（发育生物学专业论文）盐地碱蓬ssprxq基因和拟南芥atprxq基因的进一步功能研究.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 ( 注：如没 有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示谢意。 学位论文作者签名：井壶史 导师签字： 学位论文版权使用授权书 、：l4 乏 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本 人授权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密 后适用本授权书) 学位论文作者签名：井立爻 签字目期：2 0 0f 年，月7 日 导师签字广；彳歹 签字日期：2 0 06 年钿7 日 山东师范大学硕士学位论文 盐地碱蓬s s p r xq 基因和拟南芥a t p r xq 基因的进一步功能研究 中文摘要 正常的细胞代谢和许多种胁迫都会使需氧有机体产生活性氧，适量的活性氧 可以作为信号分子控制和调节细胞生长、细胞周期、程序性细胞凋亡、激素信号 传导、生物或非生物的胁迫应答以及发育等生物过程，但过量的活性氧不可避免 的对生物大分子如脂质、蛋白质以及d n a 等造成氧化损伤从而导致细胞受伤或死 亡。因此活性氧必须被控制在适当的水平以维持正常的细胞代谢。 一个有效的抗氧化剂网络系统对于维持细胞的功能是很必要的，尤其是在叶 绿体和线粒体的新陈代谢中。一些代谢物，如谷胱甘肽、抗坏血酸盐；一些酶类， 如超氧化物歧化酶( s o d ) 、抗坏血酸过氧化物酶( a p x ) 、谷胱甘肽过氧化物酶 都是抗氧化剂代谢中研究的很广泛很深入的成分。近来，过氧还蛋白( p r x s ) 被作 为一类新的酶类抗氧化剂被鉴定出来，它们依赖硫氧还蛋白等电子供体还原h 2 0 2 、 烷基过氧化物和过氧亚硝酸盐。过氧还蛋白( p r x s ) 在生物中普遍存在、丰富而且 功能多样。植物中的过氧还蛋白共分为四类：1 - c y sp r x 、2 - c y sp r x 、t y p e i i p r x 以 及p r xq 。其中p r xq 首先从佛甲草( s e d u ml i n e a r ) 中被克隆，与细菌铁蛋白共迁 移蛋白( b c p ) 同源性很高。目前对植物中其它p r x s 基因的分子和生化功能研究 进展迅速，对p r x q 的研究数据则较少。 本实验室从4 0 0 m mn a c l 处理的盐地碱蓬叶片e d n a 文库中克隆到过氧还蛋 白q 基因( s s 胁q ) ，并已经证明了它是一个胁迫相关基因，可以提高拟南芥的 胁迫耐受能力，c h l o r o p l 1 软件分析表明n 末端有6 4 个氨基酸的叶绿体转运肽。 本实验用y f p 荧光融合蛋白进一步分析了s sp r xq 在拟南芥中的亚细胞定位，结 果表明该蛋白定位于叶绿体中，这和用c h l o r o p l 1 软件分析的结果是一致的。为 了更全面了解s sp r xq 蛋白的功能并和拟南芥a tp r xq 蛋白做功能比较，本实验 构建了4 个酵母过量表达载体：p 4 1 6 + s sp r xq ，p 4 2 6 + 函p 腻q ，p 4 1 6 + a tp r xq ， p 4 2 6 + a t p r xq 。分别用n a c l 、k c l 、高温、低温、h 2 0 2 等胁迫条件处理并分析了 过量表达s sp r xq 或4 r 胁q 的酵母，结果表明低拷贝数的载体( p 4 t 6 ) 携带的 a t p r xq 基因更有助于提高酵母的耐逆性。另外，本实验为了利用转录后基因沉默 技术对拟南芥a t p r xq 基因进行沉默研究，构建了该基因的p g s a l 2 5 2 基因沉默 表达载体并利用花浸染法进行了拟南芥的基因转化，通过除草剂筛选获得了彳，尸搿 山东师范大学硕士学位论文 q 基因沉默的拟南芥转化植株，并通过p c r 技术初步鉴定了2 株拟南芥a t p r xq - p g s a l 2 5 2 的转基因植株。这些转化予的进一步分子检测正在进行中。 关键词：& j d 麒q 基因，a t p r x q 基因，亚细胞定位，酵母，基因沉默 分类号：q 7 8 2 山东师范大学硕士学位论文 f u r t h e rf u n c t i o n a ls t u d i e sa b o u ts sp r xqg e n ea n da t p r xqg e n e a b s t r a c t c e l lm e t a b o l i s ma n dm a n ys t r e s s e su n a v o i d a b l yp r o d u c er e a c t i v er e d o xi n t e r m e d i a t e s r o sc a na c ta ss i g n a l sc o n t r o l l i n ga n dr e g u l a t i n gm a n yb i o l o g i c a lp r o c e s s e s ，s u c ha s g r o w t h ，c e l lc y c l e ，p r o g r a m m e dc y c l e ，p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ，h o r m o n es i g n a l i n g ， b i o t i ca n da b i o t i cs t r e s sr e s p o n s e sa n dd e v e l o p m e n t b u te x c e s s i v er o sc a nc a u s e s e r i o u sd a m a g et om a c r o m o l e c u l e ss u c ha sp r o t e i n s ，l i p i d s ，o rn u c l e i ca c i d s ，e v e n t u a l l y l e a d i n gt oe x t e n s i v ec e l li n j u r yo rd e a t h f o rt h i s ，t h er e a c t i v i t yo fo x y g e nh a st ob e c o n t r o l l e dt om a i n t a i nt h ec e l l u l a rm e t a b o l i s mi naf i m c t i o n a ls t a t e a ne f f i c i e n ta n t i o x i d a n tn e t w o r ki se s s e n t i a lf o rt h em a i n t e n a n c eo fc e l lf i m c t i o n s ， p a r t i c u l a r l yi nt h ec o n t e x to fm i t o c h o n d r i a la n dc h l o r o p l a s tm e t a b o l i s m m e t a b o l i t e s s u c ha sg l u t a t h i o n ea n da s e o r b a t ea n de n z y m e ss u c ha ss u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) ， a s c o r b a t ep e r o x i d a s e ( a p x ) a n dg l u t a t h i o n ep e r o x i d a s ea r ea c k n o w l e d g e de l e m e n t so f a n t i o x i d a n tm e t a b o l i s m r e c e n t l y , p e r o x i r e d o x i n s ( p r x s ) h a v eb e e ni d e n t i f i e da san e w c l a s so f e n z y m a t i ca n t i o 对d a n t s t h e yf u n c t i o ni nt h i o l d e p e n d e n tr e d u c t i o no f h y d r o g e n p e r o x i d e ( h 2 0 2 ) ，a l k y lh y d r o p e r o x i d e sa n dp e r o x y n i t r i t e p e r o x i r e d o x i n sa r eu b i q u i t o u s ， a b u n d a n ta n dv e r s a t i l e w i t h i nt h ep l a n tp e r o x i r e d o x i n s ，f o u rc l u s t e r so fr e l a t e dp r o t e i n s a r ed i s t i n g u i s h e d ：1 - c y sp r x ，2 - c y sp r x ，t y p ei ip r xa n dp r xq p r xq ，a sr e p r e s e n t a t i v e o ft h ef o u r t hs u b g r o u p ，w a si d e n t i f i e di n i t i a l l yi ns e d u ml i n e a ra sah o m o l o g u eo f e s c h e r i c h i sc o l ib a c t e r i o f e r r i t i nc o - m i g r a t o r yp r o t e i n c p ) a l t h o u g h ，t h em o l e c u l a r a n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i z a t i o no f p r x sg e n e si np l a n t si sa d v a n c i n gr a p i f l y ，h o w e v e r , d a t ao nt h ep r xqi np l a n t ss t i l lr e m a i ns c a r c e o u rl a b o r a t o r yc l o n e dap e r o x i r e d o x i nqg e n ef r o ma4 0 0 r a mn a c l - t r e a t e de d n a l i b r a r yo fs u a e d as a l s al a n dp r o v e dt h a tt h i sg e n ew a sas t r e s sr e s p o n s eg e n ea n dh a d a ni m p o r t a n tr o l ei ni m p r o v i n gs t r e s s e st o l e r a n c eo f a r a b i d o p s i s h e r e ，w ea n a l y z e dt h e s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o no fs s p r x q g e n eb yt r a n s g e m ca r a b i d o p s i se x p r e s s i n g s s p r x q - p y f ro u rr e s u l t sp r o v e dt h es s p r x qp r o t e i nl o c a l i z e si nc h l o r o p l a s t ，w h i c hi s c o n s i s t e n tw i t hp r o g r a mc h l o r o p l 1a n a l y s i sr e s u l t ：t h a tt h en - t e r m i n u s6 4a m i n oa c i d s c o n s t i t u t et h ec h l o r o p l a s tt r a n s i tp e p t i d e f o rf u r t h e rf u n c t i o n a ls t u d ya b o u ts sp r xq 3 山东师j 范大学硕上学也论文 p r o t e i na n d af u n c t i o n a lc o m p a r i s o nw i t ha tp r xqp r o t e i n ，w ec o n s t r u c t e df o u ry e a s t v e c t o r s ：p 4 1 6 - s sp r xo ，p 4 2 6 + s sp r xq ，p 4 1 6 + a tp r xq p 4 2 6 + a tp r xq w e a n a l y z e dy e a s t so v e r e x p r e s s i n gs sp r xog e n e so ra tp r xog e n e su n d e rn a c i ，k c i ， g ht e m p e r a t u r e ，l o wt e m p e r a t u r e ，h 2 0 2c o n d i t i o n s ，a n dt h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a ta t p r xq g e n e sc a r r i e db yl o wc o p i e dv e c t o r ( p 4 16 ) m o r ei m p r o v e ds t r e s s e st o l e r a n c eo f y e a s t i na d d i t i o n ，r n a io f a tj d 联qi na r a b i d o p s i sh a v eb e e nc a r r i e do nb yu s i n gt h e t e c h n i q u eo fp o s t - t r a n s c f i p t i o n a lg e n e s i l e n c et p t g s ) r n a iv e c t o ra tp r xq p g s a 12 5 2w a sc o n s t r u c t e d ，t h e nt h ev e c t o rw a si n t r o d u c e di n t oa r a b i d o p s i sb yt l o r a l d i p p i n gm e t h o d t r a n s f o n n a n t sw e r e s c r e e n e db yu s i n gh e r b i c i d ef i n a l ea n dh a v e g o t t e nb a s t a r e s i s t a n c ep l a n t so ft h eg e n es i l e n c eo fp r xqi na r a b i d o p s i s t w oo f b a s t a r e s i s t a n c ep l a n t so ft h eg e n es i l e n c eo fp r xqh a v eb e e nc o n f i r m e db yp c r t h e f u r t h e rm o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o no ft h e s eb a s r a r e s i s t a n c ep l a n t si sg o i n go i l k e yw o r d s ：s sp r xqg e n e ，a tp r xqg e n e ，s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n ，y e a s t ，g e n e s i l e n c i n g c a t e g o r y ：q 7 8 4 山东师范大学硕士学位论文 第一部分文献综述 一、植物过氧还蛋白研究进展 需氧有机体在正常的细胞代谫f 中由于分子氧的不完全还原就形成超氧化物自 由基、过氧化氢、羟基自由基等形式的活性氧，在胁迫条件下活性氧的产生更是 会加剧。适量的活性氧可以作为信号分子控制和调节细胞生长、细胞周期、程序 性细胞凋亡、激素信号传导、生物或非生物的胁迫应答以及发育等生物过程【1 一，但 过量的活性氧不可避免的对生物大分子如脂质、蛋白质以及d n a 等造成氧化损伤 从而导致细胞受伤或死亡f 3 】。因此活性氧必须被控制在适当的水平以维持正常的细 胞代谢。 一个有效的抗氧化剂网络系统对于维持细胞的功能是很必要的，尤其是在叶 绿体和线粒体的新陈代谢中1 4 】。一些代谢物，如谷胱甘肽、抗坏血酸盐；一些酶类， 如超氧化物歧化酶( s o d ) 、抗坏血酸过氧化物酶( a p x ) 、谷胱甘肽过氧化物酶 都是抗氧化剂代谢中研究的很广泛很深入的成分。近来，过氧还蛋白( p r x s ) 被作 为一类新的酶类抗氧化剂被鉴定出来，它们依赖硫氧还蛋白等电子供体还原h 2 0 2 、 烷基过氧化物和过氧亚硝酸盐。过氧还蛋白( p r x s ) 在生物中普遍存在、丰富而且 功能多样，与其它的过氧化物酶不同，它缺少催化反应通常所需的含金属离子的 辅基，而具有1 2 个保守的c y s 可以替代金属离子辅基的功能，参与体内各种过 氧化物的清除反应【5 】。根据保守的c y s 的数目、结构和电子供体，植物中的过氧还 蛋白可分为四类：1 - c y sp r x 、2 - c y sp r x 、t y p e i i p r x 以及p r xq 。以下概括了植物 中过氧还蛋白的研究进展。 1 植物中的过氧还蛋自家族 植物中所有的过氧还蛋白都由核基因编码，系统发生分析表明2 - c y sp r x 、 p r x q 、卜c y sp r x 相关性强，而p r xi i 是独立进化的【6 】。拟南芥的过氧还蛋白家族 共包含十个开放读码框，至少有8 个表达【7 1 。其中1 - c y sp r x 位于细胞核中，2 - c y s p r x a 、2 - c y s p r x b 、t y p e i i p r x e 、p r x q 位于叶绿体中，t y p e l i p r x b 、t y p e i i p r x c 、t y p e i i p r xd 位于细胞质中，t y p e i i p r xf 位于线粒体中，t y p e i i p r xa 可能为 假基因。下面我们分别讨论植物中的四类过氧还蛋白的功能特征及研究情况。 山东师范大学硕士学位论文 1 11 c v sp r x 卜c y sp r x 仅含有一个保守的c y s ，与过氧化物反应形成次磺酸，然后由还原 性分子直接再生c y s 8 1 。大麦，一c y s 胁是植物中首先被鉴定的厅船，称为p e r l ， 是一种l e a 基因。开始认为它的功能是作为休眠调节予和抗氧化剂，在种子的晚 期发育和早期的吸胀吸水过程中保护胚和糊粉层细胞免受氧化损伤1 9 。2 0 0 0 年， l e e 等人在烟草中过量表达水稻p e r l ，与对照植株相比发现其萌发效率相似，而 抗氧化能力显著增加，表明其主要是作为抗氧化剂起作用1 0 l 。2 0 0 2 年，m o w l a 等 在南非的一种“复苏”植物x e r o p h y t av f s c o s ab a k e r 中分离了x v p e r l ，与以前 的1 - c y s 胁只在种子中表达不同，z 慨r ，还可在脱水、热激、高光强、a b a 、 n a c l 等非生物胁迫下在营养组织中表达【l l l 。2 0 0 3 年c a m i l l a 等通过在拟南芥中过 量表达大麦l - c y s 胁以及反义抑制和r n a i 技术证实卜c y sp r x 与休眠无关，而 是感受外部环境，抑制种子在不良环境中的萌发1 2 】。大部分植物的卜c y sp r x 都 定位于细胞核表明它在保护i ) n a 以及核转录机制中发挥作用。 1 2 2 一c y sp r x 2 - c y sp r x 通过首尾排列形成同源二聚体起作用，以a t 一2 一c y sp r x 为例，一个 亚基的3 6 位c y s 与另外一亚基的1 5 8 位c y s 形成催化中心，硫氧还蛋白、c d s p 3 2 可作 为电子供体使其二硫键再生。在筛选大麦叶生长区特异表达的基因的过程中，第 一个植物2 一c y sp r x 基因幽s 被克隆，它与细菌h h p c 以及人类和酵母中的硫氧 还蛋白依赖的过氧化物酶t p x 具有很高的序列相似性1 3 】，研究表明大麦2 一c y sp r x 可以互补大肠杆菌a h p c 的缺陷。异源表达的2 一c y sp r x 可以清除h 。0 ：，c m o o h ， t b o o h ，亚油酸过氧化物和磷脂酰胆碱形成的过氧化物，表明它具有广泛的底物特 异性i s , 1 6 l 。拟南芥基因组有两种2 一c y sp r x ，都定位于叶绿体中，拟南芥2 一c y sp r x 的反义突变体表现发育延滞、抗氧化系统状态的改变、叶绿素含量以及光合效率 降低、许多与光合作用相关的蛋白质含量减少【1 7 】，这种现象和许多其它植物的 2 - c y sp r x s 也都定位于叶绿体中的事实说明2 - c y sp r x 在保护光合作用顺利进行中 ： 发挥着重要作用。 1 3t y p e p r x p r x i i 同样含有2 个保守的c y s ，形成分子内二硫键起作用，谷氧还蛋白和硫 氧还蛋白都可做为其电子供体。羧基端7 6 位c y s 的突变导致p t p r xi i 硫氧还蛋 6 山东师范大学硕士学位论文 自依赖的过氧化物酶活性的丢失，但并不影响谷氧还蛋白依赖的过氧化物酶活性。 植物中的p r xi i 首先从b r a s s i c ac a m p e s t r i s 中被鉴定u s ，在对b r a s s i c a e a r a p e s t r i s 花芽c d n a 文库随机测序过程中克隆了如中啊口，在e c o l i 中对屁_ 胁 朋构原核表达研究表明b c p r xi i 可以保护谷氨酰胺合成酶免受氧化失活，并能利 用酵母硫氧还蛋白作为电子供体还原h 2 0 。从杨树p o p u u st r i c h o c a r p a 的木质部 和韧皮部中分离的p t - p r x 脏筛管中特异表达，在体外实验中，p t p r x i i 可以还 原h , o ：，c m 一0 0 t t 和t b o o h 1 9 】。在拟南芥基因组中，有六个基因与b c - p r x 肼日似， 其中4 个在叶中表达【，p r x i i b 和p r x i c 没有明显的定位序列，可能位于细胞质 中，p r x i i b 只被叔丁基过氧化氢所诱导，对抗坏血酸没反应【7 】；p r x i i c 具有最强 的反应活性，稳定状态下其m r n a 水平很低，却能被所有的处理( 高光强、低光强、 抗坏血酸及各种氧化胁迫) 所大量上调；p r xi ie 定位于叶绿体中，它只在绿色组 织中表达而不在根中表达，p r xi ie 在施加抗坏血酸时表达量下降；p r xi if 通过 质谱的方法被证明定位于线粒体p o j ，缺失a t - p r x l l f 的拟南芥在氧化胁迫下根生 长受到抑制，说明a t - p r x l if 在根生长中起着其它还原酶所不能替代的重要作用】； p r xi ie 和f 对叔丁基过氧化氢、h 2 0 ：或肼的处理几乎没反应。 1 4p r xq p r xq 也含有2 个保守的c y s ，活化状态的p r xq 为单体形式，2 个保守的c y s 形成分子内二硫键，可以还原h 2 0 。，c m o o h 和t b o o h ，氧化后的p r xq 只能由硫氧 还蛋白再生。胁p 是胁占家族的新成员，2 0 0 0 年才从佛甲草s e d u ml i n e a r e 中 首次克隆到p r xq 基因，n 一端测序表明该蛋白与大肠杆菌细菌铁蛋白共迁移蛋白 ( b c p ) 具有很高的同源性，被命名为s 1 一p r xq 。缺失b c p 基因的大肠杆菌对c m o o h 和t b o o h 高度敏感，突变体表型可以被异源表达的s 卜p r xq 蛋白所逆转，证明在 体内p r xq 可以作为抗氧化物起作用吲。在用叔丁基过氧化氢、h ：o 。或肼处理拟南 芥叶片时，彳 一胁印表达量大大提高，对h ：o 。的反应尤为强烈【7 】o 植物p r x 口都编 码一个具有n 一端延伸的蛋白质，为叶绿体定位的特异序列。叶绿体中有两类硫氧 还蛋白异构物t r xm 和t r xf 。菠菜p r xq 可以与缺少一个催化c y s 残基的突变 t r xi l l 相互作用，t r xm 可以再生氧化状态的p r xq 】。2 0 0 4 年关于杨树( p o p u u s t r e m u l axp o p u l u st r e m u l o i d e s ) p r xq 的研究对p r xq 作用的分子机制，底 物和电子供体的特异性，体外功能以及细胞定位等方面进一步作了补充凹】：体外 山东师范大学硕士学位论文 实验表明硫氧还蛋白可以作为p t p r xq 有效的电子供体，而谷氧还蛋白不能； p t p r xq 可以还原各种烷基过氧化物，对0 。，c m 一0 0 t t 和t b o o h 有尤其高的催化 效率；免疫化学定位以及绿色荧光融合蛋白的表达把p t - p r xq 定位于叶肉细胞以 及保卫细胞的叶绿体中。另外，杨树p r xq 的表达量在病虫害侵染时升高，可能 在抗病中发挥重要作用【2 4 j 。2 0 0 4 年从盐生植物s u a e d as a l s a 中克隆至0 了s s - p r x q , 研究表明其表达可被n a c l 、甘露醇、低温、h 。0 2 、甲基紫精以及a b a 所诱导【2 ”。s s p r x q 在氧化胁迫下的应答进一步验证了它在叶绿体氧化防御中的作用。在e c o l i 中 对骀舟棚的原核表达研究说明它具有硫氧还蛋白依赖的过氧化物酶活性阱】。 2 p r x s 清除过氧化物的机制 p r x s 与过氧化物的反应分三步进行：氧化，延伸以及基态的再生【2 ”。定点诱 变和晶体结构分析认为，一个c y s 残基与过氧化物反应作为初级催化中心，被氧 化成次磺酸b 6 , 2 7 , 2 s 】，半胱氨酸的次磺酸衍生物能高效地与其它巯基反应形成二硫 键。p r x s 含有一个或两个保守的c y s 残基，在与过氧化物反应中形成单体或二聚 体起作用，其巯基由于保守的精氨酸、苏氨酸和脯氨酸的保护而稳定存在 1 6 , 3 8 】。 在2 - c y sp r x ，p r xo 以及p r xt y p ei i 型的过氧还蛋白中，第二个巯基进攻次磺酸 基团形成二硫键，同时释放出水【2 7 1 。晶体结构分析分别证明了2 - c y sp r x 和人类 p r x t ”ei i 中分子间以及分子内二硫键的形成口7 ，2 8 ，2 9 1 。2 c y s p m 中第二个巯基位于 功能二聚体的另外一个亚基上，非还原性s d s p a g e 可以分离到氧化后形成的共 价连接的二聚体 1 5 , 3 0 l 。在t y p ei ip r x 和p r xq 中，两个c y s 残基都位于同个多 肽分子内，c y s 残基分别间隔2 5 个和5 个氨基酸。二硫键可以通过与硫氧还蛋白 3 1 1 ，谷氧还蛋白以及c y c l o p h i l i n 等电子供体的巯基相互作用再生还原性巯基口7 , 3 2 1 。 实验结果表明，t y p e i ip r x 和谷氧还蛋白、2 - c y sp r x 和硫氧还蛋白以及2 - c y sp r x 和c d s p 3 2 ( 一种干旱诱导的硫氧还蛋白) 之间可以形成二硫键【3 3 , 3 4 , 3 5 。抗坏血酸 过氧化物酶被认为是植物细胞质和基质中h 2 0 2 脱毒的关键酶，对氧化失活高度敏 感【3 6 ，它的活性在干早胁迫中丢失p t 。相反，p r x 的反应很活跃，不依赖于敏感性 的辅因子，可以清除广泛的过氧化物。仅在很高的非生理过氧化物浓度下，催化 的c y s 可以被氧化成次磺酸，p r x 不可逆失活i l “。 8 山东师范大学硕士学位论文 聩荫 的雌斗r h 士 刚 瞄s h 弋 p 孵穗一 黼橱 曦s 一 参翮h s 国 图i t 2 7 过氧还蛋白清除过氧化物的反应机制以及p r x 的再生。 注：p ：p r x 蛋白。x ：含有c y s 的蛋白质，可能与p r x 位于同一多肽链，也可能位于另一多肽 罐中。t ：可以再生p r x 的双巯基蛋白质。 f i g 1g e n e r a l i z e dr e a c t i o nm e c h a n i s mo fp e r o x i r e d o x i n - m e d i a t e dp e r o x i d ed e t o x i f i c a t i o na n d r e g e n e r a t i o no ff u n c t i o n a lp r x p ：p r xp r o t e i ne n v i r o n m e n to f t h ep r i m a r yr e a c t i v ec y sr e s i d u e x ： e n v i r o n m e n to ft h es e c o n dc y sr e s i d u ew h i c hm a yb ep r e s e n ti nt h es a i u ep o l y p e p f i d ec h a i n i tm a y a l s ob el o c a t e di na n o t h e rp o l y p e p t i d e t ：d i t h i o lp r o t e i nf o rr e d u c t i v er e g e n e r a t i o no f p r x 图1 右手分支口7 1 概括了一般的p r x 中介的过氧化物清除的催化反应。但是， 对于1 - c y sp r x ，t y p ei ip r x 和2 ：c y sp r x 的突变形式反应机制需要修改。 1 人类1 - c y sp r x 的晶体结构仅含有一个保守的c y s 残基，与过氧化物反应 形成次磺酸1 8 1 。氧化状态的1 - c y sp r x 在体外可以被还原剂d t t 再生，但是体内还 原剂仍待进步鉴定。它可能是还原酶或是其它一些含有巯基的物质，其c y s 残 基可与次磺酸残基反应形成二硫键并释放水。然后，第二个c y s 残基进攻分子问 二硫键生成分子内二硫键，结果p r x 的功能c y s 残基再生。 2 体外实验中2 - c y sp r x 利用d t t 作为还原剂可能存在与l 相似的机制。而 且，缺少一个c y s 残基的2 - c y s 、p r x 和t y p ei ip r x 失去硫氧还蛋白依赖的活性， 山东师范大学硕士学位论文 仅在d t t 依赖的过氧化物还原中保持活性( 3 9 】。 3 p t p r xi i 接受来自硫氧还蛋白和谷氧还蛋白的电子f 3 4 1 。羧基端7 6 位c y s 的突变导致p t - p r xi i 硫氧还蛋白依赖的活性的丢失，但并不影响谷氧还蛋白依赖 的过氧化物酶活性。 图l 左手分支【2 7 1 描述了修改以后可能的反应机制。 3 p r x s 在植物中的功能 近年来对抗氧化剂重要作用的认识已经发生了根本性的变化，除了它们清除 r o s 的作用，抗氧化剂还参与普遍的植物保护反应，在多种胁迫以及植物发育的 信号转导中发挥着重要作用 4 0 1 。同样，植物p r x s 作为抗氧化剂，也在抗氧化防御 和信号转导中发挥重要作用。 3 1p r x s 保护光合作用的正常进行 植物的p r x 参与一般的抗氧化剂保护反应，但由于它们的亚细胞定位，也在特 定的代谢中起作用。拟南芥基因组的1 0 个p r x 基因中有5 个定位于细胞器，p r x i 定位于线粒体，p r xi i e 、2 - c y sp r x a 、2 - c y sp r x b 和p r xq 定位于叶绿体，在光合作 用中起作用。 拟南芥2 - c y sp r x 的反义突变体表现发育延滞、抗氧化系统状态的改变、叶绿 素含量以及光合效率降低，以及许多光合作用相关的蛋白质含量减少 1 7 】，说明 2 - c y sp r x 在叶绿体抗氧化代谢中的作用不能被其它抗氧化系统例如抗坏血酸过氧 化物酶或谷胱甘肽过氧化物酶所替代。突变体叶绿体蛋白质合成的中断导致光抑 制效应的增加，表明叶绿体蛋白质可以部分缓解光抑制现象 ”】。在2 - c y sp r x 的反 义突变体中抗坏血酸库的氧化状态增加，同时，抗坏血酸过氧化物酶和单脱氢抗 坏血酸还原酶的转录水平以及活性上升，而谷胱甘肽库以及谷胱甘肽代谢相关酶 的动态平衡没有改变4 ”，说明了2 - c y sp r x 在光合生物抗氧化防御中的重要作用， 它缓解了抗坏血酸系统的氧化负担。蓝细菌s y n e c h o c y s t 妇基因组中含有一个单拷 贝2 - c y sp 肛基因。2 - c y sp r x 缺陷的s y n e c h o c y s t i sp c c6 8 3 0 在高光下比野生型生 长缓慢，对低浓度的重金属敏感【42 1 。叶绿体干旱诱导的3 2 k d a 的蛋白质( c d s p 3 2 ) 是氧化状态的2 - c y sp r x 的主要还原剂，c d s p 3 2 共抑制的转基因烟草在低温、高 光、甲基紫精、t b o o h 处理下，对p si i 的光抑制敏斟3 3 】，叶绿素含量的降低， 表明光合膜受到损伤。所有这些发现都证明了2 - c y s p r x 在光合作用中的重要功能。 山东师范大学硕士学位论文 以前描述p r xq 在光合作用中的功能主要基于绿色组织中p r xo 转录物的丰度 和藻青菌中多重mq 基因的存在 4 3 ，州，说n p r xq 在光合作用中的功能在氧化光合 的早期进化中就开始形成。最近，对拟南齐f p r xq 4 氐量表达突变体的研究揭示了p q 在叶中的作用【4 】，p r xq 定位于类囊体膜p s i i 复合物，在植株水平上p r xo 的低量 表达突变体和野生型相比并没有明显的差别。然而，和2 一c y sp r x 反义突变体类似， p r xq 的低量表达突变体对氧化剂的敏感性下降。7 7 k 处，p s i i 对p s i 的荧光率增加， 而且质体和核编码蛋白的转录有所变化，这些都说明出现了补偿p r ) ( q 缺失的调节 机制。很明显，p r x q 在保护光合作用中有和2 c y s p r x 不同的特定功能，它的缺 失引起了代谢的变化，从而引起了相关的补偿反应。这些结果表明p r xq 在保护光 合作用中发挥着特定的功能。 3 2p r x s 在光合w a t e r - w a t e rc y c l e 中的作用 p si 可以通过米勒反应( m e h l e r - t y p er e a c t i o n ) 还原0 2 ，然后s o d 歧化0 2 - 生 成h 2 0 2 ，然后主要由抗坏血酸过氧化物酶清除h 2 0 2 【4 5 1 。p r x s 还原h 2 0 2 是p si 中 清除活性氧的另外机制，组成了光合电子传递过程中替代的w a t e r - w a t e rc y c l e ( 图 2 ) 【4 6 】。电子在p s1 i 受体面传递给0 2 以及由s o d a p x 或s o d p r x 催化的水的生 成也就是w a t e r - w a t e rc y c l e ，它不仅仅是释放有害的r o s 多余电子的传递过程，而 且可以分散过度吸收的激发能放出热量，保护光合电子传递链使之部分氧化免受 光抑制【4 7 1 。缺失2 - c y s 胁基因的蓝细菌s y n e c h o c y s t i s 不能利用h z 0 2 和t b o o h 作 为光合电子传递的电子受体，证明了2 - c y sp r x 在光合w a t e r - w a t e rc y c l e 中的功能 4 8 】 山东师范大学硕士学位论文 图2 t 4 6 - 2 7 12 - c y sp r x 在光合作用w a t e r - w a t e rc y c l e 以及过氧化物清除中的功能。f d ：铁氧还 蛋白；f t r ：铁氧还蛋白一硫氧还蛋白还原酶；l o o h ：脂质过氧化物：p si i i ：光合系统 i ，i f ；t r x ：硫氧还蛋白。 f i g 2f u n c t i o no f2 - c y sp r xi np h o t o s y n t h e t i cw a t e r w a t e rc y c l ea n di nd e t o x i f y i n gp e r o x i d e si n p h o t o s y n t h e s i s f d ，f e r r e d o x i n ；f r t , f d t r x - r e d u c t a s e ；l o o h ，l i p i d h y d r o p e r o x i d e ；p sifi i ， p h o t o s y s t e mi l i ：t r x ，t h i o r e d o x i n 3 3p r x s 在植物细胞信号转导中的作用 r o s 信号是由r o s 的产生和清除来控制的，不同r o s 信号的浓度、存在时间以 及定位由细胞内产生和清除r o s 酶类的相互作用来决定，r o s 水平的变化被不同 的蛋白、酶或受体所接受并调节不同的发育、代谢和保护途径。2 0 0 4 年，m i t t l e r 等总结了拟南芥中的1 5 2 个与r o s 清除和产生相关的基因，它们构成一个基因网 络，其中就包括所有的p r x s _ 【4 9 1 。最近有研究表明a t p r x l if 在氧化还原的内稳态 平衡中起重要作用，a t - p r x l l f 的缺失使许多线粒体和细胞核蛋白的表达量发生极 大变化1 2 ”。最近研究证明c e r e v i s i a ey 7 0 0 菌株中种普遍存在的p r x s t s a l 是 h ：o 。受体并作为氧还作用的传感器把信号传给y a p l 从而激活相关基因的表达【5 。 同时又发现酵母的另一种p s - t p x l 在低h 。0 2 浓度下是p a p i 的上游激活子，激活 后的p a p l 开启特异的抗氧化基因的表达，形成低浓度氧化胁迫下的适应性反应口”。 在哺乳动物细胞中，高水平的p r xi ( 最开始被称作增殖相关基因p a g ) 抑制了转 录因子n f kb ( 肿瘤坏死因子) 的激活5 5 3 1 。与之相似，p 5 3 激活的程序性细胞 2 山东师范大学硕士学位论文 死亡在过量表达p r xv 的细胞中被抑s u 5 4 s s l 。而且2 - c y sp r x 的表达水平和聚集状 态与n f kb 通路被激活的倾向负相关【5 6 】。尽管在植物中缺少相关的证据，但植物 p r x 也可能在激活或抑制信号转导通路中具有相似的功能。我们已经知道h 2 0 2 在 调节基因表达中发挥重要作用，脂质过氧化物可以作为合成包括茉莉酮酸在内的 信号分子的底物，在植物发育和胁迫适应中发挥作用 5 刀。p r x 的活性会影响这些信 号转导通路的进行【5 ”。另一方面，由于p r x 对过氧化物有很高的亲和力，p r x 也可 能作为过氧化物的“感受器”。当过氧化物的浓度升高时，p r x 通过氧还反应氧化 其它的调节成分例如t r x 、g r x 和c y c l o p h i l i n s ( c y p ) 等，进而影响这些蛋白的下游 通路。有趣的是，氧化失活的2 - c y sp r x 其c y s 一6 4 变成半胱次磺酸，附着到类囊体 膜上【l 。c y s 的过度氧化阻止了二硫键的形成以及构象的变化，减少了还原状态的 2 - c y sp r x 。因此，2 - c y sp r x 可以作为叶绿体中氧化胁迫的信号。在对p r x q 的功 能缺失突变体研究