（微生物学专业论文）aeromonas+spsuwa9菌株几丁质酶基因及土壤细菌红色基因的克隆分析.pdf

摘要 气单孢菌爿e ，n 坍o ，脚s ps u w a 9 菌株是从日本国长野县s u w al a k e 的湖水中 分离到的细菌。该菌株可产生多种活性很强的胞内几丁质酶。利用限制性核酸内切 酶m3 a j 将该菌的基因组d n a 部分酶切成各种大小的d n a 片段，经蔗糖密度梯 度离心后收集2 一l ok b 的d n a 片段，再与经b 鲫，m b a p 处理的载体质粒p u c l l 8 连接，转入大肠杆菌中表达，得到了8 株阳性重组菌，编号c l o n e 1 ，2 ，3 ：4 ，5 ，6 ，8 ，9 。经 底物反应和限制性内切酶图谱分析，确定其中的c l o n e 1 ，4 ，5 ，6 ，8 含有相同的几丁质酶 基因；而c l o n e 一2 ，3 ，5 ，9 四株重组菌则含有不同的几丁质酶基因。s d s p a g e 活性染 色显示这些酶所作用的底物有所不同，既有内切型酶，也有外切型酶，分子量从 6 4 k d 一8 3 k d 不等。用不同的限制性核酸内切酶对c l o n e 一5 蓬组质粒进行酶切，构建 了它的酶切图谱。根据c l o n e 一5 质粒的酶切图谱，利用多种核酸内切酶进行消化，冉 用连接酶进行连接，构建了一系列的重组1 e 克隆质粒。通过测定这些亚克隆质粒n 0 两端核苷酸序列，再设计引物，分别从两含方向测定了c l o n e 5 质粒的核苷酸序列， 共3 ，2 0 5 b p 。利用基因分析软件g e n e t y x 对c j o n e 一5 质粒的核苷酸序列进行分溉并 搜索日本d 咐a 数据库( d n ad a t ab a n ko f j a p a n ，简称d d b j ) ，推断c l o n e 一5 质粒的 几丁质酶基因含有一个2 ，2 6 1 b p 的开放阅读框( o r f ) ，编码条8 8 7 个氮基酸的几 丁质酶蛋白；0 r f 上游有一个启动子。经检索，与d d b j 中登陆的一个来源于 4 p ，_ 0 册d ，棚的几丁质酶基因有9 0 的同源性。 另一方面，在生物遗传转化的研究中，理想报告基因的探索一直是重要研究内 容之一。自然界的微生物中约9 9 是目前还不能培养的，这些未能培养的微生物蕴 藏着极其巨大的基因资源，是筛选有用基因的重要来源。在研究和开发来能培养的 微生物的过程中，从土壤细菌中克隆到一条伞k4 7k h 的d n a 片段，与质粒口u c l l 8 连接后转入大肠杆菌蹦1 0 9 菌株中，其编码的产物可以使重组菌体在紫外线照射下 呈现红色荧光。将基因称为红色基因( r e d 坚e n e ) ，含该基因的重组菌称为r e d c l o n e 。 利用多种限制性梭酸内切酶对r e d c 】o n e 的重组质粒插入片段进行消化，构建了该 插入片段的限制性内切酶图谱：并以其图蹭为指导，构建了一系列哑克隆重组质粒。 其中有一一个亚克隆( 称为r e d 一勋ci 曲，i ) 尽管仅含l5 k b 左右原插入片段，仍然能 在紫外线下发射红色荧光。再用各种限制性核酸内切酶对r e d 一胁i 一di 进行消化、 连接和转化，继续亚克隆。测定各亚克隆的核苷酸序列，确定r e d 妇ci 勘，i 的插 入片段为1 ，5 4 l b p 。利用软件分析，并搜索d d b j ，推断r e dg e n e 的开放阅读框为7 7 l b p ， 编码2 5 7 个氮基酸。在开放阅读框的上游没有找到启动子，但在开放阅读框的内部 却发现了一个启动子，估计r e d g e n e 的启动子是基因内启动子，或者是利用质粒 p u c l l 8 的a c 启动子。在d d b j 中搜索到多种细菌来源的c 0 删基因( 编码 u r o p o r p h 埘n o g e n m e t l l _ y 】t r 卸s f e r a s e ) 与r e dg e n e 有4 0 一5 0 9 6 的同源性，并据报道， 其中一个来源于脚f 彻f 施c 研h 册加l 胁，鹏砌j f 的鲥的基因，转入大肠杆菌、酵 母菌及动物细胞后能使表达载体在紫外线下发射红色荧光。由此推断r e d g e n e 可能 也是c d 鲥g e 中的一种，具有类似的功能。 为验证r e dg e 能否用来作为分子生物学研究的报告基因，将克隆在c i o n e 5 的几丁质酶基因与r e d - g e n e 连接后再插入质粒p u c l l 8 中，转入大肠杆菌j m l 0 9 菌株，得到含有几丁质酶基因和红色基因的重组菌株。该重组菌株既能产生几丁质 酶，又能使菌体在紫外线下呈现红色荧光。可见，所克隆到的红色基因用作以大肠 杆菌为表达载体的报告基因具有一定的潜力。 关键词：克隆，几丁质酶基因，红色基因，报告基因，未能培养的微生物 a b s t r a c t 4 e ，d m o ，城ss ps u w a 一9i sab a d e r i u mi s o l a t e df o mt h es u w al a k eo fj a p a na sa p f o d u c e ro f s e v e a l c h i t i n d e g r a d i n g弓n z y m e s t o i s o l a t i n gg e n e sc o d i n g f o r c h i t i n d e 黟a d i n ge n z y m e s ，g e n o m i cd n a w a sp r e p a r e df 南ms u w a 一9 ，p a n l a l i yd e g e s t e d w i t h 脑“3 a i ，a 1 1 ds i z e 一疔a c t i o n a t e db ys u c r o s ed e n s i t yg r a d i e n tg e n t r i f u g a t i o n t h e r e s u l t i n g2 - 2 0k bd n a 疗a g m e n t sw e r el i g a t e dw i t hp l a s m i dp u c 1 i8 p r e v i o u s i yd i g e s t e d w i t h 砌，h ia 1 1 dd e p h o s p h o r y l a t e db yb a c t e a la l k a l i n ep h o s p h a t a s e ( b a p ) a n e r t r a n s f o r m a t i o ni n t o o 打丁m 1 0 9 ，8o u tt o t a l3 0 ，0 0 0f e c o m b i n a n tc o l o n i e sw e r es e l e c t e d a s p r o d u c i n gc h i t i n a s ea c t i v i t y o nm 9s e i e c t i o nm e d i u m c 。t a i l l i n g 虬l b s t r a ：c s ， m e t h y l u m b e f y f e r r o l ( m u ) 一( n - a c e t y l 9 1 u c o s a m i n e ) n ：( ) b yc o l l l p a m l g r e s tr j c t j o nm a p s o fp l a s m i d sp o s s e s s e di nt h e s ec l o n e s ，5c l o n e s ( c l o n e si ，4 ，5 ，6 ，a n d8 ) w e r ef _ o u n dt o c o m a i nt h es a m ec h i t i n a s eg e n e ，w h i l et h eo t h e rt t l r e ec l o n e s ( c l o n e s2 、3a n d9 ) c o n t a i n d i 能r e n tc h i t i m 5 eg e n e so n ea n o t h e fs d s p a g ea f l da “v i t ys t a i n i n ga n a i y s ；sr e v e a l e d t h a ta 1 1o fc l o n e s2 ，5a n d9e x h i b i t e das i n g l ea c t i v eb a n dw i t h8 3 一k di ns i z e ，、v h c i _ e a s c l o n e3e x h i b i t e df o u rd i f r c r e n tb a n d s 、v i t h6 4l 7 0 k d ，7 6 k da n d8 3k da n e r c o n s t r u c i n gas e r i e so fd e l e t e ds u b c l o n e s 疗o mt h ep l a s m i dp r c p a f e d 行o n lc l o n e 一5 ，a c o m p l e t en u c l e o t i d es e q u e n c e sc o m p r i s i n go f3 ，2 0 5b p sw e sd e t e m i n e d o n eo p e n r e a d i n g 劬m e ( o r f ) 啪sf o u n di nt h i ss e q u e n c e ，w h i c hw a sc o m p r i s e do f2 ，6 6 lb p sa n d c o u l de n c o d eap 0 1 y p 叩t i d ew i t h8 8 7a m i n oa c i dr e s i d u e sas e a r c hf o rd a t a b a s ei nt h e d n ad a t ab a n ko fj a p a n ( d d b j ) r e v e a i e dt h a tt h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo fi h ea b o 、7 e 0 r fs h o w s9 0 ? ii d e n t i t yw i t ht h a to fo n ep u t a t i v ec h i t i n a s ef r o m 爿e ，。 ，( ) 77 。“ ，西t 矽 ，凡， i nw h i c ho n l yap r i m a r ) - s e q u e n c eh a sb e e nr 印o r t e dt od a t e r e p o f t e rg e n ei sv e r yi m p o r t a n tf o rm 0 1 e c u l a rb i o l o g yu n t i ln o wn l o r et h a n9 9 m i c r o o 唱a n i s m si nt h en a t u r eh a v en o ib e e nc u l t u r e di th a sb e e nw i l d i ya c 亡e p t e dt h a ti t i s ag o o di d e at os e a r c hn e wg e n e sf r o mt h e s eu n c u i t u r e dm i c r o o 唱a n i s m s d u r i n gf h e c o u r s eo fs t u d yt oi s o l a l en e wg e n e sf r o mt o t a ld n a sp r e p a r e df r o mu n c u i t u r e db a c t e r i a i ns o i l ，w eo b t a i n e da47 一k bd n a 疔a g m e n tt h a tm a d ee ，h o s tc e l l sp r o d u c ear e d f 】u o r e s c e n c el i 曲tu n d e re x p o s u r eo fu l t r a v i o l e t ( u v ) t h em i n i m u mr e g j o no fd n a 疗a g m e n tr e q u i r e df o ra i l 眈p r e s s i o no fr e dn u o r e s c e ml i g h tc o u l db er e d u c e d t o1sk b t h er m c l e o t i d es e q u e n c eo f t h i s15k bd n a 疔a g m e n tw a sd e t e 册i n e d ，a n do n eo i 球w a s f o u n da n dm m e d 船r e dg e n e ，w h i c hw a sc o m p r s e do f7 7 1b pa n dc o d e df o ra p o l y p e p t i d eo f2 5 7a m i n oa c i dr e s i d u e si n s i z ead a t a b a s es e a r c hr e v e a l e dt h a tt h e p u t a t i v es e q u e n c eo f t h er e dg e n es h o w s4 0 - 5 0 i d e n t i t yw i t ht h o s e o fu r o p o r p h y r i n o g 朗 1 1 1m e t h y l t r a f l s f e r a s e ( e n c o d e db y mg e n e ) f b mv a r i o u sk i n d so fb a c t e r i a a n o v e r _ e x p r e s s i o no ft h ec o mg e n ei ne c o ，fw a sr e p o r t e dt ol e a dt oa na c c u m u l a t i o no f t r i m e t h y l a t e dd e r i v a t i v eo f p o r p h y r i nt e r m e dt r i m e t h y l p y r r o c o r p h i n a n df a c t o ri i ，w l l i c h e m i ts t r o n 旦r e dt l u o t e s c e n c eu n d e ru vt h e f e f o r e ，t h er e dg e n ei s o l a t e df o mu n c u r e d m i c r o o 唱a n i s m sm u s tb ean o v e lc d 鲥g e n e o u fi m e r e s t i n gj st ou s et h er c dg e n ea sar e p o n e rg e n et h er e dg e n ea n dc 硫i n a s e g e n e 劬md o n e - 5 w e r el i g a t e dt o g 曲e rw i t l lp u c l l 8 铆h 豫a p ) ， a n dt h e n t r a n s f o 肿e di m oe c o 厅j m l 0 9 t h er e c o m b i n a mc e l l se x h i b i t e dc h i t i n a s ea c t i v i t ya 1 1 d s h e wr e df l u o r e s c e n c eu n d e ru vs ow ec a i ls a yt h a tt h er e dg e n em a y a l s ob eu s e da sa r e p o r t e rg e n e 1 ( e yw o r d ： g e n ec l o 血n g ， c h j f i n a s eg e n e ， r e dg e n e ， r e p o r t e rg e n e ， u n c u l t u r e dl i l i c r o o r g 枷s m s 第一部分文献综述 1 1 几丁质与几丁质酶 1 1 1 几丁质 几丁质( c h i t i n ) 又叫甲壳素、壳多糖、甲壳质，广泛存在于甲壳纲动物、软体 动物、昆虫、真菌以及海藻、动物关节、蹄、足等处。自然界每年生成的几丁质约 有1 0 0 亿t ，是地球上除纤维素外数量最多，除蛋白质外含氮量最高的天然有机化 合物。它是n 一乙酰一p d 一葡萄糖胺l n a c e t y l b d g i u c o s a m i n e ，简称n a g ) 以b 1 ，4 糖苷键连接起来的直链多聚物( 见图11 ) ，是一种白色或灰白色、半透明片 状固体，无味，不溶于水、稀酸、稀碱和一般有机溶剂，但可溶于浓度为9 m o 儿 的h c l 或浓度为45 m o n ，以上的h 2 s 0 4 中。根据x 一衍射光谱得到的结果，1 9 6 3 年， r u d a l 提出几丁质存在q 、b 、y3 种几丁质晶型。几丁质具有紧密的组成，大 多数结晶的多晶区是两条逆平行链状排列，对酸是最稳定；b 一几丁质的多晶型则是 两条平行链状排列：而y 一几丁质由i 条链组成，两条同向平行上下排列，中间一条 逆向平行。 、0 a h 暇 图1 1几丁质的结构 脱乙酰几丁质( c h i t o s a n ) ，又叫壳聚糖、可溶性甲壳质、聚氯基葡萄糖等，是 几丁质用浓碱处理后脱去乙酰基而得到的产物，通常几丁质的脱乙酰度超过7 0 时 就叫做脱乙酰几丁质( 见图1 2 ) 。脱乙酰儿丁质呈白色或灰白色，是一种半透明的 n t-。ll， 、 o 。y 一 ? 忿 略带珍珠光泽的片状固体，平均相对分子量为i 2 x1 0 5 左右，不溶于水和碱溶液， 可溶于盐酸、硝酸、甲酸、乙酸、苯甲酸、环烷酸等稀酸；不溶于普通有机溶剂， 但可溶于酸化的多元醇。由于几丁质、脱乙酰几丁质及其寡聚糖具有生物相溶性、 生物降解性、无毒性、易成膜性等特点，已在食品、化工、农业、医药、环保等领 域广泛应用，并被誉为人体所必需的第六生命要素。 c h 2 0 珏c h l 0 虹 。 hn m h 圈1 2 脱乙酰几丁质的结构 扛 目前几丁质和脱乙酰几丁质主要是从虾、蟹壳中提取的。由于虾、蟹壳中的 几丁质与蛋白质共价结合，以蛋白聚糖形式存在，同时伴生着碳酸钙，所以，虽然 制各几丁质的方法很多，但都大同小异，主要操作方法是脱钙和脱蛋白，姻h a c k m a n 法、w h i s t l e r 和b e m i l i e r 法、b r o u s s i g n a c 法、p e n i s t o n 法等。由几丁质制备脱乙酰几 丁质，主要方法有碱脱乙酰法，如碱熔法、p e n i s t o n 和j o h n s o n 法、k e n n e 和“n d b e 瞍 法等。此外，赵继伦等利用柠檬酸生产的废菌体如黑曲霉等制备出脱乙酰几丁质，戴 云等也从蝉壳中制各出了几丁质和脱乙酰几丁质。 由于目前人们所利用的几丁质、脱乙酰几丁质及其衍生物主要是通过化学方法 获得的，在：副备过程中需用大量的酸碱，产生大最的废水唛料，严重污染了环境f 图 l3 ) 。故人们均将目光转向了生物方法，希望能通过微生物降解的方法来获取和利 用大量的几丁质、睨乙酰几丁质及其衍生物。，。量大，效率高，人力、物力消耗少， 且不会造成环境污染的生物降解几丁质、脱乙酰几 质的方法引起了人们广泛的关 注。 臣圃一圈一回一圈一回一 ， 一，一，团一、 一回一围一匿一回一圃 臣亟至重堕亚堕叵困 图1 3月，丁质、瞠乙酰几丁质制各的流程图( 日i 自婴潇韫等) i 2 1 1 1 2 几丁质酶 1 9 0 5 年，b e n e c k 首次分离到能够利用几丁质作为营养物质的微生物，定名为溶 几丁质芽抱杆菌( 踟d 砌s 幽j 砌d w r 0 妫；1 9 2 1 年，f o l p m e r s 发现分解几丁质的细菌 和放线菌，证明水溶性几丁质酶的存在。然后，人们相继从多种细菌、放线菌、真 菌中分离到几丁质酶。随后的研究发现，高等植物中普遍存在着几丁质酶系，并且 与植物防卫反应的诱导有关。1 9 6 】年，j e u n i a u x c 首次报道了动物几丁质酶的研 究成果：1 9 9 5 年b o o t g 等报道了从人体内分离到儿丁质酶。 能降解几丁质的蛋白包括b n 乙酰葡糖胺苷酶、几丁质脱乙酰酶及几丁质酶、 几丁质结合凝集素如小麦胚凝集素( w g a ) 。几丁质酶( e c 3 2 1 1 4 ) 能水解几丁质中 n 一乙酰一p - d 一葡萄糖胺间的p 一( 1 ，4 ) 糖苷键，是一种诱导酶，几丁质、脱乙酰几丁质、 几丁二糖及部分水解的几丁质均能作为诱导物，而几丁单糖则不能。根据酶的作用 部位和降解产物的不同，几丁质酶可分为两种：外切型几丁质酶，从几丁质链的非 还原性末端依次切下几丁二糖；内切型几丁质酶，可在几丁质链的任一部位进行随 机切割，产生包括几丁二糖在内的几丁质寡糖。几丁质酶还能水解相关的多聚物， 如卜乙酰胞壁酸。微生物、植物、动物及人都能产生几丁质酶。 7 1 1 2 1 微生物几丁质酶 微生物几丁质酶可产生胞内和胞外几丁质酶。其中大部分微生物能产生胞外酶， 是目前研究和应用较多的几丁质酶。微生物几丁质酶与其它来源的几丁质酶一样， 也可分为外切几丁质酶和内切几丁质酶。绝大多数微生物产生的几丁质酶是属于外 切酶；但也有报道，皱褶链霉菌( s 础f 淞) 的几丁质酶属于内切酶。若要将几丁 质彻底水解成为单体n 一乙酰氨基萄葡糖，还需要d n 一乙酰氨基萄葡苷酶( 又称几丁 二糖酶1 。几丁质在微生物中降解的主要反应机制见图1 4 。 几t 质脱乙茂他爵 几t 厦酶 f阿一乙醌荀萄砖艘募主i ；- 儿_ 庸腚己靛化爵 l ! ：! ：竺一；一一 j n 己虢一昼一葡萄瑭胺辟 i 元秉糖酶 亘妇 图1 4 几丁质在微生物中降解的主要反应机制( 引自吴潇韫等) f 2 1 微生物几丁质酶最适d h 一般在3 1 l 之间，但大部分微生物的几丁质酶作用最 适p h 值在4 6 之问，酶稳定p h 范围一般在4 1 1 之间。酶的等电点一般在p h3 6 86 之间。酶作用的最适温度多在5 0 一6 0 ，温度过高，酶活力容易丧失。金属离子 如a f 、f e ”、c u ”、z n ”、h 9 2 - 、s n 2 _ 、c o 。等对微生物几丁员酶活力都仃不同程 度的影响，有的离子能增强酶活性而有的却具抑制作用。微生物几丁质酶的分子量 范围一般在1 9 k d 到1 i o k d 之间，不过也有的大至1 3 48k d ( 来自j d ) y _ 。c d c c 如幻女u “s 的胞外外切几丁质酶) 。微生物儿了。质酶对底物具有一定的专一性，一 般都可水解粉状几j 一质，日交状几丁质可溶性儿丁质衍生物如乙二醇几丁质和二乙 醇几丁质及可溶性的几丁三糟，凹糖，戊糖和六糖等儿丁质寡 辔。不能水解麦芽糖， 淀粉和纤维素等由几丁二糖经糖昔键连接而成的糖类。有的微生物如棉花黄茎病菌， 号 里 金龟子绿僵茵和粘质沙雷氏杆菌产生的几丁质酶还匏水解脱乙酰几丁质。 自从b e n e c k e 首次报道了溶几丁质芽抱杆菌口嘲咖v 泐蚰) 能够产生几丁质酶 以来、人们还相继发现多种细菌、放经菌及大多数真菌能产生几丁质酶。在这些微 生物中研究较多的包括：1 细菌：粘质沙雷氏菌( ，7 刎胁疗拼p 删，捌，环状芽抱 ( b a c i j l u sc j r u l a n s ，地衣芽抱杆菌( b a c u si i c h e n i f o r m i s ) ，斯氏假单菌 ( p 鼯2 f d 鲫琊m h f r e ) ，巨大芽抱杆菌( b 邪j ，7 f 珂一，昭谢硎7 删) ，液化沙雷氏菌 胁砌均”和砌砷，液化肠杆菌( e h 招m 6 卯据由z 咖曲固。嗜水气单孢菌 即黝册d 腓协西卿j 肠) ，及一些未定种的梭菌( 口，汹m ，s p ) 和孤菌( 聆6 r 胁s p ) 2 放线菌：灰色链霉菌( 跏印f 。，砂c p 5 p 疗m j ) ，红色链霉菌( 脚印f 。c 口d 打础d w ，埘砷 及其它一些未定种的链霉菌( 曲印m ”p 5s p s 一8 4 ) 3 真菌：溜曲霉a 印p 7 乎胁岱 删甜i f ) ，球抱白僵菌( 成d 2 删r 妇砌 f 珊) ，米曲霉似甲哪p 胁心d 弘础) ，木霉 ( 历幽。出删a n k 泐n ，m ) 等。 根据几丁质酶催化域一级结构和二级结构，将几丁质酶归类于糖基水解酶的第 1 8 和1 9 家族。第1 8 家族的几丁质酶催化结构域中有一个“b 的八桶折叠结构：第 1 9 家族的几丁质酶健化结构域中则有个高度n 螺旋结构。微生物来源的几丁质酶 中，除一株灰色链霉菌产生电勋甲泐，伽伊y 砧wh u t 6 0 3 7c h i c 和细菌 口z 批z 出，协射砌o ，产生的曲店属于第1 9 家族外，其它都属于第1 8 家族。而植物 来源的几丁质酶则都属于第1 9 家族。目前所发现的微生物几丁质酶分子中有两个结 构域是相似的，即催化结构域和几丁质结合结构域。从对比较目前所知的所有细菌 几丁质酶的催化结构域和几丁质结合结构域，发现催化结构域相似性所占的百分比 与几丁质结合结构域相f 以性所占的百分比之间并无直接关系，说明这两种结构域是 单独进化的。 随着分子生物学技术的迅速发展，科学工作者通过大量的实验，已发现了多种 几丁质酶和脱乙酰几丁贡酶基因，检测或推断出它们的序列组成、结构，并将该基 因进行克隆，构建出各种高效表达的基因工程产物，距瑚，向埘r p 5 c 田坫是被研究较 多的一种微生物，可产主5 种不同的几丁质酶，其分子质量分别为2 1 、3 6 、4 8 、5 2 和5 7 k d 。1 9 8 6 年美国、j o n e s 首先把经过艮o r j 部分酶切后的s ，删5 c 删s 染色 体d n a ( 2 0 3 0 k b ) 插入到载体p l a f a l 中，构建了几了质酶基因文库，通过在几丁质 平板上能否产生透明圈，筛选出含有几丁质酶基因的阳性克隆，并经过进一步的亚 9 克隆和d n a 序列分析，得到了编码5 7 k d 的几丁质酶的基因，该基因含有l6 8 6 个 核昔酸碱基，可以编码5 6 1 个氨基酸的大分子多肽，它实际上是5 7 k d 的几丁质酶 的前体，不具有几丁质酶活性。其中前2 3 个氨基酸残基为信号肽，在几丁质酶经细 菌细胞壁向胞外分泌过程中起重要的作用。在分泌过程中，前体几丁质酶经过进一 步加工，脱去信号肤而成为成熟的几丁质酶。随后，人们又从许多细菌中克隆了一 些几丁质酶，并在大肠杆菌得到了表达。除细菌来源的几丁质酶基因以外，还有许 多放线菌和真菌来源的几丁质酶基因也被克隆到了。 微生物几丁质酶基因的表达是受受体诱导物系统所控制，一般以几丁质或其降 解产物作为诱导物，但木质素和纤维素没有诱导作用；葡萄糖能抑制几乎所有微生 物产生几丁质酶，也说明微生物几丁质酶基因的调控可能涉及分解代谢物阻遏机制。 1 1 2 2 植物几丁质酶 植物不含几丁质，但几丁质酶却广泛存在于高等植物，主要分布在植物的根、 茎、叶、花、果实、种子、胚及愈伤组织中。植物几丁质酶都是小分子蛋白，其分 子量在2 5 3 5 k d a 之间，酶分子以单体形式存在。具有酸性或碱性等电点。大多数 几丁质酶对热稳定，抗蛋白酶水解。植物几丁质酶也可分为内切酶和外切酶两种， 目前研究的大多数为几丁质内切酶。 根据几丁质酶的氨基酸序列、等电点、细胞定位等特点可将几丁质酶分成5 类。 i 类几丁酶为碱性蛋白，主要分布于液泡中在氨基酸序列上有两个高度保守区，其 中间由可变的交连区分开。n 一端的保守区由富含半胱氨酸( 8 个半胱氨酸) 的约4 0 个氮基酸组成，这是几丁质结合区( c h “i n - b i n d i n gd o m a i n ) 。c 一端是催化区( c s t a l y s i s 区) ，由3 0 0 个左右的氨基酸组成，同源性高达7 0 8 0 。i i 类几丁酶为酸性蛋白， 主要分布在细胞间隙。其主要结构的氮基酸序列与i 类类似，但只含有催化区，缺 少n 端富含半胱氨酸区域及交连区，氨基酸同源性高达6 5 以上。i 类几丁酶也为 酸性蛋白，定位于胞间隙。部分氮基酸顺序比较表明，这类酶相互之间很相似，但 与i 、i i 类酶无同源性，也不含富半胱氨酸结构域( 几丁质结合区) 。类几丁质茵 包含一个富半胱氮酸的结构域和一个与i 类酶相似的高度保守序列，但在几丁质结 合区和催化区缺失了一些氨基酸，成熟结构序列只含有2 4 l 2 5 5 个氨基酸。v 类几 丁质酶序列与细菌环状芽胞杆菌伽c i c 7 删d 嘲、粘质沙雷氏菌( 脑口打口 胁珊觥) 及褶皱链霉菌( 卿p 蛔璎】聊s p ，j c 劬晒) 分泌到胞外的几丁质酶主要序列 同源，是烟草在受到外界胁迫诱导下产生的，己纯化到两种与此相关的几丁质酶， 分别为4 1 k d a 和4 3 k d a 。 植物中的几丁质酶是可诱导的，这些诱导因子包括：病毒、类病毒、细菌、病 原真菌、植物寄生真菌、真菌细胞壁组分、脱乙酰几丁质、乙烯、水扬酸、某些盐 溶液、重金属、紫外光、臭氧、昆虫取食及机械损伤等。 植物几丁质酶能抑制真菌菌丝生长和孢子萌发；类几丁质酶大多数为兼具几 丁质溶茵酶的双功能酶，可分解细菌细胞壁的肽聚糖而抑制细菌的生长和分裂， 因而在植物防卫中起重要作用。几丁质酶与植物防卫反应机制密切相关的原因可能 是：植物几丁质酶在外界胁迫条件下被大量诱导：植物受到真菌侵染时，诱导 产生的几丁质酶系破坏了真菌的细胞壁，致使细胞内容物外溢，菌丝体不能生长， 产生抵御真菌的作用。另外植物几丁质酶还能抗虫、参与植物的发育调控、参与共 生固氮。 1 1 2 3 动物及人的几丁质酶 产生几丁质酶的动物种类主要有两栖类、鸟类及昆虫类等，如蜗牛、鲫鱼、晰 蜴、麻雀、蟑螂、白蚁和鳕鱼等。哺乳动物和人也能产生几丁质酶。研究表明，动 物几丁质酶主要分布于消化液、腺体、胃和肠粘膜等部位，属于内切酶，可将几丁 质水解成二糖和三糖。 1 1 3 几丁质酶的作用 几丁质酶能把高分子几丁质降解寡糖，因而在物质循环、植物保护、基础研究 中均有重要的用途。 地球上每年生成数约1 0 0 亿吨的几丁质，同时又有同样数量的几丁质被降解成 可被循环利用的小分子。在这个物质循环的过程中，几丁质酶起着决定性的作用， 目前，脱乙酰几丁质的生产是以强碱处理脱去乙酰基而完成的。开展儿丁质脱 乙酰作用的研究，有望用酶法代替碱法，不但可以大大减轻污染，降低成本，而凡 可以控制脱乙酰过程，从而获得高质量产品。 从微生物工程的角度出发，利用几丁质酶来进行植物病原真菌的防治，具有周 期短、易于研究、便于生产等优点，因而引起了人们的普遍蓐视。进入2 0 世纪8 0 年代，随着分子生物学的蓬勃发展，使几丁质酶用于生物防治的研究上升到基因工 程水平。1 9 8 4 年s h a p i r a 把几丁质酶基因从粘质沙雷氏菌( s m 憎船绷的克隆到e 矗 后，被整合的e 肛和酶的提取浓，在室温条件下均表现出对真菌的生物防治能 力。继而科学工作者采用植物基因工程技术，把几丁质酶在生物防治中的应用又向 前推进了一步。1 9 9 0 年英国科学家通过土壤农杆菌向双子叶植物导人了细菌的几丁 质酶基因，培育成功了表达该酶的转基因植物，可抑制病原真菌的侵袭，并对植物 线虫、昆虫和其它一些病原生物也具有抗性。目前，已获得的转基因植物包括烟草、 大豆、棉花、水稻和玉米，这些研究现己申请专利。 除了利用几丁质酶基因培育转基因抗性植物以外，还可以直接将产几丁质酶的 微生物作为生物农药喷洒在土壤里，用于防治植物病害。k o n a i dd _ k 等( 2 0 0 1 ) 用 几丁质酶产生菌跏玎d 加叻d m o ，琊矾删觑s t r a i n3 4 s1 的发酵液浸泡土壤，再撤 上k e n t u c k y b l u e 笋a s s b 缸b a r o n 的种子，经温室培养4 星期后，s u m m e f p a t c h d i s e a s e 的发病率明显低于对照。 几丁质酶还能与其它生物农药具有协同作用。早已知晓，微生物几丁质酶可用 于提高昆虫病原微生物的寄生能力。细菌几丁质裂解酶己用于增强细菌、b t 和杆状 病毒a c m n p v 的活性。云杉卷叶蛾( g 幻r i 叻阳f r 口乒f n 归m 船) 的幼虫，在接触几丁质 酶一b t 混合物的死亡率要大于单独接触酶或细菌。室内实验表明，几丁质酶能增强 b t 对夜蛾 五 m 叨胁盔妒+ ) 幼虫的致死率。毒性作用与酶含量成正比，核多壳病 毒对幼虫的致死率由于附加细菌几丁质酶而增加5 倍。杆状病毒表达昆虫几丁质酶 可以增强杀虫活性。如坳亿缸几丁质酶可增加重组扦状病毒的杀虫活性。昆虫几 丁质酶用于增强生防因子防治效果，是通过增加昆虫病原菌对昆虫的致死率来达到 的。 几丁质酶在其它方面也有着广泛的用途。几丁质被几丁质酶降解后，可获得具 有生物活性的寡糖片段氨基寡糖素。氨基寡糖素在调节植物细胞生命代谢活动 中起着非常重要的作用。它作为植物功能调节剂，其功能为调控植物基因的关闭和 开放，诱导植物分泌抗性酶，这样，不但可以调节植物生长，又可增强植物对病原 真菌的抗性。在动物肠道中，氨基寡糖索还可调节微生物的代谢活动，改善肠道微 生物种群分布，刺激有益于动物健康的微生物( 如双歧杆菌) 的生长，作为人体的保 健药物具有重要的开发价值。s u z u k i 等人还报道了6 一n - 乙酰壳己糖具有抗肿瘤活性。 4 7 个寡糖的几丁质酶片段还具有抑制爱滋病病毒的作用。几丁质、脱乙酰几丁质 与其水解酶间的专一性亲和力，可以几丁质酶一脱乙酰几丁质酶一金属复合物为谈针 来检测定位生物中的几丁质和脱乙酰几丁质，有助于细胞化学定位的研究。几丁质 酶可作为食品、蔬果的防腐保鲜剂。此外，在实验中可用几丁质酶破壁，制备真菌 的原生质体。在工业上应用几丁质酶还可以进行几丁质废料的处理， 几丁质经脱乙酰酶催化脱掉乙酰基后形成的脱乙酰几丁质，可用作制造人造皮 肤、制备外伤医用材料、重金属离子吸附剂、染料吸刚剂、化妆品、基因运输系统、 脂肪吸附剂、抗菌剂、血液抗凝集等，在医药、化工、环保、生命科学研究等领域 有着广泛的用途。 1 1 4 问题与展望 目前人们对几丁质及几丁质酶的利用仍然比较少，数量巨大的几丁质仍然主要 是靠自然界中的微生物降解成小分子有机物而自发地进入物质循环。而且目前制备 几丁质几脱乙酰几丁质仍然主要是靠强酸强碱等化学方法。这除了是因为几丁质在 自然界分布过于分散以外，还因为目前人们所得到的几丁质酶活性较低，难于满足 生产的需要。自然界中肯定还存在活性更强的几丁质酶产生菌，这有待于我们去分 离。通过突变及其它生物技术提高酶的活性也将是一条有效的途径。 值得提出的是，n e u h a u s 将组成型表达的i 类碱性几丁质酶基因导入烟草中， 虽然在转基因植株中几丁质酶含量比对照中高1 2 0 倍，但仍不能明显抑制姻草蛙眼 病( c ，蚴舷硼的侵染。这注我m 认识到，几丁质酶的种类多，且在植物细胞中具 有不同的定位，这些都增加了此酶与真菌之间互作的复杂性。而且，在植物与病原 真菌互作过程中，除几丁质酶外，还有许多其它的酶的作用如葡聚精酶、纤维素 酶等等。因此，利用这些酶与几丁质酶共同导入植物可望获得更强、更广诺的抗芮 效果。 另外，转基因植物研究中也应当考虑，目的基因对任何潜在的非靶标生物的副 作用及食品安全性问题等。 1 2 报告基因 检测转基因生物有许多方法。根据检测的基因功能来划分，可分为调控基因( 包 括启动子、终止子等) 检测法、标记基因检测法及目的基因直接检测法。根据检测的 不同阶段区分，有d n a 检测法，r n a 检测法及蛋白质检测法。d n a 检测法只能检 测到外源基因是否已经整合到宿主基因组中，而后两种检测方法检测到的是外源基 因是否能在受体植物中表达；根据r n a 检测法得到的结果可判定外源基因是否转 录，蛋白质检测法则可检测出外源基因是否翻译。还可根据检测所用的具体方法划 分，有p c r 检测法、化学组织检测法、酶联免疫吸附法( e l i s a ) 、s o u t h e 丌l 杂交法、 n o n h e m 杂交法、w e s t e r n 杂交法及生物测定检测法等。但这些划分也并非是绝对的， 如用p c r 既可检测调控基因，也可检测标记基因和目的基因。其中较为常见及简便 的方法是报告基因检测法，这些基因一般编码一个特殊的酶，这些酶所催化的反应 很容易用普通的生化反应检测出来。而在正常的非转基因生物中，这些酶及其所催 化的反应几乎完全不存在。目前常用的报告基因主要有b 半乳糖苷酶基因( l a cz ) 、 卡挪霉素抗性基因( n p t i i ) 、b 一葡萄苷酶基因( g u s ) 、荧光素酶基因( l u x ) 、绿色荧 光蛋白( g f p ) 、红色荧光蛋白( r f p ) 、姻脂碱合成酶( n o s ) 和章鱼碱合成酶基 因( o c s ) 、氯霉素乙酰转移酶基因( c a t 基因) 、除草剂抗性基因( p a t ) 、二氢叶酸还原 酶基因f d h f r ) 、冰核基因( i n a ) 等。这些基因由于其检测简单方便，在大多数转 基因生物中得到广泛应用。 1 2 1 p 一半乳糖苷酶基因( l a cz ) 这是利用乳糖操纵子基因i a c 基因的一个片段，常用于以质粒p u c 系列作为载 件的大砀扦苘表达系统。载体育一个来自大肠杆菌的l a c 操纵子的d n a 区段，这一 区段编码0 一半乳糖苷酶氮基端的一卟片段。异丙基一p - d 硫代半乳糖苷( i p i g ) 可 以诱导发片段的合成，而该片段能与高生细幄所编码的缺陷型d 一半乳糖苷酶实现基 因内互补( 互补) 。暴露于诱导物l p t g 的细菌，可以同时合成该酶的两种片段， 铺在含有生包底物j 一澳4 氯3 一吲哚一b d 一半乳禧苷( x - g a l ) 的培养基卜，将形成蓝 色菌落。外源d n a 插入质粒的多克隆位点后可使b 一半乳糖苷酶的氨基端片段灭活， 破坏了a 互补作用，因此，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。该基因作为报告 基因的优点是操作简单，蓝白菌落区分明显。缺点是只适应于具有d 一半乳糖苷酶缺 陷型大肠杆菌，对于其它表达系统无法使用。 1 2 ! p 一葡萄苷酸酶( g u s ) 基因 p 一葡萄苷酸酶( g u s ) 是一种水解酶，催化各种类型的卜葡萄苷酸裂解。大肠 杆菌的d 一葡萄苷酸酶的单体分子量为6 8 ，2 0 0 道尔顿，一般情况下以四价体形式存 在。它十分稳定，抗多种去垢剂，在环境条件变化较大的情况下仍然具有活性。g u s 不需要辅酶因子和阳离子。该酶广泛应用于分光光度分析、荧光分析和组织化学分 析，其底物均为可溶性的，卜分利于操作。g u s 用于荧光分析的作用原理是依赖于 酶作用于合适的底物后，释放出易于从底物中分辨出来的产物。荧光分析法的灵敏 度要比显色法高1 0 0 一! o 。0 倍。g u s 的底物主要有4 一甲基伞形醛葡糖苷酸f m u g l 、 5 一溴- 4 氯一3 一吲哚葡糖苷酸( x g ! u c ) 、9 一羟基一3 一异吩恶唑酮葡糖苷酸( r e g ) 。组织或细 胞的g u s 分析步骤包括裂解液的制备酶，底物反应和荧光分析。简单的定性分析， 即将反应物置于低波紫外线下，用肉眼观察其发出的蓝色荧光的有无或强弱程度。 组织化学检测可用组织切片，将其浸于固定液中处理，然后进行酶( g u s ) 底物 ( x 一目u c ) 反应后，直接置于显滋镜下观察，具有酶活性的部位变成蓝色。该方法司 用于观察植物根、茎或叶等组织内g u s 活性情况或基因表达情况等，r e g 具有较 高的荧光活性，其产物激发于5 6 0n m ，发射于5 9 0n m 。该底物被广泛应剐于无强 荧光活性的植物组织的分析，其产物在自然p h 下荧光活性就可以达到最高，也不 需要终j j ：j 直。 g u s 基凼作为基因融合的际记，屡初应j 于大扬十r 菌。后来。是现几彳所有的高 等植物，特别是己研究的烟草、矮牵牛及拟南芥等，都很少或几乎没有g u si 舌一陛， 同时许多真菌、细菌及果绳的胚胎、幼虫和蛹都很少或完全检测不出g u s 活性 因此，g u s 基因融合系统已广泛地应用于基因表达、调控等分子遗传学研究，该系 统是有效的基因融合系统， 1 2 3 绿色荧光蛋白( g f p ) 1 9 6 2 年，s h i m o m u r a 等首次从多管水母属似p 郇f o 理口p 缸f o ，胁) 中分离纯化出了 g f p ，随后人们对g f p 进行了广泛研究。目前研究得较为深入的是来自多管水母科 似p q m 曲和海紫罗兰科僻p 即f ，蛐的荧光蛋白，即