（植物学专业论文）灭螺成分的提取分离、结构剖析及对鱼虾毒性的研究.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 摘要 血吸虫病( s c h i s t o s o m i a s i s ) 是严重危害人类健康和社会经济发展的重大传染性 疾病。我国流行的是日本血吸虫病，钉螺是其生育的唯一中间宿主，也是同鱼虾共 生的水陆两栖软体动物，因此，选择性控制钉螺是防治血吸虫病传播的关键技术之 。n i c 是w h o 唯一推荐、国内外广泛使用的化学灭螺药物，但因其对水生动物 的毒性大、价格昂贵等弊病限制了其广泛应用，因而研制环境友好、价格低廉的新 型灭螺药物己成为当今社会经济发展的迫切需求。作者从灭螺植物s x 中纯化生物 碱单体灭螺药物( 成分) ，研究鱼虾酯酶和转氨酶反应的动力学特性及对灭螺药物的 敏感性，成果为灭螺药物提供了设计依据。主要研究结果如下： 1 、生物碱s x 3 的纯化及结构剖析研究。 采用酸碱法、c c l 法及重结晶法，从s x 果实中分离纯化单体灭螺成分s x 3 ， 纯度9 6 1 2 ，相对分子质量7 2 1 ，元素比1 4 8 9 n 、6 2 1 4 c 、7 2 1 5 h ，经i r 检 测推定s x 3 可能一种新灭螺成分。 2 、生物碱s x 3 的活性测定。 用w h o 试验法测定，在2 0 0m g l 的s x 3 药液中浸泡钉螺2 4 h ，其上爬抑制率 和死亡率均为1 0 0 ；用平板抑菌法测定，在含5 0m g ls x 3 的培养皿中培养棉花 枯萎茵、水稻纹枯菌、黄瓜灰霉菌、小麦赤霉菌、苹果轮纹菌及棉花炭疽菌等菌物， 其生长抑制率分别为2 1 0 5 、2 1 3 7 、1 8 5 2 、2 6 0 9 、2 4 5 3 及4 5 5 。结果说明s x 3 具有抑杀钉螺和广谱抑菌的活性。 3 、鲫鱼和青虾a c h e ( 脑- ) 、g p t 和g o t ( 肝脏1 的动力学特性研究。 用l 2 5 ( 5 6 ) 正交试验法测定结果说明，因生物和酶不同，其动力学特性各异，这 为灭螺药物机理研究提供了试验方法( 依据) 。鲫鱼和青虾各酶的动力学特性归纳如 下： 物种 酶篙篙怒鬻反臀系反篙度罐妒 a c h e1 21 27 03 55 鲤鱼g p t2 02 07 03 05 5 g o ti 62 57 53 04 5 a c h e2 3o 87 54 02 0 青虾 g p t 3 00 57 54 54 5 g o t1 81 07 55 05 5 4 、鲫鱼和青虾a c h e 、g p t 、g o t 对灭螺药物的敏感性研究 在酶促反应最适条件下测定，结果说明同源酶对不同灭螺药物的敏感性不同， 来源不同酶对同种药物的敏感性也有差异。成果为新型灭螺药物的筛选提供了重要 的参考依据。灭螺药物对酶活力的诱导率如下： 物种酶n i c ( 酰胺类) c u s 0 4 ( 无机盐类) d z l ( 皂甙类)s x 2 ( 生物碱类) 青虾 a c h e g p t g o t a c h e g p t g o t 注：lj 表示抑制 3 7 7 7 q s 4 7 2 3 0 4 5 3 7 9 l l o 6 2 9 2 7 0 ，6 - 4 2 7 9 4 7 5 1 4 9 3 3 1 8 4 6 ，9 6 。9 - 4 6 2 5 9 3 2 2 6 8 7 1 4 6 4 7 1 6 8 0 9 6 - 3 5 1 4 7 1 8 关键词：s x 生物碱；结构剖析；抑螺：鲫鱼；青虾；a c h e ；g p t ；g o t a b s t r a c t & 砌i s t o s o m i a s i si sas e r i o u si n f e c t i o u sd i s e a s et h a ti sh a z a r dt ot h eh u m a nh e a l t ha n d s o c i o e c o n o m i cd e v e l o p m e n t i t st h eu n i q u ed i s e a s ei no u rc o u n t r ya n do n c o m e l a n i a h u p e n s i s ( s n a i l ) i st h eo n l yi n t e r m e d i a t eh o s to fj a p a n e s es c h i s t o s o m e o b v i o u s l y , c o n t r o l i n gt h es n a i l i sak e yt e c h n o l o g yt oc o n t r o lt h es c h i s t o s o m i a s i sa n dn i c l o s a m i d ei s t h eo n l yc h e m i c a lm o l l u s c i c i d a lr e c o m m e n d e db vw h o b e c a u s eo fi t si l l sw h i c hi s t o x i c i t yt of i s h ，h i g h e rp r i c e sa n ds oo n ，d e v e l o p i n gan e w k i n do fm o l l u s c i c i d a lw h i c hi s e 衔c i e n t d u r a b l e ，s a f ea n di n e x p e n s i v eh a sb e i n gt h en e e do fs o c i o e c o n o m i c d e v e l o p m e n t c o m p o n e n to fs n a i lc o n 仃o lw a se x t r a c t e df r o ms x ，o p t i m a lc o n d i t i o n s r e a c t i o no fa c h e g p t , g o ta n di t ss e n s i t i v et om o l l u s c i c i d a l sw e r es t u d i e di nt h i sp a p e r 砀e s er e s u l t sw e r eb a s i co fn e wm o l l u s c i c i d a l ss t u d i e d 。 1s t u d yo nt h ep u r i f ya n ds t r u c t u r eo fs x 3 an e wm o l l u s c i c i d a lc h e m i c a ls u b s t a n c e ，w i t ht h er e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h to f7 21 a n d p r o p o r t i o no fe l e m e n t sa sh a sb e e ne x t r a c t e df r o ms xb ya c i dw a t e r , c c l a n do t h e r m e t h o d s ，w h i c hn a m e ds x 3 2s t u d yo nt h ea c t i v i t yo fs x 3 n e p u r i f i e ds a m p l e o fs x 3h a v el e t h a l i t ya n di n h i b i t e do f10 0 a g a i n s ts n a i l sb y i m m e r s i n gt h es n a i l sf o r2 4 ha t2 0 0m g l t h ei n h i b i t i n g r a t eo f5 0m g ls ) 【3a g a i n s t f u s a r i u mo x y s p o r i u m ，r h & o c t o n i as o l a n i ，b o t r y t i sc i n e r e a p e r s ，g i b b e r e l l az e a e ， d o t h i o r e l l ag r e g a r i a ，c o l l e t o t r i c h u mg o s s y p i iw e r e2 1 0 5 ，2 1 3 7 ，18 5 2 ，2 6 0 9 ，2 4 5 3a n d 4 5 5 r e s p e c t i v e l yf o r4 8h t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a ts x 3h a se f f e c t e do ns n a i l sa n d b a c t e r i a s 3s t u d yo nt h eo p t i m a lc o n d i t i o n so f a c h e g p ta n dg o tf r o mc a r a s s i u s a u r a t u sa n dm a c r o b r a c h i u mn i p p o n e n s e n er e s u l t sw e r eo b t a i n e db yl 2 s ( 5 0 ) a n di n d i c a t e dt h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o n sa r e d i f f e r e n ta st h ek i n do fe n z y m e sa n ds p e c i e s 。砀e yp r o v i d em e t h o d sf o rt h em e c h a n i s m o fm o l l u s c i c i d a l ss t u d i e d c o n e 叫1 0 nc o n c e 咖t i o n t c m d m t u r e s p e c i e s e n z y m e o f e n z y m eo f s u b s t r a t e p h ； ( i l i g ，珈l l )( 弘m o l 几) 、w a c h ei 2 1 27 03 5 l 讲铂s s n 惦 g p t2 02 07 03 0 口“九埘 g o t1 62 57 53 0 ，。一 a c h e 2 30 87 54 0 m 饿r o b d c h i u m g p t3 00 57 54 5 九御仳艘 g o t1 81 07 55 0 r e a c t i o nt i m e ( m i n ) 5 5 5 4 5 2 0 4 5 5 5 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 4 s t u d yo nt h es e n s i t i v eo f a c h e g p ta n dg o t f r o mc a r a s s i u sa u r a t u sa n d m a c r o b r a c h i u mn i p p o n e n s et om o l l u s c i c i d a i s 1 1 l e s er e s u l t sw e r et e s t e du n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o i l s t h e yi n d i c a t e dt h a t t h ee n z y m ef r o mt h es r i t i es p e c i e sh a v ed i f f e r e n t s e n s i t i v et od i f f e r e n t m o l l u s c i c i d a l s ，o nt h eo t h e rh a n d ，t h es a l n em o l l u s c i c i d a lh a sd i f f e r e n te f f e c to ne n z y m e s f r o md i f f e r e n tk i n do fs p e c i e s t h e s e sr e s u l t sh a v es i g n i f i c a n tv a l u e0 1 1n e wk i n do f m o l l u s c i c i d a l ss t u d i e d s p e c i e se n z y m e c a r a s s i u s a u r a t u s m a c r o b r a c h i u m n i p p o n e n s e a c h e g p t g o t a c h e g p l r g o t ( a m i d c ) 3 7 7 7 7 0 5 4 7 2 3 0 4 5 3 7 9 l l o 6 n o t e s ：一r e p r e s e n ti n h i b i t i n g ( i n o r g a n i cs a l t ) 2 9 2 7 0 6 - 4 2 7 9 4 7 5 1 4 9 3 3 ( s a p o n i n ) 1 8 4 6 9 6 9 4 6 2 5 9 3 2 2 6 g 7 1 4 ( a l k a l o i d ) “7 1 6 8 0 9 6 3 5 1 4 7 1 8 k e yw o r d s ：s xa l k a l o i d s ，s t r u c t u r a la n a l y s i s ，i n h i b i t i n gs n a i l ，c a r a s s i u sa u r a t u s ， m a c r o b r a c h i u mn i p p o n e n s e ，a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ，g l u t a m i cp y r u v i ct r a n s a m i n a s ，g l u t a m i c o x a l o a c e t i ct r a n s a m i n a s 中文名 空心莲子草 槟榔碱 黄姜 富贵草 吉祥草 黄果茄 乙酰胆碱酯酶 三磷酸腺苷酶 牛血清蛋白 胆碱酯酶 谷丙转氨酶 谷草转氨酶 乳酸脱氢酶 一氧化氮合酶 琥珀酸脱氢酶 柱层析色谱 元素分析 高效液相色谱 红外吸收光谱 质谱 核磁共振 薄层层析色谱 紫外吸收光谱 缩略词 英文名 a l t e r n a n t h e r ap h i l o x e r o i d e s ( m a r t ) g r i s e b a r e c o l i n e d i o s c o r e a z i n g b e r e n s i s c h w r i s t p a c h y s a n d r at e r m i n a l i ss i e b e tz u c c r e i n e c k e ac a r n e a ( a n d r ) k u n t h s o l a n u mx a n t h o c a r p u ms c h r a de tw e n d l a c e t ) r l c h o l i n e s t e r a s e a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e b o v i n es e r u ma l b u m i n c h o l i n e s t e r a s e g l u t a m i cp y r u v i ct r a n s a m i n a s g l u t a m i eo x a l o a c e t i ct r a n s a m i n a s l a c t a t ed e h y d r o g e n a s e n i 仃i co x i d es y n t h a s e s h o c kd e h y d r o g e n a s e c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y e l e m e n ts n a l y s i s h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y i n f r a r e ds p e c t r a m a s ss p e c t r o m e t r y n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y u l t r a v i o l e t s p e c t r a 碘化硫代乙酰胆碱 a c e t y l t h i o e h o l i n ei o d i d e 羧甲基纤维素钠 s o d i u mc a r b o x y m e t h y l e e l l u l o s e 5 ，5 一二硫双硝基苯甲酸5 ，5 - d i t h i o b i s ( 2 一n i t r o b e n z o i ca c i d ) 氯硝柳胺 n i c l o s a m i d e 平均忍受限 湖北钉螺 3 5 简称 a p a r e d z p r r c s x a c h e 讯p a s e b s a c h e g p r r g o t l d h n o s s d h c c l e a h p l c ir m s n m r 弧c u v 二v i s a c t i c m c - n a d t n b n i c r l m 钉螺 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：力咱晒 日期：泖7 年多月莎日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并囱国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权 中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通 过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：力嵋捅 日期：枷7 年易月6 日 导师签名：谰娌 吼帅f 日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。圃童论塞握交卮澄卮；旦篓生；旦二生；臼三生筮盔! 作者签名：店咱晒 日期：哗乡月6 日 导师签名：w 筵堡 日期：叶k 月6 日 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 日本血吸虫病预控 第一章绪论 1 1 日本血吸虫病疫情 血吸虫病( s c h i s t o s o m i a s i s ) 是由血吸虫( s c h i s t o s o m a ) 寄生于人体所引发的一种严 重危害人类健康安全、影响社会和经济发展的重大传染性疾病。血吸虫的种类很多， 其中，主要寄生于人体的有6 种，又以日本血吸虫( s c h i s t o s o m a j a p o n i c u m ) ，埃及血 吸虫( s c h i s t o s o m ah a e m a t o b i u m ) 和曼氏血吸虫强m a n s o n o 弓l 起的血吸虫病流行范围 最广，危害最大，且历史悠久【1 1 ，因而其预防是各国政府面临的一个公共卫生难题1 2 l 。 我国流行的是由日本血吸虫引起的日本血吸虫病f 3 1 ，其主要流行于湖北、湖南等南 方1 2 个省( 市) 、自治区 4 1 ，近年来，血吸虫病在我国长江流域呈明显上升趋势， 尚有1 1 0 个县( 市、区) 血吸虫病未得到有效控制，其中以湖区5 省的江湖洲滩地 区和四川、云南的大山区疫情最为严重( 5 l ，受血吸虫病威胁的人口已增加到9 9 0 3 万 人。 1 2 日本血吸虫病预防 在日本血吸虫生活史中，终宿主人和哺乳动物完成其有性生殖的环节；中间宿 主钉螺完成其无性增殖的环节。因此，这两个环节无论是在血吸虫病传播动力学中， 还是在其预防中均具有至关重要的作用1 6 1 。国内外血吸虫病控制策略均经历了一个 从单一到综合措施的发展过程1 7 】，目前控制血吸虫病的措施是以化疗为主的控制策 略，有条件的地区以阻断传播为目标。主要措施为人畜化疗、健康教育和易感地带 灭螺。我国世行贷款血吸虫病控制项目即采取这一策略。 2 钉螺控制 2 1 钉螺分布 钉螺是水陆两栖的淡水螺，其自身爬行迁移的能力极为有限，借助于水流或吸 附于漂浮物随水漂流通常是钉螺远距离扩散的主要方式i 钔。主要分布于缅甸、中国、 日本、菲律宾、印度尼西亚等国家地区。我国1 2 个省、市、自治区均有钉螺的分 布1 9 1 ，长江流域是我国主要的钉螺扩散区，其分布占全国有螺面积的9 5 8 9 t 1 0 l ，江 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 湖洲滩是钉螺分布的高密度地区，洪灾是造成钉螺扩散的主要因素之一。 2 2 钉螺控制难点 由于钉螺是日本血吸虫的唯一中问宿主，因此，理论上消灭了钉螺就切断了日 本血吸虫的生活史，日本血吸虫病就无法传播。但实践中要彻底消灭钉螺并非易事。 其原因主要是受难以预测的气候和环境等自然因素变化、多种社会和经济等人为因 素的影响，使长江流域江湖洲滩的灭螺工作困难重重【5 】。目前全球控制血吸虫中间 宿主措施各异。但控制钉螺措施可以归纳为物理灭螺、药物灭螺和生物灭螺三种方 法f l l j ，其中药物灭螺是控制钉螺的主要方法。 灭螺药物包括植物源药物与化学药物。迄今为止，人工合成的化学灭螺药物已 超过70 0 0 余种。n i e 是w h o 唯一推荐使用、国内唯一登记注册批准的的化学灭螺 药物【5 1 ，分子式为c 1 3 h 8 0 4 n 2 c 1 2 ，结构式如图l ： 目 5 , 2 一二氯一4 硝基水杨酰苯胺( 5 ，2 一d i c h l o r o - 4 - n i t r o s a l i c y l i ca n i l i d e ) 图1n i e 平面结构式 n i e 系无嗅无味的黄色结晶粉末，难溶于水，易溶于有机溶剂或碱性溶剂。对 植物无害，但对鱼的毒性大( l d 5 0 为0 0 5 0 3r a g l ) ，对自鲢、草鱼、红鲤的2 4 ht l m 为0 0 4 6 0 1 0 1m g l i s l 。在实验室浸泡灭螺时，0 5m g l 死亡率为9 8 ( l d 5 0 为0 1 2 4 4 r a g l ) ，但实际应用中低浓度下钉螺有离水上爬逃逸药物作用的现象，1m g l 浸泡2 4 h 钉螺上爬率5 0 以上，影响灭螺效果。说明n i c 对鱼的毒性较大，且每吨价格超过 3 8 万元( 5 0 w p ) ，价格昂贵也大大限制了其使用量，从而使钉螺的控制难上加难。 3 研究室灭螺化合物研究 3 1 灭螺增效成分的提取分离和结构研究 为了提高n i c 灭螺效果，降低用量和成本，使用增效剂成分增j j l l n i c 抑杀钉螺效 应和减少其对非靶标生物毒性研究具有应用意义。近年来，国内外研究的灭螺增效 联合剂多局限在化学药物方面【5 l ，不仅价格较贵，而且对环境也造成污染。因此， 植物灭螺增效剂的研究将具有广阔的前景。 按照w h o 和国家的灭螺技术需求，李文新等【1 2 1 在4 0 余种含甾体生物碱的供试 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 植物中，筛选出s x 、r c 及p t 等灭螺增效植物。 冯玉文【1 3 l 从r c 原粉中提取分离的r c l 和r c 2 ，其中r c l 属甾体化合物，其 相对分子质量为7 2 5 ，1 0 l g l 浸泡钉螺1 4 4h ，死亡率为8 4 4 。r c 2 为无色针状 晶体，1 2 5m g l 浸泡钉螺4 8 h ，死亡率达到7 5 。 李文新、陈新苗等【1 2 】从r c 全草原粉水相提取物中分离出y g i j , 六醇( 图2 ) ，其 分子式为c 6 h 1 2 0 6 ，相对分子质量为15 6 ，晶体熔点为2 2 2 2 2 4 。2 5m g 几的环己 六醇浸泡钉螺7 2 h ，死亡率达到9 3 3 ；5 唔l 时钉螺死亡率达到1 0 0 。说明环己 六醇是r c 中具有灭螺高活性的成分。- 图2 环已六醇的平面结构 随后王莹莹f 1 4 j 从p t 原粉中提取分离出甾体生物碱的灭螺活性成分p t - i ，其分 子式为c 2 9 h 4 8 n 2 0 3 ，相对分子质量4 7 2 ，初步确定分子骨架结构( 图3 ) 。其0 3 5m g l 浸泡钉螺9 6 h 的死亡率达到7 6 4 ，说明p t - i 是高活性的灭螺化合物。另外5 0m g l 的p t - i 对水稻纹枯菌、黄瓜灰霉菌及苹果轮纹菌的生长抑制率分别为7 4 1 9 、6 2 5 及5 5 2 6 。说明p t - i 也是一种具有研发潜力的植物杀菌成分。 图3p t - i 的分子结构推定 李文新等从s x 果实中提取分离出含澳洲茄碱骨架的螺甾烷l s ，其分子式为 c 3 9 h 6 4 0 1 l n ，相对分子质量为7 2 1 ( 毯f l4 ) 。2 6m g l 的l s 浸泡钉螺2 4 h ，其上爬率为 0 ；浸泡钉螺1 6 8 h 的死亡率为1 0 0 ，同时对哺乳动物和鱼具有低毒的生物效应， 说明l s 是从s x 中分离的具有抑杀钉螺高效的一种新化合物。 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 2 2 - i m i d o 一3 - 4 - ( 6 ”- d e o x y - c t - l - m a n n o s i d e ) - 1 5 一d g l u c o s i d e 5 - d e h y d r os p i r os t a n ，i ta g r e e sw i t h t h en a m i n g p r i n c i p l eo fi u p a ( l s ) 图4l s 的平面结构式 王张杰【r 7 】从s x 中分离纯化出s x l 和s x 2 灭螺成分，相对分子质量分别为8 8 3 和8 8 7 ，纯度分别为9 7 8 9 和9 8 7 1 。2 0m g l s x l 浸泡钉螺7 2 h ，其死亡率1 0 0 ； 3m g ls x 2 浸泡钉螺7 2 h ，其死亡率1 0 0 。s x 2 的灭螺效果较s x l 高，且2 0m g 几s x 2 对h e l a 细胞的抑制率为9 6 8 ，说明s x 2 不仅具有较好的灭螺效应还对癌细胞的生 长也有较好的抑制作用。 曹玲伟【1 8 从d z 中提取分离有效皂甙单体d z l ，其8 0 唔l 浸泡钉螺4 8 h 的灭 螺率为9 1 6 ，说明d z l 对钉螺也具有较好的生物活性。 另外，李洲1 1 6 1 等从s x 中分离纯化出边缘茄碱，其分子式为c 4 5 h 7 3 n o l 5 ，相对分 子质量为8 6 7 ，熔点为2 9 8 3 0 5 ( 图5 ) 。其在2 8 ，0 2m g l 浸泡钉螺4 8h 的死亡率为 1 0 0 。说明边缘茄碱也是s x 中含有的另一种具有杀螺效应的化合物。 r ( 2 5 r ) 一3 p 一0 一小l r h a m n o p y r a n o s y l 一( 1 _ 2 ) o - 【q l r h a m n o p y r a n o s y l ( 1 _ 4 ) 一o - 1 3 一d - g l u c o p y r a n o s i d e 图5 边缘茄碱的平面结构式 3 2 灭螺药物的合成研究 迄今为止，人工合成的具有灭螺活性的化学药物已经超过70 0 0 余种【5 】，我室 李文新等采用肉桂酸衍生物与苯三酚反应关环合成的5 ，7 一二羟基4 。苄氧基黄烷 酮，3 0n l g l ，2 4 h 内钉螺死亡率为1 0 0 ，经口、皮急性毒性测试证明该物质属低 毒范畴，未呈现直接或间接的致畸变、致突变作用【1 9 1 。与现药物相比，该物质具有 4 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 毒性低、灭螺速度快、药效高等特点。 3 3 灭螺药物的鱼毒性研究 目前报道灭螺化合物对鱼毒性的研究较少，且限于个体水平。王张杰【1 7 1 报道 s x 原粉浓度和浸泡时间与斑马鱼死亡数均呈正相关的量效关系，1 5m g l 的s x 原 粉浸泡斑马鱼9 6 h 、1 2 0 h 及1 4 4 h ，死亡率均为1 0 ，当浓度增至6 0m g l 时斑马鱼 死亡数明显增加，7 2 h 的死亡率达6 0 。魏风华等 2 0 l 用s x 果实乙醇浸提物浸泡稀 有鲍鲫，1 7 2 8m g l 浸泡2 4 h 的死亡率为1 0 0 ( 2 4 h 的l d 5 0 为2 0 2m g l ，9 5 置信 限为1 3 3 - - 3 0 6r a g l ) 。说明s x 植物原粉及提取物对鱼均具有低毒的生物效应。王 莹莹【1 4 1 报道斑马鱼在7 5 珂g l 的p t 原粉溶液中浸泡1 6 8h ，其死亡率为0 ，说明p t 原粉也具有对鱼低毒的生物效应。 4 灭螺药物作用机理研究 对钉螺生物化学及组织化学的研究，有助于阐明钉螺在生理状况或不同的非 生理压力下的代谢变化，这对研究灭螺药物的作用机制、设计和研究高效低毒的新 型灭螺药物，以及研究钉螺对灭螺药物抗性机制均具有重要意义【5 】，但其相关研究 报导甚少。 谭苹等在研究a p 灭螺作用机理时发现，1 2 h 浸泡组的钉螺壳轴肌呈明显收缩 状态，其它部位的形态结构正常；1 8 h 浸泡组钉螺的壳轴肌不仅收缩状态明显且有 轻度肿胀，头部及触角表面平坦；足跖肌表面绒毛紊乱、部分缺失；肝脏轻度肿胀、 部分组织融合；2 4 h 浸泡组钉螺的壳轴肌断裂，头部、触角、足跖肌及肝脏等组织 均出现明显损伤。神经节细胞明显破坏，其细胞膜消失，细胞核固缩，胞质内细胞器 变性坏死，次级溶酶体增多，神经纤维断裂；足肌纤维内细胞核肿胀，肌丝排列紊乱 甚至溶解，细胞间隙明显增宽。说明a p 水浸液能机械性的破坏钉螺组织和神经细 胞，从而导致钉螺的呼吸、运动等生命功能障碍最终死亡【2 l j 。另外，谭苹等用酶组 织化学方法研究a r e 灭螺增效机制，其结果为单用a r e 浸泡钉螺2 4 h ，其中枢神 经节a t p a s e 被明显破坏，c h e 中度破坏；a r e 与五氯酚钠、n i c 及射干合用时对 钉螺中枢神经节a t p a s e 破坏作用大于后三者药物单用，各实验组s d h 和l d h 活 性无明显变化，说明药物作用位点不在三羧酸循环和无氧酵解途径，提示其增效作 用的机制在于增强其他灭螺药的药效作用，药物的灭螺位点位于阻断氧化磷酸化偶 联生成a t p 进而影响能量代谢，使钉螺丧失机械动力及生物合成等功能而死亡【2 2 l 。 戴建荣等用酶组织化学研究增效剂b 0 0 2 与n i e 复配增效机制，发现b 0 0 2 可使 5 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 钉螺头足部糖原含量减少，神经节和足肌中c h e 和n o s 活性下降，说明b 0 0 2 可 能是通过干扰钉螺神经递质的传递，使头足部肌肉失去张力，对外界反应消失，通 过增加软体与n i c 接触面来发挥增效的机制【5 】 5 灭螺药物毒鱼机理研究 目前，从酶水平上研究灭螺药物致鱼虾死亡的机制尚未见报道，但有机磷农 药使鱼a c h e 中毒机理的研究积累较多。a c h e 是维持体内胆碱能神经冲动非常重 要的水解酶，也是有机磷和氨基甲酸酯类农药的特异性抑制靶点因l ，其机理主要是 使神经的化学递质a c h 大量蓄积并作用于胆碱能受体，进而导致神经系统功能紊 乱，或直接作用于胆碱能受体导致下一神经元或效应器过度兴奋或抑制 2 4 1o 若a c h e 受到有机磷和氨基甲酸酯类农药抑制，酶的活性就会降低并存在一定的剂量和效应 关系【2 5 1 ，刘晓宇等报道1m g l8 0 的敌敌畏对鲫鱼( c a r a s s i u sa u r a t u s ) 脑a c h e 活性 的抑制率为9 3 5 1 2 6 l 。钱云等以鲤鱼( c y p r i n u s c a r p i ol i n n a e u s ) a c h e 活力为指标， 发现有机磷农药联用均产生较强的协同作用口7 1 。仪美芹等报道灭多威、硫双灭多威、 克百威、丁硫克百威对鲫鱼脑a c h e 活性的i c 5 0 分别为9 4 7 x 1 0 一、1 3 4 x 1 0 - 6 , 2 4 x 1 0 、 2 7 5 x 1 0 石m o u l 。上述结果均说明鲫鱼脑a c h e 对氨基甲酸酯类农药敏感。因此， a c h e 可以作为检测环境中有机磷和氨基甲酸酯类农药的污染瞄j 。 转氨酶是催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶，其中以g o t 和g p t 最为 重要，g p t 绝大部分位于细胞浆中，g o t 贝f j 主要位于线粒体中。正常情况下，g p t 、 g o t 在肝脏中的活性很高，当外界环境发生改变时机体通过酶活力的改变产生一种 非特异性防御反应，其目的是克服外界药物的危害而保持体内平衡1 2 引。当肝脏等组 织细胞受到损害时，会引起生物膜通透性增加，细胞浆内的g p t 首先释放到血液中， 当线粒体膜受到损伤后g o t 也会随之释放到血液中导致血清q j g p t 活力上升，肝脏 中g p t 、g o t 活力下降f 2 9 l 。当受损程度严重甚至坏死，致使肝脏中g p t 、g o t 合成 减少时，会出现肝脏中g p t 、g o t 酶活上升的现象f 3 叭。杨端等报道水中毒物剂量与 鱼血清转氨酶活性有相关性，水中毒物浓度越高g o t 和g p t 活力越高p ，王少博等报 道重金属铬和镉不仅能够影响草鱼( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l u s ) 主要酶的活力，使鱼体 组织器官明显受损，且两者表现出明显的协同损伤作用眈1 ，汝少国等报道0 0 1 硼g l 的久效磷能使g p t 活力显著下降，但g o t 活力下降并不明显，表明金鱼( c a r a s s i u s a u r a t u s ) 肝脏中g p t h ：g o t 对久效磷毒性作用的响应更为敏感【3 3 l ，徐镜波等指出鲤 鱼血清g p t 可作为一项指标用于生态毒理学研究1 3 4 。 因此，本文选取水体中具有代表性的鲫鱼和青虾作材料，试图从其脑a c h e 、 6 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i $ 肝脏g p t 和g o t 对灭螺药物的敏感性研究入手，找出其常用灭螺药物致使鱼虾死亡 的生化机理，从而为新型灭螺药物的研究提供生化依据。 6 研究内容及意义 ( 1 ) s x 果实中抑螺成分的提取分离和结构剖析研究 以抑制钉螺上爬和生物碱成分为指标，从s x 果实中提取生物碱，常规物化法剖 析其结构，为n i c 抑螺增效研究提供物质基础。 ( 2 ) 鲫鱼和青虾a c h e 、g p t 及g o t 动力学特性及对灭螺药物的敏感性研究 设定酶促反应影响的主要因素及其水平，用正交试验法测定分析确定其反应的 最佳条件组合；以在酶促反应最佳条件下的活力为指标，研究有( 无) 机灭螺药物对 鲫鱼和青虾a c h e 、g p t 及g o t 活力影响，其结果为阐明灭螺药物的毒鱼机制或环 境安全评价提供依据。 7 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 第二章s x 果实中灭螺生物碱的提取分离、结构剖析 及灭螺抑菌活性研究 研究背景 在现场使用n i c 会引起钉螺逃逸，以致增 j h n i c 的用量从而污染环境，研制抑制 钉螺上爬灭螺药物或：n i c 增效成分，是新型药物研究的热点。s x 是近年筛选的含甾 体生物碱中草药灭螺植物，1 2 0m g l 的1 5 0p m 果实原粉浸泡钉螺2 4 h ，抑螺率达到 9 3 3 ，4 3 2 瑚g l 的果实乙醇浸提生物总碱浸泡钉螺2 4 h 和4 8 h ，其死亡率分别为 9 6 7 和1 0 0 1 1 7 1 。现有研究成果说明s x 果实原粉和其生物碱均有抑杀钉螺高效的技 术特点。本章研究s x 果实中抑螺成分的提取分离和结构剖析，测定评价其灭螺抑菌 活性，为n i c 复配增效等应用研究提供物质基础。 1 试验材料、试剂及仪器设备 1 1 材料试剂 s x 原粉为实验室自制。使用钉螺亚种的肋壳钉螺株成螺，采自湖北省荆州市 李埠镇沟渠，用清水洗净后于实验室内饲养待用。去氯水为静置7 d 后的自来水。 甲醇( m e o h ) 、无水乙醇( e t o h ) 、氯仿、丙酮、乙酸、氨水、乙酸乙脂均为a r ， 上海试剂一厂；乙腈和乙酸铵g r ，北京八方公司。 1 2 仪器设备 循环水真空泵( s h z d i i i 型，上海亚荣生化仪器厂) ； 电热鼓风干燥箱( s p g 一9 0 7 2 ，东联哈尔滨仪器制造有限公司) ； 恒温水浴锅( h h - 4 ，金坛市科兴仪器厂) ； 液相分析色谱( a g i l e n t l l 0 0 ，美国a g i l e n t 公司) ； 质谱仪( l c m s m s ，美国a p p l i e db i o s y s t e m s 公司) ； c h n s o 元素分析仪( v a r i oe l s d ，德国e l e m e n t a r 公司) ； 傅立叶红外光谱仪( a v a t a r 3 6 0 ，美国n i c o l e t 公司) ； u v - v i s 分光光度计( s 3 1 0 0 ，韩国s i n e o 公司) ； 蒸发光散射仪( s e d e x 5 5 ，法国s e d e x 公司) ： 8 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 高速冷冻离心机( 毪5 ，法国j 0 u 柚公司) ； 显微镜( l e i c ad m 4 0 0 ，美国l e i c a 公司) 。 2 试验方法 2 1s x 生物碱的提取分离 取s x 果实原粉2 0 0g 入瓶，先加7 倍水溶解再用适量1 0 h c l 调整浸提剂p h 至5 ，置室温浸提1 2h 后4 层纱布过滤，滤液离心( 40 0 0r p m ，1 0m i n ) 去渣，收 得含生物碱盐的酸性提取液约l0 0 0m l 。用5 氨水将酸性提取液调p h 至1 2 ，碱 性液室温静置1 2 h 后离心，用适量1 乙酸溶解沉淀后中速滤纸过滤，酸性滤液二 次碱化后用适量e t o h 溶解过滤，收得醇溶解总碱性物( s x 总碱) ，置3 0 烘干备用。 按t l c 预试分离条件，取2g 试样溶于m e o h 后与6 0 8 0 目硅胶拌合，平置于 同目的硅胶g 填充柱( 巾3 0 x 6 0 锄) 内，用乙酸乙酯：m e o h ( 1 2 ：8 ，v ，p h s ) 平衡 后以2m l m i n 速度洗脱，收集4 0m l 瓶，t l c 法示踪合并有效组分。置室温4 5d 显现结晶，中速滤纸过滤收得晶体，再溶于平衡液重结晶2 3 次，获得s x 碱性提 取物s x l 、2 和3 的结晶。提取分离流程见图l 9 硕士学位论文 m a $ t e r st h e s l 8 s x 原粉( 2 0 0 9 ) 卜- 7 倍中性h 2 0 浸泡， 广1 0 h c i 调至p h 5 室温静置1 2 h l4 层纱布过滤 厂上 滤液残渣 卜一离，1 i , ( 4 0 0 0 r p m , l o n i i n ) 不溶物( 弃) 上清( 弃) 调至p h l 2 s x l ( 3 2m g ) s x 2 ( 4 0m g ) s x 3 ( 2 7 唱) 图ls x 3 生物碱提取分离流程 f i g le x t r a c t i o na n di s o l a t i o np r o c e s s