土壤中分解尿素的细菌的分离与计数PPT课件.ppt

1.培养基的类型？营养及要求？配制过程？2.消毒与灭菌的区别？方法？3.纯化大肠杆菌所用的培养基？两个阶段？4.最常用的接种方法？菌种保藏方法？5.检测亚硝酸盐的原理、试剂6.制果酒、果醋、腐乳、泡菜的菌种名称、代谢类型、生殖方式、发酵温度及时间,温故知新,1,课题2土壤分解尿素的细菌的分离与计数,2,课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌能利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,3,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中含有多少分解尿素的细菌,一.研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,3、课题目的,课题背景,4,实例启发：PCR技术,是一种体外大量复制DNA(PCR)技术，此技术要利用耐高温（930C）DNA聚合酶。,.筛选菌株,耐高温的酶存在于哪里？,美国黄石国家公园的一个热泉中,耐热（Taq）细菌中,Taq细菌在哪发现的？,5,实验室中微生物筛选也应用了同样的原理,1.自然界中目的菌株筛选的依据：根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,用什么培养基？,尿素为唯一氮源的培养基,选择培养基（概念、原理）,6,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,该培养基类型属于？（物理性质、用途）,分析营养成分：,水、无机盐、碳源（葡萄糖、尿素）、氮源（尿素）,7,.统计菌落数目：,(如必修三：探究培养液中酵母菌数量变化）,1.显微镜直接计数法：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点是不能区分死菌和活菌。,8,.过程：稀释涂布平板接种培养计数,.原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的。即：1个菌落1个活菌,2间接计数法：最常用稀释涂布平板计数法。,9,设置重复组的重要性：1.设计实验时，同一稀释度下至少涂布3个平板，作为重复组，增强实验的说服力与准确性。2.分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。,10,注意事项为保证结果准确：一般选多个稀释度涂布平板。可将同一稀释度涂布三个或以上的平板，经培养计算出菌落平均数（选菌落数在30300平板计数）。统计的菌落往往比活菌的实际数目低（两个或多个细菌连在一起形成一个菌落）。,11,微生物的计数,间接计数法：稀释涂布平板计数法,每克样品中的菌落数(CV)M,3.公式：,4.缺点：操作复杂，计数有误差，一般比实际数目要低。,某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4,B,12,实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。,原因：所取土样不同操作失误导致培养基污染（杂菌污染或混入除尿素外的其它氮源）,13,小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：若结果与A同学一致，则证明A无误；若结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,14,设置对照,判断培养基中是否有杂菌污染：,将未接种的培养基同时进行培养。（空白对照）,判断选择培养基是否具有筛选作用：,完全培养基（营养成分齐全）接种后培养做对照观察菌落数目。,主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,15,分离计数土壤中能够分解尿素的细菌的实验设计,1.土壤取样2.制备培养基3.稀释、涂布平板接种4.培养观察5.计数,16,二、实验设计,1.土壤取样：,选什么样的土壤取样？取多深的土样？取好的土样应该装在哪里？,有机质丰富、湿润的土壤,取38cm土壤层（先铲去3cm表层土),纸袋或信封中，并标注、编号,应在火焰旁称取土壤10g。取土样用的小铁铲和盛土样的信封使用前都要灭菌。,17,制备两种培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（完全培养基）尿素为唯一氮源培养基（选择培养基）将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。,2.制备培养基：,培养基配制的基本过程是？如何判断配制的选择培养基是否起到选择作用？,二、实验设计,18,以尿素为唯一氮源的培养基,牛肉膏蛋白胨培养基,是,分离能分解尿素的细菌,判断该培养基有无选择性,只生长能分解尿素的细菌,能生长多种微生物,是,二、实验设计,19,3、样品的稀释,在火焰旁称取土壤10g，倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。依次等比稀释至106稀释度稀释土壤溶液的过程，每一步都要在火焰旁进行。,二、实验设计,20,分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是，其目的是保证获得的平板。细菌稀释度一般为，放线菌稀释度为，真菌稀释度为。,不同微生物在土壤中含量不同,菌落数在30300之间、适于计数,104、105、106,103、104、105,102、103、104,如果是初次实验，稀释范围如何确定？,选择涂布的稀释液范围是？至少要几个培养皿进行涂布？如何避免这么多的试管和培养皿混淆？（P25）,二、实验设计,21,取样涂布,选取适合的稀释范围分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,二、实验设计,22,4、培养与观察,培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：3037培养12d放线菌：2528培养57d霉菌：2528的温度下培养34d。,观察选择培养基中菌落特征形状、大小、隆起及颜色等找出分解尿素的细菌有多少种,比较完全培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。,完全培养基中菌落数量形态明显多于选择培养基,二、实验设计,23,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,5、计数,二、实验设计,24,旁栏在研究未知微生物时务必规范操作，以防被感染，实验后一定要洗手。,致病微生物,三、操作提示,阅读P25页,1、无菌操作2、做好标记3、制定计划,25,四.结果分析与评价1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。2.提示：选择每个平板上长有30300个菌落的稀释倍数计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。,26,五.课外延伸,在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。,27,本课题知识小结:,28,分离计数土壤中能够分解尿素的细菌的实验过程,本实验的其他注意事项：,本实验的无菌操作；做好标记本实验需事先制定计划。,本实验对所选细菌的鉴定：,酚红指示剂,29,分离计数土壤中能够分解尿素的细菌的实验过程,1.土壤取样：,选什么样的土壤取样？取多深的土样？取号的土样应该装在哪里？,2.制备培养基：,培养基配制的基本过程是？本实验需要设置对照,30,分离计数土壤中能够分解尿素的细菌的实验过程,3.稀释涂布平板接种：,如何进行系列稀释操作？如果是初次实验，稀释的范围如何确定？要用几个灭菌试管和锥形瓶？如果是初次实验，选择涂布的稀释液范围是？要用几个培养皿进行涂布？如何避免这么多的试管和培养皿混淆？,4.培养观察：,涂布好的培养皿在哪儿培养？培养的温度和时间是？培养过程中，观察菌落的特征，具体包括哪些内容？,31,分离计数土壤中能够分解尿素的细菌的实验过程,5.计数：,微生物培养过程中，每隔多久要统计一次菌落数目？应选取何时的统计记录作为结果？计数公式是？,本实验的其他注意事项：,本实验的无菌操作；本实验需事先制定计划。,本实验对所选细菌的鉴