（微生物与生化药学专业论文）霞水母中胶原蛋白的分离及生理活性初探.pdf

摘要摘要霞水母是严重威胁我国渤海和黄海北部的渔业生态资源的一种海洋生态灾害物种，霞水母爆发与赤潮并列为我国海洋生态的两大灾难。为了解决霞水母爆发对我国海洋生态环境的灾难性影响，急需进行霞水母的资源化利用方面的研究，以便增加其附加值，提高渔民的捕捞积极性，确保霞水母的捕捞死亡率大于其自然增长率，逐渐消除其对海洋生态环境的影响。然而，迄今为止，有关霞水母的资源化利用方面的研究尚属空白，国内外迄今未见任何相关报道。胶原蛋白作为细胞外基质中起支持作用的主要成分，具有“g l y x y 的特异性氨基酸组成和螺旋结构，因其还具有抗原性低、可生物降解性强、生物相容性好等优点，故在生物学、医学、食品科学和美容业等领域中具有巨大的研究开发潜力和广阔的应用前景。国内外对胶原蛋白的分离制备主要以哺乳动物皮肤、软骨以及鱼类皮肤等组织为原料，对其研究主要集中在分离制备和生物材料领域的开发应用方面。到目前为止，对腔肠动物胶原蛋白的研究尚较少，霞水母来源胶原蛋白的分离纯化及其生理活性方面的研究迄今国内外未见任何报道。为了实现霞水母的资源化开发利用，本文在国内外首次就霞水母中含有的胶原蛋白进行了研究，建立了霞水母胶原蛋白的分离制备和纯化方法，并就其是否对类风湿性关节炎的预防和治疗具有生物活性进行了探索性研究，为将霞水母中所含胶原蛋白作为天然海洋胶原蛋白资源加以开发利用，运用环境经济理念，消除这一海洋生态灾难，提供了工作基础和实验依据。本文用酶法从霞水母中提取得到了胶原蛋白。根据聚丙烯酰胺凝胶电泳、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱推测霞水母胶原蛋白可能是由三条分子大小在6 6 2k d a 1 1 6k d a之间不同亚基组成的三聚体。样品中蛋白质含量为9 8 o 。本实验所测得胶原蛋白的羟脯氨酸含量为1 0 5 4 ，而糖无检出，表明胶原蛋白纯度较高。急性毒性试验表明，。在剂量为1 5 0 0 0m g k g 霞水母胶原蛋白的情况下，未出现小鼠死亡，也未有明显毒性反应。本实验对霞水母胶原蛋白口服治疗大鼠佐剂型关节炎进行了初步探索。发现口服霞水母胶原蛋白可有效减轻a a 大鼠的关节肿胀度，显著降低a a 大鼠血清m d a 、n o 水平，提高血清s o d 的活性。通过这些指标，可以推测胶原蛋白对大鼠佐剂型关节炎可能有一定的治疗效果。关键词：霞水母；胶原蛋白；提取；佐剂型关节炎a b s t r a c ta b s t r a c tc y a n e an o z a k i fi sak i n do fh a r m f u li e l l y f i s hf o rm a r i n ee c o s y s t e mw h i c hb l o o mo u ti nt h eb o h a is e aa n dn o r t h e r ny e l l o ws e ao fc h i n a i nf a c t ，t h ei e l l y f i s hb l o o ma n dh a r m f u la l g a lb l o o ma r et o pt w oe c o l o g i c a ld i s a s t e ro fc h i n e s em a r i n ee c o s y s t e m ，t h r e a t e n i n gt h ef i s h e r yi n d u s t r y i no r d e rt oe l i m i n a t et h r e a t e no fje l l y f i s hb l o o mo nt h em a r i n ef i s h e r yi n d u s t r yo fo u rc o u n t r y i ti sd e s i d e r a t e dt ou n d e r t a k et h eb a s i cr e s e a r c ha b o u th o wt ou s ei ta sak i n do fn e wm a r i n er e s o u r c e f r o mt h ee n v i r o n m e n t a le c o n o m i cp o i n to fv i e w , i ti st h eb e s ts o l u t i o nt r yt of i n dt h ew a yt ou t i l i z ei t a b o u th o wt ou s ei ta sak i n do fr e s o u r c e ，h o w e v e r ,w ek n o wn o t h i n g n o t h i n gh a sb e e nr e p o r t e da b o u tt h eb a s i ck n o w l e d g ea n di n f o r m a t i o na b o u tb a s i cc o m p o n e n t s ，a sw e l la st h e i rf u n c t i o nu pt on o w c o l l a g e ni sam a j o rc o m p o n e n to fe x t r a c e l l u l a rm a t r i x ( e c m ) ，a n dh a sau n i q u et h r e e d i m e n s i o n a ls t r u c t u r ew i t hau n i q u ea m i n oa c i dc o m p o s i t i o n o w i n gt ow o n d e r f u lp r o p e r t i e so fi t sl o w - a n t i g e n i c i t y , e a s y b i o d e g r a d a b i l i t ya n de x c e l l e n tb i o c o m p a t i b i l i t y ,c o l l a g e ni su s e dm o r ea n dm o r ew i d e l yi na r e a so fb i o l o g i c a lm a t e r i a ld e v e l o p m e n t ，f o o di n d u s t r y , c o s m e t i cm a n u f a c t u r e ，a n dm e d i c a lp r o d u c t i o na sw e l l r e c e n t l y , t h e r eh a v eb e e nm a n yi n t e r e s t si ne s t a b l i s h i n ge f f i c i e n tt e c h n i q u e st oi s o l a t ec o l l a g e nf r o ms k i no ff i s h ，a n ds k i n ，c a r t i l a g ea n ds o o nf r o mm a m m a l s ，a n dt oa p p l yt h e mi nd e v e l o p m e n to fv a r i o u sk i n d so fb i o l o g i c a lm a t e r i a l s h o w e v e r , t h e r eh a sb e e nn or e p o r ta b o u tt h ec o l l a g e nf r o mt h ec y a n e an o z a k i i ，a sw e l la si t sb i o l o g i c a lf u n c t i o n so na d j u v a n ta r t h r i t i st r e a t m e n t f o rt h ef i r s tt i m e ，t h ec o l l a g e nf r o mc y a n e an o z a k i ih a sb e e ni n v e s t i g a t e dc o m p r e h e n s i v e l y t h ei s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o nm e t h o d sh a v eb e e ne s t a b l i s h e d ，a n dt h ep o t e n t i a lp h y s i o l o g i ca c t i v i t yo ft h ec o l l a g e nf r o mc y a n e an o z a k i io nt h ep r e v e n t i o na n dt r e a t i n go fa d j u v a n ta r t h r i t i sh a sa l s ob e e ne x p l o r e d t h ed a t aa n dr e s u l t sc o l l e c t e da n dr e c o r d e do nt h i st h e s i sc a nb eu s e da st h eb a s i ci n f o r m a t i o nf o rt h ef u r t h e rr e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n to fc y a n e an o z a k i i ，a sak i n do fn e wm a r i n ec o n l l a g e nr e s o u r c e s 1 1 1 ec o l l a g e nf r o mc y a n e an o z a k i ih a sb e e ne x t r a c t e db ye n z y m a t i cm e t h o d t h ec o l l a g e ns a m p l eo b t a i n e dw a se x a m i n e db yp a g ea n ds d s - p a g e ，w h i c hi n d i c a t et h a tc o l l a g e nf r o mc y a n e an o z a k i im a yh a v et h ec h a i nc o m p o s i t i o no fah e t e r o t r i m e ra n dt h es u b u n i t sw e i g h e df r o m6 6 2k d at o1 l6k d a r e s p e c t i v e l y , t h ep e r c e n t a g eo fh y d r o x y l - p r o l i n ei nt h ec o l l a g e na f t e rp u r i f i c a t i o nw a s10 5 4 ，t h ec o n c e n t r a t i o no ft h ep r o t e i nw a s9 8 o a n dt h ec o n c e n t r a t i o no ft h ep o l y s a c c h a r i d ew a sn od e t e c t i o n n l ea c u t et o x i c i t ye x p e r i m e n ts h o w e dt h a ti n j e c t i n gb i gd o s e ，m i c ed i d n td i ea n dh a d n to b v i o u st o x i c i t yr e a c t i o n i naw o r d ，t h ec o l l a g e nf r o mc y a n e an o z a k i ih a sn ot o x i c i t y , w h i c hs e c u r i t yd o s ew a s15 0 0 0m g k g i nt h i ss t u d y ，t h e r a p e u t i ce f f e c to fc y a n e an o z a k i ic o l l a g e nb yo r a la d m i n i s t r a t i o no na d j u v a n ta r t h r i t i s i nr a t sw a si n i t i a t o r ye x p l o r e d c y a n e an o z a k i ic o l l a g e na td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o nc o u l da m e l i o r a t et h ea d j u v a n ti n d u c e da r t h r i t i s ，s u p p r e s st h ec o n c e n t r a t i o n so fn oa n dm d ai nt h eb l o o ds e r u ma n di n c r e a s et h ea c t i v i t yo fs o di nt h eb l o o ds e r u m f r o mt h e s ei n d e x e sc a np r e s u m et h a t , c y a n e an o z a k i ic o l l a g e ni sp r o b a b l ya m e l i o r a t i n gt h ei ia b s t r a c ta d j u v a n ti n d u c e da r t h r i t i s 。k e y w o r d s ：c y a n e an o z a k i i ，c o l l a g e n ，e x t r a c t ，a d j u v a n ta r t h r i t i s独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。期：2o 。p q 太关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后也遵守此规定。签名：主丝查盔导师签名：日期：第一章绪论第一章绪论弟一早珀w1 1 霞水母概述1 1 1 霞水母的形态特征和生物学特性霞水母为属名统称，属学名c y a n e a ，属腔肠动物f - ( c o e l e n t e r a t a ) 钵水母纲( s c y p h o z o a )旗口水母目( s e m a e o s t o m e a e ) ，霞水母科( c y a n e i d a e ) ，为大型海洋浮游生物。我国沿海已发现白色霞水母、发形霞水母、棕色霞水母和紫色霞水母四种，其中以白色霞水母数量最多、分布范围最广，其成体伞径可达5 0 1 0 0c m 。霞水母体色乳白或微带淡褐，伞体呈扁平圆盘状，中央略为隆起，具有刺丝胞所成的颗粒体，边缘有8 个缘瓣，每个缘瓣又平分为二，感觉器位于小瓣之间。在伞体的下面有排列规则的肌肉束，数量与个体大小成正比；触手中空、多而细长；口腕宽阔、扁平，以多种海洋游泳生物幼体和小型浮游生物为饵【l 】。见图1 1 所示。图1 1 霞水母f i g 1 1c y a n e an o z a k i i霞水母生殖腺发达，发育过程中没有水螅体阶段，繁殖能力强，生长速度极快。由于其运动能力很弱，故多半随波逐流，受潮汐、风向、海流的影响，也可飘到外海生活，我国辽宁、江苏、浙江、福建、广东沿海均有分布，其中以江浙沿海分布范围最广。鲜活霞水母的i s l 柄、肩板和丝状附属物带有毒素。每年春末夏初，沿海水温增高，雨量充沛，浮游生物大量繁殖，为霞水母繁殖、生长提供了基础饵料。霞水母的幼体在5 月开始萌发。进入7 月后，海洋表层水温达到2 4 2 6 时霞水母便大量出现于近岸海域，其繁殖、生长过程中分泌大量毒素，大片海域海水遭受严重污染，造成大量的海洋生物、微生物死亡，渔业生态环境遭到严重破坏【2 j 。江南大学硕士学位论文1 1 2 霞水母的危害霞水母己成为危及海洋渔业资源的危险杀手。每年6 月1 0 月，霞水母繁殖、生长过程中分泌大量毒素，因此在这段时间，往往海水遭到污染，海洋生物资源遭到严重破坏。近二、三年来，东海、黄海近海海面出现大规模霞水母，其分布范围之光，数量之大，时间之长，在历史上也属于罕见。国家为了保护渔业资源，每年6 月1 5 同9 月1 5日对东海、黄海实施休渔期3 个月，这期间正是霞水母繁殖、生长的最佳时期。5 月底只有水珠大小的霞水母幼体，到9 月底能生长到0 。5m 2 _ 1m 2 平方米成蛰。由于霞水母繁殖能力极强，生长速度极快，在不长的时间内，就能蔓延、覆盖东、黄海大片海区，使大片海域的海水遭受严重污染，造成大量的海洋生物死亡，即使幸存下来的中上层鱼类为了生存，也纷纷逃离渔场，向安全区域转移，使鱼类的生长、繁殖、索饵失去了生存环境，鱼类产卵群体进入渔场数量减少，造成海洋渔业资源枯竭，渔汛期难以形成，海洋捕捞产量严重下降，渔民深受其害。1 9 9 7 年1 9 9 8 年，南黄海连续两年霞水母暴发，吕四渔场、大沙渔场、长江口渔场以及周边渔场海洋捕捞产量大幅度减产、减收。当地渔民说，在一定气候条件下，如果没有风暴袭击破坏霞水母幼体，来年近海渔业资源势将要遭受灾难。近- - = 年中渔业资源急剧衰退，果然是由于捕捞强度过大，但很重要的原因是霞水母对海洋造成的污染所致。霞水母的大量繁殖、生长所带来的危害，已经远远超过了近年来近海赤潮所造成的危害。如果对霞水母不能进行有效的遏制，海洋渔业资源将得不到有效的保护，不仅使海洋渔业资源长期不能复苏，甚至产生更为严重的后果。霞水母旺发区，一般水色发红，渔民称其为“麻蜇水”，有毒害性，鱼虾类一旦进入，常被麻醉，以至受害、死亡，对渔业资源十分有害。据有关专家初步估算，霞水母的大量繁殖、生长所带来的危害已远远超过赤潮，如果不能对霞水母进行有效扼制，海洋生态环境将得不到有效保护，海洋渔业资源也难以复苏，由此将产生长期的、多方面的生态灾难。因此，规模开发利用霞水母资源具有社会效益、经济效益、海洋环境效益和渔业资源生态效益一举四得之划3 1 。1 1 3 霞水母的利用霞水母沿海分布，数量较大，尤其海蜇资源衰退以来，霞水母成为大型水母的优势种，资源相当丰富。目前根治霞水母尚无好的办法。传统的方法：一是等待大风暴袭击，在海浪冲击下，霞水母破碎后自然死亡：二是采用专用网具，通过捕捞来减少它的数量，控制其蔓延发展的速度。1 9 8 5 年东山渔民成功地将霞水母加工成“海蜇皮”推向市场以后，霞水母逐步得到开发，渔获量逐年上升。然而，由于霞水母加工的“海蜇皮”产量也受到市场因素而减少，其产量的下降并不是资源的变化，主要是销量不大。此外，霞水母作为一种大型水母，虽然可加工食用，但由于它的中胶层薄、含水量很高，手工加工霞水母费时费工费料、出品率低、质量差、价格低、经济效益差，渔民将其作为一种产品进行开发的经济效益难以体现，因此，霞水母作为海洋生物资源至今尚未得到有效的开发利用。若加工工艺上有新的突破，受到广大消费者青睐，霞水母的开发将成为沿2第一章绪论海渔业经济一个新的增长点【4 】。1 2 胶原蛋白1 2 1 胶原蛋白的分子结构胶原蛋白是哺乳动物提内含量最多的蛋白质，占蛋白质总量的2 5 - - 3 0 ，相当于体重的6 。胶原蛋白的英文名c o l l a g e n ，源自希腊文，意思是“生成胶的产物 ，大约引用在1 8 6 5 年。1 8 9 3 年的牛津大辞典给c o l l a g e n 的定义是“结缔组织的组成成分，煮沸时产生胶质”。显然这是胶原蛋白的热变性产物。以后，随着生物化学的进展，g r o s s ( 1 9 5 6 ) 首先命名构建胶原纤维的蛋白质单体为t r o p o c o l l a g e n ( 原胶原) 。现今胶原蛋白的科学定义是：“细胞外基质( e c m ) 的结构蛋白质，分子中至少应有一个结构域具有a链组成的三股螺旋构象( 即胶原域) ”。胶原域的氨基酸序列中有g l y x y 重复三联体。富含亚氨基酸，x 位多为脯氨酸，y 位多为羟脯氨酸。胶原分子在e c m 中聚集为超分子结构5 1 。胶原蛋白结构是一种右手型的超螺旋结构，螺距为8 6n n l ，每圈包含3 0 个残基。其中每一股螺旋又是一种特殊的左手螺旋，螺距为9 5n n l ，每一圈含3 3 残基，每一残基沿轴向的距离为0 2 9l l l l l 【引。胶原蛋白最常见的结构形式是胶原纤维( c o l l a g e nf i b e r ) ，每股胶原纤维是由胶原原纤维( 又称原胶原分子) 并列成束组成的超螺旋结构。胶原原纤维的直径约为1 0 3 0 0n n ，长达数百微米，分子量约为3 0 0k d a 。每条胶原原纤维是由胶原分子规则装配而成的，胶原分子首尾相接连成线，并列成束，组成胶原原纤维。由于分子排列极其规则，- 在电子显微镜下，胶原原纤维呈现特有的周期性区带，区带间距为6 0 7 0n l n ，其大小取决于胶原的类型和生物来源。目前发现2 0 多种类型胶原蛋白，按照发现的顺序依次用罗马字母分别命名。不同类型胶原蛋白的主要区别在于分子中非螺旋部位的位置和分布，其类型差异也造成胶原蛋白生物物理特性的不刚卜引。1 2 2 胶原蛋白的生物化学性质胶原蛋白具有胶体性、沉淀、变性和凝固等生化特点。酸、碱、中性盐和蛋白酶等都可以与胶原蛋白发生作用。胶原蛋白在长时间的酸或碱作用下，其交联键会遭到破坏而发生胶解【9 】。中性盐对胶原蛋白的作用因盐种类差异而各不相同，有的中性盐可使胶原蛋白脱水，有的则会引起胶原蛋白膨胀。胶原蛋白溶液粘度较高，溶液在酸性条件下较为稳定，在碱性和中性条件下稳定性较低，胶原蛋白易被分解生成多肽片段。因此，胶原蛋白溶液必须在酸性条件下低温保存【l 。胶原蛋白的变性温度为3 8 4 0 c ，胶原蛋白一旦变性，便形成明胶，使得溶解度增高，粘度下降，这与普通蛋白质变性后凝固的性质正好相反【l 。江南大学硕士学位论文1 2 3 胶原蛋白分离制备技术的研究概况胶原蛋白是一种纤维状蛋白，分子结构类似于纤维。一直以来，人们认为胶原蛋白是一种不溶性蛋白。在1 9 0 0 年，法国研究人员发现了胶原蛋白可溶于稀醋酸。此后经过人们的不断研究，发现胶原蛋白可以溶解于多种不同p h 值和盐浓度的提取介质中。迄今为止，依据提取介质的不同，胶原蛋白的分离制备方法可分为五种，即酸抽提法、碱抽提法、酶解抽提法、中性盐抽提法以及热水抽提法。其基本原理都是根据胶原蛋白的特性改变蛋白质所在的外界环境，把胶原蛋白从其他蛋白质中分离出来，而且在实际提取过程中，不同提取方法之间往往相互结合【1 2 - 13 1 。酶解抽提法即利用各种不同的酶在一定的外界环境条件下提取胶原蛋白，是目前抽提胶原蛋白最广泛使用的方法。其中所使用的酶有中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶等。原料采用不同的前处理后，加入不同的酶提取得到酶促溶性胶原蛋白。1 2 4 胶原蛋白的应用概况1 2 4 1 胶原蛋白在医学领域的应用随着对胶原蛋白生化性质研究的不断深入，胶原蛋白作为类具有多种优良特性的生物医学材料，在医学领域中已得到广泛应用。1 胶原蛋白作为生物医学材料的重要特性：( 1 ) 低免疫原性胶原蛋白作为医用移植材料最重要的特点在于其低免疫原。| 生( i m m u n o g e n i c i t y ) 。胶原蛋白虽然是大分子物质，但其结构重复性大，所以同其它蛋白质相比，胶原蛋白的免疫原性非常低。其主要免疫原性位点是在分子的c 末端和n 末端区域，这两个区域是由- d , 段非螺旋氨基酸序列所组成，称为端肽( t e l o p e p t i d e s ) 。在制备可溶性胶原蛋白医用产品时，均需通过选择性水解除去胶原蛋白的端肽，使得胶原蛋白分子仅在三股螺旋内保留微弱的免疫原性，而不足以引起明显的排异反应。另外，对各种胶原蛋白产品的免疫原性进行测定时发现：胶原蛋白产品中的极少量的非胶原蛋白会引起免疫应答；材料中存在的某些胶原蛋白受到破坏而变性时，也会引起免疫应答【1 4 - l5 1 。( 2 ) 良好的生物相容性胶原材料另一优势在于它与宿主细胞及组织之间良好的生物相容性。胶原材料无论是在被吸收前作为人工组织的骨架，还是被吸收同化成为宿主组织的一部分，都与细胞周围的基质有着良好的生物相容性，并成为细胞与组织正常生理功能整体的一部分。胶原蛋白良好的粘附性对成纤维细胞有一定的生物诱导性，有利于细胞的长入及基质的沉积、新生血管生成以及伤口愈合。临床有报道称，在胶原蛋白凝胶中培养肝细胞诱导聚集体的形成，从而使每个细胞合成蛋白的量比非聚集体增加2 倍。胶原蛋白可促进不同类型细胞生长，如i 型胶原可用于培养各种不同类型的细胞。细胞与胶原之间的相互作用机理取决于细胞的类型，可能直接通过细胞中一些特异的受体，但更多的是由特殊的粘结蛋白，如纤维结合素等介导的相互作用【1 6 】。( 3 ) 止血作用4第一章绪论胶原蛋白主要通过促进血小板凝聚和促进血浆结块来发挥其止血功能。胶原蛋白促使血小板凝聚，可形成血栓，进而血浆结块阻止流血【l7 1 。血管壁的内皮层发生损伤流血时，胶原蛋白使靠近受伤部位的血小板与内皮下的结缔组织直接接触，使血小板活化并释放出颗粒成分，从而迅速凝血【1 8 j 。( 4 ) 可生物降解性胶原蛋白具有紧密牢固的螺旋结构，绝大多数蛋白酶只能切断胶原侧链，只有特定的蛋白酶( 如胶原酶) 在特定的条件才能使胶原肽键发生断裂，破坏胶原螺旋结构，断裂后形成的胶原多肽可被其他蛋白酶彻底水解。利用胶原蛋白的可生物降解性，人们设想当胶原类材料植入人体后，新生组织或器官即可将其作为支架开始生长，在一定时期后，胶原类材料自行降解为小分子进而被人体吸收，从而达到彻底治疗的目的【1 9 锄】。胶原蛋白的可生物降解性具有二重性。胶原类材料植入人体后，如果降解速度过快，则新生组织或器官尚未长成，达不到预期目的：如果降解速度过慢，则会影响新生组织或器官的生长。理想的情况是寻求最佳的降解速度。因此对于胶原材料降解速度的可控性有待进一步的研究。2 胶原蛋白在医疗领域的研究进展胶原蛋白在医学领域中有多种应用形式，根据临床要求的不同，可对胶原蛋白进行相应的处理加工，制备成多种医用材料，具体应用有如下几种。( 1 ) 作为药物输送系统微囊包封是在细小药物颗粒外包裹上一层保护性的胶原蛋白，胶原蛋白可起到对药物分离、贮存和运输的作用，以便将被包裹物在预定的条件下释放出来，从而起到缓释的效果。药物大多通过氢键结合、共价键结合或被包裹的形式，被胶原膜承载，其被释放的条件取决于胶原保护层的构造，如膜的过滤性、腐蚀、破裂等。已有的研究结果表明，无端肽重组胶原( r e c o n s t i t u t e dc o l l a g e n ) 佑o 成的厚度为0 0 1 0 5l i l l n 膜，对药物有明显缓释作用。被包裹的材料种类很多，包括粘合剂、农药、活细胞和药剂等。胶原基药物输送体系适用于眼球的表面，并有自我调节的潜能。胶原膜敷在眼睛表面5 - 6h 后就能完全水解。这表明胶原基系统适用于模拟目前的液体类和油膏类药物输送装置。其中，承载物的药物释放决定于胶原膜的药物传送能力。胶原基质充当一个储存库的作用，水溶药物被包裹在胶原基质的结构间隙内，水不溶药物则被吸收入膜内。当药物从膜中释放，角膜周围就会保持较高的药物浓度，且持续时间长久。研究表明，相对于传统的滴液、药膏或皮下注射等输送形式，胶原膜可提供相同或更好的药物输送能力。( 2 ) 作为基因传送载体胶原蛋白与重组的入骨形态基因蛋白2 ( r h b m p 2 ) 形成的复合物可激化骨的形成。在骨形成过程中，胶原蛋白为细胞的分化提供了场所，并可作为骨形成过程的人工基质。研究发现，无论是载有b m p 的胶原基质，还是与骨细胞紧密接触的胶原基质，均直接引导骨架生成。这些结果表明生物表面镶贴移植物的胶原蛋白作为基因传送体系是非常有效的。江南大学硕士学位论文胶原蛋白材料作为基因传送体系有广泛的应用前景，例如，用基因改性细胞来长期传送一种病理转基因产品，一直以来都是治疗单基因遗传病和大量多因素非基因疾病的有效治疗途径。目前，胶原材料已被用作受感染病毒核酸的纤维原生质存活的支架。( 3 ) 作为组织工程的支架胶原支架在组织工程中的作用主要体现在三个方面：为组织塑形、支持和连接作用、提供有利于工程化组织成熟的微环境。胶原作为一种天然的结构蛋白，是所有天然或人工合成材料中较为理想的支架材料。研究表明其分子中的“天冬氨酸甘氨酸谷氨酸丙氨酸”结构与细胞的受体结合而达到细胞的贴附，并使细胞按胶原纤维的方向排列。目前广泛使用的支架有脱钙骨基质支架、胶原基心血管装置、血管膜、心脏瓣膜、韧带等【2 1 2 引。( 4 ) 作为角膜保护膜角膜胶原保护膜是以表面覆盖接触镜( c o n t a c tl e n s e s ) 的形式用作角膜敷料的。角膜胶原保护膜可帮助角膜移植后的表皮愈合，可在眼睛表层分解形成一薄层胶原溶液，润滑眼睛，使眼睑对角膜的磨擦最小化，并增加药物与角膜的接触时间，促进角膜上皮细胞的愈合【2 弛引。另外胶原膜还可结合使用高剂量的抗菌剂，对受感染的角膜组织进行处理，所制成的抗菌胶原保护膜对手术前和手术后的抗菌预防、细菌角膜炎的最初处理和角膜擦伤的处理都具有临床意义【z 7 。2 引。( 5 ) 作为皮肤替代物皮肤替代物是在人体遭受烧伤或创伤导致皮肤损伤或缺失时，能够覆盖和保护创面，并促进创面尽快痊愈的医用生物材料。创伤后皮肤受到损伤，经常伤至真皮层，甚至皮下组织，因此理想的皮肤替代物不仅应该可以覆盖伤口、减轻疼痛、保持体液平衡、防止细菌侵入，还应该在等待最终自体移植物时，提供一种暂时| 生生理保护或为创面修复提供支梨如j 。随着人们对胶原蛋白生物学功能和良好的生物相容性的研究，以胶原蛋白为主要成分的各种不同形式的皮肤替代物被研制出来。如胶原凝胶、胶原海绵等皮肤替代物。目前，胶原海绵在皮肤创伤后的恢复中作用明显，因此不同类型的人工皮肤多以胶原海绵的形式制备，由海绵生长、分化进而取代病理皮肤。另外由胶原和氨基葡聚糖制成的皮肤取代物是人体表皮角化细胞的合适培养基，它由人体表皮角化细胞和附着在胶原一氨基葡聚糖交联的底物上的纤维质构成，能降低生物降解率，从而减少皮肤替代物的用量。( 6 ) 止血海绵研究表明，胶原蛋白不仅能够诱导血小板附着，而且能够激活血液的凝固因子，对已经损伤的血管起填塞作用，从而达到止血的目的。临床应用表明：与藻酸钙、藻酸海绵凝血增强纤维泡沫、增凝明胶海绵及氧化纤维素等常用的止血剂相比，胶原海绵具有很好的止血性能，且亲水性强，吸水率大，止血时间短，粘附创面能力优异，而且创面干燥，不易发生感染，愈合迅速，副作用小，是一种理想的止血材料。国外对于利用胶原蛋白研制止血海绵的研究一直十分活跃，国内目前尚处于起步阶段，但发展较迅速。据报道，国外已经有粉状及片剂的微晶胶原止血剂、纤维织物止血6第一章绪论剂和海绵止血剂等。尽管胶原蛋白以其优良的性质得到重视，但其不可避免的弱点也限制了它的应用。如胶原具有天然材料共有的弱点：物理机械性能差，其生物降解性在某些应用上也是一个弱点。而合成材料尽管其力学性能良好并且性能稳定，但生物相容性普遍较差。因此制备胶原高分子复合材料，使其同时具有两种材料的共同优点，已经成为一个重要的发展方向，从而向开发“理想”的生物材料的目标迈进了一步，并将为医用生物材料的变革性发展提供广阔的前景。1 2 4 2 胶原蛋白在美容业中的应用胶原蛋白及其水解物与人皮肤胶原的结构相似，其分子中氨基和羧基基团使其具有很高的表面活性和良好的生物相容性，对皮肤无刺激作用。胶原蛋白中还富含羟基等亲水性基团而具有良好的保湿能力，在相对湿度7 0 时，仍可保持其自身重量4 5 的水分。化妆品中添加的胶原蛋白浓度达到o 0 1 时，即能供给皮肤所需的全部水分，并增加肌肤的含水量，是皮肤结缔组织中保湿的重要条件【3 1 1 。当胶原蛋白作为化妆品覆盖在皮肤上时，可以增强肌肤的锁水功能，防止水分从皮肤表面蒸发，进而改善皮肤粗糙、无光泽的状况1 3 2 j 。随着年龄的增长，成纤维细胞的合成能力下降，皮肤中胶原纤维发生交联，使细胞间粘多糖减少，皮肤便会失去弹性和光泽，发生老化，同时真皮层的纤维断裂、脂肪萎缩、汗腺及皮脂腺分泌减少等因素，使皮肤出现色斑、皱纹等一系列老化现象【3 3 】子补充足够的胶原蛋白能够刺激真皮层中的纤维母细胞进行胶原蛋白的自行分泌，使胶原蛋白自行生成机制与代谢功能恢复正常，进而有效延缓肌肤的老化与松弛。小皱纹的产生是由于肌肤内部胶原蛋白流失，供给不及耗损而导致真皮层的网状层胶原纤维失去活性，使肌肤老化。适当的补充胶原可以保持肌肤正常的弹性，维持水分平衡。充足的胶原蛋白可改善肌肤内油脂分泌状态，能让油性肌肤或干性皮肤渐趋于中性，当肌肤底层的保水性及紧实性相互作用时，可使油性肌肤毛孔收小，干性肌肤则保有水分，让肌肤慢慢变为紧实细致的中型肌肤。胶原蛋白的修复功能，还能有效改善塌陷的毛孔组织，让肌肤回复紧实、有弹性的状态。胶原蛋白添加至化妆品中，其含有的酪氨酸与皮肤中的酪氨酸竞争，可抑制黑色素的产生，对皮肤起到美白作用【34 。因此可将胶原蛋白开发用作营养性护肤类、护发类化妆品的原料。胶原蛋白应用于化妆品中的功效总结起来有如下几点：( 1 ) 营养性可以给予含有胶原蛋白的皮肤层所必需的养分，补充1 7 种对人体有益的氨基酸，使皮肤中的胶原蛋白活性加强，保持角质层水分以及纤维结构的完整性，改善皮肤细胞生存环境和促进皮肤组织的新陈代谢，增强循环，达到滋润皮肤、延缓衰老、美容、消皱的功效。( 2 ) 修复性7江南大学硕士学位论文胶原蛋白和周围组织的亲和性很好，从而具有修复组织的作用。( 3 ) 保瀑性由于胶原分子中含有大量的亲水基，使之具有良好的保湿功效，能够达到保持皮肤润泽的目的。( 4 ) 配伍性胶原蛋白具有调节和稳定p h 值、稳定泡沫、乳化胶体的作用。同时，作为一种功能性成分，在化妆品中可| 以减轻各种表面活性荆、酸、碱等刺激性物质对皮肤、毛发的损害。( 5 ) 亲和性胶原蛋白对皮肤和头发表面的蛋白质分子有较大的亲和力，胶原蛋白主要通过物理吸附与皮肤秘头发结合，能耐漂洗处理。亲和作用随其分子量的增大面增强。分子量较小时可以渗入皮肤和头发的表皮，有时还可以透过皮质层，达到营养皮肤的作用。分子量较大时，每个分子的可结合位置较多，结合力增强，亲和力增大。胶原类产品性能温和、功能丰富、使餍安全，符合当代化妆品的潮流，是高档化妆品的重要原料。当今国际市场销售的胶原类原料化妆品近5 0 种，而我国的化妆品仅限于n - 酰化胶原永解蛋自缩合物、胍氨黢、粮丝氨酸和透锈质酸等少数几种产品。穆畅道等( 2 0 0 3 ) 已经建立了从动物皮中，提取符合国家食品卫生级的胶原蛋白系列产品的方法，开发为胶原类系列化妆品。随着生物化学和分子生物学的发展，生物原料越来越多地应用于化妆晶中，胶原蛋白将作为一种功能性的生物原料成为化妆品系列中的重要一员，为人类美容产业发挥越来越大的作用。1 2 4 3 胶原蛋白在食品领域中的应用随着对胶原蛋自的研究圜益深入，人们发现胶原蛋良还具有强筋健骨、增强体质等多种保健功能，在食品工业中具有越来越广阔的应用前景。1 胶原鬣自在食品工业中应用的优越性胶原蛋白具有一些适合于食品生产与加工的属性，在食品工业中经常被用作功能物质和营养成分，具有其它替代材料无可比拟的优越性。( 1 ) 胶原大分子静螺旋结枣鼋和结晶区的存在，使萁具有一定的热稳定性。( 2 ) 胶原天然的紧密的纤维结构，使胶原材料显示出很强的韧性和强度，适用于食用包装材料的制备；并且其独特之处为，在热处理过程中，随着水分和油脂的蒸发和熔化，胶原蛋白几乎与肉食品的收缩率一致。( 3 ) 由于胶原蛋白分子链上含有大量的亲水基团，所以与水结合的能力很强，这一性质使胶原蛋白在食品中可以焉作填充剂和凝胶。( 4 ) 胶原蛋白可在酸性和碱性介质中膨胀，故可应用于制各胶原基材料的处理工艺中。2 胶原蛋白在食晶领域中的应用进展( 1 ) 食品包装近年来，各类香肠制品在肉制品所占的比例越来越大。由于传统天然肠8第一章绪论衣制品的产量受到限制，市场上出现了肠衣供不应求的情况，国内外许多食品专家丌始研究人造肠衣作为天然肠衣的替代品。利用胶原蛋白制作成的胶原肠衣，具有口感好、透明度高、制作工艺简单等特点，很受用户青睐，在我国具有很好的开发前景。人工肠衣还有一些天然肠衣不可比的优点，如在人工肠衣中加入某些酶，使肠衣本身具有固化酶的功能，可以改善香肠风味和质量【3 5 1 。胶原蛋白还可作为食品粘合剂合成纤维膜，用作肉类、鱼类等的包装纸。此外胶原蛋白还可作为食品保护层，具有抗氧化性，可保持肉食品的颜色和鲜亮程度。( 2 ) 肉制品添加剂早在1 9 8 3 年就有专家建议：将胶原蛋白改性后，直接作为食品的一种组分。研究表明：将酸法制得的胶原蛋白粉，添加到肉制品中，不仅能改善产品品质( 如口感、多汁) ，而且能提高产品的蛋白质含量，并且无不良气味。m e u l l e n e t 等人研究显示，添加2 的胶原蛋白、2 0 的水时，腊肠的感观、质地和口感较好【3 6 1 。( 3 ) 胶原蛋白类食品胶原粉经调浆、成型、干燥、油炸等工序，可制得胶原类食品；调浆时，可根据口感需要，添加不同的香辛料，制作而成。( 4 ) 保健食品胶原蛋白在补钙食品中应用比较广泛。胶原蛋白与体内钙的关系，包括2 个方面：血浆中胶原蛋白的羟脯氨酸，是运送钙到骨细胞的主要工具；骨细胞中的胶原( 骨胶原) 则是羟基磷灰石的粘合剂，它与羟基磷灰石共同构成了骨骼的主体。由此不难看出，只有摄入足够的可与钙结合的胶原蛋白，才能使钙在体内被较快消化吸收，且能较快达到骨骼部位而沉积。( 5 ) 胶原蛋白在食品工业中的新应用胶原蛋白的分散性使它可以代替传统的鱼胶作为啤酒和白酒的澄清剂，结合啤酒中的物质，而且促进啤酒的后成熟陈化；利用胶原蛋白的成膜性，可将其用作固化酶的膜材料和肉食品标签，后者已经在欧洲实际应用【了7 1 。在胶原蛋白用于食品工业的研究方面，国外的研究比国内的研究更成熟。在国内，胶原蛋白食品的优越性还没有得到消费者的充分认识，随着人们生活水平及对绿色食品要求的提高，胶原蛋白食品会越来越得到消费者的青睐。1 3 胶原蛋白治疗关节炎的研究进展类风湿关节炎( r h e u m a t o i da r t h r i t i s ，r a ) 是一种常见的自身免疫性疾病，以慢性、对称性滑膜关节炎和关节外病变( 皮下结节、心包炎、胸膜炎、肺炎、周围神经炎等) 为主要临床表现。r a 在中国的发病率约为0 3 0 4 ，其发病原因和发病机制至今仍未完全阐明。当前治疗的主要目标是缓解痛苦，减轻和控制炎症，保护肌肉和关节功能，治疗和预防严重并发症，包括非甾体类抗炎药、糖皮质激素、病情改善药等。这些疗法易使患者免疫系统受到普遍性抑制而导致严重感染，而且也不能有效的防止疾病复发。口服引起r a 的自身抗原如鸡i i 型胶原蛋白，诱导机体重新获得对自身抗原的耐受，有可能是治疗r a 的一条方便、有效而且较为特异、安全的途径【3 8 】。以完全弗氏佐剂( c o m p l e t ef r e u n da d j u v a n t ，c f a ) 诱导的大鼠佐剂性关节炎( a d j u v a n ta r t h r i t i s ，a a ) 与r a 有许多共同的组织学和免疫学特征【3 9 1 ，是建立较早且比较成熟的r a 实验动物模型。近年来，人们对口服诱导免疫耐受的机制进行了许多探讨，通过口9江南大学硕+ 学位论文服耐受在部分实验性自身免疫病动物模型治疗中的成功实践 4 0 - 4 1 】。1 9 1 1 年，w e l l s 首先报道了在给豚鼠口服母鸡蛋白时，观察到其系统性过敏症得到抑制1 4 纠引。目前，普遍认为此疗法具有方便、无毒及抗原特异性等优点，很可能成为治疗r a 的重要手段，但仍存在一些问题，口服免疫耐受的诱导需要依靠自身的免疫功能才能实现对疾病的治疗，长期免疫功能低下或缺陷的患者可能不易产生口服免疫耐受，口服免疫耐受的形成机制尚有待进一步完善，免疫剂量的确定还不明显。国内学者也证实了口服鸡源和牛源和羊源i i 型胶原蛋白能明显减轻患鼠关节肿胀度，降低r a 和a a 发病率。有关i i 型胶原蛋白预防和治疗剂量的研究有很多，口服抗原的剂量是影响口服耐受产生的重要因素，普遍认为高剂量抗原诱导自身反应性淋巴细胞克隆清除( c l o n a ld e l e t i o n ) 或克隆无f l 皂( c l o n a la n e r g y ) ，低剂量抗原诱导主动抑铝l j ( a c t i v es u p p r e s s i o n ) 。t h o m p s o n 首先报道灌胃剂量为2 5m g ( k g d ) ，2 5m g ( k g d ) 连续灌胃5d 可明显显推迟大鼠胶原性关节炎的发生时间，减轻关节肿胀程度。研究发现，口服高、中、低剂量鸡i i型胶原蛋白均能减轻佐剂剂关节炎的发病症状，但高剂量组效果显著( 0 1 2m g k g ) 粥j ，f r i e d m a n 等报道的低剂量治疗组的用药2 周累计剂量( 每只1m g ) 能有效地诱导口服耐受。1 4 本文研究目的和意义胶原蛋白是动物结缔组织中的主要成分，是动物体内含量最多、分布最广、具有免疫学性剧4 4 j 的蛋白质，在皮革业、影像业、制药业、糖果生产、生物医学原料和食品工业中有广泛的应用。最近，国外研究表明，胶原蛋白水解所得的胶原多肽不仅具有很好的消化特性，而且还具有许多生理活性功