（动物学专业论文）基于线粒体cyt+b基因的蟋蟀科分子系统学研究（直翅目：蟋蟀总科）.pdf

基于线粒体c y t6 基因的蟋蟀科分子系统学研究 ( 直翅目：蟋蟀总科) 那素芳 摘要：蟋蟀科( g r y l l i d a e ) 隶属于昆虫纲直翅目螽亚目蟋蟀总科( i n s e c t a ： o r t h o p t e r a ：e n s i f e r a ：g r y l l o i d e a ) 。蟋蟀科昆虫既是类观赏性昆虫，又是药用和 食用的资源昆虫，同时也是主要的农业害虫之一。国内外对蟋蟀科昆虫的分类研 究工作主要集中在形态分类、鸣声分类、细胞学等方面。本研究趴线粒体基n c y t b 为分子标记对蟋蟀科部分种类的系统发育关系进行了重建，为蟋蟀科的系统学研 究提供分子依据。 本研究应用昆虫的通用引物扩增出蟋蟀科7 属翘异针蟋属1 种作为外群共3 5 条c y t b 基因部分序列，序列长度为5 7 9b 口( 去除引物序列) ，从分子水平上对蟋 蟀科部分类群属种间的系统进化关系进行了研究，得出以下结论： 1 蟋蟀科3 5 条c y t b 基因部分序列在碱基组成上具有偏好性。a 、t 、g 、c 的平均含量分别为3 2 6 、3 6 4 、1 0 + 1 、2 0 8 ，a + t 含量为6 9 ，而g + c 含 量为3 0 9 ，a + t 含量明显高于g + c 含量。密码子第三位点a 卜t 平均含量最高。 第三位点的高转换率与其高a + t 含量有关，转换率稍高于颠换率说明本科昆虫分 歧时间较近。另外c y t b 基因在密码子的使用上及氨基酸组成上也具有偏向性。 2 对于蟋蟀科7 属1 8 种蟋蟀，用几种建树方法所构建的分子系统的拓扑结构一 致，系统发生关系为：( ( 哑蟋属+ 秦蟋属) + ( 棺头蟋属+ ( ( 油葫芦属+ 蟋埠属) + ( 斗蟋属+ 灶蟋属) ) ) ) 。各属种间的系统关系基本和李恺博士论文中传统分类 的结果一致。哑蟋属和秦蟋属是比较原始的类群，且支持油葫芦属和斗蟋属有着 较近的亲缘关系，而与棺头蟋属亲缘关系较远。 3 对于棺头蟋属内种间的系统发育关系，用几种建树方法所构建的分子系统 的拓扑结构一致，系统发生关系为：( 尖角棺头蟋+ ( ( 泰康棺头蟋+ 石首棺头蟋) + ( ( ( 多伊棺头蟋+ 窃棺头蟋) + 小棺头蟋) + 哈尼棺头蟋) ) ) 。其中泰康棺头蟋 + 石首棺头蟋是比较原始的类群；支持哈尼棺头蟋和窃棺头蟋分别为两个种的观 点，但对于尖角棺头蟋及小棺头蟋的分类地位与李恺博士论文略有差别，还需要 结合其他方法进一步研究。 4 对分别采自蓝田、翠华山、旬阳、柞水和眉县营头五个不同地理区域的多 伊棺头蟋的c y t6 基因片段序列进行了重复试验，结果显示所测序列完全一致，没 有地域差异，可能原因有以下几种推测：c y t6 基因在种内是稳定的；我榴选捌哥帛 每帅绣翻讽玎1 舜酗砷舶嘲本够多f 5 和g e n b a n k 中的双斑蟋c y t6 基因( g r y l l u sb i m a c u l a t u s ) 的全序列比较，扩 增得到的序列位于线粒体基因组全序列c y t6 基因序列的中后段( 1 0 7 6 3 11 3 4 2 ) ， 所包含的变异位点较多( 变异位点数为2 5 8 个，变异率为4 4 ，5 5 ，其中简约信息位 点数为2 2 1 个，占整个变异总数8 5 6 6 的，单个碱基变化位点数3 7 个) 。运用c y t6 基因的核苷酸序列对蟋蟀科进行系统进化分析，结果显示：科内属种间的系统关 系比较明确，得到的系统发育树的拓扑结构一致，且置信值较高。园此通过该实 验可以看a c y t6 基因在蟋蟀科昆虫的分子系统进化分析中可以作为有效的分子遗 传标记，且适合于进行属种分类单元之间的系统进化研究。 关键词：蟋蟀科，c y t6 ，分子系统学 m o l e c u l a rp h y l o g e n yo fg r y l l i d a ei n f e r r e df r o mc y tbg e n e ( o r t h o p t e r a ：g r y l l o i d e a ) d a n gs u - f a n g a b s t r a c t ：c 毋, l l i d a ei sal a r g ef a m i l yi ng r y l l o i d e a ( i n s e c t a ：o r t h o p t e r a ：e n d i f e r a ) m o s ts p e c i e so f t h ef a m i l ya r ea g r i c u l t u r a lp e s t sa n ds o m ec a nb eu s e df o re n t e r t a i n m e n t o rm e d i c a la n de d i b l er e s o l i r o c e i nt h ep a s ty e a r s ，i t sm o r p h o l o g y ，s t r i d u l a t i o na n d c y t o l o g yh a db e e ns t u d i e d o n l yaf e wm o l e c u l a rt a x o n o m i cw o r kh a db e e nd o n e b a s e d o nm t d n ac y tbg e n e ，t h i ss t u d , r e c o n s t r u c t e di t sp h y l o g e n ya n do f f e r e ds o m e e v i d e n c e st ot h ee l a s s f i c a t i o no fc r r y l l i d a e w i t hu n i v e r s a lp r i m e r s ，p a r t i a ls e q u e n c e s ( 5 7 9 b p ) o f3 5i n d i v i d u a l si ng r y l l i d a e ， i n c l u d i n g7g e n u s18s p e c i e s ，h a db e e ns e q u e n c e d b ya n a l y s i n gt h ec o m p o n e n t s ，t h e s a t u r a t i o no fs u b s t i l u t i o n , t h e b i a so fb a s e p a i r sa n dp h y l o g e n e t i cs i g n a lo ft h e s e s e q u e n c e s ，w er e c o n s t r u c t e di t sp h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i po fg r y l l i d a e t h ec o n c l u s i o n s 黜a sf o t l o w s ： i ) t h e3 5s e q u e n c e so fg r y t l i d a ep r e s e n t sah i g ha tb i a s ：a m o n gt h e s es e q u e n c e s ， t h ea v e r a g ep e r c e n t a g eo fa + ti s6 9 ( a _ 3 2 6 ，t 2 3 6 4 ，c = 2 0 8 ，g 2 1 0 1 ) ， w h i l ec + gi s3 0 9 t h ea v e r a g ep e r c e n t a g eo fa + ti nt h e3 r dp o s i t i o no ft h ec o d o ni s t h eh i g h e s tt r a n s i t i o n sa r es l i g h t l yh i g h e rt h a nt r a n s v e r s i o n s ( r = i 1 ) w h i c hd e p e n do n 廿l iv e l e c i t yo fe v o l u t i o n e s p e c i a l yi nt h e3 r dp o s i t i o no b v i o u s l y t r a n s i t i o n sm o s t l y o e x l l rb e t w e e nta n da ，a n dn o td e a l sw i t hb e t w e e nca n dg ；t r a n s v e r s i o n sm o s t l y o o t i i eb e t w e e nta n dc t h eu s eo fc o d o na n da m m o n i aa c i d sp r e s e n tad i s t i n c tb i a s 2 、m o l e c u l a rp b y l o g e n e t i ct r e e so fg r y l l i d a eh a db e e nr e c o n s t r u c t e db ys e v e r a l m e t h o d s t h er e s u l t sc o n f o r m e dw i t ht h et a x o n o m i cv i e w s t h er e l a t i o n s h i po ft h e s e g e n e r ai s ( ( g o n i o g r y l l u s , q i n g r y l l u s ) o x o b l e m m u s ( ( t e l e o g r y l l u s ，g r y l l u s ) ( g e l a r i f i c t o r u s , g r y l l o d e s ) ) ) ) g o n i o g r y l l u sa n dq i n g r y l l u sa r eo r i g i n a l c l a d e s t h e c l a d i s t i ca n a l y s i ss h o w st e l e o g r y l l u si sc l o s e rt ov e l a r i f i c t o r u sw h i c hp r e s e n t sam o r e d i s t a n tr e l a f i o n s h i pt ol o x o b l e m m u s 3 ) d i f f e r e n tm e t h o d sw e r eu s e d t or e c o n s t r u c tt h e p h y l o g e n e t i c t r e e so f l o x o b l e m m u s + t h er e s u l t sw i l lb es h o w e da sf o l l o w s ：t h er e l a t i o n s h i po f t h e s es p e c i e si s ( la n g u l a t u s ( t a i c o u n ，le q u e s 扫i s ) ( ( d o e n i 据i ，三d e t e c t u s ) l a o m o r i e n s i s ) l 1 1 i h a a n i ) ) ) ；l t a i c o u na n dle q u e s t r i sa r e o r i g i n a lc l a d e s ；s u p p o r tt h ev i e wo f c o n s i d e r i n glh a a n ia n dl d e t e c t u sa st w od i f f e r e n ts p e c i e s r e s p e c t i v e l y t h es t a t u so f la n g u l a t u sa n dla o m o r i e n s i sn e e d se x t e n s i v es t u d y 4 ) t h es e q u e n c e so fc y tbg e n et o1 0i n d i v i d u a l so fl d o e n i 红ic o l l e c t e d 丘o m5 r e g i o n ss h o w st h a tt h e s es e q u e n c e sa r ee x a c t l yt h es i m i l a rw i t l le a c ho t h e r w k c h p r o v e dc y tbg e n ei sv e r ys t a b l ea m o n gd i f f e r e n ti n d i v i d u a l so ft h es a m es p e c i e s m a y b et h er a n g eo fr e g i o na n dg e n ec h o s e ni sa p p r o p r i a t e 5 1 c o m p a r e d 、v i t l lt h ec o m p l e t ec y t bg e n es e q u e n c eo fg r y l l u s ( g r y l l u s b i m a c u l a t u s ) f r o mg e n b a n k ，w ef o u n dt h a tt h e s e3 5s e q u e n c e sl o c a t et h el a t t e rp a r ta n d i n c l u d em a n ys i g n a ls i t e s t h er e s u l t ss h o wt h a td i f f e r e n tm e t h o d sc o u l dr e c o n s t r u c t e d t h es a m et r e e s ，a n de v e r yb r a n c hp r e s e n tah i g hs u p p o s e dv a l u e s ，w h i c hp r o v e st h a tt h e r e l a t i o n s h i p sb e t w e e ng e n e r aa n db e t w e e ns p e c i e sa r ev e r yd i s t i n c t s ow ec o n c l u d et h a t t h ec y tbg e n ei ss u i t a b l et os o l v et h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p sa tt h el e v e ro f f a m i l yo r g e n u s k e y w o r d s ：g r y l l i d a e ，c y tb ，m o l e c u l a rp h y l o g e n y i v 学位论文独创性声明 y 9 0 0 16 5 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文 中不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕 西师范大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢 意。 作者签名：盐叠蔓日期：兰! ：! g 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕 西师范大学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时 署名单位仍为陕西师范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部 门或其它指定机构送交论文的电子版和纸质版；有权将学位论文用于 非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查 阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索；有权将学位论 文的标题和摘要汇编出版。 作者签名：鼍e 童蔓日期：迎五：圭。! g 第一部分前言 1 蟋蟀科的研究现状 蟋蟀科隶属于昆虫纲直翅目螽亚目蟋蟀总科( i n s e c t a ：o r t h o p t e r a ：e n d i f e r a ： g r y l l o i d e a ) ，是蟋蟀总科中种类最多的类群【l 】。目前，全世界已知约1 7 0 多个属， 4 9 0 多种。我国已知约2 1 属，7 0 余种。其中有些种类具有观赏性和娱乐性，某些种 类也是主要的农林业害虫，它们咬食作物的根、茎、叶、果实和种子，曾经造成 严重危害，给农业生产带来了极大的经济损失。 1 1 蟋蟀的形态特征和生活习性 蟋蟀的外形及大小变化较大，一般有圆柱形、卵形、细长形、背腹扁平形等 多种形状。体长长可达5 0 毫米，短的只有3 毫米。体色多为褐色或黑褐色、黄褐色， 体表一般被短柔毛。身体分为头、胸、腹三部分。 头部：头一般呈圆形或棺头形，口器为典型的咀嚼式口器，触角为丝状，通 常超过体长，其中一些种类的雄性在触角第一节上具突起。 胸部：前胸背板具毛或光滑，前后缘凹入或凸出，或者呈一直线。有些种类 在后胸背板具陷窝。前胸背板的形状、颜色等特征在分类上较为重要。 翅：前翅一般较发达，有些种类前翅较小或无翅，某些种雌、雄翅脉相似。 后翅较长或缺后翅，后翅在分类中不重要。 足：大多在前足胫节基部具听器，少数种类缺失。跗节3 节，第二跗节的形状 在科一级的分类上特别重要。后足胫节背面刺及齿的有无及数量，是分类上的一 个重要特征。 腹部：腹部的重要分类特征是雄性的生殖器和雌性的产卵瓣的形状以及长短。 蟋蟀是渐变态昆虫。生活史大多一年一代，以卵在土壤中越冬。若虫5 - - 6 龄， 第二龄后出现翅芽，后翅覆在前翅的上面，此点可与短翅形种类相区别。成虫一 般出现在八九月份，个别种类五月份就已经呜叫，成虫期约为5 个月以上，穴居型 或生活于腐叶层下或碎石之中，还有一些种类生活在茅草丛或灌木丛中。蟋蟀大 多为夜间活动。 1 2 蟋蟀科的分类地位 在1 9 3 2 年前，大多数分类学家只承认蟋蟀为直翅目的蟋蟀科( g r y l l i d a e ) ，蝼 蛄为其亚科之一，而b r u e s & m e l a n d e r ( 1 9 3 2 ) 明确区分了蟋蟀科和蝼蛄科 ( c r y l l o t a l p i d a e ) ，其中蟋蟀科又分为6 亚科。c h o p a r d ( 1 9 3 4 ) 仍维持1 个科：蟋 蟀科；但在1 9 4 9 年他承认了蟋蟀总科( g r y h o i d e a ) ，含1 2 个科( 包括蝼蛄科) 、8 个亚科。1 9 7 3 年，d i r s h 将蟋蟀和蝼蛄上升为目。我国学者殷海生、刘宪伟( 1 9 9 5 ) 把蟋蟀总科分为1 0 科、9 亚科，蝼蛄为另一总科。o t t e ，d ( 1 9 9 6 ) 把蟋蟀总科分为 4 科( 含蝼蛄科) ，1 8 亚科。目前，还没有一种分类系统得到普遍承认，但大多数 分类学家承认蟋蟀为总科，蟋蟀总科一般分为9 1 1 科，其中蟋蟀科分为8 个亚科9 个族3 个亚族1 7 0 个属。我国的蟋蟀类昆虫隶属于以下1 0 科 2 】： m y r r n e c o p h i l i d a e 蚁蟋科 t r i g o n i d i i d a e 蛉蟋科 g r y l l i d a e 蟋蟀科 g r y l l o m o r p h i d a e 貌蟋科 m o g o p l i s f i d a e 癞蟋科 s c l e r o g r y u i d a e 铁蟋科 c a c h o p l i s f i a e 扩胸蟋科 p h a l a n g o p s i d a e 蛛蟋科 o e c a n t h i d a e 树蟋科 e n e o p t e r i d a e 蛄蟋科 本研究所采用的分类系统是以殷海生、刘宪伟的分类系统为准，分别属于蟋 蟀科中的7 属1 8 种。 1 3 蟋蟀的系统学研究 1 3 1 形态分类方面的研究 1 ) 国外的研究现状： 蟋蟀的系统学研究，主要集中在形态分类方面。从世界范围讲，以欧洲的蟋 蟀类昆虫分类研究较为彻底、全面。1 9 6 9 年，h a r z ，k 出版 t h e o r t h o p t e r a o f e u r o p e ， v 0 1 1 一书，书中系统的研究了欧洲蟋蟀科昆虫的区系分类，共记载9 亚科、4 族、 2 2 属、7 3 种。六十年代以来，v i c k e r y ，v tr 等对加拿大的蟋蟀进行了研究，并于 1 9 7 4 年出版了t h eo r t h o p t e r o i d i n s e c t s o f q u e b e c a n d a t l a n t i c p r o v i n c e s o f c a n a d a 一书( 7 】，5 ：1 9 8 3 年出版了( ( a m o n o g r a p ho ft h eo r t h o p t e r o i di n s e c t so fc a n a d aa n d 娟a c e n tr e g i o n s ) ) 一书。1 9 8 3 年，o t t e ，d 和a l e x a n d e r ，p d 对澳大利亚蟋蟀作了 系统的研究，出版了( ( t h ea u s t r a l i a nc r i c k e t s ) ) 一书【9 。在亚洲，s h i r a k i ，t 对日 本蟋蟀类昆虫作了全面研究，于1 9 3 0 年发表( ( o r t h o p t e r ao ft h ej a p a n e s ee m p i r e i g r y l l o t a l p i d a ea n dc n y l l l i d a e ) ) 一文，共记载2 科、1 6 亚科、3 7 属、8 8 种。c h o p a r d 自二十世纪初到六十年代，对东南亚和阿拉伯半岛以及伊朗、以色列、阿富汗和 日本等地的蟋蟀进行了研究，并于1 9 6 9 年出版t h e f a u n a o f i n d i aa n d t h e a d j a c e n t c o u n t r i e s ，o r t h o p t e r a ，v 0 1 2 g r y l l o i d e a ) ) 一书，该书详细地研究了印度及其邻 近地区的蟋蟀总科昆虫的区系分类，涉及1 2 科、8 7 属、3 5 5 种，并给出了分科、分 属、分种的检索表，对每一种都进行了描述，实为一部研究东洋区蟋蟀总科昆虫 分类的专著川。 2 ) 国内的研究现状： 在我国，最初饲养蟋蟀是为了欣赏其鸣声，而后最常见的是斗蟋蟀的游戏。 相反，对蟋蟀类昆虫进行科学分类的研究则起步很晚。1 9 1 1 年，s h i r a k i 出版 m o n o g r a p h i e d e rg r y l l i d e ny o nf o r m o s a ，m i td e ru e b e r s i c h td e rj a p a n i s c h e na r t e n 一书，系统地研究了台湾的蟋蟀科昆虫的分类，涉及6 亚科、2 4 属、5 0 种【4 j 。1 9 2 9 年，徐荫棋对采自北平、苏州、山东、无锡、北戴河、海南岛、福建等地的蟋蟀 类昆虫进行了分类，共记载7 亚科、1 7 n 、3 6 种；1 9 3 1 年，他又对采自济南、厦门、 南京、杭州和苏州的蟋蟀类昆虫进行了分类研究，分出2 科、1 l 亚科、1 9 属、5 0 种。 1 9 3 5 年，胡经甫在 c a t a l o g u si n s e c t o r u ms i n e n s i u mv 0 1 1 一书中记载蟋蟀类昆 虫共2 科、1 2 亚科、2 3 属、5 7 种【”。1 9 3 6 年，c h o p a r d 发表( ( n o t e ss u rl e sg r y l l i d e sd e c h i n a 一文，共记载蟋蟀科昆虫1 0 亚科、2 0 属、3 7 种垆j 。1 9 5 9 年，b e i b i e n k 对中 国境内的蟋蟀科昆虫进行了分类研究，记载9 亚科、1 6 属、2 8 种。c h o p a r d ( 1 9 6 7 1 9 6 8 ) 1 在 o r t h o p t e r o r u mc a t a l o g u sp a r t s1 0 1 2 g r y l l i d e s ) ) 一书中记载在中 国有分布的蟋蟀总科昆虫共3 科、8 亚科、1 2 族、4 5 属、1 1 4 种眵。1 9 8 5 年，g o t o k h o v 在 o n t h e f a u n a o f g r y l l o i d e a o f c h i n a ) ) 一文中共记载蟋蟀总科昆虫6 亚科、1 7 n 、 2 9 种。康乐( 1 9 9 0 ) 对内蒙古自治区螽亚目( t e t t i g o n i o d e a ) 昆虫区系及地带性分 布作了研究，其中记载蟋蟀类昆虫2 科、6 属、1 2 种【l “。1 9 9 1 年，夏凯龄等记述海 南、云南等地的蟋蟀2 种，1 9 9 2 年记载武陵山地区蟋蟀总科昆虫5 科、1 8 属、2 8 种【1 1 ”j 。 1 9 9 2 年，吴福桢等记述甲蟋属( a c a nt h o p l i s t u s ) 3 种、哑蟋属( g o n i o g r y l l u s ) 8 种， 并记载横断山区蟋蟀总科昆虫3 科、6 属、6 种【1 3 i s 。同年，王音等对我国油葫芦属 t e l e o g r y l l u s 的昆虫进行了分类研究，并记述了片蛄蛉属t r u l j a l i a4 种。1 9 9 4 年，王 音、吴福祯报道了我国常见蟋蟀种类的识别【1 6 - 1 7 】。1 9 9 5 年，殷海生、刘宪伟出版 了中国蟋蟀总科和蝼蛄总科分类概要一书，共记述蟋蟀总科9 个科、1 i 亚科、 6 2 属、1 8 9 种( 亚科) 。尤平、郑哲民( 1 9 9 7 ) 对陕西省蟋蟀总科呙穆薛了初步报 道，共记载4 科、1 6 属、3 7 种 1 8 】。陈军、郑哲民( 1 9 9 5 ，1 9 9 6 ) 、殷海生等( 1 9 9 6 ， 1 9 9 8 ) 、李恺、郑哲民( 1 9 9 8 ) 分别对我国蟋蟀总科的种类作了报道【1 92 “。目前我 国蟋蟀总科昆虫已知约2 0 0 种，隶属于1 0 科6 4 属。 1 3 2 细胞学方面的研究 细胞分类学( c y t o t a x o n o m y ) 是利用细胞学特征进行生物分类的学科。目前 应用的细胞学特征多为染色体的数目，结构与行为，所以又称为染色体分类 ( c h r o m o s o m a lt a x o n o m y ) 。它可以解决常规形态分类难以解决的问题，是现代综 合分类的重要组成部分。 在蟋蟀类昆虫的染色体研究方面，1 9 2 7 年，o h m a c h i ，e 经过对1 8 种蟋蟀的 染色体数目和性染色体的特征进行研究后提出了一个新的分类系统，建立了树蟋 科( o e c a n t h i d a e ) ，下分两亚科，并将针蟋属n e m o b i t u s 提升为针蟋亚科 ( n e m o b i i n a e ) ，从而使原来的蟋蟀科( g r y l l i d a e ) 分为4 亚科，树蟋科和蟋蟀科组 成蟋蟀总科瞄1 。此外，国外还有其他许多学者对蟋蟀总科昆虫的染色体研究做了 工作。我国在这方面的工作做的不多，1 9 9 7 年尤平、郑哲民概述了蟋蟀总科 ( g r y l l o i d a e ) 的细胞分类研究及核型演化【2 6 】。尤平、刘建玲、秦铭、郑哲民( 1 9 9 7 ) 分析了分布于湖北五当山，神农架，陕西西安，洋县，延安的黄脸油葫芦( t e l e o g r y l l u s e m m a ) 五种群的染色体，并应用核型似近系数对这五种群作了比较研究。展示了 这五个种群的亲缘关系，为黄脸油葫芦的生物多样性及演化关系提供染色体方面 的资料【27 1 。同年，李延清、尤平、郑哲民利用体内注射秋水仙素，精巢低渗和空 气干燥法，分析了两种蟋蟀的核型，并与前人的工作作了比较，得出了哑蟋属 ( g o n i o g r y l l u s ) 在蟋蟀科( g r y l l i d a e ) 中形态较为原始等结论1 2 8 1 。1 9 9 8 年，尤平、 郑哲民首次报道了峨嵋哑蟋( g o n i o g r y l l u s e m e i c u sw ue tw a n 9 1 9 9 2 ) 藏蜀哑蟋 ( g p o t a n i n i b - b i e n k 0 1 9 5 6 ) 及一种聋蟋( c o p h o g r y l l u ss p ) 的核型，并作了比较 研究，同时，对聋蟋的c 带也作了报道【2 9 】。尤平、郑哲民( 2 0 0 1 ) 对五种棺头蟋 的核型进行了比较研究，其还应用核型近似系数及进化距离对这5 种蟋蟀作了聚类 分析、得出了它们的演化方向【3 0 】。2 0 0 3 年尤平、谢志红报道了中国4 种蟋蟀的染 色体c 带核型，对蟋蟀染色体及c 带核型在分类中的意义作了初步的探讨【j lj 。总 的来说，染色体特征在蟋蟀总科昆虫的系统学研究中的应用还不十分广泛。 1 3 3 鸣声分类的研究 昆虫声学是生物声学的一个重要组成部分。昆虫学家发现对蟋蟀类昆虫行为 特征的研究主要集中在发声行为的研究。蟋蟀鸣声是同种雌雄个体间的一种联络 信号，具有种的特异性。 将蟋蟀的鸣声用于分类则开始于二十世纪。由于不同种蟋蟀翅上摩擦脉的齿 列排列不同，音齿的形状不同，音齿上小齿的形状及稀疏程度不同，摩擦部位不 同等，故不同蟋蟀的鸣声结构不同。a l l a r d ， h 首次将蟋蟀的鸣声用于种类的分 4 类鉴定上；f u l t o n ，b ( 1 9 1 5 ) 则描述了纽约州树蟋属o e c a n t h u s 的鸣声，并于1 9 3 2 年以鸣声为特征，编制了北卡罗来纳螽蜥科和蟋蟀科的检索表。随后，w a l k e r ，工 j 利用鸣声将本地区分类混乱的树蟋进行了明确分类，并对美国南部地区和加勒比 地区蟋蟀总科昆虫作了分类研究，证实了召唤声的差异可揭示近缘种的不同。 自二十世纪初以来，据不完全统计，约有近千种蟋蟀被录音分析和用于分类，特 别在近缘种的区别上，鸣声特征显出了其独特的优点。目前，发声作为系统学特 征，在我国应用有所增多。吴福祯等( 1 9 8 6 ) 对蟋蟀部分种类的鸣声进行了分类 研究口z j 。李恺、郑哲民( 1 9 9 9 ) 对蟋蟀科棺头蟋属l o x o b l e m m u s6 9 e 常见种类的鸣 声特征进行了较为系统的分析研究。从其频域特征和时域特征上明显地显示了种 间差异，并将其鸣声特征用于分类【3 ”。1 9 9 9 年李恺、廉振民对湖北省分属于3 科不 同属的3 种蟋蟀的鸣声结构进行了较系统的分析，从频域特征和时域特征明显地显 示了种间差异【3 4 1 。2 0 0 2 年芦荣胜、杨培林等应用计算机技术，分析了山西历山自 然保护区的白须双针蟋、短翅灶蟋、银川油葫芦、迷卡斗蟋4 种蟋蟀雄性的鸣声结 构【3 5 】。 已有实验表明，鸣声特征在不同分类阶元存在着差异，特别是对近缘种的鉴 别和种下分类是相当简便而有效的方法。总之，鸣虫的鸣声具其种的特异性，用 声学方法对鸣声进行分析所得的种类特征是鉴别种类简便而可行的手段，同时也 为考察大自然中鸣虫的分布和种群密度，研究声语言特征以及进行声引诱提供经 济而简便的方法。 1 3 4 发音器的分类研究 由于研究方法的改进特别是电子显微镜的应用，使人类对昆虫的发音器的显 微结构才有了比较清楚的了解并运用于系统学研究中。而蟋蟀发声器，作为系统 学性状，应用并不广泛。w a l k e r ( 1 9 6 2 ) 在普通光学显微镜下，观察并测量了美国 1 5 种树蟋的声锉长度、声齿数目及声齿密度的范围值和平均值，并用于近缘种的 区别：1 9 7 5 年，w a l k e r 又在扫描电镜下，观察了7 科2 1 种蟋蟀的声锉和声齿结构， 发现蟋蟀的声锉和声齿在种间存在明显差异，但同种不同个体间差异不明显，并比 较了鸣声差异与声齿差异之间的相关关系，发现具有很不相同的声锉和声齿种类 发出的呜声差异很大：声齿结构的主要差异跟主要的谱系分化有关系，甚至还可 以证明仅仅依据声锉结构就可以将大多数蟋蟀种类鉴定到科 2 6 1 。我国学者吴福祯 ( 1 9 8 6 ) 在蟋蟀种类鉴定和描述时，使用了声锉特征。陕西师范大学动物研究所 的谢令德( 2 0 0 1 ) 应用扫描电镜观察了蟋蟀总科中3 科5 属1 0 种蟋蟀的音齿形态结 构，研究结果表明，蟋蟀类昆虫音齿形态结构在种间、属间都存在明显差异，而 种内差异极小，据此可以作为蟋蟀分类的一项重要特征1 。随后，谢令德、郑哲 民( 2 0 0 1 ) 利用扫描电镜观察了3 种蟋蟀科昆虫的音锉及附近翅面微毛结构，观察 结果说明音锉和音齿的超微形态结构及其前翅微毛特征在蟋蟀分类中都具有重要 意义。”。同年，谢令德、郑哲民利用扫描电镜观察并描述了棺头蟋属4 种常见昆虫， 首次使用拐角、音齿分布、音齿左右端等形态特征，为棺头蟋属乃至蟋蟀科种类 鉴定提供了新的分类依据o 。2 0 0 2 年写了九种蟋蟀声锉的比较研究( 直翅目蟋 蟀总科) 一文。同年，还对音蟋属三种蟋蟀发声器特征的进行了比较研究。2 0 0 4 年又研究了癞蟋科4 种蟋蟀的声锉和声齿形态特征，结果表明，发声器超微特征在 种内个体间差异小，而种间和属间差异明显，且性状稳定。并于2 0 0 5 年观察了片 蟋属t r u l j a l i ag o r o c h o v3 种雄性声锉和声齿的超微结构【3 9 4 2 】。 蟋蟀音齿的确是一个很好的分类特征，充分挖掘其所有特征信息对蟋蟀分类 具有重要意义。但同时必须指出，音齿毕竟是蟋蟀发声器中的一个组成部分，在 分类应用中，如将其他特征结合进去，对分类鉴定将会更有意义。 1 3 5 分子系统学方面的研究 在直翅目，相对于蝗总科而言，蟋蟀总科的分子系统学研究的较少。1 9 7 9 年， h a r r i s o n 首先将同工酶电泳技术应用于蟋蟀种间关系研究，并根据电泳资料纠正了 以前对蟋蟀属g r y l l u s = 个近缘种的看法，随后( 1 9 8 2 、1 9 8 7 ) ，他与他的同事又多 次利用同工酶方法对不同种蟋蟀进行研究，以确定它们的变异性和亲缘关系等 4 3 4 5 。h o w a r dd j 对4 l l o n e m o b i u s 属进行了同工酶电泳分析，提出a a l l a r d i 实际包含 有3 个种，a f a s c i a t u s 包含有2 个种，这样该属就有3 个近缘种被发现 4 6 。g r o s s 等 对p i c t o n e m o b i u s 属进行研究，发现同工酶方法结果与其它方法结果相符，但有两 个种群的电泳资料聚类结果与鸣声结果不符，他认为这些种群有可能代表着该属 不同的种 4 ”。用m t d n a 作为标记，研究昆虫的系统发育近年来发展很快( c r o z i e r a n dc r o z i e r ，1 9 9 3 ；f l o o ka n dr o w e h ，1 9 9 5 ) 1 4 8 4 9 ，而在蟋蟀的系统学研究中，偶 见利用m t d n a 序列作为分子标记的研究报道( h u a n g e ta 1 ，2 0 0 0 ) 【5 叭，国内在 此方面的报道较少。国内田英芳、郑哲民( 2 0 0 1 ) 首次将r a p d 技术运用于蟋蟀 总科的分子系统学研究中，采用2 种引物对7 种蟋蟀进行了基因组d n a 多态性研究， 认为棺头蟋属与油葫芦属亲缘关系最近【5 “。2 0 0 3 年李恺、郑哲民、陈立侨用r a p d 技术研究了棺头蟋属l o x o b l e m m u s 9 个种的亲缘关系，聚类结果所呈现的属内种间 关系与传统分类研究基本一致1 5 2 】。2 0 0 4 年，蒋国芳等测定了蟋蟀科5 属9 个种 的线粒体1 6 sr r n a 基因部分序列并比较其同源性，表明1 6 sr r n a 基因序列对 蟋蟀科种间系统发育的研究是有价值的h ”。另外，奚耕思，贺秉军用聚丙烯酰胺 凝胶电泳方法对蟋蟀同工酶的进行了比较研究 5 4 s 5 。 在分子水平上探讨这些类群的分类地位和亲缘关系，为蟋蟀科的系统分类提 供了分子生物学方面的部分依据，有助于对蟋蟀科系统发育的进一步研究。 2 分子系统学的基本原理及方法 2 1 分子系统学，冒地m 以“ 分子系统学( m o l e c u l a r o f 是检测、描述并解释生物在大分子水平的多样性及其 演化规律的学科。根据组成生物体分子的特点和分子多样性的研究对象，分子系 统学的研究分为两大类：以小分子化合物为研究对象的称小分子系统学，即过去 文献中的化学系统学或生化系统学；以生物大分子为研究对象的称犬分子系统学， 即目前文献中的分子系统学( 黄原1 9 9 8 ) p 。 2 2 分子系统学常用的分子标记 1 ) 限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r 玎j ) d n a 限制性片段长度多态性( r f i 卫) 是指用限制性内切酶处理不同生物个 体的d n a 所产生的大分子片段的大小差异。这一标记系统是b o s t e i n 和w h i t e 等于 1 9 8 0 年首次提出的，也是最早的d n a 分子标记。其基本原理是，生物在长期进 化的过程中，会在种、属甚至品种间同源d n a 序列上的限制性内切酶识别位点上 出现差异，在酶切作用下会产生许多太小不等的d n a 片段，用放射性周位素标记 的d n a 作探针，把与被标记d n a 相关的片段检测出来，从而可以构建出多态性 图谱。目前国内外多进行的是生物体线粒体d n a 多态性的研究。这是因为线粒体 d n a 分子较小，处于限制性内切酶的分析范围，并且基囡组结构相对比较简单， 便于进行结果分析( b r o w n ，1 9 8 3 ) p “。 2 1 单链构型多态性分析s s c p ( s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m ) s s c p 技术的基本原理是根据双链d n a 经变性处理后变为单链d n a ，然后进 行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，由于d n a 分子在凝胶电泳中的迁移率与其分子量 和空间构型有关，在非变性条件下，s s d n a 分子内力作用形成卷曲构型，这种二 级结构与s s d n a 的序列有关。其电泳迁移受到二级结构的影响。电泳后s s d n a 带 在凝胶中位置的差异反映了d n a 序列的差异。 3 ) 变性梯度凝胶电泳d g g e ( e e n a t u r e dg r a n dg e le t i e t r o p h o r e s i s ) d g g e 是根据d n a 的变性来分离片段的。双链d n a 片段通过含有浓度递增 7 的变性剂的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳时，在某一变性剂浓度下，d n a 的一个区域 发生变性，含有部分单链的片段，其迁移速率明显下降。出于不同片段在梯度不 同的部分发生变性，因此可以把两个大小相同但序列不同的片段分开。如果变性 剂的梯度平缓，该技术的灵敏度足以将相差一个碱基对的片段分开。 4 1d n a 指纹图谱技术( d n af i n g e r p r i n t ) d n a 指纹图谱技术是一种在一个单一实验中可检测出大量d n a 位点差异性 的分子生物学技术。自1 9 8 5 年j e f f r e y s 等从人的肌红蛋白位点获得第一个多位点 探针并用于检测人类基因的v n t r s 以来，由于各种高水平探针，如微卫星探针、 寡聚核苷酸探针的相继问世，使d n a 指纹技术在动植物科学研究等方面得到广泛 应用，充分再现了此技术的优越性i 该技术是依据核基因中的一些高度重复序列 做遗传标记，用于种内或种间个体的鉴别。 5 ) 扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) a f l p 的基本原理是对基因组d n a 限制性酶切片段的选择性扩增，使用双链 人工接头( a r t i f i c i a la d a p t e r ) 与基因组d n a 的酶切片段相连接作为扩增反应的模 板，接头与接头相邻的酶切片段的1 2 个碱基序列作为引物的结合位点，选择碱基 延伸到酶切片段区，这样就只有那些两端序列能与选择