（生物化学与分子生物学专业论文）低分子量香菇多糖的结构研究.pdf

摘要 香菇是一种兼食用和药用为一体的大型真菌，香菇中最重要的香菇多糖有很 明显的抗肿瘤，增强宿主对细菌、真菌、病毒和寄生虫感染的抵抗能力，增强自 然杀伤细胞和细胞毒性t 细胞活性等多种生物学和免疫学活性，其化学结构与活 性关系密切，所以结构研究也逐渐成为研究热点 本文以香菇子实体为实验材料，分离纯化水溶性低分子量香菇多糖并对该多 糖的结构进行研究，为更好的研究低分子量香菇多糖的生物学活性研究奠定了基 础。 该论文的主要研究内容：香菇子实体热水煮提，将其滤液浓缩后，乙醇沉淀 得到香菇粗多糖( c l n t - i ) ；c l n t - 1 经反复冻融、高速离心( 1 0 0 0 0 r p m ) 、9 5 乙醇沉淀得c l n t - 2 ；c l n t - 2 经链蛋白酶酶解、s e v a g e 法脱蛋白、凝胶柱层析 方法纯化得水溶性香菇多糖；高效液相色谱( h p l c ) 分析，结果证明该纯化香 菇多糖组分均一且分子量较低( m w = 7 0 4 0 d a ) ，并命名为l m w l n t 。气相色谱 ( g c ) 分析结果表明l m w l n t 单糖组成主要为葡萄糖，半乳糖，甘露糖，阿 拉伯糖，岩藻糖，其摩尔比为1 0 7 4 ：4 7 8 ：2 3 ：l ：1 0 4 。 l m w l n t 经部分酸水解、高碘酸氧化、s m i t h 降解、甲基化、g c m s 分析、 i r 分析等方法，确定其分子结构大体为：主链主要由g l c ( 1 - - - , 3 ) 和g a l ( 1 - - - * 6 ) 组成， 并且有少量的f u c ( 1 - - ，2 ) 。支链主要由g a l ( 1 - - - ，4 ) ，g l c ( 1 - - 辛3 ) 组成，并且含有少量 的f u c ( 1 2 ) a r a ( 1 _ 3 ，5 ) ；分支点由a r a ( 1 _ 3 ，5 ) ，m a n ( i - - - * 2 ，4 ) 构成；末端残基为 m a n 。 关键词：香菇多糖；分离纯化；结构 a b s t r a c t l e n t i n u se d o d e s ( l e d o d e s ) i saw e l lk n o w nm a c r o f u n g iw i t he d i b l ea n d m e d i c i n a lv a l u e ，i t sp o l y s a c c h a r i d e sh a v eav a r i e t yo fb i o l o g i c a la n di m m u n o l o g i c a l a c t i v i t y ，s u c ha sa n t i t u m o re f f e c t s ，s t i m u l a t et h ef o r m a t i o no fi n t e r f e r o n ，s t r e n g t h e n h o s tr e s i s t a n c et ob a c t e r i a l ，f u n g a l ，v i r a lo rp a r a s i t i ci n f e c t i o n s ，e n h a n c en a t u r a lk i l l e r ( n k ) ，c y t o t o x i ctl y m p jo c u t e s ( c t l ) a c t i v i t ya n ds oo n i t sc h e m i c a ls t r u c t u r ei sg r e a t o s c u l a t i o nw i t hi t s a c t i v i t y ，a n ds o 工e d o d e s sc h e m i c a ls t r u c t u r ei sg r a d u a l l y i n v e s t i g a t i v eh o t s p o t b yt h i sa r t i c l e ，w e t o o kt h e d r ym u s h r o o ml e d o d e sf o re x p e r i m e n t m a t e r i a l ，a n dr e s e a r c ht h es t r u c t u r eo ft h el o wm o l e c u l a rw e i g h tp o l y s a c c h a r i d e s w h i c hc a ns o l u b l ei nw a t e r i tw a sl a yt h ef o u n d a t i o nf o rl o wm o l e c u l a rw e i g h t p o l y s a c c h a r i d e s ss t u d i e so nl o c o m o t o ra c t i v i t y i nt h i sp a p e r ：d r ym u s h r o o ml e d o d e sw e r ee x t r a c t e dw i t hd i s t i l l e dw a t e rf o r t h r e et i m e s ，t h e nt h es u p e r n a t a n tw a sc o n c e n t r a t e da n dp r e c i p i t a t e dw i t he t h a n o lt o o b t a i nt h ec r u d ep o l y s a c c h a r i d e ( d e s i g n a t e dc - l n t - 1 ) c l n t - 2w a sr e c o v e r e db y r e p e a t e df r o z e n ，t h a w e da n dp r e c i p i t a t i n gw i t h9 5 e t h a n o lf r o mc l n t - 1 c - l n t - 2 w a sd e p r o t e i n a t e db yac o m b i n a t i o no fp r o t e i n a s ea n ds e v a gm e t h o da n dw a sf u r t h e r p u r i f i e db ys e p h a r o s ec l 一6 bg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h yt og e tt h eh o m o g e n e i t y a n dl o wm o l e c u l a rw e i g h tl e n t i n a n ( m w = 7 0 4 0 d a ) ( d e s i g n a t e dl m w l n t ) w h i c hw a s e v a l u a t e db yh p l c g a sc h r o m a t o g r a p h y ( g c ) a n a l y s i ss h o w e dt h a tl m w l n tw a s c o m p o s e do f g l c ，g a l ，m a n ，a r aa n df u ci nr a t i oo f1 0 7 4 ：4 7 8 ：2 3 ：1 ：1 0 4 w ec a nk n e wt h el m w - l n t sm o l e c u l es t r u c t u r eb yp a r t i a l l yh y d r o l y z e db ys o m e m e t h o do fs t r u c t u r a lr e s e a r c h i th a sab a c k b o n em a i n l yc o m p o s e do 坟1 - 3 ) 一l i n k e d g l c ，a n d ( 1 叶6 ) 一l i n k e dg a la n dal i t t l e ( 1 _ 2 ) 一l i n k e df u cw i t h4b r a n c h e sa t t a c h e dt o ( 1 3 ，5 ) 一l i n k e da m ，( 1 2 ，4 ) 一l i n k e dm a na n dt e r m i n a t e d 谢t h ( 1 _ ) 1 i n k e dm a n ，a n d t h e ( 1 _ 4 ) 一l i n k e dg a l ，o t h e r ( 1 3 ) 1 i n k e dg l c ，al i t t l e ( 1 _ 2 ) 1 i n k e df u ca n d ( 1 3 ，5 ) 一l i n k e da r aa r ed i s t r i b u t e di nb r a n c h e s k e yw o r d s ：l e n t i n a n ；p u r i f i c a t i o n ；s t r u c t u r e i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名孓迸谴 r 期： 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东 北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论 文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：王递笼 日 期：籼辞：6 1io 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名： 2 盎主 日 期：卫归。 电话： 邮编： 己l吉 jl f j 1 多糖及多糖结构的研究意义 多糖( p o l y s a c c h a r i d e ) 是一类天然大分子化合物，是由醛糖或酮糖连接在一起 的多聚物，多糖是自然界中储量丰富的生物聚合物，广泛存在于动物、植物和微 生物等有机体中【l 】，是构成生命的四大基本物质之一，并且具有多种生物活性，药 理作用非常广泛。随着分子生物学和细胞生物学的发展，人们得到了有关糖的结 构和功能越来越多的信息，逐步认识到糖是除核酸和蛋白质之外的另一重要的生 命物质，具有许多生物学功能【2 j 。 多糖具有能量储存、结构支持、防御和抗原决定性等多方面的生物学功能， 而且有些多糖或其衍生物还具有多种药理活性，所以近年来多糖成为天然药物研 究的一个热点【3 】。并且在医药上是一种很好的佐剂，近年来发现多糖的糖链在分 子生物学中具有决定性作用，此外它还能控制细胞的分裂和分化、调节细胞的生 长和衰老【4 】。流行病学和生理学研究表明，多糖对人体的影响与细胞壁多糖的化 学组成有关【5 一。在生命过程中，糖作为能量物质和结构物质，它的味觉性能、 生理性能及加工性能早己为人们所熟悉【7 j 。除此之外，现代医学研究表明某些多 糖还具有抗凝血、抑感染、御放射、降血糖、防肿瘤等免疫调节功能，其与炎症、 自身免疫、肿瘤细胞的恶性转化等生理、病理过程密切相关【8 。1 们。可以作为广谱 免疫促进剂，常被称为“生物应答效应物”( b i o l o g i c a lr e s p o n s em o d i f i e r ，b r m ) 或生物活性多糖【1 1 】。多糖的应用已渗入到保健品，化妆品，食品，饲料等领域，从而 使这一学科成为目前生命科学中最活跃的研究领域之一【l 引。 多糖的化学结构是其生物活性的基础，多糖化学结构复杂，具有装载丰富生 物信息的能力，因此多糖的结构研究是多糖化学研究的关键【l3 1 。研究发现，多糖 具有多种生物活性，多糖的生物活性与其结构、构象、分子量、纯度有着密切的 关系，因此对多糖的结构分析就显得尤为重要。近年来，随着生物学、化学等学 科及仪器分析技术的发展，对多糖及其复合物的化学结构和生物活性的研究也越 来越深入。有关多糖的构效关系也是当今医学界和化学界十分感兴趣的课题 【1 4 1 6 】 o 核酸中的核苷酸和蛋白质中的氨基酸都只有一种链接方式，而多糖中的糖单 体则有多种链接点，从而形成不同构型的直链和支链的结构i l7 1 ，如，4 种不同的 单糖形成同分异构体的可能性为3 5 5 6 0 种，而4 种氨基酸只能形成2 4 种同分异 构体【l 引。多糖也能依据分子量、分子问氢键的不同而形成不同的高级结构。多 糖结构的多元化，表明了其具有多种生物学功能。 有人预计，如同2 0 世纪是蛋白质、肽类、氨基酸与核酸时代一样，2 l 世纪 应当是多糖生命科学的时代。这种想法已越来越成为国内外学者的共识。2 0 0 1 年3 月2 3 日出版的美国科学杂志汇编了7 篇综述和6 篇简介组成的一个专辑“糖 和糖生物学”，其中一篇题为“灰姑娘的马车已经来了”，预示着长期被人类堪称 灰姑娘的多糖类已经搭上了仙人的马车，必将其天生的丽质出现于科学领域的最 前沿 1 9 , 2 0 。 2 多糖及多糖结构的研究进展 人们对多糖的活性研究可追溯到1 9 3 6 年s h e a r 对多糖抗肿瘤活性的发驯2 l 】； 在上世纪4 0 年代就发现了多糖类物质的抑癌效应，特别是上世纪6 0 年代以来逐 渐发现了多糖具有一些独特的生物活性，同时毒性极低，几乎没有直接的细胞毒 作用【2 2 】。近年来，人们惊奇地发现多糖及其缀合物对多种危害人类健康的疾病， 如免疫紊乱、癌症、糖尿病、高血压、肝炎、血栓等，都具有显著的疗效【2 3 之5 1 。 其中最引人注目的是它们的免疫修饰和抗肿瘤活性。目前，灵芝、茯苓多糖注射 液被广泛用于临床治疗各种肿瘤，提高免疫功能。因此深入研究多糖的结构、生 物活性以及构效关系，可推动多糖类新药的发现与研究。 对于多糖的结构，瓦特金于1 9 6 0 年最早确定了a b o 抗原的决定基的糖链 结构。近2 0 年来，许多糖类物质不断进入临床研究，主要集中在抗感染、抗肿瘤、 抗风湿、抗消化道溃疡和增进免疫功能等方面实验与应用。但由于多糖本身的结 构复杂，很多特殊的生物活性都与其复杂的空间结构关系密切，因此对多糖结 构的研究是开发新一代糖类药物的关键。目前，国内外对多糖结构的研究主要有 两个趋势：一是在多糖常规结构分析方法基础上，引入免疫生物化学、p e r 等现 代分子生物学技术，进行多糖化学结构与活性的系统研究：二是借助最新的仪器 与计算机模拟技术，研究和模拟多糖在溶液中的构象变化，以研究糖类物质在 参与生命活动、产生生物效应时的精细结构。 多糖的化学结构是其生物活性的基础，多糖的构效关系就是指多糖的一级结 构和高级结构及理化性质与其生物活性的关系，是当前多糖化学和多糖生物学共 同关注的焦点问题 2 6 1 。近年来由于多糖类化合物的特殊生理活性，使得对于多 糖复合物和多糖类化合物的研究得到了快速发展。就多糖的研究状况而言，虽然 已经取得了巨大进展，但与核酸和蛋白质的飞跃发展相比，显得远远落伍i z7 | 。 近年来，生物学、化学等学科的研究飞速发展，对多糖及其复合物的化学结构和 生物活性的研究也越来越深入【2 引。 3 多糖结构的研究 3 1 多糖结构与活性的关系 2 3 1 1 多糖组成和糖苷键类型的影响 多糖组成和糖苷键类型对其生物活性有一定的影响如奇果菌属分离出的具 抗肿瘤活性的奇果菌多糖，基本结构是d 1 ，3 结合的直链葡萄糖，3 分子中有1 分子的b 1 ，6 侧链葡聚糖【z 引。 3 1 2 官能团的影响 多糖一级结构对其生物活性影响的第二个方面是多糖中的一些官能团。多糖 中的官能团的种类或有无对其生物活性有极大的影响，如糖链上硫酸基、乙酰基、 烷基和羧甲基等的取代位置和含量及络合元素的种类决定了多糖有何活性及活 性大小。而这些官能团往往可以通过一定的化学方式进行添加或消除，所以多糖 中官能团的改造已成为研究多糖构效关系的有力手段。通常可以通过降解、羧甲 基化、硫酸酯化、乙酰化、烷基化、磷酸酯化、二乙基氨基乙基化、碘化、氨化 等改造多糖官能团的方法有目的地得到高活性的多糖片段或寡糖。 3 1 3 多糖的高级结构与生物活性的关系 多糖的高级结构的研究还较少，但许多科学家认为多糖的高级结构对功能的 影响比一级结构重要得多。多糖的特定空间构像是其产生生物学活性所必需的。 多数研究认为生物学活性较强的多糖( 尤其是葡聚糖) ，一般都具有规则的空间构 像。具有三股螺旋结构的葡聚糖大多都具有多糖的免疫活性1 3 。 3 1 4 多糖的溶解度的影响 多糖的溶解度对生物活性的影响也很大。多糖溶于水是其发挥生物学活性的 首要条件，如从茯苓中提取的多糖组分中，不溶于水的组分不具有生物学活性， 水溶性组分则具有突出的抗肿瘤活性。 3 1 5 多糖的分子量的影响 b l a s c h e k ( 1 9 9 2 ) ，f a b t e ( 1 9 8 4 ) ，k o j i m a ( 1 9 8 6 ) 研究发现，分子的大小是多糖 具备生物活性的必要条件，这可能同多糖分子形成的高级构型有关。如分子量为 9 ，0 0 0 左右的右旋糖具有一定活性，其活性随分子量大于和小于此值而迅速降 低。一般来说，把较高分子量的多糖降解为较低的分子量，能显著提高其活性。 多糖分子质量越大，分子体积越大，不利于多糖跨越多重细胞膜障碍进入生物体 内发挥生物学活性。一定的分支度对其活性是必须的，由于分子内氢键作用力， 形成的三股螺旋构象对活性影响极大。因此，要了解多糖的生物活性有必要对多 糖的结构进行分析。 综上所述，多糖的研究不仅是对它的化学结构进行研究，而且更重要的是对 它的构效关系进行研究。多糖的构效关系研究，首先要弄清多糖的溶液性质和其 链构象，而国内对多糖链构象和构效关系的报道很少，尤其溶液中多糖链构象的 研究几乎是空白。因此，目前重要的课题是研究它们的构效关系，从分子水平阐 明其作用与机理，然后用分子修饰【3 l 】来改善它们的生物活性。 3 2 多糖结构的研究方法 到目前为止，已经建立的多糖一级结构分析的方法有化学法( 如酸水解、甲 基化、s m i t h 降解、碱降解、甲基化反应、乙酰解等) 、物理法( 包括高效液相色 谱法、气相色谱法、红外光谱法、核磁共振谱法、质谱分析法等) 3 2 - 3 7 1 。和生物 法( 主要是酶化学方法) 3 8 , 3 9 】。 3 2 1 化学方法h 叫 水解法：将多糖链通过完全水解分解为各个单糖，是分析多糖链组成成分的 主要手段。水解法包括完全酸水解、部分酸水解、乙酰解和甲醇解等。 高碘酸氧化法：高碘酸可以选择性的氧化断裂糖分子中的连二羟基或连三羟 基处，生成相应的多糖醛、甲酸，反应定量的进行。通过测定高碘酸的消耗量和 甲酸的生成量，可以判断糖苷键的位置、连接方式、支链情况和聚合度等结构信 息。 s m i t h 降解：s m i t h 降解是将高碘酸氧化产物还原后进行酸水解或部分酸水 解。由于糖基之间以不同的位置缩合，用高碘酸氧化后则生成不同的产物，经 g c ：分析，由降解产物可以推断糖苷键的位置。 甲基化：甲基化是多糖结构测定中最重要的手段。甲基化反应是将多糖中各 种单糖残基中的游离羟基全部甲基化，将甲基化后的多糖水解，水解后得到的化 合物，其羟基所在的位置即为原来单糖残基的连接点，从不同类型的甲基化单糖 的比例，可以推测出糖链重复单位中各种单糖的数目，末端糖的性质以及分支点 的位置，但是无法获知糖的连接顺序。多糖甲基化的方法较多，有p u r d i e 法、 h a m o r t h 法、m e n z i e s 法、h a k o m o r i 法等【4 1 1 。多糖甲基化完全后，水解成甲基化 单糖，经还原、乙酰化后通过g c 或g c m s 分析，测得的相对保留时间和质谱 的主要碎片与文献值对照，便可分析相邻单糖基的连接方式。 3 2 2 仪器分析方法： 高效液相色谱法( h p l c ) ：h p l c 主要用于对多糖的分离纯化、组成分析、定 量分析、分子量的测定等【4 2 1 。 气相色谱法( g c ) ：g c 用于可挥发的糖类衍生物的分析，对于多糖可以通过 甲醇解的作用，使半缩醛起甲基化反应，生成甲基糖甙，然后通过三甲基硅烷基 化作用生成三甲基硅烷基衍生物，从而用气相色谱分离各组分。进行色谱分析时 每种糖都可以得到单峰 4 3 , 4 4 j 。将衍生化后样品的保留时间与标准单糖的保留时间 相比较，确定单糖的种类，并根掘各组峰面积计算出摩尔比【4 5 1 。 红外光谱法( i r ) ：i r 是分析多糖结构的强有力的工具可以判别多糖的特征 吸收峰。此外，利用红外光谱在3 5 0 0 c m 处有无吸收常用来判断甲基化反应是否 完全【4 6 1 x 射线衍射法( x r d ) 一7 j ：x 一射线衍射法可得到晶体的晶胞参数和晶格常数， 4 再加上立体化学方面的信息包括键角、键长、构型角和计算机模拟，就可以准确 的确定多糖的构型。多糖通常是不能结晶的，但在适宜的条件下，它可以微晶态 存在。所以进行衍射分析的样品必须通过外界的诱导使其中有相当部分呈现微晶 态。 毛细管电泳法( c e ) ：毛细管电泳技术不仅仅是一种分离手段，还可用于寡糖 链的纯度和结构分析，又可对寡糖的酶解产物进行定性和定量分析，从而得到寡 糖链的完整结构。 核磁共振方法州m r ) 【4 8 】：一维n m r 谱可得到整体结构信息可以用来确定 糖残基的相对数量，糖链的连接位置，某些单糖种类及异头碳的构型，二维n m r 谱则能给出相关碳氢连接方式方面的信息。 气质联用( g c 。m s ) t 4 9 】：气相色谱与质谱联用可以得到有关单糖残基类型、链 的连接方式、糖的序列和糖环形式、聚合度等多种结构信息。 快原子轰击质谱( f a b m s ) ：f a b m s 是一种软电质谱技术。f a b m s 适合 于分析极性大、难挥发、热不稳定的样品。在快原子轰击过程中，样品通过正离 子方式增加一个质子或阳离子，或通过负离子方式失去一个质子产生准分子离子 作为谱图的主要信号，并给出反映连接顺序等信息的碎片。因此f a b m s 可用来 测定寡糖链的分子量。 原子力显微镜( a f m ) ：a f m 用很尖的探针扫描待测样品表面。探针附在一 根可活动的微悬臂的底端上，当探针与样品接触时，产生的微小作用力引起微悬 臂的偏转，通过光电检测系统对微悬臂的偏转进行检测和放大，信号经过转换可 得到样品的三维立体图像 5 0 , 5 1 】。探针是其核心部件，为了克服当样品的尺寸大小 与探针的尖端曲率半径相当或更小时，会出现所谓的“加宽效应”，可使用尖端 更尖的探针，或者对探针进行生物或者化学修饰。 3 2 3 酶学方法 酶学方法主要用于糖链结构的分析，其最大优势在于酶解的高度专一性和放 射性标记方法的引入。试剂阵列分析方法是将酶解方法的操作简化为只要将纯化 的多糖样品等分为几个试样，再将每个试样与某各种精确设定的外切糖苷酶混合 物保温酶解，合并每次酶水解的产物，再对产物库进行一次凝胶渗透色谱分离， 把分离图谱与计算机数据库中的图谱进行对照即可确定结构。 3 2 4 免疫学方法 抗原和抗体会相互结合，一定结构的多糖( 寡糖) 会抑制抗体一抗原的相互结 合，不同的多糖( 半抗原) 有不同的抑制常数。当某种未知结构的糖链对抗原和抗 体的结合产生了抑制，通过测定其抑制常数，再与已知结构的糖链相比较，有相 近抑制常数的多糖，其结构也相似，这就是利用免疫方法分析糖链结构的原理。 4 香菇的研究现状及重要意义 香菇( l e n t i u se d o d e s ) 为担子菌纲伞形科真菌，是世界上第2 大食用斟北j 。中 医理论认为香菇具有多种功效。我国早在明朝便将其作为药物使用，可以治疗伤 寒、天花、溃疡、便秘、痛风和低血压等。香菇多糖是香菇中最重要的一种生物 活性物质，作为一种免疫促进剂，在2 0 世纪6 0 年代已引起人们广泛的兴趣1 9 6 8 年日本人千原吴郎首先利用热水从香菇子实体中浸提出6 种胞外l n t ，其中二 种有明显抗肿瘤作用，测试表明其平均分子量为1 0 0 万，是一种带分支侧链的b 葡聚糖结构，并定商品名为l e n t i n a n ，l9 7 0 年c h i h a r d 和s a s a k i 用热水浸提结合有 机溶剂沉淀从香菇种提取到另外4 种多糖8 0 年代以来，l n t 的研究更为深入和 多元化由于同本人枸二在1 9 8 0 年证实l n t 是一种广谱免疫促进剂，l n t 研究 就大量转向了药理和临床实验。 现代研究表明：香菇多糖具有抗病毒、抗肿瘤，调节免疫力、降血糖、抗氧 化等功能 5 3 , 5 4 】。与传统中草药相比，香菇多糖通过增强机体免疫力间接杀死肿瘤 细胞，因而毒副作用极j , 、 5 5 , 5 6 】。在临床上香菇多糖主要用于抑制和防止胃癌、鼻 咽癌、直肠癌、乳腺癌和慢性粒细胞病的术后微转移【5 1 m 引。多糖生物活性的挥发 与其结构有关，化学基团的引人也常常会增强多糖的活性或使多糖产乍新的活 性，囚而对多糖结构进行适当修饰是多糖研究领域的重点之一【6 1 , 6 2 。有关香菇多 糖的研究，特别是结构方面的研究已引起国内外学者的高度关注，并有望成为多 糖领域的研究热点。 香菇多糖具有多种多样的生物功能，而它的化学结构则是其生物活性的基础 6 3 , 6 4 】。研究活性多糖的构效关系，确定何种结构的多糖才具有活性，结构的改变 如何影响多糖活性等问题对活性多糖的筛选工作具有指导意义。 多糖的结构复杂、多样，研究难度大，往往需要多种方法结合起来，才能完 成对多糖结构的测定。目前已明确香菇多糖结构与免疫及抗癌活性关系的只有b 葡聚糖物质【6 5 1 。该物质的一级结构具有b d ( 1 3 ) 连接的吡喃葡聚糖主链，在主 链中葡萄糖的c 6 位上含有支点( 每5 个d 葡萄糖有2 个支点) ，其侧链是由 d d ( 1 6 ) 和p d ( 1 3 ) 链相连的d 葡萄糖聚合体组成，分子量范围在几十万左右。 而其天然物质的空间结构为p 三股绳状螺旋型立体结构1 6 6 ，6 7 j 。 香菇生物活性与结构有着密切的关系 4 1 一级结构与生物活性关系 香菇多糖足以( 1 3 ) 葡聚糖主链结构，具有抗肿瘤作用和提高机体免疫力等多 种生物功能，香菇多糖的组成同样对其生物活性有着重要的影响。t i f f a n y 等【6 8 】 通过多元回归分析法研究了香菇多糖单糖组成及摩尔比对其生物活性的影响。结 果表明：树胶醛醣、木糖、甘露糖和半乳糖以及其摩尔比与香菇多糖生物活性的 发挥有着密切的关系，而葡萄糖尽管是香菇多糖的重要组成部分，但对其生物活 6 性的影响甚小。 4 2 高级结构与生物活性的关系 对香菇多糖生物活性与化学结构关系的深入研究发现：二者不仅是建立在多 糖分子的一级结构基础上，且还与多糖分子的空间构象有关。多糖的特定空间构 象是其产生生物学活性所必需的。天然香菇多糖的空间结构为b 三股绳状螺旋立 体结构，具有生物活性，但用脲或胍处理过的香菇多糖却没有活性，这是由于脲 或胍的作用改变其空间构型而引起的【6 9 】。 4 3 理化性质与生物活性的关系 香菇多糖的理化性质如溶解度、黏度和分子量等对其生物活性有着不同程度 的影响。多糖溶于水是其发挥生物学活性的首要条件，多糖常因分子量大、黏度 高、溶解度低等而影响其应用。分子的大小是多糖具备生物活性的必要条件。1 9 7 6 年t a k u m a s a s a k i 发现不仅大分子量多糖( 1 0 0 万) 具有生物活性，而且一种分子量 为1 6 0 0 0 的小分子香菇多糖也具有抗肿瘤活性。 香菇多糖不仅是一种比较理想的药物，也是一类重要的保健食品功能因子， 具有广阔的应用前景，是当今医药和食品工业共同关注的焦点。随着生化分离技 术和现代分析仪器的逐步完善，香菇多糖的分离纯化技术已经较为成熟。但关于 其结构，特别是高级结构的研究并不深入，极大地影响了香菇多糖构效关系的研 究进程，阻碍了香菇多糖筛选和结构改造的研究工作。结构研究是香菇多糖研究 中的一个重要内容，随着新的分析技术的不断发展和完善，多糖的结构及构效关 系的研究将更加深人，香菇多糖在各个领域的应用将具有广阔的前景。 有关香菇多糖的结构和生物学活性的报道已经很多，但目前主要集中在香菇 中b ( 1 3 ) d 葡聚糖和大分子量的研究上，而关于低分子量香菇多糖的分离纯化 和结构分析报道很少。本实验室香菇多糖的免疫增强作用的研究曾介绍了用不同 剂量的l m w l n t 和o v a 共同对i c r 小鼠进行皮下免疫，以o v a 作为对照组来检测 其免疫增强作用。动物实验结果表明，l m w - l n t 明显的增强了机体的细胞和体液 免疫应答。所以本文研究低分子量香菇多糖的结构，可以结合前面生物活性来分 析，具有重要意义。 本文主要研究的是经过h p l c 鉴定的组分均一的低分子量( 约为7 0 0 0 d a ) 香菇多糖的结构，经过经部分酸水解、高碘酸氧化、s m i t h 降解、甲基化、g c m s 分析、i r 分析等方法，最后推断出其大致的分子结构，从而为更好的研究低分 子量香菇多糖的空间结构、构效关系、及其生物学活性研究奠定了基础。 7 第一章实验方法弟一早头芍亚力 右 1l m w - l n t 的分离纯化 l m w l n t 提取流程图： 香菇( 长春市光复路庆丰大厦) 上( 浸泡过夜，水煮三次，过滤留上清) 香菇提取物 上( 三倍体积9 5 乙醇醇析， 香菇粗多糖c l n t - 1 j ( 反复冻融，9 5 乙醇醇析， 香菇粗多糖c l n t - 2 离心，常规干燥) 离心，常规干燥) 上( 脱蛋白，s e p h a r o s ec l 6 b 柱层析纯化) 低分子量香菇多糖l m w l n t 1 1c - l n t 一1 的提取【7 0 7 l j 将干燥的香菇浸泡过夜，沸水煮提后过滤，重复3 次，合并滤液，浓缩，用 三倍体积9 5 乙醇醇析过夜，离心后常规干燥得香菇粗多糖( c l n t - i ) ，其为棕色 粉末，易溶于水。 1 2l m v c - l n t 的分离纯化 1 2 1 冻融分级 将均匀的5 c l n t - 1 糖液，在一2 0 冷冻过夜，室温缓慢融化，高速离心 ( 1 0 0 0 0 r p m ) ，弃沉淀。重复数次，至基本无沉淀为止，然后将上清液浓缩后用9 5 的乙醇醇析过夜，离心，常规干燥得c l n t - 2 。 1 2 2 脱蛋 7 2 , 7 3 】 5 的c l n t - 2 糖溶液，用英国进口链蛋白酶，按酶：蛋白= 1 ：2 0 0 取蛋白 酶，加入糖溶液中，加少量二甲苯防腐，1 n a c l 作激活剂，3 7 。c ，保温2 4 小 时，按糖液总体积1 4 加入s e v a g e 试剂( 氯仿：正丁醇= 4 ：1 ) ，充分振荡1 2 小时， 静止，离心，取上清重复，至无游离蛋白为止。 1 2 3l m w l n t 纯化1 7 4 】 将脱蛋白后的香菇多糖配成5 糖溶液经s e p h a r o s ec l 6 b ( 2 5 x 9 0 c m ) 柱层 析，酚一硫酸法测多糖分布，收集糖峰洗脱液，流速为1 0 m l 2 0 m i n ，收集第6 1 6 3 管，经浓缩、真空冷冻干燥，最终得灰白色粉末状l m w l n t 。 2 香菇多糖的性质测定 2 1c l n t - 1 的性质测定 2 1 1 总糖含量测定( 酚硫酸法) p 5 】 将1 0 m g 1 0 0 m l c l n t - 1 糖溶液，6 的苯酚溶液，浓h 2 s 0 4 依次按1 ：0 5 ：2 5 的比例加入，振荡，静止，冷却，然后在4 9 0 n m 波长下比色，所得数值查标准 曲线可得总糖含量。 2 1 2 蛋白含量测定( 凯氏定氮法) 准确称取c l n t - 1 糖样1 0 0 m g ，加入5 m l 浓硫酸，加半勺催化剂 ( k 2 s 0 4 ：c a s 0 4 5 h 2 0 = 3 ：1 ) 。明火( 挚石棉网) 加热，变黑后加少许高氯酸( h c l 0 。) ， 继续加热至溶液变浅透明( 淡绿色) ，冷却定容至5 0 m l 。蒸馏，与硼酸反应， 用0 0 0 9 8 4 5nh c i 滴定，通过计算得总蛋白含量。 2 2l m w l n t 均一性和分子量的测定 3 m gl m w - l n t 溶于l m l 纯水中，用超声波处理5 m i n 以使多糖充分溶解， 进行h p l c 分析，测定其均一性和分子量。 3 仪器器分析方法 3 1 高效液相色谱( h p l c ) 仪器：日本s h i m a d z u 公司生产高效液相色谱仪，r i d 1 0 a 视差折射鉴定器， s h i m a d z uc l a ss - v p 工作站 色谱柱：不锈钢色谱柱t s k g 3 0 0 07 8m m ( i d ) 3 0 0 c m ( l ) 柱温：4 0 柱操作压力：1 6 m p a 流动相：硫酸钠溶液 流速：0 5 m l m i n 进样量：2 0 “l 3 2 红外光谱法( i r ) s p e c o r di r 型红光谱仪，样品与k b r 压片，常规方法测定。 3 3 气相色谱法( g c ) 仪器：v a v i a n3 4 0 0 气相色谱仪附f i d 检测器 h p 3 3 6 5 化学工作站 色谱柱：d m 2 3 3 03 0 m 0 3 2 m m 0 2 m 气化：3 0 0 。c检测：3 0 0 。c 9 柱温：1 2 0 。c ( 2 m i n ) 8 。c m i n2 5 0 。c ( 3 0 m i n ) 载气：高纯氮气 3 4 色质联机( g c m s ) 色质联机h p 5 8 9 0 ( i i ) g c h p 5 9 8 8 m s h p s 石英毛细管柱2 5 m x 0 2 2 m m x 0 2 n m 进样口：2 7 0 离子源：2 0 0 。c 程序升温：1 2 0 1 。c m i n 1 4 0 4 香菇多糖的结构测定 4 1 乙酰化 2 0 m g 糖样加入到l m l 的2 m o l l 三氟乙酸1 2 0 条件下处理3 小时，然后放 入6 0 8 0 水浴条件下滴加乙醇以除去剩余的三氟乙酸，用p h 试纸检测至中性； 加0 1 m o l l 碳酸钠l m l ，加l m g 肌醇3 0 c 处理5 0 分钟；加5 0 m gk b h 4 室温下 处理1 5 小时；滴加2 5 乙酸中和至不产生气泡( p h = 6 ) ；加入阳离子交换树脂 ( 大约使其至液面) 除盐处理2 小时，用蒸馏水5 - 6 m l 冲洗过滤( 使用定量滤纸) ， 滴加甲醇除酸至中性；8 5 条件下真空去除水分( 大约2 小时) ；加l m lj 下丙胺 与l m l 无水吡啶5 5 条件下处理3 0 分钟；抽干后加入o 5 m l 无水吡啶与0 5 m l 乙酸酐，9 0 条件下处理1 小时；抽干后加入l m l 无水二氯甲烷，离心后取上清 检测。 4 2 部分酸水解1 7 6 ，7 7 1 称糖样1 2 5 m g 于岛津管内，加2 5 m l 蒸馏水，然后加2 5 m l0 1 m 三氟乙酸 溶液，摇匀，9 5 条件下水解8 小时。降至室温后，离心( 4 0 0 0 f f m i n ，1 0 m i n ) ， 将沉淀干燥，留做g c 分析。上清以蒸馏水透析2 4 小时，将袋外透析液浓缩， 用无水乙醇赶酸至中性( p h 为6 7 ) ，真空干燥，沉淀留做c t c 分析。袋内液浓缩 至5 m l 左右，加5 倍体积无水乙醇，醇沉过夜，离一b ( 4 0 0 0 r m i n ，1 0 m i n ) ，沉淀常 规干燥，作g c 分析。上清浓缩，真空干燥，沉淀留做g c 分析。 4 3 高碘酸氧化和s m i t h 降解1 7 8 , 7 9 l 4 3 1 高碘酸氧化 ( 1 ) 准确称取糖样5 0 m g ，用少量水溶解于5 0 m l 容量瓶中，然后加入3 0 m m o l l n a l 0 4 2 5 m l ，定容，使n a l 0 4 终浓度为1 5 mm o l l 。 ( 2 ) 放置在暗处反应( 室温) ，间隔时间( 0 、6 、1 2 、2 4 、3 6 、4 8 、6 0 小 时) 取样0 1 m l ，用蒸馏水稀释2 5 0 倍，用7 5 4 型分光光度计，以蒸馏水作空白对 1 0 照，在2 2 3 n m 波长处测光密度值，直到光密度值恒定为止。加乙二醇终止反应， 高碘酸氧化完成。 ( 3 ) 而后通过查标准曲线，就可计算出高碘酸的消耗量。 4 3 2 测定 取2 m l 上述氧化液，加l 滴溴甲酚( 红) 紫作指示剂，用0 0 0 4 2 9 2 n n a o h ( 用 邻苯二氢钾标定) 滴定，计算得甲酸生成量。 4 3 3s m i t h 降解 ( 1 ) 将乙二醇处理后的溶液透析，流水2 4 小时，蒸馏水2 4 小时。浓缩，加 入n a b h 4 还原过夜。用5 0 h a c 中和至p h 为6 7 ，透析，流水及蒸馏水各2 4 小时。取1 3 干燥后做g c 分析，剩余部分进行s m i t h 降解。 ( 2 ) 加入等体积的1 mh 2 s 0 4 ，2 5 c 水解4 0 小时，b a c 0 3 中和至p h 为6 ， 用定量滤纸过滤，滤液用蒸馏水透析4 8 小时，袋外部分干燥做g c 分析，袋内 加乙醇醇析，离心，上清及沉淀部分干燥后分别做g c 分析。 4 4 甲基化分析 4 4 1 糖样溶解 称取2 0 m g 彻底干燥糖样，溶于6 m l 二甲亚砜( d m s o ) 中，d m s o 以4 a 分 子筛脱水；充n 2 封管后，4 0 。c 磁力搅拌1 5 小时，至糖样充分溶解为止： 4 4 2n a o h d m s o 混悬液的制备 将2 4 0 m g8 0 目过筛的n a o h ( 5 5 。c 真空干燥) 与6 m ld m s o 在匀浆器中混合， 充n 2 密封，充分研磨，使其成为均匀的混悬液： 4 4 3 甲基化 将第2 步的混悬液加入第1 步的溶液中，充n 2 密封，磁力搅拌1 小时，加 入3 6 m l 碘甲烷，密封，磁力搅拌，准确反应7 分钟，然后加入6 m l 蒸馏水中止 反应，产物用流水透析2 4 小时，蒸馏水透析2 4 小时： 4 4 4 萃取甲基化多糖 将上述反应液浓缩至1 0 m l 左右，加入等体积氯仿，充分振荡3 0 分钟，萃取 甲基化多糖，重复至少三次，将萃取液合并。再用蒸馏水反复洗萃取液至少三次， 然后加无水n a 2 s 0 4 干燥2 4 小时，过滤，3 5 4 0 。c 真空蒸除氯仿至l m l 左右： 4 4 5 红外光谱检查 如图6 ，i r 图谱在3 4 0 0 c m 。处无吸收峰，即无羟基吸收峰，则证明多糖甲 基化完全。否则，重复甲基化，至多糖甲基化完全为止： 4 4 6 水解、还原和乙酰化 ( 1 ) 水解。完全甲基化的多糖真空干燥后，加8 5 甲酸l m l ，充n 2 封管， 1 0 0 水解4 小时，然后加甲醇8 0 。c 蒸除甲酸，至p h 为6 7 ，真空干燥，再加入 2m o l l 三氟乙酸2 m l ，1 0 0 。c 水解6 小时，然后用无水乙醇赶除三氟乙酸至中性， 再用蒸馏水赶除乙醇。 ( 2 ) 还原。加入n a b h 47 0 m g 还原2 4 小时，室温磁力搅拌；然后加入1 匙强 酸型阳离子交换树脂，磁力搅拌2 小时，过滤( 以除树脂) ，向滤液中加入甲醇 蒸除硼酸至中性，真空干燥； ( 3 ) 乙酰化。加乙酐、无水吡啶各o 5 m l ，封管，1 0 0 乙酰化2 小时，然后 移入蒸发皿，再反复加无水乙醇赶除乙酐，然后真空干燥： 4 4 7 样品分析。产物干燥后，用少许氯仿溶解，进行g c 分析及g c m s 分析。 1 2 第二章实验结果与分析 1 c l n t - 1 的分离提取及其性质测定 1 1c l n t - 1 的分离提取 将干燥的香菇浸泡，沸水煮提后过滤，重复3 次，合并滤液，浓缩，用三倍 体积9 7 乙醇醇析过夜，离心后常规干燥得香菇粗多糖c l n t - 1 ，收率为5 1 2 ， c l n t - i 为棕色粉末，易溶于水。 1 2c l n t - i 中总糖含量及蛋白质含量 1 2 1 经苯酚一硫酸法测定，c l n t - 1 中总糖含量6 2 8 。 1 2 2 凯氏定氮法测得c l n t - 1 中蛋白质含量为7 5 4 。 1 3c - l n t - 1 的分子量分布测定 c l n t - 1 窆圣s e p h a r o s ec l 6 b 柱( 1 5 x 9 0 c