院张才乔教授等对实验的支持! 感谢浙江大学动物中心给予的指导和帮助! 感谢孙建国、刘雨丽、宗承、石东燕、袁文佶、苏丽、黄国平、杨金凤、 郑文静、郭春娟等同学给予我的帮助。感谢彭诗圆、于敏利等同学的支持和帮 助，在此一并表示诚挚的谢意! 感谢我的家人给予我的物质和精神上的支持。 感谢所有帮助和关心过我的人们：假如没有您们的帮助，我就没有今天，如 果没有您们的关爱，我更不会有明天! 浙江大学博上学位论文 前言 由上皮、真皮、皮肤附属器官、肌肉和神经等构成的鸟类体壁已经被用做 发育生物学研究的主要模型。羽髓干细胞来源于体壁组织，是一种成体干细胞， 在一定条件下，能够形成具有特定形态和功能的羽囊和皮肤的各种细胞类型， 羽囊连接肌肉和神经，因此它与整个鸟类机体的生理息息相关。位于羽囊基底 部的羽髓干细胞( f e a t h e rk e r a t i n o c y t es t e mc e l l s ，f k s c s ) 是鸟类皮肤及其附 属器如羽毛，鳞片，皮脂腺，指( 趾) 甲发生、更新和修复的主要来源。关于 羽髓干细胞定位及其再生机理，前人已经开展了一些探索性研究( s a w y e r ， 2 0 0 3 ；y u e 等，2 0 0 5 ；a l i b a r d i 等，2 0 0 7 ；x i 等2 0 0 3 ) 。利用电子显微镜观察 胚胎期绒羽的组织和细胞超微结构，已经获得了关于羽毛形态结构的很多信息 ( a l i b a r d i 等，2 0 0 7 ；a l i b a r d i ，2 0 0 2 ；a l i b a r d i ，2 0 0 5 ；a l i b a r d i ，2 0 0 6 ) 。羽毛的 循环可分为五个连续的形态变化阶段，f k s c s 在羽芽，羽囊等形态建成中起 着种子细胞的作用( l i nc m 等，2 0 0 6 ) 。 羽囊保持周期性生长，每一周期包括：生长期( a n a g e n ) 、退化期( c a t a g e n ) 、 静止期( t e l o g e n ) 。这个过程需要有新生细胞代替老化、死亡细胞。y u e 等( 2 0 0 5 ) 利用b r d u 标记、d i l 跟踪和组织块移植等技术对体内f k s c s 行为进行研究， 发现羽囊中存在三类细胞：标记长期滞留细胞( 1 a b e l r e t a i n i n gc e l l s ，l r c s ) ， 短暂扩增细胞和终末分化角质化细胞。其中，l r c s 具有自我扩增、多向分化 潜能等干细胞的性质。推测在来自真皮乳突的信号刺激下，l r c s 大量扩增， 产生短暂扩增细胞，短暂扩增细胞再进一步分化，形成终末分化细胞并处于相 应的空间位置，形成羽毛的各个结构。相对于毛发，羽毛没有隆突起结构，其 循环和再生的过程也存在差异，生长速率、细胞扩增、细胞角质化、羽毛形态、 颜色、形状等也更加多样化和复杂化。 本研究以初生小鸡的翅为材料，采取羽囊，分离培养羽髓干细胞并进行鉴定， 阐明羽髓干细胞生物学特征，摸索羽髓干细胞在参与羽毛组织体外重建和体内 胚胎组织胚层分化过程中所起的作用。 在此基础上，我们进行了异源表达人端粒酶基因( h t e r t ) 对羽髓干细胞 复制性衰老影响的研究。正常细胞体外增殖能力是有限的，经过一定时期的增 殖期以后，最后将进入生长抑制状态，称之为衰老。我们的研究表明，羽髓干 l 浙江大学博士学位论文 细胞虽然具有一定的自我增殖能力，但在体外培养1 5 1 7 代时，细胞趋近衰老 分化。细胞的衰老主要是因为遗传物质染色体出现非正常状态。在染色体的末 端，有一种端粒的结构将染色体固定以防染色体发生松散和变异。在染色体每 一次复制过程中，端粒都会减少一段序列，当端粒的长度减少到不能够固定染 色体时，染色体就会变得非常不稳定，或者变异而导致肿瘤等疾病的发生或者 细胞发生死亡。 端粒酶基因在鸡和哺乳动物中具有较高的同源性。鸡胚胎干细胞 ( v e n k a t e s a n 等，1 9 9 8 ) 和哺乳动物胚胎干细胞( s w a n b e r g 等，2 0 0 4 ) 都具有较高的 端粒酶活性，随着胚胎发育，端粒酶活性逐渐降低。在体细胞中，端粒酶不再 表达( f o r s y t h 等，2 0 0 2 ) 。在鸡和人类，细胞衰老的“生物钟”都是染色体两端 的端粒决定1 的( d e l a n y 等，2 0 0 0 ；t a y l o r 等，2 0 0 0 ；s w a n b e r g 等，2 0 0 3 ；d e l a n y 等，2 0 0 4 ) ，两类细胞都存在抑制自发突变的机制( l i m a 等，1 9 7 2 ；f o r s y t h 等，2 0 0 2 ) 。鸡和人在端粒生物特性有很多相似性，鸡和人的细胞都具有自发调 节细胞寿命的机制，这说明它们可能拥有相同的基因信号途径和机制，包括细 胞老化、永生和癌变。如何使正常细胞在没有发生转化的前提下寿命延长而达 到永生化，对人类的生活和未来医学研究将会产生极大影响。由此，由于鸡和 人的细胞在端粒酶调控机制的关键步骤极其相似，所以鸡可以做为研究人体细 胞衰老和细胞转化的一种生物模式( c a m p i s i ，2 0 0 0 ) 。 异源表达人端粒酶逆转录酶( h u m a nt e l o m e r a s er e v e r s et r a n s c r i p t a s e ， h t e r t ) 已被用作研究细胞衰老的方法之一。利用携带h t e r t 基因的质粒转 染骨髓间充质干细胞( s i m o n s e n 等，2 0 0 2 ) 、毛囊干细胞( s a t i n 等，2 0 0 5 ) 、鼠间 充质祖细胞( d e n n i s 等，1 9 9 6 ) 、人胚胎干细胞( c o u n t e r 等，1 9 9 2 ) 等，已经获得 了永生细胞系。除了这些干细胞外，h t e r t 还可以使体细胞永生化，如人成 纤维细胞( v a z i r i 等，1 9 9 8 ) 、视网膜色素上皮细胞( b o d n a r 等，1 9 9 8 ) 、内皮细 胞( y a n g 等，1 9 9 9 ) 等。另外，其它多种脊椎动物的细胞如兔( x i a n g 等，2 0 0 0 ) ， 鹿( z o u 等，2 0 0 2 ) ，牛( v e i t o n m a k i 等，2 0 0 3 ) 和羊( c u i 等，2 0 0 3 ) 的细胞也通 过异源表达h t e r t 实现了永生化。 本研究用逆转录病毒载体将人端粒酶催化亚基( h t e r t ) 转染到鸡羽髓干 细胞，建立了永生化羽髓干细胞，并检测转基因细胞的生物学特性、分化潜能 以及组织重建能力。 浙江大学博士学位论文 羽髓干细胞在保护濒危动物，种子细胞储备，特殊蛋白表达，转基因动物， 动物疫苗研发，动物性疾病的细胞和基因治疗等方面有着广泛的应用前景；同 时，羽髓干细胞研究对组织器官重建和功能恢复等研究有重要的参考价值，具 有积极深远的科学意义。 浙江大学博士学位论文 第一章文献综述 羽髓干细胞研究进展 【摘要】f k s c s 在羽毛的形态建成和周期生长中起着重要的作用。f k s c s 定位于羽囊基底部，具有干细胞的一般特征，能自我更新和分化，能表达丰富 的i m e g r i n l 3 1 和c d 4 9 c 。f k s c s 与真皮相互作用形成各种羽毛的中间结构，最 终形成羽毛。在羽毛形态建成中存在特定的基因调节和信号传导通路。 【关键词】羽髓；干细胞；形态建成；信号通路 羽毛在鸟类的一生中不仅规律地更换，而且鸟羽拔掉一周后就会再生。羽 毛强劲的再生能力是靠位于羽囊基底部f k s c s 的自我更新和分化来实现的。 f k s c s 是发育成羽毛、鸟类皮肤这些组织器官的母细胞，具有多向分化潜能， 通过自身的分裂增殖产生多种组织细胞，以适应组织器官的新陈代谢和外界损 伤等环境的变化。通过研究f k s c s 分离培养、生物学特征、细胞表面蛋白、 增殖分化调控机制以及在羽毛形态形态建成中的作用，对于实现组织再生及促 进皮肤损伤后功能与结构的完全修复意义重大。 1 、f k s c s 的定义和定位 f k s c s 是来源于外胚层的一种专能成体干细胞。在生物体最初发育期， 其外胚层曾是一单层多潜能细胞。在进化过程中，生物体形成储存细胞种子的 机制，部分具有多向分化潜能的外胚层细胞作为种子细胞储存在皮肤基底层， 毛囊隆突区或羽囊基地层。位于皮肤基底层的种子细胞，成为表皮干细胞，约 占整个种子细胞的1 0 ，另外约9 0 的种子细胞储存在毛囊隆突区成为毛囊 干细胞或羽囊基底部成为f k s c s ，它们是皮肤中干细胞的主要储存仓库。无 论是皮肤基底层，还是毛囊隆突区或羽囊基底部，这些位置都较为隐蔽，从而 能够有效保护种子细胞免受化学、物理等的不良侵害；另外这些位置血管较为 丰富，能够提供足够营养维持细胞的活性。表皮干细胞和毛囊干细胞( 人或部 分一甫乳动物) 或f k s c s ( 鸟类) 来源相同，它们都具有干细胞的基本特征， 如慢周期性( 标记滞留性) ；增殖能力强；具有多向分化潜能等。它们或向下 4 浙江大学博士学位论文 迁移到毛囊根部或羽囊底部，在真皮细胞的刺激下生成新的毛囊或羽囊；或在 外界环境的刺激下，向上迁移生成表皮，皮脂腺，汗腺，鳞片，指( 趾) 甲等。 根据羽髓中细胞的不同分裂增殖能力，可分为三类细胞：周期缓慢的干细 胞、短暂扩增细胞和终末分化细胞。在各类细胞中，干细胞只占很小的比例， 大部分是干细胞的分裂子细胞，即短暂扩增细胞( t r a n s i ta m p l i f y i n g ，t a c s ) 。 t a c s 为定向分化细胞，只能分化为某一种或几种细胞系。经历3 5 代分裂周 期后就退出细胞周期转入终末分化。t a c s 经过分裂产生子代细胞，这些子代 细胞迁移并分化成各种细胞系，在相应位置形成相应的组织结构。 f k s c s 为慢周期细胞，可以利用b r d u 进行标记和定位。羽毛刚刚启动进 入生长阶段时，各种细胞开始扩增，b r d u 渗进正在复制的d n a 。被标记的 细胞由于大量扩增，标记逐渐暗淡，直至消失。而干细胞由于周期缓慢，标记 将长期存在，所以干细胞也被称为标记滞留细胞( l a b e lr e t a i n i n gc e l l s ，l r c s ) 。 相对于毛发，毛囊干细胞所处的环境一毛囊隆突区的位置是不变得，而f k s c s 生存的壁龛却随着羽毛的生长而处于动态变化中利用b r d u 标记、d i i 跟踪、 细胞异体移植以及原位杂交等技术对在体羽囊干细胞行为进行研究( y u e 等， 2 0 0 5 ) ，其中b r d u 标记用于周期缓慢的细胞；细胞异体移植用于研究其多分 化潜能；d i i 用于研究细胞迁移。研究发现，在羽毛循环过程中，羽囊中各种 细胞处于一种动态平衡中，f k s c s 位置也发生相应变化。在静息状态下，羽 根角质化，羽根环体积缩小，最后以v 字形结束。随着羽根环的收缩，乳突 结构逐渐消失，但是f k s c s 依然存在，并从羽根环回归真皮乳突的上皮细胞 中。在换羽阶段，f k s c s 占据生长阶段羽囊的真皮外胚层，然而生长阶段的 乳突外胚层并不与f k s c s 一起扩增。旧的羽毛脱落后，乳突生成，并逐渐增 大，产生新的羽髓层，开始新的羽毛生长。在开始时，e k s c s 是发散式，后 来逐渐聚集，在生长期间呈现典型的羽根环突起结构。在生长刚刚启动阶段， f k s c s 开始扩增。在组织移植试验中，f k s c s 表现了多种分化能力。从三维 空间重构的试验来看，f k s c s 在放射性对称的绒羽中呈现水平状排列，在飞 羽中则呈现螺旋状排列。 f k s c s 能自我更新，它有以下特点：( 1 ) 具有自我更新能力、增殖和分化潜 能。体外培养的角质化克隆形成细胞，在一定培养条件下，能够形成细胞克隆， 特征性表达细胞表面分子i n t e g r i n l 3 1 和c d 4 9 c ，具有一定分化潜能，分化出羽鞘 浙江大学博士学位论文 细胞、羽片细胞。将g f p 转入原代培养的角质化克隆形成细胞中，发现角质化 克隆形成细胞能够稳定表达g f p 并传代( x i 等，2 0 0 3 ) ；( 2 ) 数量较少，慢周期。 利用b r d u 标记f k s c s ，在长达6 个月甚至更长的时间里，这些标记依然存在 ( y u e 等，2 0 0 5 ) ；( 3 ) 在信号分子作用下，可分裂产生短暂增殖细胞。在体内 环境中，f k s c s 和真皮细胞能够相互作用，大量扩增，分化形成各种羽毛的结 构，如羽鞘、羽片、羽原基状，最终形成羽毛结构；( 4 ) 存在部位隐蔽、安全， 血管丰富，营养条件好；( 5 ) 复制和分裂有两种方式，一种是对称分裂形成两 个相同的干细胞，另一种是非对称分裂，即由于细胞质中的调节分化蛋白不均 匀地分配，使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端成为功能专一的分化细 胞，并且保持与其祖细胞相同的遗传特征；另一个保持亲代的特征，仍作为干 细胞保留下来，分化细胞的数目受分化前干细胞的数目和分裂次数控制。 到目前为止，毛囊干细胞和表皮干细胞已经建系，并在组织工程，临床医 学中得以应用。而f k s c s 还没有建立一种有效分离纯化和培养的方法。 为了更好地了解f k s c s 的生物学特点，需要找到f k s c s 特异表达的细胞蛋 白。x i 等从研究细胞黏附特性入手，选择i n t e g r i n l 3 1 和c d 4 9 c 做为检测角质化克 隆形成细胞的特征性标记。i n t e g r i n 为异源双聚体，包括0 【和p 两种亚基。在基 底层细胞定向分化过程中， i n t e g r i n 3 1 表达下调，直至细胞完全脱离基底层， 其细胞表i 面i n t e g r i n l 3 1 y - 丧失表达，故i n t e g r i n l 3 1 可作为干细胞的表面标志。通 过细胞免疫荧光染色发现，羽髓中的角质化克隆形成细胞表达丰富的 i m e g r i n l 3 1 ，可快速粘附至细胞间基质，部分i n t e g f i n p l 阳性细胞具有较强的克 隆能力以及分化和表达外源基因的能力( x i 等，2 0 0 3 ) 。 研究表明，角蛋白是表皮细胞的结构蛋白，是表皮的主要分化产物。它们 构成直径1 0 n m 的微丝，在细胞内形成广泛的网状结构。它们与细胞的增殖分 化程度密切相关。细胞分化程度的不同，表皮细胞就表达不同的角蛋白，如定 向祖细胞表达k 5 ，k 1 4 ，分化的终末细胞表达k 1 ，k 1 0 等。研究发现毛囊隆突 部皮肤干细胞表达k 1 5 ，k 1 9 ，而终末分化标记k 1 0 则不表达。到目前为止， 人们已经鉴别了多种毛囊干细胞和表皮干细胞的特征表达分子，如p 6 3 ， c d 7 1 ，k 1 5 ，k 1 9 ，0 【2 8 1 等。而f k s c s 特有的分子标记几乎为空白研究表明， 羽毛的结构成分也主要为角蛋白。在羽毛不同发育阶段，分化程度不同的细胞 中，角蛋白表达的类型也不同。利用角蛋白的表达差异有望鉴别和筛选f k s c s 。 浙江大学博上学位论文 2 、羽毛形态建成和f k s c s 的生物学功能 不同鸟类的羽毛形态、颜色、花纹多种多样，具有多层分支，如：羽轴、 羽根、羽片。羽片又分为羽枝、羽小枝、羽小钩等。其功能随结构变化而各异， 它不仅承担鸟类飞行、保温功能，而且还起着向其它鸟类传递欢迎或排斥的信 息。羽毛在形成初期，分支结构在大小、数目、形状上是可变的，从而形成羽 毛在形态上的多样性。根据其结构不同羽毛一般可分为3 种：正羽、绒羽和纤 羽。正羽是最为普遍和主要的羽毛，其中间是1 根羽轴，下段称羽根，埋在皮 肤的羽囊中上段为羽茎；轴的两旁生羽片。羽片由羽枝构成，这些羽枝互相平 行、彼此相邻，与羽轴呈4 5 0 角。羽枝进一步分支，其同样也斜生着呈4 5 0 角 的许多彼此平行的羽小枝。羽小枝上具有羽小钩，羽小钩互相钩连，形成严密 的羽片，这些羽片沿着羽轴形成两边对称结构，这是飞羽的典型结构。另一种 羽毛是绒羽。绒羽没有羽轴，只有1 根很短而细的羽茎。羽枝较长，羽小枝上 没有小钩，羽片呈放射性对称。在鸟类的身体上紧靠每一正羽的毛囊都有细软 的绒羽，它生长在正羽的内层后贴皮肤，起隔热保温、防辐射作用。纤羽是单 根存在的细羽枝，特点是细软而长，主要着生在正羽内层无绒羽的地方。 羽毛的主要成分来自羽囊的角化上皮细胞。羽囊是一个上皮细胞与圆柱状 羽纤维体组成的复合体，它在机体的一生中保持周期性生长，每一周期包括生 长期、退化期、休止期。羽囊的结构复杂，其外层是由致密结缔组织构成的外 根鞘，与表皮相延续。外根鞘的上皮从内到外分为三层：生发层、中间层、角 质层。在生长期，f k s c s 产生的大量t a c s 就聚集于生发层，从而生发层有很 强的分裂增生能力。它增生的细胞逐渐向外层推移；中间层是生发层向角质层 的过渡；角质层不断产生角蛋白，构成外根鞘和羽纤维体。羽囊内侧称为内根 鞘，内根鞘与外根鞘之间由具有弹性和韧性的结缔组织相连接。羽囊内部呈圆 柱状，里面包含的物质是羽髓。在生长期，羽囊结构由上至下分为成熟区、生 长区、羽根环、真皮乳突。在退行期，羽根环、真皮乳突和羽髓逐渐退化；至 静止期时，上述三个结构消失。羽毛成熟区也有三层，其最外层是羽鞘，后来 羽鞘破裂，羽毛从中伸出；中间层和基底层是羽轴和羽枝成熟的地方。羽囊内 部紧靠羽毛成熟区下端的内根鞘是细胞不断分化生成羽枝、羽轴的生长区。不 同的羽毛，该区的物质分布是不一样的。而f k s c s 分布对生长区的物质分布以 及羽毛的形状起着决定性作用。在飞羽中，f k s c s 呈现螺旋状排列，使得羽 浙江大学博j l 学位论文 轴形成区两边的物质如角蛋白a 等呈现浓度梯度，并与羽轴呈一定的角度， 靠近生长区前端，浓度较大，而在后端，逐渐消失，新的羽轴从生长区前端产 生，羽枝在生长区后端以螺旋式方式到达羽轴形成区，产生前端粗后端细的羽 轴( y u e 等，2 0 0 5 ) 。在放射性对称的绒羽中干细胞呈现水平状排列，同一物 质会在前后轴同一水平线上表现相同的浓度。将生长中的羽囊前后轴分割，就 会发现b r d u 标记的f k s c s 以及细胞与真皮细胞相互作用产生的形成羽毛结构 的各种物质在同一等高线上是均一的，而在飞羽中有一个倾斜度，即在前后轴 同一水平线上表现不相同的浓度。说明干细胞存在的状态是产生物质浓度梯度 进而影响羽毛形状的原因。另外通过乳突重建实验，将小鸡胸部的乳突与飞羽 中的乳突对换，发现重新长出的羽毛与原来位置的乳突保持了一致。从而说明 真皮乳突决定了f k s c s 的存在方式，而两者又共同决定了羽囊中的物质分布， 物质分布的差异又造成了羽毛以及羽毛功能的不同( y u e 等，2 0 0 5 ；c h e n 等， 2 0 0 4 ) 。 生长区下端为细胞不断扩增的区域，称为羽根环，生长期的f k s c s 就处 于羽根环处。羽囊中存在干细胞、短暂扩增细胞、终末分化角质细胞。当羽毛 进入生长期时，一部分f k s c s 在乳突细胞的分子信号作用下，离开自己生存 的壁龛，以普通细胞增值的方式产生子代细胞，并与真皮乳突细胞相互作用， 使真皮乳突的上皮聚集了大量具有增殖能力的细胞，即短暂扩增细胞。另一部 分f k s c s 继续停留在壁龛中，维持干细胞数量的稳定。随着羽根环的逐渐增 大，f k s c s 所处的整个环境位置被牵扯，向上移动。当其位置超出真皮乳突 细胞的刺激效应范围时，f k s c s 停止产生t a c s 细胞，当所有的t a c s 完成终 末分化，形成成熟细胞时，羽囊进入退行期，羽根环逐渐消失，f k s c s 回归 于真皮乳突的上皮层。最后真皮乳突被结缔组织鞘牵拉，定位到羽囊底部，羽 毛失去营养来源，逐渐萎缩，然后脱落，羽囊处于休止期。 真皮乳突是上皮细胞与真皮相互作用的结果，其包含的细胞有多种，如上 皮细胞、黑色素细胞、成纤维细胞等。真皮乳突在羽囊周期性生长过程中定期 形成，在羽囊周期调控中发挥重要作用，它是f k s c s 增殖和分化命运的主宰， 在羽毛形成过程中起着主要的分子信号导向作用。 羽髓是由生长期真皮乳突面向羽纤维体的细胞变得松散形成的。羽髓包括 一条主动脉、血管、纤维原细胞、纤维结合素、层粘蛋白以及许多扩增的的间 浙江大学博士学位论文 充质细胞和明胶样物质。它们将羽纤维体填充，使得羽纤维体形成一个圆柱状 结构神经开始进入羽髓腔。羽毛生长过程中所需的营养，就通过羽髓提供， 羽髓伴随羽毛生长而延伸。当羽髓以及其周围的上皮细胞退化时，羽片便从中 长出。羽毛没有成熟时，羽根中充满带有血管的羽毛，呈红色，俗称血管毛( y u 等，2 0 0 4 ) 。在羽毛生长末期，血管从羽毛上部开始萎缩、退化，逐步后移， 一直萎缩到羽根，与其它物质形成白色帽状结构。正如皮肤角化层细胞不断脱 落一样，羽毛也会脱落，需要下层的细胞不断增殖补充。 在羽毛的形态建成中，f k s c s 和真皮细胞是关键的组织者，而f k s c s 的 扩增和分化能力为羽毛的形成提供了源源不断的细胞来源。 3 、羽毛形成过程中的分子信号网络 到目前为止，羽毛的形成被描述为五个连续的形态变化阶段：宏观调控、 微观调控、羽芽形成、羽囊形成以及羽毛再生循环( l i n 等，2 0 0 6 ) 在羽毛 发育的每一阶段都涉及分子信号网络以及成形素如f g f ，b m p ，s h h 和w r i t 等，它们在不同的事件中会反复出现，但是作用不同，分为两个方面来阐述。 3 1 羽毛形态发生的阶段 3 1 1 宏观调控阶段 在胚胎期，外胚层的上皮细胞是单层多潜能的，它既可以形成皮肤也可以 形成各种皮肤附属物。环境的变迁和进化机制使得生物体不可能一次用光这些 种子细胞。在生物体储备种子细胞的机制调节下，原本均一的真皮受到分子信 号c d e r m o 1 、f g f 、s h h 、b m p 的作用( s c a a lm 等，2 0 0 1 ) ，开始按照一 定的规律进行浓缩，形成皮肤附属物生长的最初基地。真皮本生分泌抗浓缩成 分b m p 2 ，激活剂和抑制剂之间进行竞争，达到一定的平衡时，就形成羽毛区、 无毛区，皮肤实现整体规划，并与功能保持一致，这就是羽毛的宏观调控 ( s e n g e l 等，19 9 0 ；l i n s e n m a y e r 等，19 7 2 ；d h o u a i l l y ，2 0 0 4 ) 。 3 1 2 微观调控阶段 真皮间充质按照一定规律凝集后，促使其上方一部分多潜能细胞按照一定 的形状和比例储存起来，其它多潜能的细胞接受真皮浓缩物分泌的信号分子 1 3 - c a t e n i n 、b m p 2 7 、f o l l i s t a t i n 等作用开始大量扩增，在相应空间效应下，向上 延展、增厚，形成基板。基板分泌s h h 、b m p 、v e n t 等，促使真皮凝聚体进一步 9 浙江大学博士学位论文 凝聚形成真皮乳突，乳突和基板形成最初的羽芽原基，导致真皮区域转为羽芽 和羽芽之间区域( s c a a l 等，2 0 0 2 ) 。这个过程也叫做微观排列。 3 1 3 羽芽形成 微观排列结束后，就进入羽芽形态形成阶段。在飞羽中，羽芽的形态形成 包括前一后轴、近一远端、羽囊的整合、管状结构的形成等变化( l i n 等，2 0 0 6 ) 。 而对于绒羽，羽芽的形态形成只是羽芽的生长和羽囊的形成。最初的羽芽比较 小，在角蛋白a 以及w n t 3 a 分子不同浓度梯度作用下，形成前后轴，具有前后 轴的羽芽纵向生长，造成近远端分子浓度的差别，圣g s h h 、n o g g i n 、b m p 只在 远端表达而近端无表达。管状结构是通过羽芽间充质的丢失来实现的，这时的 羽芽已经趋向成熟。在这些羽芽之间就是无毛区，羽芽和无毛区之间在一定条 件下是可以变化和互换的，例如w n t 家族成员会改变羽芽位置( c h a n g 等， 2 0 0 4 ) 。鸡胚中，羽芽在小鸡的胚胎表面按照一定的规律在不同位置形成，它 们的形状、大小截然不同，这是将来形成各种羽毛的基础( l i n 等，2 0 0 6 ) 。 3 1 4 羽囊形成 羽芽向上部分延伸形成羽鞘，周围与表皮相连的细胞向下凹陷，与真皮乳 突细胞相互连接的细胞也发生整合，在羽芽基部形成羽囊。羽囊是羽芽细胞活 跃增殖、迁移、分化的结果，其形态形成主要包括三个形态学上的变化：( 1 ) 存在干细胞、短暂扩增细胞、终末分化细胞；( 2 ) 出现羽髓，由于羽髓的出 现，使得整个羽囊的外形呈现圆柱状；( 3 ) 在生长区形成羽枝( l i n 等，2 0 0 6 ) 。 羽囊中由于大量短暂扩增细胞以及成熟细胞的出现，形成相应的羽根环、生长 区、成熟区。在生长区，细胞以及细胞分泌的因子或均匀排布，或在不同的高 度形成均匀带。基底层的上皮细胞整合，形成空白区。两个空白区之间是羽小 枝形成区，两个羽小枝之间即为轴区。这三个区域总称为羽枝区。空白区是单 层细胞组成，包含的主要细胞因子是s h h 、b m p 2 ( m a t t h e w 等，2 0 0 5 ) ，在 羽小枝成熟后，s h h 就会诱导该处的细胞凋亡，使羽枝和羽小枝分开。羽小枝 生成区的内部填充由基底层不断产生的细胞来完成。这些细胞逐步分化，形成 角化细胞，并相互垒叠成柱，细胞柱之间是羽小枝轴。远端细胞完成终末分化， 失去细胞核，成为死细胞。当包裹在外面的羽鞘碎裂脱落，完整的羽毛便象降 落伞一样从中撑开。 在飞羽中，由于f k s c s 存在的位置离乳突不同，造成相互作用产生的细胞 l o 浙江人学博士学位论文 以及分泌的细胞因子在同一水平线上不同，这种梯度使得生长区不仅有羽枝 区，还具有羽枝脊区，羽枝脊区与羽芽纵向平行，并向羽芽下端伸长。分子浓 度相同的位置形成同一羽枝，从解剖学上观察，羽枝以螺旋型的方式逐渐向前 端靠拢。在羽枝脊区，羽枝生长消失，相互融合，羽枝脊共同组成羽轴。成熟 羽片的上下面分别代表原来的基底层和基底上层。 在绒羽中，羽毛的形成过程基本与飞羽一致，只是由于细胞以及细胞分泌 的成形素比较均匀，同一羽枝在同一水平线上形成，不存在羽轴形成区，羽枝 呈现放射性对称。 3 1 5 羽毛再生循环 在整个羽毛的循环过程中，毛囊呈现动态的变化。相对较长的是生长期， 可以是几个月甚至是几年。羽毛的成熟从远端开始。当所有细胞完成了终末分 化时，羽囊就会进入退行期。f k s c s 回到真皮浓缩物的上皮处，相互之间的距 离缩短，双方又一次落在相互作用的范围内，真皮浓缩物进一步被诱导形成乳 突，部分f k s c s 被诱导大量扩增，共同启动羽毛再生循环。羽毛的退化有一定 的规律，如：飞羽是按照从左到右的次序脱落和更换。羽毛的这种定期性更换 具有季节性，一般一年两次：春季和秋季，这种季节性可能与温度调控相关。 自然状况下，羽毛更换还与与光照、激素，应急等因素有关。 3 2 分子表达与调控 3 2 1 激活抑制机制 羽毛生长的局部性、周期性与成形素相关，但成形素本身并不足以启动这 种循环，它们只是在定期排列中充当真皮和上皮竞争因子，并可能对羽芽和羽 芽间间充质的特化起作用。这些成形素可以分为两类，对羽毛形成起着积极作 用的称之为激活剂，如f g f 2 一4 ，n o g g i n ，t g f l 3 2 ，p - c a t e n i n ，s h h 等；对羽毛形成 起抑制作用的称之为抑制剂，如d e l t a - 1 、f g f r 、e g f ( l i n 等，2 0 0 6 ) 等。 另外，在羽毛形态发生过程中，同一家族中的不同成员发挥的作用是不同的， 如b m p 家族，b m p 7 起激活作用，而b m p 2 ，b m p 4 起抑制作用。有的成形 素只限制在特定区域表达，如s h h 只在羽芽中表达( l i n 等，2 0 0 6 ) ，c o l l a g e n 1 只在羽芽之间区域表达( a t i t 等，2 0 0 3 ) ；有的成形素一开始在皮肤整个区 域都表达，后来只限制在特定区域表达，例如，1 3 - c a t e n i n 、w n t7 a 和g r e m l i n 、 w n t1 1 ( c h a n g 等，2 0 0 4 ；o h y a m a 等，2 0 0 1 ) 成形素参- 9 了皮肤附属物的 浙江火学博士学位论文 宏观或微观排列，在羽芽内部表达的成形素有利于羽芽的形态形成，如羽轴的 特化、生长或者分化，在羽芽间区表达的成形素有利于羽芽之间的组织形态形 成，如肌腱、肌肉和真皮的形成( j u n g 等，1 9 9 8 ；j i a n g 等，2 0 0 4 ) 。 3 2 2 分子信号途径 在羽毛的形态建成中，b m p 、w r i t 、s h h 、1 3 - c a t e n i n 、n o t c h 、f g f 等家 族承担了主要功能。 b m p ，即骨形成蛋白，不仅对骨、软骨的形成与生长起作用，而且对生 物体胚胎发育、器官形成、左右对称、皮肤附属物的发育都有作用。成熟的 b m p 分泌到细胞外基质中发挥作用，成员为同源二聚体。在胚胎早期，b m p 不仅诱导神经管的形成，而且b m p 2 与f g f 、c d e r m o l 作用，共同抑制和诱 导真皮浓缩物形成。研究发现，b m p 2 能够在早期阶段诱导异位的羽原基的形 成( s c a a lm 等，2 0 0 2 ) ，而且是通过c d e r m o 1 诱导的( s c a a lm 等，2 0 0 1 ) ，因 此c d e r m o 1 可能位于b m p 2 的上游。b m p 与s h h 作用促进羽芽形成；b m p 7 与 3 - c a t e n i n 在同一时期表达，它与外胚层器官形成密切相关，过量表达b m p 7 会 产生羽毛样的鳞片( h a r r i s 等，2 0 0 4 ) 。 b m p 的拮抗# j n o g g i n 、c h o r d i n 、f o l l i s t a t i n 、g r e m l i n ( d r m ) 可以和b m p 特 异性结合，调节b m p 的活性( o h y 啪a 等，2 0 0 1 ) 。在宏观调控中，f o l l i s t a t i n 、 g r e m l i n 在羽毛形成区表达，调节真皮浓缩物的形成。基板形成时，f o l l i s t a t i n 转移到基板周围，n g r e m l i n 在基板内部表达；羽芽形成后，f o l l i s t a t i n 、g r e m l i n 与s h h 一起表达于羽芽的后端和顶端，对b m p 活性进行调节( o h y a m a 等，2 0 0 1 ； p a t e l 等，1 9 9 9 ；b a r d o t 等，2 0 0 4 ) 。羽囊形态建成中，在生长区，b m p 表达