（凝聚态物理专业论文）煎炸食用油品质光谱表征方法的研究.pdf

摘要 摘要 食用油经高温煎或炸，尤其是反复高温煎炸以后，不仅营养价值降低，而 且对人体有一定的毒性作用，所以煎炸过的食用油应该在其变质之前及时更换。 但是为了既能充分的利用食用油，又能在煎炸食用油变质前及时更换，必须找 到食用油变质的临界值，即煎炸过的食用油应该何时废弃。 本文在对国内外煎炸食用油品质测量和检测技术的现状及发展趋势的分析 与综合的基础上。对其进行了理论分析和实验研究。本文取得的主要研究成果如 下： ( 1 ) 提出了利用光谱表征方法测量煎炸食用油品质的创新思想，并首次利 用灵敏度高，能够解决多组分荧光物质并同时测定分析的同步扫描荧光光谱法 分别对新鲜的和煎炸过的食用油进行光谱测量，并对它们进行对比。实验结果 表明同步荧光光谱法可以对煎炸食用油品质进行测定。 ( 2 ) 最先利用在研究分子结构和分析化学组成中功效最为显著的红外光谱 法分别对新鲜的和煎炸过的食用油进行光谱测量，并利用计算机差谱技术做出 它们的吸光度差谱图，实验结果表明根据食用油中某一种成分含量的变化能够 确定油加热或煎炸食品后质量的变化程度。 ( 3 ) 首次利用光谱方法测定出食用油经煎炸以后羰基c = o 和反油酸( 是一 种对人身体健康有害的物质，能够引起心血管疾病的发生，而且对胎儿体重和 i i 型糖尿病有影响。) 的含量明显的增加。 关键词：品质，同步扫描荧光光谱法，红外光谱法，临界值，光谱表征。 a b s t r a c t a b s t 怕c t e d i b l eo i l s ，捕e rd e e p f 时i n g ，w h i c hn u m t i o nv a l u ep l a yd o w n ，i s 嘶o u st o p e o p l e sh e a l m s od e e p 一的i n ge d i b l e o i l sm u s tb er 印l a c e di nt i m eb e f o r ei t d 酏e r i o r a t e s b u ti no r d e rt ou t i l i z et h eo i l sa d e q u a t e l ya i l dr c p l a c ei ti nt i m e ，t h e c r i t i c a iv a i u ew h e r et h eo i i sw i i id e t e r i o r a t em u s tb e 内u n do u t b a s e do nt l l ea i l a l y s i sa n ds y i n h e s i so ft l l ep r e s e mm e a s i l r e m e n ta n dd e t e c t i o n t e c q u eo f d e e p 田i n ge d i b l eo i l sc h m c t e r i s t i ca n di t sd e v e l 叩i n gt e n d e n c y ，w i l i c h h a sb e e nd i s c u s s e dt h e o r e t i c a l l ya n de x p e r i m e m a l l yi nd e t a i l s t t l em a i l lr e s e a r c h w o r k sa r ea sf o l l o w i i l g ： 1 t h ep a p e rp m p o s e sab r a n di 肌0 v a t i v ei d e at 王l a tt h eq u a l i t yo fd e e p 一疗y i n g e d i b l eo i l sc o l l l db em e a s e db yas oc a l l e ds p e c 订o s c o p i cc h a m c 蜘洲o nm e 1 0 d s f r e s he d i b l eo i l sa n dd e e p - 矗_ y i n go i l sw a sd e t e c t e dr e s p e c t i v e l yb ys y n c h m n o u ss c a n n u o r e s c e n c es p e c t m mt e c h i l i q l l ew l l i c hh a sl l i g hs e n s “i 、r i 哆a n di sa b l et od e t e c t m u l t i c o m p o l 】n d 嘶也f h l o 豫沿e n c ea tt h es 锄et i m ef i r s l u 山1 dt l l e i rs p e c t r l l i i l i m a g e sw e 糟c o m p 删t h er e s 山t so f e x p 翻m e n ti 1 1 d i c a t et 1 1 a tq l 】a l i t yo f d 髓p f 聊n g e d i b l eo i l sc a i lb ei n e a s l l r e db ys y i l c h m n o l l ss c a l lf l u o f e s c e n c et e c l l i l i q u e 2 f r e s he d i b l eo i l sa n dd e e p - 疗y _ m go i l s 、 船d e t e c t e dr e s p e c t i v e l yb ym d s p e c 咖t e c h n i q u ew t l i c hi sm o s tp o t e n ti i ls t l l d y o nm o l e c u l a r 舶m e w o r ka 1 1 d c h e r n i c a li n f e d i e mf i r s t l y a n dt i l e i ra b s o r b e n c ys p e c t r a ls u b 如c t i o nw a sf i l l 6 u e db y c o m p u 屯e rs p e c t r a l s u t 衄a c t i o nt e c h n i q u e t h er e s l l l t so f 叩r i i i l e n ti n d i c a t e 血a t q l l a l 时o f d e 咿衄啦e d i b l eo i l s c a l lb ec o 吐珊e db y t h ec h a n g eo f c o n t e 嫩o f s o i n e i n g r e d i e n ti ne d i b l eo i l s 3 t h ec o n 把n t “c 盯b o n y l ( c = o ) a n d 妇n s - 0 1 e i ca c i d ，w h i c hi sb a dt op e o p l e s h e a l t ha n dc a nc 卸s et h et i a p p e i l i n go fc a r d i o v 够c m 壮d i s e 舔e 趴dj l l f h e n c e 也e w e i g h to ff e t u s 锄dt y p ei id i 舭t e si ne d i b l eo i l s ，i n c r e a s eg r e a u y 概r 衄堍，w l l i c h h a db e e nd e t e c t e db ys p e c 仃o s c o p i cc h a r a c t e r i z a t i o nm e t h o d s k e yw o r d s ：q u a l i 吼s y n c h o n o i l ss c a j lf l u o r e s c e n c es p e c t n 埘t e c h l l i q u e ，i m i a r e d s p e c 觚l i nt e c l l i l i q u e ，c r i t i c a lv a l u e ，s p e c 廿d s c o p i cc h a m c t e r i z a t i o n i i 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版：在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：、炙辛邑卑 口6 年r 月f 。日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、己公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本入承担。 学位论文作者签名：溘辛乞华 山。6 年r 月r 目 第一章绪论 第一章绪论 第一节引言 民以食为天，食品是人类物质条件赖以生存和发展的最基本的原料之一。随 着我国国民经济的迅速发展和人民的生活水平的不断提高，随着科学技术的发 展，高度机械化、自动化、食品加工机械化、单机高度的机、电、光、液一体 化，加工生产线高度的自动化；高新技术( 超临界气体提取技术、膜分离技术、 食品辐射技术、挤压膨化技术、微胶囊技术、速冻加工技术、超声波技术、光 电检测技术及电子技术等) 的广泛应用；高效节能产品( 干燥、蒸发、油炸、杀 菌以及烘烤) 多：高保鲜贮藏技术( 气调保鲜技术、辐射保鲜技术、涂膜保鲜技 术、预冷保鲜技术、化学保鲜技术、速冻保鲜技术和无菌保鲜技术等) 日趋成 熟；高度重视食品综合利用和环境保护：食品种类的趋于更营养、卫生、方便， 保鲜食品、微波食品、速冻食品、功能食品、方便食品、儿童食品、休闲食品 和微生物食品等应运而生“1 。但同时，食品安全问题也日趋成为人们关注的焦点， 并发展成为一个世乔性的问题，重视食品安全，己经成为衡量人民生活质量、社 会管理水平和国家法制建设的一个重要方面。 在我国居民的饮食( 尤其是早餐) 结构中，油炸食品占有较大比重，从烧豆 腐、烤肉串到炸薯条等煎炸烧烤类食品。这些食品经过食用油煎炸之后，色、 香、昧俱全，深受人们的喜爱，其品种及食用量明显增加。但食用油经高温煎 或炸，生产制作某些油炸食品时，高温加热温度高，油脂反复使用，则发生高 温氧化，这种氧化比常温时油脂酸败的、自动氧化要尉烈得多，而且食品中韵水 分会发生水解反应，致使颜色变深、粘度增加、持续起泡，可使油中的维生素a 、 胡萝h 素、维生素e 等被破坏。同时，因氧化反应，必需脂肪酸也受到破坏， 营养价值会降低。经高温加热的油，其供热量只有未经高温加热油的三分之一 左右，而且不易被机体吸收，且妨碍同时进食的其他食物的吸收。当然，在一 般烹调中，由于加热温度不很高，时间短暂，故对营养价值的影响不大，但反 复经高温加热的食用油其营养价值的破坏就较大。1 。尤其是反复高温加热食用 油，不仅降低营养价值，而且这种油对人体有一定的毒性作用。因为高温加热 第一章绪论 会使油脂中的脂肪酸聚合，反复高温加热食用油，产生油脂过氧化物、杂环胺、 苯并芘、丙烯醛等很多脂肪酸聚合物。脂肪酸聚合物可使肌体生长停滞，肝脏 肿大，肝功能受损，甚至有致癌的危险：加热生成的反油酸也是一种对人身体 健康有害的物质，能够引起心血管疾病的发生，而且对胎儿体重和i i 型糖尿病 有影响。所以在油炸、油煎、烧烤等烹调方式加工食品时由于食用油在煎炸、 烧烤时如果温度过高也容易引发食品安全问题。本论文就以煎炸食用烹饪油品 质特性及其光谱表征方法为主要研究对象展开的。 第二节煎炸食用油品质的研究概况 为了对煎炸食用油的品质进行测量以及如何确定煎炸食用油应该废弃的判 据临界值，人们一直进行着不懈的努力。到目前为止，黏度、游离脂肪酸、感 观质量、发烟点、聚合物生成以及特殊的降解产物等的测定技术不同程度地得 到应用。另外，已研制了一些特别的方法评定使用过的煎炸用油的化学性质， 其中有些方法需要标准的实验仪器，而其他的方法需要专门测定。 由于煎炸过程中产生的变化极其复杂，一种方法只适合于一类条件，但对 其他条件就不适合了。 l 、石油醚不溶物这种方法是德国首先研制的，测定煎炸食用油中石油醚 不溶物的含量，如果石油醚不溶物的为0 7 ，发烟点小于1 7 0 ，或者石油醚 不溶物为1 o ，不管发烟点是多少，那么可以认为使用过的油炸油脂已变质了。 但由于氧化产物部分溶于石油醚，因此这个方法既花时间又不太准确。 2 、极性化合物这种方法测定煎炸食用油中的极性化合物的含量。经煎炸 后的油脂在硅胶柱上进行分级分离，使用石油醚一二乙醚混合物洗脱非极性馏 分，极性馏分的百分含量可以从总量与非极性馏分的差值计算得到，可使用油 的最大允许的极性组分量为2 7 。 3 、二聚酯这个技术就是测定煎炸食用油中的二聚酯的含量。是将油完全 转化成相应的甲酯后采用气相色谱短柱进行分离和检测。可采用二聚酯的增加 作为热分解作用的量度。 4 、介电常数快速测定该技术就是采用食用油传感仪器快速测定油的介电 常数的变化0 1 。介电常数随着极性的增加而增加，极性增加意味着变质。这种技 术具有一些优点：整套设备体积小而且是手提式的，不熟悉这个领域的人也能 2 第一章绪论 进行操作，分析时间不到5 m i n 。然而，在解释由这个方法得到的数据时必须十 分谨慎。介电常数的读数代表了油炸中产生的极性和非极性组分间的净平衡， 一般以极性增加为主，但是两种组分间的净差值取决于许多因素，其中一些与 油的质量无关( 例如水分) 。 5 、采用“诊断盒”评定油的变质大多数是将一种试剂简单的加入到样品 中，再用标准色去对比所产生的颜色。由m e r c k ( d r a m s t a d t ，德国) 出售的f r i t e s t 是测定羰基化合物“3 ，而o x i 历t 5 刮是测定氧化了的化合物。l i b r al a b s ( p i s c a t a w a y ，n j ) 的v e r i 句一f a a 5 0 0 1 是测定游离脂肪酸，而v 翻匆t a m 1 5 0 是测定碱性物质”1 ，这些都是有用的测定方法。 6 、激光光谱法测定煎炸食用油的荧光强度的变化来表征煎炸油的变质程 度。该方法只利用了煎炸食用油的荧光强度的变化比较粗糙的表征了煎炸油的 品质因素，没有详细的测定是哪一种或哪些物质经过煎炸后生成或消失。 第三节煎炸食用油品质光谱表征的目的和意义 1 3 1 食用油脂的物理和化学性质 供食用的油腊有两种形式，一种是从植物和动物中分离出来的“可见脂 肪”，例如奶油、猪油以及起酥油；另一种是作为基本食品( 例如乳、肉) 的 组成成分。植物油大部分来自大豆、棉籽、花生、以及含油棕榈、椰子以及橄 榄树的种子。 9 9 的植物油和动物油中的油脂是脂肪酸甘油酯，它们是脂肪酸和甘油酯 形成的化合物。甘油是一个三羟基醇，因此可与脂肪酸形成一酯、二酯以及三 酯。天然存在的主要是三酰基甘油。通常在室温下脂为固体，油为液体。“脂肪” 这个术语涵盖了固态和液态的油脂。脂肪酸甘油酯形成的方程式为： 9 掣厂o h r 1 c o o h ( h 厂r 民 c h o h + r 2 c o o h年h ( 卜e 卜r 2+ 3 h 2 0 l 。 l0 c h 厂o hr 3 c o o h 6 h 广o 邑一r 3 第一章绪论 天然油脂中所含的脂肪酸( 无论饱和或不饱和) 绝大多数为偶碳直链的， 极少数为奇数碳链和具有支链的酸；不饱和脂肪酸根据所含双键的多少，分为 一烯酸、二烯酸、三烯酸和三烯酸以上的酸。天然存在的不饱和脂肪酸除少数 为反式结构外，大部分为顺式结构。碳链长、饱和程度以及顺反结构有差异的 脂肪酸，其物理化学性质也不同，组成的三脂肪酸甘油酯的性质也显然不同。 因此，油脂的性质和用途很大程度上是由脂肪酸所决定的。 天然油脂具有同质多晶现象，膨胀性等物理性质。而化学性质是我们研究 的主要内容，它的化学性质如下： l 、脂解通过酶作用，或通过加热或水分的作用，脂类中酯键水解( 脂解) ， 产生游离脂肪酸。在深度油炸过程中，由于从食品中引入大量的水，而且保持 相当高的温度，因此，脂解是一个主要的反应。油炸过程中产生的大量游离脂 肪酸通常会导致油的发烟点和表面张力下降，此外，游离脂肪酸比甘油脂肪酸 更易氧化。 2 、氧化脂类氧化是食品变质的主要原因之一。由于它能导致食用油和含 脂食品产生不良的风味和气味，一般称为哈味，哈味的产生使食品不能被消费 者接受，因此脂类氧化对于食品工业是至关重要的。食用油在加热时的氧化方 程式为： hh ii r c = c r 热、金属、氧 肛r 吨f 蓦 内酯 芳香化合物 烃 3 、热分解食品加热时产生各种化学变化，其中有一些对风味、外观、营 养价值以及毒性是重要的。食品中不同的营养成分不仅经历分解反应，而且这 些营养成分相互间也能通过非常复杂的途径生成大量新的化合物。其中饱和脂 肪酸生成少量的链长较短的烃类、内酯类以及羰基化合物；不饱和脂肪酸在无 氧条件下加热主要生成二聚物，在空气中和高温下加热生成了氧化二聚物或含 氢过氧化物、氢氧化物、环氧化物和羰基以及醚和含有过氧桥的氧化物。食用 4 第一章绪论 油热分解的方程式为： 早 2 r c o 。h 半r k o + c o 。+ h 2 0 4 、聚合多双键脂肪酸的分子容易聚合，聚合有两种形式，一种为高温缺 氧的聚合称为热聚合，另一种为氧化聚合。前者以碳碳结合为主，后者既有碳 碳结合，也有碳氧结合。这里我们主要考虑氧化聚合。氧化聚合的方程式为： r h + o ，r o o h r o o h r o 对g o h 2 r o o h 手r og 卜r o o g 卜h ，o r o o 譬卜r h 争r o o h + r g r g 卜r 聋r - r r o o g 卜r o o g 专r o o r + 0 ， 1 3 2 煎炸食用油的性质 在煎炸过程中，食用油中产生很多新的化合物。 ( 1 ) 挥发性物质在煎炸过程中，包括氢过氧化物的形成和分解的氧化反 应，产生诸如饱和与不饱和醛类，酮类、内酯类、醇类、酸类以及醅类这样的 化合物。油在1 8 0 并有空气存在的情况下加热3 0 分钟，用气相色谱法可检测 到主要的挥发性氧化物。虽然所产生的挥发性物质的量随油的类型、食品类型 以及热处理方法不同和时间不等会有很大的变化，它们一般达到一个平衡值， 这可能是因为挥发性物质的生成和由于蒸发或分解所造成的损失达到一个平衡 【9 】 o ( 2 ) 中等挥发性的非聚合的极性化合物( 例如羟基酸和环氧酸) 这些化 合物是由烷氧基自由基的各种氧化途径产生的。 ( 3 ) 二聚物和多聚酸以及二聚和多聚甘油酯这些化合物是由自由基的热 和氧化结合产生的，聚合作用造成了煎炸用油的黏度显著提高，煎炸时间越长 越明显“”。 ( 4 ) 游离脂肪酸这些化合物是在热与水存在条件下由三酰基甘油水解 生成的“。 第一章绪论 上述这些反应是在煎炸过程中观察到的食用油的各种物理和化学变化的原 因。这些变化包括了黏度和游离脂肪酸的增加、颜色变暗、碘值降低、表面张 力减小、折射率改变以及形成泡沫的倾向增加。 煎炸食用油的化学变化和物理变化受许多油炸参数的影响，显然形成的化 合物同油和被油炸食品的组成有关。高温、长的油炸时间以及金属污染有利于 油脂的过渡分解，油炸锅的式样与类型( 平底间歇油炸锅或连续的油炸锅) 也 及其重要。表面一体积比越大，则油的氧化越快。其他有关的因素是油的转换 效率与加热模式( 连续的或间歇式的) 以及是否存在抗氧化剂。 1 3 3 煎炸食用油品质光谱表征的目的和意义 由于食品安全问题日趋成为人们关注的焦点，并发展成为一个世界性的问 题；重视食品安全，已经成为衡量人民生活质量、社会管理水平和国家法制建设 的一个重要方面。而且油炸产品是人们比较喜欢的食品之一，食用量呈每年增 加的趋势。因此油炸食品的安全问题也引起了人们的重视。各种检测煎炸食用 油品质的方法层出不穷，一些比较直观的方法包括黏度和感观质量的观测方法 以及测定煎炸食用油中的石油醚不溶物的含量、游离脂肪酸的含量、极性化合 物的含量、聚合物的含量以及发烟点的方法已经应用到这方面的研究之中，但 是这些方法要么需要花大量的时间而且有的还不是太准确，要么需要非常麻烦 的步骤，而且不能实时在线测量；采用“诊断盒”评定油变质的方法非常精确， 但是必须向样品中加入一定的试剂，也不能实时在线测量。目前只有采用食用 油传感仪器快速溅定油的介电常数的变化的方法能够进行实时在线测量，但由 于俞电常数的读数代表了油炸中产生的极性和非极性组分间的净平衡，所以， 测定结果容易受到一些与油的质量无关的因素( 比如极性物质水) 影响。 快速方便的光谱技术己经广泛的应用于食物的分析和检测，尤其是红外光 谱已广泛的应用在蔬菜油的测量“”，橄榄油的测量”和牛奶的测量”。荧光 光谱对多荧光团物质的分析应用具有很大潜力，陈慰宗等已经利用激光荧光法 对煎炸食用油进行了分析和测量“，荧光光谱已在有机分子及生物大分子的分 析中得到广泛应用”7 ”3 。但是常规的仅改变激发波长的荧光激发光谱法和仅改 变发射波长的发射光谱法，不能包含分析物的足够信息，而同步荧光光谱法可 以提高荧光光谱的分析能力。同步扫描荧光光谱是解决多组分荧光物质同时测 6 第一章绪论 定分析的良好方法之一，因同时扫描激发单色仪和发射单色仪，荧光强度是激 发波长和发射波长的共同函数，在一定程度上可获得更多的光谱信息，因此同 步扫描荧光光谱法具有比上述方法更高的灵敏度。 红外光谱在研究分子结构和分析化学组成中功效最为显著，可以根据光谱 中吸收峰的位置和形状来推断未知物的结构，依照特征峰的强度来测定混合物 中各组分的含量。能够根据油中某一种成分的含量来确定油加热或煎炸食品后 质量的变化程度。 经过实验验证这两种方法都有可能走向现场，进行实时在线快速的测量， 虽然目前的研究主要还是在实验室里进行的。 所以，对煎炸食用油的品质利用光谱方法进行检测和分析研究是十分有必 要的，而且具有十分重要的理论意义和应用价值。 第四节本论文研究的主要内容 本学位论文主要对煎炸食用油的品质进行了光谱特性表征方法的研究。分 别采用灵敏度较高、多组分测量光谱简单、可实时在线测量的同步扫描荧光光 谱法和研究分子结构和分析化学组成功效显著的红外光谱法对煎炸食用油的荧 光光谱特性和红外光谱特性进行了分析和研究，并与新鲜的未经煎炸的荧光光 谱和红外光谱进行了比较，从而能够根据油中某一种成分的含量来确定食用油 经加热或煎炸后质量的变化程度，提出比较方便快捷的检测方法检测食用油在 反复煎炸的过程中油脂的品质的变化，并找到个方便、快速、可实时在线测 量并确定煎炸油应该废弃的物理或化学量判据临界值的光谱方法。 本论文的主要研究内容： 1 ) 在第二章中首先介绍了荧光的产生机理，影响荧光强度的环境因素以及 与分子荧光有关的几个参量，同时介绍了同步荧光光谱技术的一些技术特点， 仪器结构和性能，以及f 司步荧光光谱的分析应用； 2 ) 在第三章中阐述了同步扫描荧光光谱法测量煎炸食用油的实验，结果以 及讨论； 3 ) 在第四章中讨论了红外光谱的形成以及与分子结构的关系，并介绍了红 外光谱仪器的类型、基本组成、技术参数和光谱仪器的分析和应用。 4 ) 在第五章中阐述了红外光谱法测量煎炸食用油的实验、结果以及讨论。 7 第二章荧光基本原理与同步荧光光谱技术 第二章荧光的基本原理与同步荧光光谱技术 荧光不同于热辐射，一些化学物质从外界吸收能量后进入激发态，当其再 从激发态经过一定的驰豫再回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射( 即 发光) 称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光，当 供能一旦终止，这种发光现象也随之消失，而且与温度无关。 按产生荧光的原因的不同，可分为化学荧光和光致荧光。其中由化学反应 引起的荧光称为化学荧光，由光激发所引起的荧光称为光致荧光。我们在本文 中仅涉及光致荧光。 按产生荧光的基本微粒的不同，荧光又可分为原子荧光、x 射线荧光和分 子荧光。原子的外层电子吸收电磁辐射后，由基态跃迁到激发态，在回到较低 能态或基态时，发射出一定的辐射，即原子发光。用初级x 射线激发原子内层 电子所产生的次级x 射线称为x 射线荧光。基于测量x 射线荧光的波长及强 度以进行定性和定量分析的方法称为x 射线荧光分析法。处在基态的物质分子 吸收激发光后跃迁到激发态，这些激发态分子在因转动、振动等损失一部分激 发能量后，以无辐射跃迁下降到低振动能级，再从低振动能级下降到基态，在 此过程中，激发态分子将以光的形式释放出所吸收的能量，称之为分子荧光， 就是通常所说的荧光。 以物质发射的荧光强度与浓度之间的线性关系为依据进行定量分析及以荧 光光谱的形状和荧光峰对应的波长进行定性分析的方法称为荧光分析法，也称 作分子荧光光谱法或荧光光谱法。 第一节荧光的产生机理 荧光的产生过程包括分子吸收光能、激发及去活化三个阶段啪1 。 2 1 1 光的吸收 光通过物质时，某些频率的光会被吸收而强度减弱这一现象称为物质对光 的吸收。原子、分子或离子具有不连续的、数目有限的量子能级，只能吸收与 8 第二章荧光基本原理与同步荧光光谱技术 能级之差相同或为其整数倍的能量。对于光来说，只能吸收一定频率的光子， 即 巨一e 0 _ v = ( 2 1 ) 式中e 一吸光物质的基态能级能量 e 一吸光物质的较高能级能量 一普朗克( p l a n k ) 常数 v 一光的频率 旯一光的波长 c 一真空中的光速 分子的吸收光谱包括转动、振动和电子光谱。 ( 1 ) 纯粹的转动光谱只涉及分子转动能级的改变，不产生振动和电子状态 改变，转动能级间距离很小，吸收光子的波长较长、频率较低。分子的转动能 级差一般小于o 0 5 p y ，甚至小到1 0 。4p y 以下，因此分子振动能级变化所产生的 吸收光谱出现在远红外甚至微波区。 ( 2 ) 振动光谱反映了分子转动和振动能级的改变。分子吸收光子后产生振 动能级的跃迁，在每一振动能级改变时，还伴有转动能级改变，因此吸收峰加 宽，谱线密集，显示出转动能级改变的微细结构，称为“振动一转动”吸收带， 或“振动”吸收。分子的振动能级差一般在o 0 5 l p 矿，引起这种改变的光子 能量比第一种的高，分子振动能级变化所产生的吸收光谱出现在中、近红外区。 ( 3 ) 分子吸收光子后使电子跃迁，产生电子能级的改变，即为电子光谱。 电子能级的变化都伴随有振动能级与转动能级的改变，所以两个电子能级之间 的跃迁不是产生单一吸收谱线而是有很多相距不远的谱线所组成的吸收带。电 子能级间的能量差一般为1 1 0 p y 左右，相应于电子运动能级变化( 电子能级 跃迁) 所产生的吸收光谱出现在可见光区和紫外光区”“。 各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，也即各种物 质所具有的能级数目和能级间的能量差不同，因此它们吸收光能量的情况也不 同，所以每种物质都有其特有的固定的吸收光谱曲线。 2 1 2 光的激发 通常分子里的价电子数目是偶数，若一半的自旋方向正好和另一半的自旋 9 第二章荧光基本原理与同步荧光光谱技术 方向相反，价电子自旋量子数的总和为零，即s = 0 ，自旋的多重态 m = 2 s + l = l ，称这类分子处于单重态，用s 表示。物质被激发时，分子中可 出现自旋平行的成对电子，此时s = 1 ，m = 2 s + l = 3 ，称这类分子处于三重态， 用r 表示。单重态的电子基态( 墨) 的分子被激发时，容易跃迁到单重态的电 子激发态( s ，& ) ，而不容易跃迁到三重态的电子激发态( 互，瓦) 。 同样正一 l 或五一 五容易，互一 氐难。大多数分子在室温下处于基态的最 低振动能级。荧光或磷光所涉及的分子其基态都处于单重态，具有最低的电子 能量。 2 1 3 激发态分子的去活化 处于激发态的分子是不稳定的，可通过辐射跃迁和非辐射跃迁等分子内去 活化过程丧失多余的能量而返回基态。 辐射跃迁的去活化过程发生光子的发射，伴随着荧光或磷光现象。非辐射 跃迁的去活化过程，其结果是电子激发能转化为振动能或转动能，包括内转化 ( 相同多重态的两个电子态之间的非辐射跃迁，如s 一 & ) 、系统问交叉或称 体系问窜跃( 不同多重态的两个电子态之间的非辐射跃迁，如s 一 z ) 、碰撞 驰豫等。处于& 以上的某个电子激发单重态较高振动能级上的分子很快地( 约 1 0 1 2 1 0 。1 4 s ) 发生振动弛豫，将多余的振动能量传递给介质而降落到该电子态 的最低振动能级( v = o ) ，此后又经由内转化及碰撞振动驰豫而降落到s 电子 态的最低振动能级。激发单重态间( 如s 一 s ) 的内转化速率很快( 速率常 数约为1 0 “l o ”s 1 ) ，因此高激发单重态的寿命很短( 约l o 1 0 1 s ) ，处于这 种电子态的激发分子，在辐射跃迁发生前，便内转化及振动驰豫落到s 电子态 的最低振动能级，所以观察到的荧光现象通常情况下是发生自s 态的最低振动 能级的辐射跃迁。处于s 电子态的最低振动能级的激发分子，其分子的去活化 作用有三种途径： ( 1 ) 发生s 一& 的辐射跃迁而伴随的发光现象称为荧光； ( 2 ) 发生s 一 & 的内转化： ( 3 ) 发生s 一 五的体系间窜跃。 处于z 电子态的最低振动能级的激发分子，其分子内的去活化作用有两种 途径：( 1 ) 发生正一墨的辐射跃迁而伴随的发光现象称为磷光；( 2 ) 发生互一 s 的体系间窜跃。如图2 1 所示。 1 0 第二章荧光基本原理与同步荧光光谱技术 ，l l| i 口 li f 芷 30 2 v r l i 一证 ili u ia l f p 3 - 2 l 旬 t 1 k & 吸收；f 荧光；p 磷光；i c 内转化；i s c 体系问窜跃；v r 碰撞振动驰豫 图2 1 分子能级示意图 激发单重态间的内转换速率很快( 速率常熟约为1 0 “1 0 ”s - 1 ) ，因此更高 激发单重态的寿命很短( 约1o _ 1 1 l o - 1 3 s ) ，处于这种电子态的激发分子，在辐 射跃迁发生之前，便内转化及振动驰豫落到s 电子态的最低振动能级，所以观 察到的荧光现象通常情况下是发生自s 态的最低振动能级的辐射跃迁。 第二节与分子荧光有关的主要参量 2 2 1 荧光物质箭激发光谱( e x c i t a t i o ns p e c 畹m ) 扫描激发单色器，使不同波长的出射光激发荧光物质，产生的荧光通过固 定输出波长的发射单色器照射到检测器上，检测相应的荧光强度，记录荧光强 度对激发波长的关系的曲线，即为激发光谱。当发射波长固定在它的峰值波长 时，所得到激发光谱的强度最大。激发光谱反映了不同波长的激发光引起物质 发射某一波长荧光的相对效率，可供鉴别荧光物质，在进行荧光测定时供选择 适当的激发波长。通常激发光谱的形状与吸收光谱的形状很相像，但由于仪器 第二章荧光基本原理与同步荧光光谱技术 因素( 如监测器的响应特性) 的影响，往往又有所差异。 2 2 2 荧光物质的发射光谱( e m i s s i o ns p e c t m m ) 保持激发光的波长和强度不变，物质所产生的荧光通过发射单色器照射到 检测器上，扫描发射单色器并检测各波长下相应的荧光强度，记录荧光强度对 荧光发射波长的关系曲线，即为发射光谱，也就是荧光光谱。激发波长固定在 它的峰值波长时，所得到发射光谱的强度最大。发射光谱反映了荧光物质所发 射的荧光在各种波长下的相对强度，可供鉴别荧光物质，并作为荧光测定时选 择适当的测定波长或滤光片的根据。”。 发射光谱具有以下特点： 1 斯托克斯位移：在溶液荧光光谱中，所观察到的荧光的波长总是大于激 发光的波长，即在激发与发射之间存在着一定的能量损失，即荧光光谱向长波 方向移动。 2 形状与激发波长没有关系，原因在于：内转化和碰撞振动弛豫的速度非 常快，分子即使被激发到高于s 的电子态的更高能级，也很快地丧失多余的能 量而衰变到s 电子态的最低振动能级，所以分子的吸收光谱可能有几个吸收带， 但其荧光光谱却只有一个发射带。由于荧光发射发生于第一电子激发态的最低 振动能级，而与荧光物质分子被激发至哪一个电子态无关，所以荧光光谱的形 状通常与激发波长无关。 3 与吸收光谱呈镜像对称关系：荧光光谱的荧光发射光谱和它的吸收光谱 之间存在着“镜像对称”关系，如图2 f 2 所示。 荧光光谱的形成是激发态分子从第一电子激发单重态的最低振动能级( s ) 辐射跃迁至基态( 鼠) 的各个不同振动能级所引起的荧光光谱的形状与基态中 振动能级的分布情况有关。吸收光谱中第一吸收带的形成是由于基态分子被激 发到第一电子激发单重态的各个不同振动能级引起的，而基态分子在通常情况 下是处于最低振动能级的，因此第一吸收带的形状与第一电予激发单重态中振 动能级的分布情况有关。一般情况下，基态和第一电子激发单重态中振动能级 的分布情况是相似的。根据f 硪】哦- c o n d o n 原理，电子跃迁速率非常之快，以致 跃迁过程中核的相对位置近似不变。假如在吸收光谱中某振动能级间的跃迁几 率最大，其相反跃迁的几率也应该最大，因此荧光光谱和吸收光谱之间呈镜像 对称关系。 1 2 第二章荧光基本原理与同步荧光光谱技术 x 醚 嘿 米 1 r 限 罂 波长( n m ) 图2 2 硫酸奎宁在日2 s d 4 溶液中的吸收光谱和荧光光谱 2 ，2 3 荧光寿命 激发态的寿命定义为返回基态之前分子耽搁在激发态的平均时间，或者说 处于激发态的分子数目衰减到原来的所经历的时间。对于处于s 电子态的荧 光体来说，其平均寿命( f ) 可用下式表示： 弘石豪 2 式中七，一荧光发射的速率常数 k 一各种单分子的非辐射去活化过程的速率常数的总和 荧光发射是一种随机过程，只有少数激发分子才是f = f 的时刻发射光子 的。荧光的衰减情况通常是属于单指数衰变过程，在，= f 之前6 3 的激发分子 已经衰变，3 7 的激发分子在， f 时刻衰变。 粒子数容易增加的电子激发态，处于该电子态的粒子数也将是容易衰减的。 荧光分子的平均寿命与跃迂的许可性两者闻的关系如下： r 。l o 一 ( 2 3 ) ，s 。 式中s 一最大吸收波长下的摩尔吸光系数。 式( 2 3 ) 可用来估计激发态的辐射寿命，如瓯一 s 是许可的跃迁，一般 情况下，一值约为1 0 3 m 2 m o l ，因而荧光的寿命大致为1 0 s 没有非辐射去活化过程存在时，荧光分子的寿命称为内在的寿命，用表 1 3 第二章荧光基本原理与同步荧光光谱技术 不 铲k j 荧光强度的衰减遵从如下公式： l n l l n j ，= 么 ( 2 4 ) ( 2 5 ) 式中，。表示是f = o 时的荧光强度， f 表示t 时的荧光强度。 通过试验测量不同时刻，所对应的值，并做出l n 一，的关系曲线，其结 果为一条直线，由该直线的斜率可求得荧光寿命的数值。利用荧光分子寿命的 差别可以进行荧光物质混合物的分析。 2 2 4 荧光量子产率 发生荧光必须具备两个条件：一是物质的分子吸收频率必须具有与照射光 相同的频率；二是吸收了与本身特征频率相同的能量的分子，必须具有高的荧 光效率。许多能吸收光的物质并不一定发生荧光，就是由于其分子的荧光效率 不高，而将所吸收的能量消耗于与溶液分子或其它溶质分子之间的相互碰撞。 荧光效率一般用量子产率表示。 荧光量子产率k 定义为荧光物质吸收光后所发射的荧光的光子数与所吸 收的激发光的光子数的比值，即 荧光的量子产率= 发射的光子数吸收的光子数( 2 6 ) 由于激发分子的去活化过程包括辐射跃迁和非辐射跃迁，因而荧光量子产 率可表示为 七， 耳2 南 7 ) 一 假如非辐射跃迁的速率远小于辐射跃迁的速率，即罗k 同步扫描荧光溅定”m “3 。该方法在测绘同步荧光光谱时， 使激发和发射单色器以不同的速率同时扫描。 同步扫描荧光测定具有如下优点：( 1 ) 使光谱简化；( 2 ) 使谱带窄化；( 3 ) 减 小光谱的重叠现象：( 4 ) 减小散射光的影响。 图3 1 是使光谱简化的例子之一。图3 1 ( a ) 表示丁省乙醇溶液的激发光谱 与发射光谱。在发射光谱中( 丸= 4 4 2 m ) ，于4 7 3 n m ，5 0 7 m 及5 4 6 m 呈现三 第二章荧光基本原理与同步荧光光谱技术 世 篱 蕞 霉 毋 逛 求 戳 急 随 蛮 翼 静 趣 岛 e i 凶遮 i 技长i n m ， 图3 1 丁省的荧光发射光谱与激发光谱( a ) 丁省的同步荧光光谱( b ) ( a ) ： 厂j 厂 童：殳f ：赴时 ， f 几 ；哟” 图3 2 邻甲酚的荧光激发光谱与发射光谱( a ) 以及同步荧光光谱( b ) 第二章荧光基本原理与同步荧光光谱技术 个明显的发射带，所覆盖的波长范围为4 6 0 一6 0 0 m ；在激发光谱中 ( 五。= 5 0 7 n m ) ，于4 7 0 ，4 4 2 ，4 1 6 及3 9 7 n m 显现四个吸收带，覆盖的波长范围 为3 5 0 一4 8 0 m 。如果以五= 3 m ( 等于o o 带之间的斯托克斯位移) 进行同 步扫描时，所获得的同步荧光光谱( 图3 1 ( b ) ) 呈现一个位于4 7 3 m 的同步 光谱峰。这种光谱简化，虽然损失了其他光谱带所包含的信息，对光谱学的研 究不利，但就分析工作的角度，则可免除其他谱带存在所引起的干扰，对分析 工作十分有利。由于同步荧光信号同时是激发波长和发射波长的函数，因此， 只要激发光谱或发射光谱在所需要的波长范围有结构特征，所获得的同步荧光 光谱在该光谱区便显现结构特征。从图3 2 可以看出，使用同步扫描技术，能 使光谱带窄化。 有的作者曾指出，同步荧光光谱的谱带半高宽度( 乃) 与激发光谱和发射 光谱的谱带半高宽度( 分别以五和屯表示) 大致符合以下关系： 蝇“( 她+ 醌) 一【( 她) 2 + ( 她) 2 】l 2 ( 3 2 ) 2 6 2 固定波长同步扫描荧光测定 在同步扫描荧光测定中，同步荧光的信号强度气( 丸，五。) 可表示如下： 毛( 疋，k ) = 拓e ( 丸) ( k ) ( 3 3 ) c 为待测物质的浓度，为试样溶液的厚度，e ( 丸) 表示激发光谱，( 五。 表 示发射光谱，七为实验的条件常数。由式( 3 2 ) 可知，对于某种待测物质，在 实验条件保持固定的情况下同步荧光的信号强度便与待测物质的浓度成正比。 由于同步扫描过程中保持厶五= 乞一久= 常数，式( 3 幻可以表示为五。或 丸的函数： 厶= 幻f e ，( k 一丑) ( k ) ( 3 4 ) l = 妇哆( 丸) 魄+ 咒) ( 3 5 ) 从式( 3 3 ) 和( 3 4 ) 来看，同步荧光光谱既可视为同步扫描激发波长时 的发射光谱，亦可看成同步扫描发射波长时的激发光谱。 不难理解，同步光谱显然与激发光谱及发射光谱都有关系，它同时利用了 化合物的吸收特性和发射特性，因而使选择性得到改善。由于点0 ( k ) 和e ( 丸) 2 4 第二章荧光基本原理与同步荧光光谱技术 是分别以短波区域和长波区域为极限的函数，且又几乎镜像对称，因而使获得 的同步荧光光谱简化，且带宽度极小。 在同步扫描过程中，a 值的选择十分重要，这直接影响到同步荧光光谱的 形状，带宽和信号强度。目前，五值的选择还是经验性的，在实际应用中都应 通过实验加以选择。 在可能条件下，选择等于斯托克斯位移的五值是有利的，这时将会获得同 步荧光信号最强，半高宽度最小的单峰同步荧光光谱。”。 选择较小的五值，通常有利于减小光谱带宽。不过随着减小五值，仪器 的狭峰宽度也相应的减小，才不致增大散射光的干扰而降低光谱分辨率。然而， 减小狭峰宽度又会减小光通量而降低灵敏度，因而必须两者加以兼顾。a n d r e 等提出为减小散射光的干扰，选择兄值与狭峰宽度f 的大致原则：当测定只 受瑞利散射干扰时，选择a = 丸一屯( 乃与五分别代表测定波长与激发波长) ， fs 旯2 ；当测定同时受瑞利散射和拉曼散射的干扰时，视具体情况可选择 1 五s 丸一五，以2 或从屯一九，去【兄一( 厶一也) ( 太代表拉曼散射光的 上 波长) 。 2 6 3 固定能量同步扫描荧光测定 这种以能量关系代替波长的同步扫描技术，是由i n 眦n 和w i n e f o r d n e r 等 口6 1 最早提出的。在同步扫描过程中，维持如下条件： ( 1 ，丸一l ，五。) x 1 0 7 = 矿= 常数 e 3 ，6 ) 矿表示能量差( 册1 ) ，即激发与发射两个单色器之间保持固定的波数差 进行同时扫描。 这种方法对于多环芳烃的鉴别和测定特别有利。在温室或低温条件下，多 环芳烃的振动谱带间隔约为1 4 0 0 c m ，在正烷烃的溶剂中振动谱带的准确位置 虽然可能随溶剂改变丽发生位移，但其相对问隔基本上保持不变。在多环芳烃 的固定波长同步扫描荧光测定中，通常采用3 咖( 相当于矿= 2 0 0 删1 ) 的兄 值，这大约等于室温下多环芳烃在正烷烃溶剂中的斯托克斯位移，因