（细胞生物学专业论文）人elongator复合物及其组蛋白乙酰转移酶活性在基因表达调控中的功能研究.pdf

摘要 真核生物d n a 紧密包装成染色质结构，影响了包括转录、复制和 修复等在内的以d n a 为模板的每一个生物过程。其m r n a 的合成是个多 步骤的复杂过程，由控制该过程的多个辅因子协助r n a p i i 完成。一个 完整的转录循环包括r a n pi i 和通用转录因子被招募至启动子、r a n 链 合成的起始和r a n p i i 从启动子的脱逸、r n a 链的延伸以及伴随r a n p i i 和新生r n a 链从d n a 模板释放的转录终止等过程。当r n a pi i 离开基因 的启动子转录编码区时，遇到包括核小体在内的多种障碍。近来研究 表明组蛋白尾部尤其是h 3 、h 4 四聚体的尾部强烈影响通过核小体的转 录延伸速率，而尾部的乙酰化修饰可抑制这种影响。延伸中的r n a p i i 的辅因子可能具有这种作用。与磷酸化的r n a pi i 结合的e l o n g a t o r 复 合物具有组蛋白乙酰转移酶( h a t ) 活性，它可能执行这一功能。 酵母e l o n g a t o r 是与染色质组分结合，并与延伸中的磷酸化形式 的r n a pi i 相互作用的复合物，是个六亚基的功能整体，在高盐处理或 m o n o q 层析时易于分解为两个三亚基亚复合物，其中一个是含e l p 3 的 核心复合物，另一个含e l p 4 5 6 亚基。缺失y e l p 3 ( 或其它y e l p ) 可 导致一系列表型，有的与转录延伸缺陷有关。e l p 3 具有h a t 活性，该 活性为复合物行使功能所必需。使e l p 3 的h a t 活性严重丧失的点突变 可引起所有e 助表型。完整的复合物可直接修饰组蛋白h 3 和h 4 尾部， 其优先乙酰化位点是h 3k 1 4 和h 4k 8 。复合物的h a t 活性需要e l p 4 5 6 的存在，它们只与核心复合物相互作用( 不与r n a p i i 作用) ，可能对 核心复合物的h a t 活性具调控作用。 近来人e l o n g a t o r 也被分离，它也是个不稳定的六亚基复合物， 可与r n a p i i 相互作用，具有h a t 活性，能乙酰化h 3 和h 4 ，在h e l a 细 胞核抽提物中去除e l o n g a t o r 可降低抽提物对染色质模板的转录延伸 速率，提供了该复合物在染色质为模板的转录延伸中有功能的生化证 据，但是上面的信息都来自体外研究。尚未见对人e l o n g a t o r 复合物 及其亚基功能的体内研究的报道。 本文以酿酒酵母为实验材料，利用其易于进行遗传操作的优点， 对人e l o n g a t o r 的功能特点进行体内研究。证明了人与酵母的e l p 3 在 功能上是保守的，初步确定了h e l p 3 及其拥有的h a t 活性在复合物中 的功能地位，了解了复合物h a t 活性在基因表达调控中的作用方式。 得到的主要结果和结论如下： 1 、建立了以酵母为材料对人e l o n g a t o r 复合物作用特点进行分析的功 能互补和基因表达分析的实验体系 2 、利用上述体系证实y e l p 3 、y h e l p 3 和h e l p 3 分别可以完全、显著、 部分补偿y e l p 3 缺失引起的生长缺陷，并分别能够在诱导条件下完 全、显著、部分恢复y e l p 3 缺失引起的p h 0 5 和s s a 3 基因表达延迟 的缺陷。h a t 区催化结构域缺失的y h e l p 3 t f a y ：g j 彪z 船倒，投有上 述功能。表明人与酵母的彤在功能上是保守的，h e l p 3 的f a t 区 可以替代y e l p 3 的h a t 区，h e l p 3 的h a t 活性为其行使功能所必需。 3 、利用功能互补和r t p c r 证明h e l p 4 可部分补偿y e l p 4 缺失引起的生 长缺陷，并能在一定程度上恢复其崩船百初s s a 3 表达延迟的缺陷， 表明与y e l p 4 相似，h e l p 4 所在的较小亚复合物可能对核心复合物 的h a t 活性行使调控功能。 4 、利用点突变和p l a s m i ds h u f f l e 等技术构建了含h 3k 1 4 一r 、h 4k 8 一r 单突变和h 3k 1 4 一r h 4k 8 一r 双突变的e l p 3 4 菌株，通过功 能互补实验分析y e l p 3 对突变株的补偿功能，证实酵母e l o n g a t o r 可对h 31 4 k h 48 k 进行乙酰化修饰。同时以转入，既助为参照确 立了研究h e l p 3 的h a t 活性作用方式的体内检测体系。 5 、通过对h e l p 3 相关质粒转入含h 3 h 4k r 突变的e l p 3 a 菌株的功 能互补实验，发现在供试条件下组蛋白突变均使y e l p 3 、y h e l p 3 和 膨舟补偿能力下降。在h 3k 1 4 一刚h 4k 8 一r 双突变的e l p 3 a 菌 株中，三个基因的补偿功能都近乎丧失，表明在体内组蛋白( h 3k 1 4 、 h 4k 8 ) 是h e l p 3 及其所在的e l o n g a t o r 复合物的重要靶位点，同时 表明人e l o n g a t o r 复合物与转录相关的染色质的修饰和改构 ( r e m o n d e li n g ) 有关。 6 、在对h 3 h 4k r 突变株的功能互补实验中，我们发现h 3k 1 4 一r h 4k 8 一r 双突变使e l p 3 a 菌株产生更为严重的缺陷表型，表明细 胞内其它乙酰转移酶与e l p 3 在功能上有重叠，同时也表明体内维持 一定的乙酰化水平对细胞正常生长或迅速适应条件变化非常重要。 7 、h 4k 8 一r 对y b e l p 3 、h e l p 3 与y e l p 3 功能的影响大于h 3k 1 4 一r ， 表明体内组蛋白不同位点的乙酰化修饰对基因表达有不同的影响。 人与酵母的e l p 3 对组蛋白h 4k 8 的乙酰化修饰可能有比h 3k 1 4 更 重要的作用。 关键词：e l o n g a t o r 复合物，e l p 3 ，e l p 4 ，组蛋白h 3 、h 4 定点突变， h a t 活性，功能互补，基因表达， a b s t r a c t t h ep a c k a g i n go fe u k a r y o t i cd n ai n t oc h r o m a t i ni n f l u e n c e sv a r i o u s p r o c e s s e s t h a tu t i l i z ed n aa sa t e m p l a t e ，i n c l u d i n gt r a n s c r i p t i o n ， r e p l i c a t i o na n dr e p a i r e u k a r y o t i cm e s s e n g e rr n a s a r es y n t h e s i z e db yt h e m u l t i s u b u n i te n z y m er n a p o l y m e r a s ei i ，a i d e db ym y r i a dc o f a c t o r st h a t c o n t r o ld i f f e r e n te v e n t si n t h i sm u l t i s t e pp r o c e s s ac o m p l e t er o u n do f t r a n s c 咖t i o n i n v o l v e st h er e c r u i t m e n to f p o l y m e r a s e a n d g e n e r a l t r a n s c r i p t i o nf a c t o r st o t h ep r o m o t e r , r n ac h a i ns y n t h e s i si n i t i a t i o na n d p o l y m e r a s ee s c a p ef o r mt h ep r o m o t e r , r n a c h a i ne l o n g a t i o n ，a n df m a i l y t e r m i n a t i o n 、v i 也r e l a e a s eo f p o l y m e r a s ea n dn a s c e n tt r a n s c r i p tf r o mt h e d n at e m p l a t e a sr n ap o l y m e r a s ei il e a v e sa g e n ep r o m o t o r t o t r a n s c r i b et h e c o d i n gr e g i o n ，i t f a c e s m a n yo b s t a c l e s ，i n c l u d i n g n u c l e o s o m e s r e c e n td a t ah a v ed e m o n s t r a t e dt h a tt h et a i l so fh i s t o n e sh 3 a n dh 4g r e a 廿yr e d u c et h es p e e do ft r a n s c r i p t e l o n g a t i o nt h r o u g h a n u c e l o s o m e ，a n dt a i la c e t y l a t i o ns u p p r e s s e st h i se f f e c t a c c e s s o r yf a c t o r s f o r e l o n g a t i n gp o l y m e r a s e w o u l db e e x p e c t e d t o c a r r y o u tt h e s e m o d i f i c a t i o n s 1 1 1 er n a pi i a s s o c i a t e d c o m p l e xe l o n g a t o rh a sh i s t o n e a c e t y l t r a n s f e r a s e ( h a t ) a c t i v i t ya n d 也u sm i g h t f u l f i ls u c har o l e y e a s te l o n g a t o rw a si s o l a t e da sac o m p l e xt h a ta s s o c i a t e sw i t ht h e c h r o m a t i nf r a c t i o na n di n t e r a c t sw i t ht h ee l o n g a t i n gp h o s p h o r y l a t e df o r m o fr n a p1 1 n ef u n c t i o n a le n t i t yo f e l o n g a t o rc o m p l e xh a sr e c e n t l yb e e n s h o w nt ob ea nu n s t a b l es i x - s u b u n i t c o m p l e x ，t e r m e dh o l o - e l o n g a t o r , w h i c hc a nd i s s o c i a t ei n t ot w od i s c r e t et h r e e - s u b u n i ts u b c o m p l e x e su p o n t r e a t m e n tw i t hh i g hs a l ta n d o rm o n o qc h r o m a t o g r a p h y o n eo ft h e s e s u b c o m p e x e si s t h e e l p 3 - c o n t a i n i n gc o r ec o m p l e x ，a n dt h e o t h e ri sa c o m p l e xo f t h ee l p 4 ，e l p 5a n de l p 6p r o t e i n s d e l e t i o no f e l p 3 ( o r o t h e r e l p g e n e s ) c o n f e r sas e to f p h e n o t y p e s ，s o m eo f w h i c h a r ea s s o c i a t e dw i t h e l o n g a t i o nd e f e c t s s i g n i f i c a n t l y , t h ee t p 3s u b u n i ti sah i 曲l yc o n s e r v e d h i s t o n ea c e t y l t r a n s f e r a s e ( h a t ) m u t a t i o n st h a td e b i l i t a t et h eh a t a c t i v i t y o f e l p 3i nv i t r oa l s oc o n f e re ，pp h e n o t y p e si nv i v o ，i n d i c a t i n gt h a tt h eh a t a c t i v i t yo fe l o n g a t o ri sr e q u i r e df o ri t sf u n c t i o n t h ea c t i v i t yo fi n t a c t e l o n g a t o rc o m p l e xi sd i r e c t e ds p e c i f i c a l l yt o w a r dt h ea m i n o t e r m i n a lt a i l s o fh i s t o n eh 3a n dh 4 t h ep r e d o m i n a n ta c e t y l a t i o ns i t e sa r el y s i n e 一1 4o f v i h i s t o n eh 3a n d1 y s i n e 8o fh i s t o n eh 4 t h es m a l ls u b c o m l e x e sc o m p o s e d o f e l p 4 5 6i sr e q u i r e df o rt h eh a ta c t i v i t y , i ti n t e r a c t sp r e f e r e n t i a l l yw i t h t h ec o r ec o m p l e x ( r a t h e rt h a ni nc o m p l e xw i t hr n a pi i ) a n dw a st h e r e f o r e p r o p o s e d t oh a v ear e g u l a t o r yf u n c t i o n r e c e n f l y h u m a ne l o n g a t o rc o m p l e x e sh a v eb e e ni s o l a t e d t h eh u m a n c o m p l e xi saf r a g i l es i x - s u b u n i tc o m p l e x t h a ti n t e r a c t sw i t hr n a pi ia n d h a s 姒ta c t i v i t yd i r e c t e d a g a i n s t h i s t o n eh 3a n dh 4 d e p l e t i o no f e l o n g a t o rf r o mh e l an u c l e a re x t r a c t sr e d u c e s 也ea b i l i t yo ft h e s ee x t r a c t s t ot r a n s c r i b ec h r o m a t i nt e m p l a t e s ，p r o v i d i n gb i o c h e m i c a ls u p p o r tf o rt h e p r o p o s e dr o l e o fe l o n g a t o rd u r i n gt r a n s c r i p t e l o n g a t i o n i nc h r o m a t i n h o w e v e ra l lo ft h e s ed a t ac o m ef r o mi nv i t r os t u d i e s t h e r eh a v eb e e nn o r e p o r t ss of a ro n t h ec h a r a c t e r i z a t i o no f h u m a n e l o n g a t o rc o m p l e x i nv i v 0 i nt l l i st h e s i s w es t u d i e dt h ef u n c t i o no fh a ta c t i v i t yo fh u m a n e l o n g a t o rc o m p l e xi ng e n ee x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o ni ns a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e t h er e s u l t sh a v es h o w nt h a tt h eh a ta c t i v i t 、ro f 皿j p 3 w h i c hi s e s s e n t i a lf o ri t sf u n c t i o ni nv i v o , i se v o l u t i o n a r i l yc o n s e r v e db e t w e e n h u m a na n dy e a s t h u m a ne l o n g a t o rc o m p l e xs e r v e sar o l ei nc h r o m a t i n r e m o d e l i n gt h r o u g hm o d i f y h a gt h el y s i n er e s i d u e so f h i s t o n eh 3a n dh 4 d 埘n gt r a n s c n 曲o ne l o n g a t i o n i n h i g h e rc e l l s 1 h e m a i nr e s u l t sa n d c o n c l u s i o n s8 1 e 鹤f 0 1 1 0 w i n g s 1 、u s i n gd e p l e t i o n s t r a i no fy e a s t 船m a t e r i a l w eh a v ee s t a b l i s h e da s y s t e m f o rc o m p l e m e n t a t i o nt e s ta n d g e n ee x p r e s s i o na n a l y s i so f h u m a n e l o n g a t o rc o m p l e x 2 、b yu s i n gt h ea b o v es y s t e m ，w ed e m o n s t r a t e dt h a ty e l p 3 , y h e l p 3a n d h e l p 3w e r ea b l et oc o m p l e t e l y , d r a m a t i c a l l ya n d p a r t i a l l yc o m p l e m e n t t h eg r o w t hd e f e c t sa n dt h es l o wa c t i v a t i o no fp h 0 5a n ds s a 3g e n e c a u s e db yt h e d e p l e t i o no fy e l p 3 , r e s p e c t i v e l y , w h i l ey h e l p 3 h a t , 。 w h o s ec a t a l y t i cd o m a i nw a s p a r t i a l l yd e l e t e d h a dr i of u n c t i o nd e t e c t e d a b o v e t h e s er e s u l t sh a v es h o w nt h a tl l e l p 3a n dy e l p 3a r ec o n s e r v e di n f u n c t i o n ，t h eh a t d o m a i no f h e l p 3c a n r e p l a c et h a to f y e l p 3 a n dt h e h a t a c t i v n yo f h e l p 3i se s s e n t i a lf o ri t sf u n c t i o n 3 、b yu s i n gc o m p l e m e n tt e s ta n dr t p c r w ed e m o n s t r a t e dt h a th e l p 4 w a sa b l et op a r t i a l l yc o m p l e m e n tt h eg r o w t hd e f e c ta n d p a r t i a l l yr e s c u e t h es l o wa c t i v a t i o no fp h 0 5a n ds s a 3i ni n d u c i b l ec o n d i t i o n s t h e s e r e s u l t sh a v es h o w nt h a tj u s tl i k et h a ti ny e a s tt h es m a l ls u b c o m p l e x w h i c hc o n t a i n st h ee l p 4s u b u n i tp l a y sar o l e i nt h er e g u l a t i o no f e l o n g a t o ra c t i v i t y 4 、t h r o u g hs i t e - d i r e c t e dm u t a t i o na n dp l a s m i ds h u f f l ee x p e r i m e n t sw e c o n s t r u c t e de l p 3d e l e t i o ns t r a i nc a r r y i n gm u t a t i o n so fl y s i n e 一1 4i nh 3 ， l y s i n e - 8i nh 4 o rc o n c o m i t a n tm u t a t i o no ft h et w os i t e si n t oa r g i n e b y u s i n g t h e c o m p l e m e n tt e s t o fy e l p 3i nt h e s em u t a n t s t r a i n s ，w e d e m o n s t r a t e dt h a ty e a s te l o n g a t o rc o u l da c e t y l a t et h et w os i t e sa n dw e c o n c l u d e dt h a tt h e s em u t a n ts t r a i n sc a nb eu s e dt ot e s th u m a ne l p 3 f u n c t i o n 5 、t h r o u g h t h ec o m p l e m e n to fh e l p 3r e l a t e dp l a s m i d si nh i s t o n em u t a n t s t r a i n s ，w ef o u n dt h a th i s t o n em u t a n t sr e d u c e dt h ec o m p l e m e n t a t i o no f y e l p 3 , y h e l p 3a n dh e l p 3g e n et ot h eg r o w t hd e f e c tc a u s e db yt h e d e l e t i o no f y e l p 3 i nt h ec o n c o m i t a n tm u t a t i o n so fh 3k 1 4 一ra n d h 4k 8 - - rs t r a i n ，y e l p 3 ，y h e l p 3a n dh e l p 3g e n e sa l m o s th a dn o c o m p l e m e n t a f i o ne f f e c t st ot h eg r o w t hd e f e c t b a s e do nt h e s er e s u l t s ， w es u g g e s tt h a th i s t o n e sa r ei m p o r t a n tt a r g e t sf o rh u m a ne l p 3a n d e l o n g a t o r h a t a c t i v i t yi nv i v o ，a n dh e n c eh u m a ne l o n g a t o r i si n v o l v e d i nt r a n s c r i p t i o n a s s o c i a t e dc h r o m a t i nm o d i f i c a t i o na n d r e m o d e l i n g 6 、w ea l s of o u n dt h a tt h ee t p 3as t r a i nc a r r y i n gc o n c o m i t a n tm u t a t i o n so f h 3k 1 4 一ra n dh 4k 8 一rh a dm o r es e v e t ep h e n o t y p e st h a ne l p 3a s t r a i n c a r r y i n g w i l d t y p e h i s t o n e i ti n d i c a t e dt h a t m u l t i p l e a c e t y l t r a n s f e r a s e sh a v eo v e r l a p p i n gs u b s t r a t es p e c i f i c i t i e sw i t l l b u tn o t i d e n t i c a lt ot h o s eo fe l p 3 ，o re l p 3a f f e c t s a c e t y l a t i o no fa d d i t i o n a l t a r g e t si nh 3 h 4o ro t h e rp r o t e i n si np o v ot h a tf i r en o tr e c o g n i z e db y t h er e c o m b i n a n to rp u r i f i e dp r o t e i ni nv i t r o i ta l s oi n d i c a t e dt h a tt h e m a i n t e n a n c eo fn o r m a lh i s t o n eh 3a n dh 4a c e t y l a t i o nl e v e l si n c h r o m a t i ni nv i v oi si m p o r t a n tf o rc e i l sg r o w t h 7 、e i t h e ri nt h ep r e s e n c eo ra b s e n c e o f y e l p 3 , y h e l p 3 a n d h e l p 3 ，e l p 3 4 s t r a i nc a r r y i n gm u t a t i o no fh 4k 8 一re x h i b i t e dm o r es e v e r eg r o w t h d e f c c tt h a nt h a to fh 3k 1 4 一r n e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a td i f f e r e n t a c e t y l a t i o ns i t e si nh i s t o n eh a v ed i f f e r e n te f f e c t so nt h eg e n ee x p r e s s i o n v i - i i nv i v o i ts e e m e dt h a tt h eh a t a c t i v i t yo fy e l p 3a n dh e l p 3a g a i n s tk 8 i nh 4i sm o r e i m p o r t a n tt h a n k 1 4i nh 3 k e y w o r d s ：e l o n g a t o rc o m p l e x ，e l p 3 ，e 1 p 4 ，s i t ed i r e c t i o nm u t a n ti n h i s t o n eh 3a n dh 4 ，h a t a c t i v i t y , c o m p l e m e n tt e s t ，g e n e e x p r e s s i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得东j p , i j m 范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者签名：李芳日期： 毋脚孑，_ t 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文 的规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学 位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范 大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：! i i 蔓指导教师签名：童皇盗 日 期：出醴：坐f 日期：趣2 i ：f 兰：堕 学位论文作者毕业后去向：、 工作单位：逝遣酲瞌缒鱼盥刮电话： 通讯地址：酒嗡幽必车剖 邮编：篮i ! ! 兰 c s b d r b d s i f f a c t g n a t n e l f p t e f b s p t s s r p l r n a p 6 a u c t d e l l 1 h t - s f l v h l m l l h n f 3 h m g 1 4 e s a l r s s t i p 6 0 s a g a s i r 2 r t p c r h a t h d a c c b p m e f h d l p p c a f s a s m o z n u a 4 d r l l e h l m y s t a c t r c r e b 英文缩写词 c o c k a y n e ss y n d r o m e b p r o t e i n 5 6 - d i c h l o r o 1 b d - r i b o f u r a n o s y l b e n z i m i d a z o l e d r b s e n s i t i v i t v i n d u c i n gf a c t o r f a c i l i t a t e sc h r o m a t i nt r a n s c r i p t i o n g c n 5 r e l a t e dn a c e t y l t r a n s f e r a s e n e g a t i v ee l o n g a t i o nf a c t o r p o s i t i v et r a n s c f i p o t i o ne l o n g a t i o n f a c t o rb s u p p r e s s o ro f t y i n s e r t i o n s t r u c t u r e - s p e c i f i cr e c o g n i t i o np r o t e i n1 r n a p o l y m e r a s e i i 6 a z a u r a c i l c a r b o x y t e r m i n a ld o m a i n 1 1 1 9l y s i n e - r i c hi nl e u k e m i a 1 a t s t i m u l a t o r yf a c t o r1 v o n h i o p e l l i n d a n m i x e d l i n e a g el e u k e m i a h e p a t o c y t en u c l e a rt r a n s c r i p t i o nf a c t o r3 h i g h m o b i l i t yg r o u pp r o t e i n1 4 e s s e n t i a ls a sf a m i l ya c e t y l t r a n s f e r a s e1 r e c o m b i n a n ts i g n a ls e q u e n c e s t a t i n t e r a c t i v ep r o t e i n 6 0 k d s p t a d a g c n 5 a c e t y l t r a n s f e r a s ec o m p l e x s i l e n c ei n f o r m a t i o nr e g u l a t o r2 r e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n h i s t o n ea c e t y l t r a n s f e r a s e s h i s t o n ed e a c e t y l a s e c r e b - b i n d i i l gp r o t e i n m y o c y t ee n h a n c i n g f a c t o r h i s t o n e d e a c e t y l a s e 1 i k ep r o t e i n p 3 0 0 c b pa s s o c i a t e df a c o r s o m e t h i n g a b o u t s i l e n c i n g m o n o c y t i c l e u k e m i az i n cf i n g e r p r o t e i n n u c l e o s o m a la c e t y l t r a n s f e r a s ef o rh 4 t h ed e f o r m e dr o o r sa n dl e a v e s1 n a - i n d u c i b l e g e n e m o z ，y b f 2 s a s 3 s a s 2 t i p 6 0 a c t i v a t o r o f t h y r o i da n dr ar e c e p t o r c a m p r e s p o n s ee l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n 第一章文献综述 在细胞的生长和分化过程中，遗传信息的表达是严格按照一定的 空间顺序发生的，并受到外界环境的影响和调整。真核基因的表达调 控是一个多层次的复杂过程，包括在d n a 和染色质的转录水平、转录 后和翻译后等不同层次上的调控。其中转录是基因表达的第一步，也 是关键的一步。 真核生物基因的转录调控是一个多步骤的复杂过程，一个转录循 环至少包括起始( i n i t i a t i o n ) 、延伸( v l o n g a t i o n ) 和终止( t e r m i n a t i o n ) 三 个主要阶段。转录的起始和延伸阶段都由控制r n a 聚合酶i i ( r n a p i i ) 活性的多个不同的转录因子进行调控。在过去的三十多年 里，对真核生物基因转录的研究主要集中在转录起始阶段，在此期间 运用生化手段鉴定了r n a p i i 起始机器的组分，包括中间复合物和通 用转录因子等；它们的功能也通过大量的实验证据得到阐明。近些年 来越来越多的研究集中到真核生物m r n a 合成的转录延伸阶段。 一、r n a 聚合酶i i 控制的转录延伸 ( 一) 概述 真核生物的转录延伸是一个非常复杂的过程，受到控制r n a pi i 活性的多个因子的调控。k o r n b e r g 和其同事报道的r n a p i i 的3 5 a 的 高分辨晶体结构【l 】，使我们对转录延伸的理解有了一个重大的进步， 该结构不仅有助于了解转录延伸复合物沿d n a 模板延伸的分予机制， 也有助于了解r n a 聚合酶在转录延伸过程中的瞬间休止( p a u s e ) 和 停滞( a r r e s t ) 倾向的产生原因。 越来越多的生化研究也获得了关于r n a p i i 控制的转录延伸的分 子机制以及在转录延伸过程中起作用的转录因子的新的信息令人意 想不到的是，在研究r n a p i i 由转录起始向转录延伸的转变过程中，人 们发现通用起始因子t f i i e 、t f i i f 和t f i i h 在延伸早期和启动子脱逸 ( e s c a p e ) 的过程中具有功能( p o s t i n i t i a t i o nr o l e s ) ，并且也获 得了r n a p i i 大亚基c 一末端结构域( c t d ) 磷酸化在转录延伸中具有功 能的直接证据。同时在以裸露d n a 和染色质为模板的转录中控制 r n a p l i 活性的新的延伸因子也逐渐被发现，对其作用机制也有了日益 详尽的了解，而且有关延伸因子在正常细胞和某些疾病中的生理功能 方面的信息也开始出现。 ( - - ) r n a 聚合酶延伸复合物的结构功能 r n a pi i 的分子量约为6 0 0k d a ，含有1 2 个亚基，在酵母和哺乳动 物之间高度保守。要了解r n a p i i 如何能够使r n a 链延伸，需要在分子 水平上回答两个与催化机制有关的基本问题。第一，为什么r n a p i i 可 以抓牢d n a 模板和新生的r n a ，以至于使其在一个反应中可以合成长 达2 5 m b p 的基因如肌营养不良基因的转录本? 第二，为什么在延伸的 过程中r n a p i i 对瞬间休止和停滞非常敏感? 酵母的十亚基活性形式的r n a p i i 的晶体结构的发现【1 ，提供了有 关延伸复合物的构成和其催化特点的信息。如图1 1 的模型所示， r n a p i i 的催化位点和其单一必需的m g ”位于r p b l 和r p b 2 亚基界面所 形成的深隙( d e e pc l e f t ) 的底端，深隙的大小足以容纳d n a 和r n a 杂合双链的8 9 个碱基对，并且可保证新生转录本的3 一羟基与催化 位点 1 9 2 + 的正确排列。而r p b l 和r p b 2 之间深隙的剩余部分的大小则 足以容纳d n a 模板催化位点下游约2 0 个碱基对。 r n a p i i 的晶体结构也有助于对延伸复合物的延伸性 ( p r o c e s s i v i t y ) 和稳定性( s t a b i l i t y ) 的理解。由r p b l 、r p b 5