（遗传学专业论文）三种冷激蛋白重组克隆研究.pdf

摘要 若将正处于对数生长期的大肠杆菌从生理环境( 3 7 ) 转入低温环境( 1 0 1 5 ) 培养，细菌细胞生长受到抑制。此时，细胞中绝大多数蛋白质的合成突然停止【4 l ，细胞 进入停滞期；然而，这个停滞期是暂时的，大约在2 4 h 后，细胞的生长就可恢复正常1 5 】。 在停滞期，细胞迅速合成2 6 种冷激蛋白。这些冷激蛋白在细胞恢复转录和翻译过程中 起到非常重要的作用1 4 j 。 c s p a 蛋白家族是1 9 8 7 年j o n e s 等人在大肠杆菌中发现的【4 1 ，该类蛋白是研究最多 的一类冷激蛋白。根据序列同源性，j o n e s 等找到了包括c s p a 在内的9 个家族成员，分 别命名为c s p a c s p i ，这9 种冷激蛋白中，仅有c s p a 、c s p b 、c s p g 和c s p i 【1 2 】可以被低 温暂时冷激诱导，在冷激后处于停滞期的大肠杆菌中，转录、l n 卧队稳定性及翻译水平 等方面都受到这4 种冷激蛋白的调节【l3 1 。本论文以p e t 2 8 a ( + ) 为骨架构建含有确鲥、卿旧 和唧g 基因编码区d n a 片段的表达载体，将三种表达载体分别转入低温缺陷型菌株 b x a g 中，检测常温及低温条件下三种重组菌株与缺陷型菌株的生长情况。利用统计 学软件s p s s l l 5 对比分析三种重组菌株相对于缺陷型菌株的生长水平差异。同时，分 别在1 6 和3 7 下表达( 加入或不加入口t g 诱导作为对照) 三种重组菌株；利用 s d s - p a g e 分析比较b x a g 巾e t 2 8 ( + ) a 一删叫、b x a g - p e t 2 8 ( + ) a - c 点眇和b x a g p e t 2 8 ( + ) a _ c 印g 表达水平差异。 实验结果显示：在1 6 温度条件下6 1 必4 g p e 狮) a 加恢复生长最为显著， 彤睑4 g j 把刀8 ( + ) a - c 点础也可以恢复生长；b x 4 g 脚刀8 ( + ) a c 妒g 不可以恢复生长。 缺陷型菌株和重组菌株的蛋白表达水平差异发现3 7 和1 6 条件下四者差别不大。 关键词：冷激蛋白；c s p a 、c s p b 和c s p g ；低温缺陷型菌株；生长水平差异 a b s t r a c t m 1 e na ne x p o n e m i a l l yg r o w i n gc u l t u r eo fe s c h e r i c h i ac o l ii ss l l i f t e d 台o m3 7 t ol o w t e m p e r a n l r e ( 1 0 - 1 5 ) ，a na 玎e s to fc e l l g r o 叭h 谢1 lo c c w 1 1 1 i sp e r i o d ，w m c hi sc a l l e dt h e a c c l i m a t i o np h a u s e ，i s 饥m s i e n t d u r i n gt l l i sg r o w t l ll a gp e r i o d ，m es y n t l l e s i so fm o s tc e l l u l a r p r o t e i n si ss h a 印l yr e d u c e d ，w h e r e a sas e to fa tl e a s t2 6c o l ds h o c kp r o t e i i l sw h i c hp l a y e s s e n t i a lr o l e si i lt h er e s u m p t i o no fc e l lt m s c r i p t i o n 锄d 咖s l a t i o na r ei m m e d i a t e l yi n d u c e d a f t e r 印p r o x 妇a t e l y2 4 h ，c e l lg r o w c l lr e s 啪e s c s p a 觚i l yi 1 1e c d ，fw 1 1 i c hi sr e p o r t e df i r s tb yj o n e sa 1 1 dl l i sc o l l e a g u e si i l1 9 8 7i s k g 王d yr e s e a r c h e d j o n e sf o u n dt h a tc s p af - 黜i l yc o n s i s t so fi l i n eh o m o l o g o u sp r o t e i n sw 撼c h w a sc a l l e dc s p at 0c s p i f o u ro ft h e s ep r o t e i l l s ，c s p 气c s p b ，c s p g 锄dc s p i ，仃a n s i e n t l ya i l d s i 鲥f i c a n t l yi n d u c e du p o nl o wt e m p e r a n i r e d 耐n ga c c l h a t i o np h a s e ，t l l ef o u rc o l ds h o c k p r o t e 证sa r ec o n s i d e r e dt or e g u l a t et 1 1 ec e l l sa tt 1 1 e1 e v e lo ft h et 啪s c r i p t i o n ，m i 矾as t a b i l i 哆 锄dt h e 觚l s l a t i o n i nt h j sp 印e r ，p l a s m i dp e t 2 8 a ( + ) w a su s e df o rc o n s 仃u c t i o no fe x p r e s s i o n c 删e ri n t ow h i c ht h ec o d i n gr e g i o no fg e n ec 戈础，c 妒召a n d 们p gw a s 如s e di n t 0 也e 加工2 孙r e s p e c t i v e l y t h e s e 妇e ee x p r e s s i o nc 删e rw e r e 仃a 1 1 s f o 册e di n t od e f e c t i v es 仃a i n 8 配4 gw 1 1 i c hi sn o ta b l et og r o wn o n n a l l yu i l d e rl o wt e m p e r 绷l r e t h e 伊。训hc o n d i t i o no f t l l e 廿1 r e er e c o m b m 锄ts t r a i n s ( 舀! x 4 g 节e 乃8 ( + ) a - c 互础，8 配4 g p e 7 2 8 ( + ) a - c 点p ba 1 1 d 8 凇4 g 巾e 力8 ( + ) a 驴g ) a n dd e f e c t i v es 仃a j n8 尬4 gu i l d e rn o 咖a la i l dl o wt e m p e r a ：t u r e w e r ed e t e c t e d s t a t i s t i c sa i l a l y s i ss o 胁a r es p s sl1 5 、糯a p p l i e dt 0c o n t r a s ta i l da n a l y z et h e 伊o w t l l - l e v e ld i 丘e r e n c e s 锄o n gt l l e t h r e er e c o m b i n a ms 廿面i l sa g a i n s tm ed e f e c t i v es 仃a i n 8 y 4 g s d s p a g ew a l sa l s oa p p l i e dt od e t e c t e dt 1 1 ee x p r e s s i o nl e v e lu 1 1 d e r3 7 a n d16 锄o n g s 仃a i n s 8 舰全4 g 哆e 刀8 ( + ) a c 印a ，舀：凇4 g 誓店力8 ( + ) a c 戈加 a i l d删g 啦刀8 ( + ) a - 唧g t h er e s u l t ss h o 、v e dt h a ts t r a i n8 k 4 g 节e 乃8 ( + ) a - c 印艿a i l d 舭爿g 节e 力8 ( + ) a - c 叫 c a l lr e i l l i t i a t ei t sc e u 伊o w t hu 1 1 d e r l6 n l ef o 珊e r h a d 觚o b v i o u se x t e n to fg r o 坝1 1 i n g ，t l l e l 撇l e s s e r b u ts 仃a m8 凇4 g 癌刀8 ( + ) a - c - 驴ga p p e 锄甜n or e n e w i i l gg r o w t l la b i l i t y t h e r e w e r ea l s on od i 岱：r e n c e s 锄o n gt l l ew h o l ep r o t e i i le x p r e s s i o nl e v e lo fd e f e c t i v es t r a i n 8 x 7 z 爿ga n dt h i e er e c o m b i n a n ts n 伍n s k e yw o r d s ：c o l ds h o c kp r o t e i n s ；c s p af 锄i l y ；1 0 、v t e 加p e 阳t u 啪d e f e c t e ds 仃a i n ；d i 丘- e r e n c e si n 掣- o w t h l e v e l 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所取得 的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了 明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：日期- 坦蔓鱼! 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东 北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、 汇编本学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士学位论文全文数据库 ( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论文全文数据库( 中国科学技 术信息研究所) 等数据库中，并以电子出版物形式出版发行和提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：到簪指导狮签缝瞧、 日 期：a 鲢基k1 6 ：) 日期：z 与斜1 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 东北师范大学硕士学位论文 止l 1 日i j舌 微生物具有很强的适应能力，当生活环境发生改变时，它们会迅速发生生理反应以 适应这种变化了的环境。若将正处于对数生长期的大肠杆菌( 西c 办p ，f 如缸c d ，f ) 从生理 环境( 3 7 ) 转入低温环境( 1 0 1 5 ) 培养，其细胞的许多生理特性都会受到影响。 例如，细胞膜的流动性降低，物质的运输和分泌减缓；核酸的稳定性增强，d n a 的复制、 m i a 的转录和蛋白质的合成受阻；游离的核糖体亚单位和7 0 s 亚基以多聚体的形式在 细胞中积累，细胞内多数m r n a 的翻译受到抑制【l 引。这些生理特性的改变会导致细胞在 冷激( c o l ds h o c k ) 条件下的生长受到抑制，细菌细胞中绝大多数蛋白质的合成突然停 止【4 】，细胞进入停滞期。然而，这个停滞期是暂时的，大约在2 - 4 h 后，细胞的生长就可 恢复正常1 4 】【5 1 。在此期间，细胞迅速合成2 6 种冷激蛋白( c 0 1 ds h o c kp r o t e i l l s ，c s p s ) ，其 中冷激结合蛋白有：c s p a 、c s p b 、c s p e 、c s p g 、c s p i 、r n a 解旋酶d e a d 、r b 丛、翻 译起始因子i f l 、i f 2 、i f 3 、n u s a 、p n p a s e 、r a 、h 二n s 、g y r a 、h u b ( 核酸结合蛋 白h u 的一个亚基) 、d n a a 等。与核糖体装配有关、具有r n a 分子伴侣以及解旋酶功能 的蛋白有：r b f a 、d e 扣、所有c s p 基因、t f 、h s c 6 6 等。与蛋白折叠有关：h s c 6 6 、d n 擞、 i f 2 、t f ，以及调控海藻糖合成的基因t i g 、o t s a 、吣b 等1 6 1 。这些冷激蛋白在细胞恢复转 录和翻译过程中起到非常重要的作用。根据序列同源性，找到了包括c s p a 在内的9 个 家族成员，分别命名为c s p a i 。它们的等电点在5 5 3 到1 0 7 2 之间，氨基酸残基数 目从6 9 到7 4 不等【7 1 。但这9 种c s p s 仅有c s p a 、c s p b 、c s p g 、和c s p i l 8 j 是由冷 激诱导的。冷激后大约一小时后冷激蛋白的诱导量最大【9 】。冷激反应的强度与导致冷激 反应的温度差成正比，即温度下降越多，冷激反应越强烈。在e z f 中，温度下降1 3 即可导致冷激反应。 1 1 大肠杆菌冷激蛋白a 的结构特点及冷激蛋白的生理功能 在ec d z f 的冷激蛋白中，c s p a 是最引人注目的。从3 7 转移到1 0 冷激，c s p a 表 达量会增加2 0 0 倍，它的合成占全部蛋白合成的1 3 【1 0 】。c s p a 是冷激后第一个被诱导产 生的蛋白，也是唯一的在3 7 检测不到的冷激蛋白】。c s p a 在冷激反应中扮演着极其 重要的角色，它已经成为研究的重点。 x r a y 衍射和核磁共振( n u c l e a ri i l a 目e t i cr e s o n a i l c e ，n m r ) 分析表吲1 2 】：c s p a 由 7 0 个氨基酸组成，分子量为7 3 6 5 d ，其二级结构主要由a 螺旋构成；而三级结构包含5 个反向平行的b 折叠片( ps 仃a i l d s ) ，p 1 p 5 ，它们构成p 桶( bb a r r e l ) 结构；两个进化 保守的r n a 结合结构域( r n ab i n d i n gm o t i f s ) ，r n p l ( t r p l l p h e 惜- p h e z o ) 和r n p 2 ( p h e 3 1 h i s 3 3 p h e 3 4 ) 分别位于b 2 和p 3 片层上；在c s p a 分子的同一面上有7 个芳香 族残基( 5p h e ，lt f ，lt 印) ，表明c s p a 与核苷酸可能通过疏水反应相互作用【l 引。 东北师范大学硕士学位论文 c s p a 的b 桶结构与核糖体蛋白s 1 的p 桶构成的s 1 结构域( s 1d o m 抽) 非常相似，说 明它们可能起源于一个共同的核酸结合蛋白1 1 3 】；c s p a 的氨基酸序列与真核y b o x 蛋白 家族的冷激结构域( c o l ds h o c kd o m a j n ，c s d ) 4 3 是一致的，这说明c s p a 与含有s 1 结构域的蛋白及y - b o x 蛋白一样，其功能是通过与核苷酸结合行使的，后来的研究表明 c s p a 是一种i a 分子伴侣【1 4 】。c s p a 的分子伴侣作用可能有助于帮助阻止形成对i 冰a s e 敏感的不稳定二级结构从而达到易化m r n a 翻译的作用。 大肠杆菌冷激蛋白c s p a 能够与r n a 分子结合，但这种结合没有序列的特异性， 结合的亲和性也比较低【1 5 j 。而c s p b 、c s p c 和c s p e 与r n a 或s s d n a 的结合具有一定 的选择性，如c s p b 与i 兀兀兀兀7 结合、c s p c 与a g g g a g g g a 结合、c s p e 与富含a u 区( a u r i c hr e 西o n ) 结合；枯草芽孢杆菌冷激蛋白c s p b 与唧t t 相结合，但这些结 合并不紧密【1 6 】。冷激蛋白c s p a 家族与i a 或s s d n a 结合的不紧密性和非特异性对于 它们行使分子伴侣( c l l a p e r o n e s ) 的功能是十分重要的，原因是这种结合方式不会妨碍 核糖体在r 1 1 i 斟a 上的移动7 | 。 2 0 0 0 年m a s a y o i n o u y e 等人经过体内外实验研究发现c s p a ，c s p c ，c s p e 都具有转录 抗终止作用【1 8 】。另外，m a r ag i a l l g r o s s i 等人研究表明c s p a 在各个时期的细胞定位在细 胞的极部( 远离类核区) 可能由于细胞极部是感受环境变化的敏感区域【l9 1 。因此它的定 位可能与其功能有关。 1 2 大肠杆菌冷激蛋白调控机制 1 2 1c 洲启动子 研究表明钢叫启动子在低温及高温条件下都保持有高度的活性【2 0 】，低温条件下其 活性甚至比大肠杆菌中强启动子却还要强【2 l ，2 2 1 。另外，低温条件下钮叫还可以在启动 子忉调控下诱导产生。 1 2 2u b 区域 缺失研究表明：5 u t r 的3 端有一高度保守的区域，称为上游框( u p s 仃e 锄b o x ， u b ) ：u b 使c 倒转录产物更易与细胞内冷修饰翻译复合物( c o l d m o d m e d 订a 1 1 s l a t i o n m a c l 血l e r y ) 结合，提高翻译速率2 3 1 。 1 2 3m i 矾a 稳定性 删鲥训刚a 在3 7 在极不稳定( 半衰期不及2 0 s e c ) 。经过冷激，铡鲥i i 瓜n a 的 稳定性立即显著提高( 半衰期2 0 i n i n ) 【2 4 1 。有证据表明，在硝m r n a 的5 端有1 5 9 n t 的非翻译区( 5 u 1 1 t r a n s l a t e dr e 西o n ，5 u t r ) ，它的存在使州m r n a 的半衰期极短 ( 约为1 0 s ) ，影响翻译【2 4 】；而5 u t r 内三个碱基的替换突变引起3 7 时c 刚m r n a 稳定性提高了1 5 0 倍，这说明c 刚的启动子在3 7 时是活跃的，据推测，这种稳定性 的增加可能是由其对1 w a s e 降解的抗性产生的【7 1 。若将伽鲥m r n a 的5 u t r 连接到其 它结构基因编码区的5 端，使这些基因的表达受温度控制，即在3 7 时表达量较少，而 2 东北师范大学硕士学位论文 在1 5 时有较高的翻译活性1 2 5 1 。另外，傩硝i i 州a 的稳定性在低温条件下显著提高的 现象是暂时的，当细胞适应了低温环境并恢复生长时，这种优势即会消失。其原因可能 是经过冷协迫后某种特定核酸酶活性恢复或冷激诱导产生的核酸酶( 如多聚核苷酸磷酸 酶) 降解m r n a 所致1 2 6 j 。 1 2 4 冷框 冷激基因伽鲥57 u t r5 端1 1 b p 的“冷框”( c o l db o x ) ，在冷激基因中高度保守， 并且在阻遏伽鲥合成中起重要的作用【2 7 1 。冷激后细胞有一个冷适应延滞期，在此阶段 c s p a 大量表达，而其它蛋白质表达被抑制；在延滞末期，其它蛋白开始表达，c 倒的 表达则被抑制。可是当含有冷框的5 u t r 序列被过量产生时，延滞末期的卿叫表达被 抑制现象就消失了，如果将5 u t r 中的冷框破坏，或者过量表达c s p a ，抑制现象又会 重新出现。说明翻鲥和冷框在转录水平起着十分重要的调节作用。2 0 0 2 年m a s a y 谢 h 1 0 u y e 等人研究发现冷框的存在可以大大增强c 点础1 1 1 刚a 的稳定性从而达到促进冷激 蛋白表达的作用。而冷框的这种作用主要依赖于其茎环部分的茎部的完整性即此片段减 短缺失或突变会引起c 印a 表达量明显下降。另外，其茎环后的a u 序列缺失会引起卿鲥 m i 斟a 稳定性增强半衰期明显增长，其原因可能是此区域含有i a s ee 的剪切位点。他 们还证实了删鲥m r n a 与核糖体结合位点为冷框即当冷框过表达时核糖体与冷框序列 大量结合，从而保证了低温条件下铡鲥m r n a 5 u t r 与核糖体有很强的亲和性并可以 优先表达【2 羽。 1 z 5d b 船州删刚a 编码区中含有一段与1 6 sr r n a 倒数第二位干环( h e l i x 4 4 ) 部分互补的 序列，位于起始密码子下游，长度为1 2 b p ，称为下游框( d o w n s 仃e 锄b o x ，d b ) 瞄w 。 目前已经确定鲫鲥、c 印b 、印g 和c 叫中都含有d b ，并且高度保守【3 0 j 。细菌细胞在 1 5 时存在翻译的起始缺陷，d b 通过与1 6 sr i 斟a 的结合促进翻译起始复合体的形成 来增强翻译起始。由于具有d b ，叫的m r n a 可以越过i 地丛、c s p a 等核糖体因子， 在低温下起始翻译表达蛋白有助于渡过冷协迫条件【3 1 1 。当细胞经过冷协迫期后进入适应 期，细胞内可以合成r b 执、c s p a 等核糖体因子。适应期后细胞内装配的核糖体转化成 冷适应核糖体，此时细胞可以表达大量的非冷激蛋白，细胞恢复生长p 引。而d b 的这种 翻译增强作用是依赖于s d 序列的存在的，当s d 序列缺失时“瞵a 的翻译强度明显减 弱，远不及无d b 序列的m l a 的翻译程度。另外，突变研究表明d b 序列的下游序列 越长，d b 对1 刚a 翻译的增强作用越刮3 3 】。而近期研究认为，在正常或冷激条件下， d b 与1 6 sr r n a 结合作用并不明显1 3 卅；印c 、卿癌缺少d b 元件，但是冷激后仍然大 量表达【3 5 】。因此，d b 的存在与否及它在冷激后的作用还有待进一步研究【3 6 】。 1 3 冷激细胞翻译机器对冷激基因的优先翻译 冷激后的细胞抽提物中的冷激蛋白m r n a s 的翻译效率比对照细胞中的要好的多，而 3 东北师范大学硕士学位论文 且它们的翻译效率随着暴露于低温时间的延长而快速增加。2 0 0 1 年b i n gx i a 研究发现低 温条件下无义突变的c 删基因转录的m r n a 即使不能产生全长的c s p a 蛋白其翻译仍然 保持很高的水平，并且导致细胞的生长停滞，这种现象称为l a c e 【”】。其原因是由于突 变基因转录的c 刚m r n a 结合细胞内大量核糖体而使其他州 a 与核糖体结合机会显 著下降，从而导致细胞生长必须的蛋白质无法合成而造成细胞生长停止甚至死亡【3 7 】。这 表明在低温条件下核糖体与冷激基因优先结合使得冷激基因优先翻译表达，并且这种结 合具有高效性。 1 4 冷激蛋白在生物界的分布 冷激蛋白的分布非常广泛【8 1 ，几乎存在于所有的革兰氏阳性菌和阴性菌中，比如大 肠杆菌例( 西幽p r f c 矗砌c d ，f ) 、嗜热链球菌( 跏印幻c c 螂胁p ，聊印办f ，姗) 、枯草杆菌 ( 肋c 川搬j 材6 耐括) 、沙门氏杆菌( 勋砌d 玎p 砌p ，2 纪，七口s e r o v a rt 卯m m 嘶啪) 等都证实有 c s p s 的存在。 c s p a 家族在b 5 甜6 f 玎括中存在有c s p b 、c s p c 、c s p d 【4 2 】，其中c s p b 与ec d z f 的 c s p a 具有6 1 的序列同源性。在嗜冷菌b c p ，p 螂中，发现有c s p a 和c s p e 【4 3 1 。f m a c i s k p 设计了一套通用寡核苷酸引物，采用p c r 的方法，从超过3 0 种革兰氏阴性和阳 性细菌中扩增出长2 0 0 个碱基对的d n a 序列，通过分析证实，它们具有相当高的d n a 序列同源性，这些细菌来自不同的属，包括三c f d c d c c 珊、工括幼衙、尸p 西d c c 姗、 p h o t o b a c t e r i m 、p r o t e u s 、s n l m o n e n n 、s h i g e l l a 、s t c i p h y l o c o c c t l s 、s t r e p t o c o c c u s a n a 搿；行肠。使入惊奇的是它们与真核y 2 b o x 转录因子的冷激域( c o l ds h o c kd o m a i n ) 也有 4 3 的同源性。不过c s p a 家族并非总是以多基因形式存在的，h 加厂，“p 舷口中就仅存在 c s p d 。而且，并非所有的原核生物都存在c s p a 家族，从基因组序列分析，肺炎枝原体 ( 肋弦印正m 口p ，z p “朋d 聍妇p ) 和生殖道枝原体( 均胱移玩册口舻，2 f 幻，f “聊) ，蓝细菌p c c 6 8 0 3 ( 5 咖p 如d 坶出p c c6 8 0 3 ) ，詹氏甲烷球菌( 胞扔册d c d c 螂细嬲c 办功，幽门螺杆菌 ( h p ，f 6 口c 纪厂p y 肠，f ) 中就不存在1 4 6 】。 1 5 本文的研究内容 大肠杆菌冷激蛋白家族中四种冷激蛋白c s p a 、c s p b 、c s p g 和c s p i 为典型的冷激诱 导蛋白，即冷激后可以大量表达。缺陷型菌株8 尬4 g 基因组中础，印g 基因编码区 缺失，该菌株低温条件下生长缓慢，几乎停止生长，而常温可以正常生长。本论文以 肚刀船( + ) 为骨架构建含有铡鲥、c 舢和唧g 基因编码区d n a 片段的表达载体，将三种 表达载体分别转入b x a g 菌株，分别组成性表达三种冷激蛋白。检测常温及低温条件 下菌株生长情况，观察三种重组菌株相对于缺陷型菌株的生长水平差异，以了解组成性 表达外源冷激蛋白对菌株生长情况的影响，为温控表达载体的应用奠定理论基础。同时， 分别在1 6 和3 7 下表达( 加入i p t g 诱导) 三种重组菌株；利用s d s p a g e 分析比较 8 x 出g 哆e 咒8 ( + ) a 钢叫、b 魁全4 g 妒e 砣8 ( + ) a c 印b 和蹦4 g 雎咒8 ( + ) a - 驴g 表达水 4 东北师范大学硕士学位论文 平差异，分析外源蛋白表达对菌株整体表达系统的影响。 实验研究设计主要包括以下二个方面： ( 1 ) 表达载体的构建 提取大肠杆菌( ec d f f ) 基因组，p c r j 广增冷激基因脚爿、o 加、c 印g 编码区片段， 在两端引入酶切位点；以加刀孙( + ) 为骨架，酶切、连接，构建含冷激蛋白。叫、c 哪、 c 驴g 编码区片段的表达载体加刀8 ( + ) a 一印、p 匹刀8 ( + ) a - 卿妇和加乃8 ( + ) a 唧g 。 ( 2 ) 缺陷型菌株蛋白互补实验研究 将三种表达载体分别转入b x a g 菌株，检测常温及低温条件下菌株生长情况利用 统计学软件s p s s l l 5 对比分析三种重组菌株相对于缺陷型菌株的生长水平差异。同时， 分别在1 6 和3 7 下表达( 加入或不加入口t g 诱导作为对照) 三种重组菌株；利用 s d s p a g e 分析比较比翊g 脚刀8 ( + ) a - 铡鲥、8 尬4 g 伽乃8 ( + ) a q 妒和彤【4 g p e 死8 ( + ) a 筇矽g 表达水平差异。 东北师范大学硕士学位论文 2 1 实验材料 2 1 1 菌种 大肠杆菌( e z f ) d h 5 0 l 大肠杆菌( e z f ) b l 2 1 大肠杆菌b y 4 g 2 实验材料及方法 2 1 2 载体 p m d 1 8 一t v e c t o r p e t - 2 8 a ( + ) v e c t o r 2 1 3 引物 p r i m e rp r e m i e r5 软件设计够硝、c 舢、印g 5 端和3 端的引物，并在5 端引物添 加刀2 d i 酶切位点c t c g a g 。 甜刁彳引物1 ：5 c t c g a g a c a c t a t g t c c g g t aa a3 c 邓“引物2 ：5 t t a c a g g c t g g l l a c g 3 口b 引物1 ：5 ，c 彤g 么g g g 纵粥明g 纵弼陀4 4 3 c 印b 引物2 ：5 g t a g c g a g c a g a c a t 3 p g 引物1 ：5 7c t c g a g t g a a g g a a g t a a a a t a t g t c 3 口g 引物2 ：5 a a a t g g a g a t g t t g a g l 、a a t3 2 2 试剂 1 l b ( l 谢a b e n a i l i ) 液体培养基 酵母提取物o 5 9 ；胰蛋白胨1 9 ；n a c l1 9 ；d h 2 01 0 0 m l 。用5 m o 儿n a o h ( 约1 2 0 此) 调节p h 值至7 4 ，加入d h 2 0 至总体积为1 0 0 n 正，1 0 3 4 1 0 5 p a 高压蒸汽灭菌1 5 m i n ， 室温冷却至5 0 ，按需要加入抗生素。 2 l b 固体培养基 配制方法参照l b 液体培养基的配制，高压灭菌前加入琼脂1 2 1 0 0 i n l 。 3 3 0 丙烯酰胺 丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性，称量丙烯酰 胺时应戴手套和口罩。 丙烯酰胺2 9 9 ；n ，n ，亚甲双丙烯酰胺1 9 ；d h 2 01 0 0 m l 。配制时将己称量好的丙 烯酰胺和n ，n 亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为6 0 m ld h 2 0 中，加热至3 7 使之溶解， 6 东北师范大学硕士学位论文 加d h 2 0 至终体积为l o o m l 。用孔径为0 4 5 “m 的滤器过滤除菌，置于棕色瓶中室温保 存。 4 1 m o l lc a c l 2 将1 1 1 9c a c l 2 溶解于8 0 m ld h 2 0 中，加d h 2 0 定容至1 0 0 m l ，用孔径为o 2 2 岬 的滤器过滤除茵，分装成1 0 m l 小份，2 0 保存。 5 1 0 m m l 溴化乙锭( e b ) 溴化乙锭是一种非常强的诱变剂，有中度毒性。使用含有这种染料的溶液时，要务 必戴上手套，称量染料时要戴口罩。 将5 9e b 溶解于4 0 0 i l 也d h 2 0 中，溶解过程中需要用磁力搅拌器搅拌，加d h 2 0 定 容至5 0 0 i l 也，室温避光保存。e b 的使用浓度为0 5 “咖l ，用时从母液稀释。 6 1 m o 儿二硫苏糖醇d t t 二硫苏糖醇( d t t ) 3 0 9 9 0 1 m o l l n 啦c ( p h 5 2 ) 2 0 i n l 将称量好的d t t 溶解于2 0 m l 0 1 m o 儿n a a c 中，用孔径为0 2 2 岫的滤器过滤除菌，分装成1 m l 小份，2 0 保存。 7 0 5 m o 班，e d t a ( p h 8 0 ) 将4 6 5 9 e d t a n a 。2 h 2 0 ( 二水乙二胺四乙酸二钠) 溶解于2 0 0 1 1 1 l d h 2 0 中，在磁力 搅拌器上剧烈搅拌，用n a o h 调节溶液的p h 值至8 0 ( 约需要5 9 n a o h 颗粒) ，然后用 d h 2 0 定容至2 5 0 m l ，1 0 3 4 x10 5 p a 高压蒸汽灭菌15 枷n ，备用。 8 5 m o l l 醋酸钾 将4 9 1 9 醋酸钾( k a c ) 溶解于9 0 m ld h 2 0 中，加d h 2 0 定容至1 0 0 m l ，1 0 3 4 1 0 5 p a 高压蒸汽灭菌1 5 m i n ，备用。 9 1 0 m g m li 斟a s e a 在4 m ld h 2 0 中加入5 0 此1 m o 儿h s - h c l ( p h 7 5 ) 和1 5 此5 m o 儿n a c l ( p h 7 5 ) ， 再加入5 0 m gi 州a s e a ，沸水中加热1 5 i i l i i l 使之完全溶解，缓慢冷却至室温，加d h 2 0 至 5 m l ，使最终浓度为1 0 m m l ，2 0 保存。 1 0 5 m o 儿醋酸钠( p h 7 0 ) 将4 0 8 9 醋酸钠( n a a c 3 h 2 0 ) 溶解于9 0 m ld h 2 0 中，用1 2 8 此冰醋酸调节p h 值 至7 o 后加d h 2 0 定容至1 0 0 m l ，1 0 3 4 1 0 5 p a 高压蒸汽灭菌1 5 r n i n ，备用。 1 1 5 m o l l 氯化钠 将2 9 2 9 氯化钠( n a c l ) 溶解于9 0 m ld h 2 0 中，加d h 2 0 定容至1 0 0 m l ，1 0 3 4 x 1 0 5 p a 高压蒸汽灭菌1 5 m i l l ，备用。 1 2 1 0 十二烷基磺酸钠( s d s ) 将1 0 9 十二烷基磺酸钠( s d s ) 溶解于9 0 i n l d h 2 0 中，使之完全溶解，加d h 2 0 定 容至1 0 0 m l ，使最终浓度为1 0 ，室温保存。 一4 13 1 m 0 1 lt r i s h c l 将1 2 1 1 9 h s 溶解于9 0 m l d h 2 0 中，加入浓盐酸调节p h 至所需值，加d h 2 0 定容 至1 0 0 m l ，使最终浓度为1 m o l l ，1 0 3 4 1 0 5 p a 高压蒸汽灭菌1 5 m i n ，备用。 14 2 0 0 m m li p t g 7 东北师范大学硕士学位论文 将2 9 异丙基硫代d d - 半乳糖苷( i p t g ) 溶解于8 m ld h 2 0 中，加d h 2 0 定容至1 0 i i 儿， 用孔径为0 2 2 岫滤器过滤除菌，分装成l n 儿小份，贮存于2 0 。 1 5 5 0 t a e 将2 4 2 9h s ，5 7 。1 i i l l 冰醋酸，1 0 0 m lo 5 m 0 1 几e d t a ( p h 8 0 ) 溶解于8 0 0 i n ld h 2 0 中，溶解过程中需要用磁力搅拌器搅拌，加d h 2 0 定容至1 0 0 0 m l 1 6 5 0 m g m l 氨苄青霉素 将5 9 氨苄青霉素溶解于8 0 m ld h 2 0 中，加d h 2 0 定容至1 0 0 m l ，用孔径为0 2 2 p m 滤器过滤除菌，分装成1 m l 小份贮存于2 0 。在使用时，每1 0 0 m ll b 培养基加入贮 存液10 0 “l ，使工作浓度为5 0 p g m l 。 1 7 1 0 m 咖l 卡那霉素 将1 9 氨苄青霉素溶解于8 0 m ld h 2 0 中，加d h 2 0 定容至1 0 0 m l ，用孔径为o 2 2 “m 滤器过滤除菌，分装成1 m l 小份贮存于2 0 。在使用时，每1 0 0 m ll b 培养基加入贮 存液5 0 0 此，使工作浓度为5 0 弘m l 。 1 8 4 0 甘油 将4 0 i l 也甘油注入4 0 m l d h 2 0 中，混匀，加d h 2 0 定容至1 0 0 m l ，使最终浓度为 4 0 ( m ) ，1 0 3 4 1 0 5 p a 高压蒸汽灭菌1 5 m i r i ，备用。 1 9 t e 缓冲液 8 0 m l d h 2 0 中加入1 m 0 1 l t r i s h c l ( p h 8 o ) 1 m l 和o 5 m 0 1 l e d t a ( p h 8 0 ) 2 0 0 p l ， 混匀，加d h 2 0 定容至1 0 0 i n l ，1 0 3 4 1 0 5 p a 高压蒸汽灭菌1 5 m i n ，备用。 2 0 2 0 m 咖l 蛋白酶k 溶液 在8 m l d h 2 0 中加入1 m o l l t r i s h c l ( p h 8 o )5 0 0 p l 和1 5 m m o l l 乙酸钙1 0 p l ， 配制成溶剂，溶解0 2 9 蛋白酶k ，加d h 2 0 定容至1 0 m l ，使得蛋白酶k 的最终浓度为 2 0 m 咖l 。 2 1 s t e 在6 0 m ld h 2 0 中加入5 m o l 几n a c 】2 m l 、1 m o l 凡t r i s h c l ( p h 8 o ) 1 m l 和o 5 m o l ，l e d t a ( p h 8 0 ) 2 0 0 肛l ，混匀，加d h 2 0 定容至1 0 0 m l ，1 0 3 4 1 0 5 p a 高压蒸汽灭菌1 5 m i n ， 备用。配制好的s t e 含有0 1 m o l ln a c l ，1 0 m m o l lt r i s h c l 和1 m m o n 。e d t a 。 2 2 溶液i 6 0 m l d h 2 0 中加入0 9 9 葡萄糖、1 m o 儿瞄s h c l ( p h 8 0 ) 2 5 m l 和o 5 m o l l e d t a ( p h 8 o ) 2 m l ，混匀，加d h 2 0 定容至1 0 0 n 也，1 0 3 4 x 1 0 5 p a 高压蒸汽灭菌1 5 m i n ，4 贮存。配制好的溶液i 含有5 0 n u n o l l 葡萄糖，2 5 衄o l lt r i s h c l 和1 0 m m o l le d t a 。 2 3 溶液i i 溶液i i 中含有o 4 m o l l n a 0 h 和1 s d s ，该试剂需要新鲜配制，配制后将n a o h 和s d s 按1 ：1 的比例混合。 2 4 溶液i i i 5 m o l lk a c6 0 m l ；冰醋酸1 1 5 m l ：d h 2 02 8 5 m l 。配制好的溶液i i i 含3 m o l lk a c 、 5 m o l 几冰醋酸( p h 4 8 ) 。 r 东北师范大学硕士学位论文 2 3 方法 2 3 1 大肠杆菌基因组d n a 的提取 1 实验前先配制c t a b n a c l 溶液( 表2 2 2 ) ：4 1 9n a c l 溶解于8 0 m ld h 2 0 ，缓慢加 入1 0 9c t a b ，加水至1 0 0 m l ； 2 将2 m l 培养至对数期的大肠杆菌d h 50 【菌液5 0 0 0 印m 冷冻离心1o m i n ，弃上清； 3 加1 9 0 此t e 悬浮沉淀，并加1 0 此1 0 s d s ，1 此2 0 m i l 也蛋白酶k ，混匀，3 7 保温1 h ； 4 力3 0 此5 m o 儿n a c l ，混匀； 5 加3 0 “lc t a b n a c l 溶液，混匀，6 5 保温2 0 m i n ； 6 加入3 0 0 此酚氯仿异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 抽提，5 0 0 0 甲m 离心1 0 m i n ，将上清液移 至干净离心管； 7 加入3 0 0 此氯仿，异戊醇( 2 4 ：1 ) 抽提，取上清液移至干净管中； 8 加3 0 0 此异丙醇，颠倒混合，室温下静止1 0 i i 血，沉淀d n a ； 9 5 0 0 0 印m 离心1 0 m i i l ，沉淀d n a ，加入5 0 0 此7 0 乙醇，5 0 0 0 印m 离心1 0 m m ，弃 乙醇，吸干； 1 0 溶解于2 0 此t e ，2 0 保存。 2 3 2d n a 片段的回收 在本实验中，目的d n a 片段的回收采用的是北京鼎国生物技术发展中心的d n a 回 收纯化试剂盒。 溶液a 1 0 0 m l 6 m o 儿n a c l 0 4 ，o 0 3 m o 儿n a a c ( p h 5 2 ) ，少量酚红 溶液b 1 5 m l3 m o l ln a a c 溶液c 6 0 m l用时需要加入7 0 m l 无水乙醇，充分混匀 溶液d 6 i l l lt e 缓冲液 1 切取含d n a 片段的琼脂糖( 1 0 0 m g 3 0 0 m g ) ，用吸头捣碎，按重量比1 ：3 ( 切取 重量与溶液的a 体积比) 加入溶液a ； 2 5 0