（生物化学与分子生物学专业论文）β核转运蛋白家族的进化、表达和调控模式分析.pdf

摘要 1 3 核转运蛋白家族是真核细胞中广泛存在的一类蛋白质，在生物大分子核质 转运这一细胞过程中扮演着关键角色。由于p 核转运蛋白家族各成员间序列组成 及结构上的差异，其所携带的底物及工作机制也有所不同。目前国际上对该家族 的研究尚浅，对其家族的形成及功能演化也尚未明晰。在本研究中，我们利用系 统发育分析，表达谱j 卷片分析，转录因子调控位点预测等方法，对酿酒酵母，秀 丽隐杆线虫，黑腹果蝇，斑马鱼，爪蟾，原鸡，小鼠和人类基因组中p 核转运蛋 白家族成员开展了进化、表达和基因调控模式分析。在酵母的1 4 个家族成员中， 8 个成员( k a p 9 5 ，k a p l1 4 ，k a p l 2 0 ，k a p l 2 3 ，c s e l ，m s n 5 ，c r m l 和l o s l ) 直接 与它们在人类中的同源蛋白对应，2 个成员( k a p l 2 2 和s x m l ) 在进化过程中丢 失，剩下的4 个成员( p s e l ，n m d 5 ，m t r l 0 和k a p l 0 4 ) 在不同的机制下发生了基因 重复。b 核转运蛋白虽普遍存在于各物种中，但在不同类型的组织和细胞中却不 是均匀表达的。在酵母和小鼠中某些d 核转运蛋白家族成员的基因表达水平同时 受到细胞周期和发育水平的调控。进一步对该家族基因启动子结合元件的虚拟分 析说明了s p l ，n r f 一2 ，h e n 1 ，r r e b 1 和n f y 等转录因子调控着大部分b 核转 运蛋白成员基因的表达。这些发现揭示了1 3 核转运蛋白家族进化过程中的功能分 化是与该蛋白家族多样的基因表达和调控模式密切相关的。 关键词：核转运蛋白；基因重复；逆转录转座 a b s t r a c t k a r y o p h e r i nps u p e r f a m i l yi sag r o u po fp r o t e i n sw h i c hw i d e l ys p r e a di ne u k a r y o t i c c e l l s t h e yp l a y ak e yr o l ei n m e d i a t i n gn u c l e o c y t o p l a s m i ct r a n s p o r t o f m a c r o m o l e c u l e s b e c a u s eo ft h e i rd i v e r s i t yi ns e q u e n c ec o m p o s i t i o n sa n ds t r u c t u r e ， t h e yb i n dv a r i e dc a r g o sa n df u n c t i o ni nd i f f e r e n tw a y s c u r r e n t l yk a r y o p h e r i np s u p e r f a m i l yi sn o tw e l ls t u d i e dw o r l d w i d e ，a n di t ss t i l lu n c l e a ra b o u tt h eo r i g i na n d f u n c t i o ne v o l v e m e n to ft h i sf a m i l y i nt h i ss t u d y , w ei n v e s t i g a t e dt h ee v o l u t i o n a r ya n d t r a n s c r i p t i o n a lp a t t e r n so ft h e s ep r o t e i n si n8g e n o m e s ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e , c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s , d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r , d a n i or e r i o , x e n o p u st r o p i c a l i s , g a l l u sg a l l u s ，a n dm u sm u s c u l u sa n dh o m os a p i e n s ) w i t ht h eh e l po fp h y l o g e n e t i c a n a l y s i s ，m i c r o a r r a ye x p r e s s i o np r o f i l ea n a l y s i sa n dp r e d i c t i o no ft r a n s c r i p t i o nf a c t o r b i n d i n gs i t e s a m o n g141 3 - k a r y o p h e r i n si ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ，8c o r r e s p o n d e d t ot h e i rh u m a no r t h o l o g sd i r e c t l yw i t h o u td i v e r s i f i c a t i o n ( k a p 9 5 ，k a p114 ，k a p12 0 ， k a p l 2 3 ，c s e l ，m s n 5 ，c r m la n dl o s l ) ，2w e r el o s t ( k a p l 2 2a n ds x m 0 ，a n d t h er e m a i n i n g4p r o t e i n s ( p s e1 ，n m d 5 ，m t r10a n dk a p10 4 ) e x h i b i t e dg e n e d u p l i c a t i o n sb y d i f f e r e n t m e c h a n i s m s 1 3 - k a r y o p h e r i n s w e r e u b i q u i t o u s l yb u t n o n u n i f o r m l ye x p r e s s e di nd i s t i n c tc e l l sa n dt i s s u e s i ny e a s ta n dm i c e ，t h et i t e ro f s o m e1 3 - k a r y o p h e r i nt r a n s c r i p t sa p p e a r e dt ob er e g u l a t e db o t hd u r i n gt h ec e l lc y c l ea n d d u r i n gd e v e l o p m e n t f u r t h e rv i r t u a la n a l y s i so fp r o m o t e rb i n d i n ge l e m e n t ss u g g e s t e d t h a tt r a n s c r i p t i o nf a c t o r ss p1 ，n r f - 2 ，h e n - 1 ，r r e b - 1a n dn f - yr e g u l a t ee x p r e s s i o n o fm o s ti b - k a r y o p h e r i ng e n e s t h e s ef i n d i n g si l l u m i n a t e dc l o s er e l a t i o n s h i pb e t w e e n f u n c t i o n a le v o l u t i o no fi b - k a r y o p h e r i n sa n dt h e i rd i v e r s i t yi ng e n ee x p r e s s i o na n d r e g u l a t i o np a t t e r n s k e yw o r d s ：k a r y o p h e r i n ；g e n ed u p l i c a t i o n ；r e t r o p o s i t i o n 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学 术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为( 纪志梁教授) 课题( 组) 的研究成果，获 得( 纪志梁教授) 课题( 组) 经费或实验室的资助，在( 厦门大学生 物信息学与药物开发) 实验室完成。( 请在以上括号内填写课题或课 题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特别声 明。) 声明人( 签名) ：砼哮 j 年6 其3 e t 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和 摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 ( ) 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“ 或填上相应内容。保密学位论文 应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密 委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认 为公开学位论文，均适用上述授权。) 声明人( 签名) ：左窨 纱哆年月弓日 刚蟊 1 前言 在真核细胞中，蛋白质，r n a ，核糖体的核质转运是至关重要的生理过程， 参与细胞核质转运过程的主要载体蛋白是p 核转运蛋白( 1 3 k a r y o p h e f i n s ) 家族， 该蛋白家族能将大分子底物通过核孔复合体( n u c l e a rp o r ec o m p l e x ，n p c ) 运输 到核内或核外【l 】。该蛋白家族成员的分子量大约在9 5 到1 4 5 k d a 间。迄今为止从 酵母到人类等真核生物中都有1 3 核转运蛋白被人们发现。在低等真核生物酿酒酵 母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 中1 4 个p 核转运蛋白成员起着运输相应货物进 核以及出核的作用【2 ，3 1 。然而在哺乳动物细胞中，有大约2 0 种p 核转运蛋白参与 了这些过程【4 】，各成员蛋白能转运一组特定类型的底物【5 1 。这个蛋白家族同时包 括了负责输出和输入的受体，其中负责底物输入的受体蛋白比负责输出的数量更 多。比如在酿酒酵母中，1 0 个成员蛋白负责将底物运输到细胞核内，3 个成员蛋 白( c r m l ，l o s l 和c s e l ) 负责输出，1 个成员蛋白( m s n 5 ) 既能参与底物输 入也参与输出过程【3 1 。 1 1b 核转运蛋白的结构 该家族蛋白的n 末端都有一个被称为i m p o r t i n bn t e r m i n a l ( i b nn ) 的结构 域( 或者叫做结合结构域)，中部靠近n端和c端分别有两个rangtp核孔蛋白 结合区，c 末端还有一个i m p o r t i n 仅结合域( 图1 ) 。1 3 核转运蛋白家族成员是由 18 个到2 0 个连续的h e a t ( h u n t i n g t i n ，e l o n g a t i o nf a c t o r3 ，p r o t e i np h o s p h a t a s e2 a ， t o r l ) 重复基序组成，每一个h e a t 重复基序都是由两段反平行的a 螺旋( a 螺旋和b 螺旋) 通过一段环链连接而成。这些h e a t 重复基序能在不同的功能 状态下呈现出不同的构象。柔性的h e a t 重复基序通过一种诱导一适应机制 ( i n d u c e d f i tm e c h a n i s m ) 促进了其结合物的定位【6 】。整体上该家族蛋白可以看作 一段超螺旋，同时在超螺旋的内侧和外侧具有广阔的相互作用表面【7 1 。这些特征 使得p 核转运蛋白区别于其他转运底物到非核细胞器的转运蛋白。 前言 a h e l i c e s n 型u c l e 堕o p 0 9 r i nt “n d i n g ( c ) l b h e li c e s 图li m p o r t i n b 结构域示意图( 引自【8 】) f i g u r e1 d o m a i no r g a n i z a t i o no fi m p o r t i n - p 通过结构分析人们发现p 核转运蛋白家族成员具有多个底物结合位点1 9 】。3 项独立研究分别分析了i m p o r t i n p l 与0 c 核转运蛋白片段0 。、转录因子s r e b p 一2 片段【1 1 1 和p t h r p ( p a r a t h y r o i dh o r m o n e r e l a t e dp r o t e i n ) 1 2 】结合的共结晶结构，这 些研究显示了d 核转运蛋白与这些底物间的结合部位是截然不同的。这说明每一 类1 3 核转运蛋白都可能含有多个底物结合位点，这也能解释有限种类的d 核转运 蛋白家族成员是如何转运各种不同性质的底物。这些不同的结构也显示出p 核转 运蛋白能够根据彳 = 5 0 ) 。这1 4 组基因分别是：c s e i i ，i p 0 4 ， i p 0 7 一i p 0 8 i p 0 9 ，i p o l l ，i p o l 3 一t n p 0 3 k p n b i ，r f i n b p s r a n b p 6 ，t n p o i t n p 0 2 ， x p o i x p 0 4 一x p 0 7 一r a n b p l 7 ，x p 0 5 x p 0 6 和x p o t 。有趣的是这1 4 组系统发育树 并币是都包含有酿酒酵母中的祖先基因。总结系统发育分析( 图6 ) 和同源分析 ( 表2 ) 的结果，酵母只有1 2 个b 核转运蛋白基因存多细胞物种中有同源物， 另外2 个基因k a p l 2 2 和s x m l 没有同源基因。实际上在b 核转运蛋白家族分化稳 定前基因的获得与丢失是很常见的。比如，酿酒酵母的7 个b 核转运蛋白家族 成员基凼( k a p l l 4 ，k a p l 2 0 k a p l 2 2 ，k a p l 2 3 ，m s n o ，n m d 5 和s x m l ) 在线虫中丢 失了，同时也有2 个新基因获得：c 3 5 a 58 ( 人类r a n b p l 7 和x p 0 7 可能的祖先基 因) 和y 6 9 a 2 a r1 6 ( 人类x p 0 4 的祖先基因) 。基因的获得与丢失在黑腹果蝇中也 有发现，y 6 9 a 2 a r1 6 ( 人类x p 0 4 的祖先基因) 和l o s i ( 人类x p o t 的祖先基因) 丢失了，一个新的b 核转运蛋白基因e x p 6 ( 人类x p 0 6 祖先) 新出现了。这些变化 结果与讨论 的发生可能使得各物种拥有最少量但足够的不同蛋白载体用于运输关键底物。 对其他7 种酵母和2 种植物的序列分析发现b 核转运蛋白基因的丢失在进 化过程中并不罕见：光滑假丝酵母( c a n d i d a # a b r a t a ) 1 4 个基因，汉逊德巴利 酵母( o e b a r y o m y c e sh a n s e n i d1 3 个基因，棉阿舒囊霉( e r e m o t h e c i u m g o s s y p i d1 4 个基因，乳酸克鲁维斯酵母( k u y v e r o m y c e s a c t i s ) 1 3 个基因，耶 氏酵母( y a r r o w i al i p o l y t i c a ) 1 2 个基因，裂殖酵母( s c h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b e ) 1 3 个基因，新型隐球菌( c r y p t o c o c c u sn e o f o r m a n s ) 9 个基因，拟南芥 ( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ( 1 7 个基因) ，水稻( o r y z as a t i v a ) 1 4 个基因。基因丢 失的原因可能与各物种在生理、行为和发育等方面的特征有关。由于在斑马鱼中 没有新类型的1 3 核转运蛋白成员基因被发现( 尽管存在一些已知的1 3 核转运蛋白 的重复基因) ，所以1 3 核转运蛋白成员基因的多样化和扩增应该是在不晚于斑马 鱼这一物种形成时开始稳定下来。然而这并不意味着在斑马鱼之后形成的物种中 没有基因的获得和丢失发生。例如i p 0 4 和t n p 0 2 的同源基因就在原鸡中丢失了。 为什么没有一些原始的1 3 核转运蛋白被发现这仍然是一个谜。然而，在一 些原生动物中我们却发现了一些简单的f 3 核转运蛋白，比如蓝氏贾第虫( g i a r d i a l a m b l i a ) 和秀丽隐杆线虫，蓝氏贾第虫只有4 个b 核转运蛋白基因【2 4 1 。去估计 到底有多少个b 核转运蛋白家族成员就足够个体生存是不太可能的，这是因为有 关该家族底物转运特异性的认识还不全面，甚至它们的功能也存在冗余：一些底 物能够被多种1 3 核转运蛋白识别并转运，同时某些b 核转运蛋白家族成员能够识 别多类底物。尽管如此，我们有理由认为某些b 核转运蛋白的存在或缺失对于所 有真核生物的生存是至关重要的。 为了在原核生物中搜寻1 3 核转运蛋白可能的祖先基因，我们用b l a s t 搜索 了迄今已完成测序的3 2 7 种细菌和2 7 种古细菌的基因组，但最后只发现了一段 由1 4 3 个氨基酸残基组成的片段( 丙酮丁醇梭菌c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y i c u m 感觉传导组氨酸激酶s e n s o r yt r a n s d u c t i o nh i s t i d i n ek i n a s e 片段) 与酵母 s x m l p 蛋白序列有微弱的相似性( 序列一致性2 6 ) 。其他b 核转运蛋白也对某些 原核生物基因组中的短序列显示出了弱相似性( 不超过3 0 序列一致性) ，其中 许多都是尚未有任何注释的假定的蛋白片段。这些序列可能就是h e a t 重复基序 的远源同源物。 结果与讨论 c s e l l i o o 7 l o o c s e l lh s 1 0 0 jc s e ll m m 划l c s e l l g g lc s e l l d r c a sd m i m b - 5 c e h o 1 c s e l s e c s e l l 叫 o 1 卜一 o 1 l p 0 1 1 - - 一 o 1 d m 4s c - 一 o 1 i - 4 o i 2 s c e 叫 o i - o 1 - - 一 o l h o i 1 6 c e 一 o 1 1d m s c c g 跎1 9d m e k a p i l n s e - - - - - _ o 1 x p a t i - - - - 4 o i 卜叫 o i 图6 ：8 个物种1 3 核转运蛋白超家族基于蛋白序列全长的系统发育树。 b 6c e l o s l s c f i g6 - p h y l o g e n e t i ct r e e sc o n s t r u c t e do nt h ef u l l - l e n g t hp r o t e i ns e q u e n c e so f k a r y o p h e r i n b s u p e r f a m i l ym e m b e r si ne i g h to r g a n i s m s 1 6 表2 ：8 物种1 3 核转运蛋白家族成员一览。 t a b l e2 ：s u m m a r yo f1 3 一k a r y o p h e r i ng e n e so f e i g h to r g a n i s m s ( 表中各组同源基因由不同的阴影形式区分。我们发现i p 0 7 和i p 0 8 可能来源于同一个祖先 基因，即酿酒酵母中的n m d 5 ：i p 0 1 3 和t n p 0 3 可能来源于同一个祖先基因，即酿酒酵母 中的m t r l 0 ；r a n b p 5 和r a n b p 6 可能来源于同一个祖先基因，即酿酒酵母中的p s e l ； t n p o i 和t n p 0 2 可能来源于同一个祖先基因，即酿酒酵母中的k a p l 0 4 ；x p 0 7 和r a n b p l 7 可能来源于同一个祖先基因，即秀丽隐杆线虫中的c 3 5 a 5 8 。斜线表示在该位置没有对应的 同源基因发现。) 酿酒酵母秀丽隐杆线虫 黑腹果蝇 斑马鱼爪蟾原鸡小鼠 人类 c s e ll m b 一5c a s c s e l lc s e l lc s e l lc s e l lc s e l l c g 3 2 1 6 4 k a p l 2 3，i p 0 4i p 0 4，i p 0 4i p 0 4 c g 3 2 1 6 5 l p 0 7l p 0 7l p 0 7i p 0 7 l p 0 7 n m d 5，m s k l p 0 8 a i p 0 8l p 。8i p 0 8l p 0 8 l p 0 8 b k a p l l 4r a n b p 9i p 0 9i p 0 9i p 0 9 l p 0 9i p 0 9 k a p l 2 0， r a n b p l ll p o 钉i p 0 1 1i p 0 1 1l p 0 1 1l p 0 1 1 t 1 6 g 1 2 6c d mi p 0 1 3l p 0 1 3i p 0 1 3i p 0 1 3 l p 0 1 3 m t r l 0 t s r o lt r n s rt n p 0 3 t n p 0 3t n p 0 3t n p 0 3t n p 0 3 k a p 9 5l m b 1 f s ( 2 ) k e t k p n b lk p n b lk p n b lk p n b lk p n 8 1 r a n b p 5r a n b p 5 p s e li m b - 3k a r y b e l 3r a n b p 5r a n b p 5r a n b p 5 r a n b p 6r a n b p 6 t n p 0 1t n p o 1 n p 0 1t n p 0 1t n p 0 1 t r n k a p l 0 4l m 良2 t n p 0 2 a c g 8 2 1 9t n p 0 2，t n p 0 2 1 n p 0 2 t n p 0 2 b x p 0 1 a c r m li m b - 4e m 8x p 0 1x p 0 1x p 0 1 x p 0 1 x p 0 1 b x p 0 4 a ly 6 吼吣 a r 1 6|x p 0 4x p 0 4 x p 0 4x p 0 4 x p 0 4 b m s n 5， r a n b p 2 1x p 0 5x p 0 5x p 0 5x p 0 5x p 0 5 |， e x p 6x p 0 6x p 0 6x p 0 6x p 0 6x p 0 6 x p 0 7 ax p 0 7x p 0 7 x p 0 7 |c 3 5 a 5 8 r a n b p l 6 x p 0 7 x p 0 7 b r a n b p l 7r a n b p l 7r a n b p l 7 l o s ll m b 6 ，x p o tx p o tx p o tx p o t x p o t s x m l， ，7 ， ，| k a p l 2 2， ，|， 1 7 结果与讨论 3 1 3 基因重复 苎1 3 核转运蛋白家族的扩张伴随着不断重复的基因扩增。序列比对显示有5 对人类1 3 核转运蛋白家族成员( 1 0 个蛋白) 彼此很相似：i p 0 7 一i p 0 8 ，i p 0 1 3 一t n p 0 3 ， r a n b p 5 - r a n b p 6 ，t n p 0 1 - t n p 0 2 和x p 0 7 一r a n b p l7 。由于每一对b 核转运蛋白都可 能起源于同一个祖先基因，所以我们进行了物种内和物种间的外显子比较分析 ( 图7 ，图8 ) 。根据每个外显子的长度和核苷酸组成，我们发现同源b 核转运蛋 白基因在不同物种中是很保守的。比如基因r a n b p 5 的保守性能够追溯到最早的 共同祖先，即酿酒酵母的p s e l 基因( 图8 ) 。通过对1 3 核转运蛋白基因外显子排 列的比较，我们发现i p 0 7 一i p 0 8 ，t n p 0 1 - t n p 0 2 和x p 0 7 一r a n b p l 7 这3 对基因，每 一对的双方成员都具有几乎一样的外显子数目、长度和顺序( 图7 ) 。这个发现 强有力地支持了一个假说，即这些1 3 核转运蛋白成员对是通过基因重复( g e n e d u p l i c a t i o n ) 产生，他们应该起源于共同的祖先基因。该家族完整的外显子排 布比较结果请参见h t t p ：b i o i n f x m u e d u c n k a g o p h e r i n e x o n h t m 。 重复的b 核转运蛋白对也能够在黑腹果蝇( c g 3 2 1 6 4 一c g 3 2 1 6 5 和 t r n c g 8 2 1 9 ) 和斑马鱼( i p 0 8 a i p 0 8 b ，t n p 0 2 a - t n p 0 2 b ，x p o l a - x p o l b ， x p 0 4 a - x p 0 4 b 和x p 0 7 a x p 0 7 b ) 的基因组中找到( s t2 ) 。这些基因对的蛋白序列 显示出了很高的一致性：9 9 9 ( i p 0 8 a i p 0 8 b ) ，9 7 7 ( c g 3 2 1 6 4 一c g 3 2 1 6 5 ) ，9 4 8 ( x p o l a - x p o l b ) ，9 1 9 ( t n p 0 2 a t n p 0 2 b ) ，8 4 1 ( x p 0 7 a x p 0 7 b ) ，6 8 6 ( t r n - c g 8 2 1 9 ) 和6 3 9 ( x p 0 4 a - x p 0 4 b ) 。然而目前并没有证据表明该家族的基 因重复在更高等的物种里面也存在，同时1 3 核转运蛋白的一些重复基因可能进行 了分化并获得了新功能。因此黑腹果蝇和斑马鱼基因组中的基因重复可能实际上 对该物种的形成作出了贡献。 结果与讨论 c s e l i p 0 7 i p 0 8 i p 0 1 1 i p 0 1 3 k p n b l 蒯b p 6 d 。日踢囝团晷团饧，厨囫目饧- 目- 国- 饧国一日- 日t 豳- 罾囝固- 场囫t 匠二 1 2 3 删1 4 3 1 0 2 1 4 8 9 11 0 8 1 6 81 3 06 62 0 38 5 6 21 3 7 1 0 4 t 5 12 0 9 8 21 4 72 3 2 s o ) 目- 伢罟1 罾堰牙一目署一屠- 囫咽艮。团。忍豳忍伢一伢屠艮罾日忍矛一昏仍- 咆刁讶囫。口仞 v 硝8 78 04 2 1 3 01 8 0 1 0 28 41 6 55 4 1 1 01 3 0 1 1 41 1 41 2 11 1 21 1 6 阳5 81 0 61 9 45 11 2 62 0 91 站1 艏7 e 1 3 1 日窃仞- 仞饧日- 饧场- 伢仞屠囫一伢饧- 囫一日- 日一囫仞一日豳一沥一囫，场目 “8 21 5 4 鞠1 5 7s o9 58 51 3 5 l o o 玎1 1 7 1 1 础1 6 7 9 62 2 1 2 0 62 0 1 1 1 7 雏 皿留一囫饧- 饧一伢- 日- 日盟一罚一蚤场国- 饧一日昼目一层国- 署一饧豳- 沥翻- 臣- 二 2 5 4 ( 8 4 ) 8 21 5 71 鞠1 5 7s o 9 5 8 51 3 5 1 0 07 7 1 1 79 0 1 6 81 6 11 2 6 6 71 2 6 9 62 2 12 0 62 0 41 1 71 嘲) 呀- - 日- 豳日- 目- 日囫- 昏历目忍- 豳园囫盔一团一沥饧囫- 团- 惕日仁： 2 3 2 ( 1 6 3 ) 6 2 8 72 0 2 8 98 7 1 2 01 0 1 1 5 2 1 0 71 4 0 1 6 02 2 7 1 4 9 1 2 92 7 61 6 7 1 3 4 1 2 31 0 5 7 78 3 5 1 ( t r 1 ) 日署一昏一臣勿一囫- 罾昏一昏一囫一饧一 屠一 囫留 一团饧一屠日一日国- 罟- 团- 饧- 目一目一饧 1 3 81 0 l7 32 0 4 t 3 35 94 97 11 9 31 5 34 49 1 伯1 1 打3 44 11 1 7 1 1 41 1 6 丌8 08 1 1 1 4 1 2 29 6 皓1 皓 二二盈一弦圆饧场雹豸团场- 屯豸- 1 饧- 诩署日日吾曙目- 讶囫一层口 7 6 4 ( 8 4 ) 7 3 71 4 11 4 2t 6 71 2 11 4 81 8 22 7 1 3 51 4 48 11 3 89 7 5 3 6 75 9 9 01 8 2 4 3 7 ( 9 7 ) 一昏一囫一层豺一翰昏日一珏一日一琶勿一豳一豳一场习一艮伢一豳一豳忍饧饧一 二二二二 3 7 6 ( 4 0 ) 5 91 8 32 0 11 5 36 0g o1 1 11 0 22 2 5 1 9 21 3 11 4 87 21 4 58 31 1 4 41 0 6 1 1 5 1 6 21 2 3 5 ( 1 ) i 口一凸一层一目一鼍銎一日- 忍一豳一日一豳一目一忍一珏日饧嚯勿- 固- 场一昼一日一饧饧署一日呀忍蕴日一匠二： 4 2 1 0 8 9 4 ( 9 0 ) 8 11 9 3 1 0 39 71 0 51 2 3 1 2 1 1 0 71 2 5 9 0 1 7 42 1 98 41 3 3 1 2 29 71 7 3 1 1 25 61 2 3 2 2 02 2 91 4 22 5 6 2 ( 叻 4 5 7 6 ( 3 3 1 8 1 r a n b p l 7 卜囫- 固一琶豸一 饧一囫一日召一日一囫埋绪一豳一场一目一屠一目一忍一日- 伢场- 日- 琶豸日- 囫- 罾场。囝 1 81 4 79 t1 贸6 81 0 5 1 6 67 4 1 2 01 4 7 1 7 31 9 41 1 7 引6 41 0 9 1 0 4 1 0 8 2 1 51 3 91 钉t 2 8 钉 1 n p 0 t 1 w p 0 2 1 w p x p 0 1 x p 0 4 x p x p o e x p o t 口- 电釜一目一囫一 一团埋绪喝场一饧- 扈豸一团一罾t 日均一昏i 昏- 团- 日- 日- 日历- 咆勿一饧- 饧一署w 日t 臣 1 1 邮8 ) 1 4 7 9 4 1 6 76 61 0 5 1 6 67 41 2 0 1 4 7 1 7 3 1 9 4 1 0 6 1 3 67 47 2 1 5 5 8 1 0 78 91 8 32 1 51 1 6 1 轴1 2 84 7 3 ( 9 4 ) - 日b 豳- 艮罾- 场一日囫唱饧- 日囫- 囫署- 团- 团一目国- 固- 目- 目珏团口 8 2 1 1 4 ( 1 0 s ) 7 6 1 5 0 1 0 71 3 48 2 1 2 31 1 96 1 1 6 91 5 3 2 2 6 1 7 28 71 0 8 1 5 q8 8 9 99 67 61 0 07 5 1 4 3 ( 9 日) 2 3 8 0 固一目一场仞团一日一伢忍一唱一讶一日一囫一汤一园一忍一饧- 目饧一署- 囫伢署一囫口 1 1 复1 7 6t 5 0 1 0 71 3 48 21 2 31 1 96 1 1 臼 2 2 61 7 28 71 0 8 1 5 98 8 1 0 6 1 0 07 5 1 2 鲋蚴刚 日囫一瑁一日场髫蕴一日一盔一昼伢嚯蕴一囫一伢署一 嚯蚕一囫罾饧一囝一日暑 2 3 3 ( 1 2 0 ) 2 0 17 4 1 5 7 1 4 41 7 61 3 91 4 7 t 0 69 22 1 21 9 29 2 7 76 11 4 11 1 79 5 1 耵1 6 81 1 34 35 1 日一日一罾一号昏囫一昏日饧一饧一埋历饧一莒豸一医一日一日一囫一罾医瑟- 囫一切一团伢一团 1 1 7 3 眩51 啦的1 加1 均1 鞠1 1 1 跎1 耵1 斜1 3 51 1 1 蛄1 1 3 51 9 71 4 7 囝- 忍一日- 忍一伢一日囫仞一电牙一囫一饧一场鼍豸一讶一囫黾銎- 匠勿囫一忍一匠一团一层坯二j j j j j j ：! ! j j 4 1 ( ) 1 0 6 1 4 21 3 0 1 1 7t 5 4 1 1 3 1 5 8 1 7 51 丌1 4 31 61 7 8 1 6 0 1 7 01 7 52 9 41 8 11 1 91 3 11 1 89 35 0 4 5 ( s e ) 囝昼一日一饧一饧- l - 饧一日一场- 国一场目饧屠一日阳饧一目- 惕一日国一伢鲁一昏署一 屠一场- 伢饧- 匝： 2 5 5 ( 1 嗡1 2 2 7 3 1 3 81 8 32 71 8 67 71 0 0 8 41 籀9 11 2 91 3 11 5 64 2 9 0 抛1 0 01 8 21 0 19 71 5 18 44 7 6 38 31 0 8 1 3 8 1 6 5l s 6 e ( 1 弼 口一伢一团一琶勿一场一饧一嚯弦琵笏场一口一团一日一臣一日一日一日日一囫- 饧一饧一层孕一日罾一琵勿伍二 5 0 4 ( 3 ) 9 11 1 31 9 8 1 6 07 84 5 41 2 7 1 1 0 1 0 99 3 7 01 6 09 31 4 5 1 4 7 1 s o1 5 61 1 5 1 7 21 6 2 鲳2 3 16 4 5 ( 1 0 2 ) 目- 蚤日瑁- 嚯勿饧一日屋勿+ 一 切- 诩固- 忍罟一层勿- 握翌勿- 咆蕴- 囫饧昌- 昏 - l 5 77 02 1 91 皓1 2 3 7 1 2 51 | 51 加7 02 3 9 2 8 s1 1 1 71 t 6 柏7 2s 7 刀 图7 ：人类2 0 个b 核转运蛋白家族成员基因的外显子排布。 f i g7 ：t h ee x o na r r a n g e m e n t so f 2 0h u m a nb ( 图中带阴影的方块表示基因的翻译区，空白的区域表示非翻译区u t r 。方块下面的数字表 示该外显子的长度( 碱基对) ，括号中的数字表示当一个外显子同时包含翻译区和非翻译区 时，此外显子中翻译区的长度。我们发现t n p o i t p n p 2 ，i p 0 7 i p 0 8 和x p 0 7 - r a n b p l 7 等 基因对具有很强的结构相似性。r a n b p 6 只有一个外显子，我们认为它起源于r a n b p 5 基 因的反转录转座。) 1 9 结果与讨论 3 1 4 逆转录转座 正如前面的讨论，基因重复是1 3 核转运蛋白家族扩充的几种可能机制之一。 由序列比对和同源物分析结果判断，r a n b p 5 和r a n b p 6 关系非常密切。为了搞清 r a n b p 5 和r a n b p 6 的进化途径，我们研究了它们的外显子排列。图8 清楚地显示 了酿酒酵母p s e i 基因的外显子数量从一个增长到斑马鱼中的2 6 个和人类的2 9 个，它是人类r a n b p 5 基因可能的祖先基因。我们推测外显子数目的倍增反映了 哺乳动物表型的高度复杂性【3 们。基因非翻译区的大量扩增( 从酿酒酵母中o b p 到人类中约2 ，7 0 9 b p ) 可能有利于基因转录的调控。然而，不同于r a n b p 5 和其 他b 核转运蛋白家族成员，r a n b p 6 基因在人类和小鼠基因组中仅有一个外显子 ( 图8 ) 。进一步对e n s e m b l 基因组数据库的b l a s t 搜索发现r a n b p 6 的同源基因 仅在哺乳动物中存在。因此我们认为r a n b p 6 基因的出现可能是r a n b p 5 基因逆转 录转座的结果，这导致了一个只含有一个外显子的新基因的产生【3 7 】。从已知的 r a n b p 6 同源物判断，r a n b p 5 基因逆转录转座并生成r a n b p 6 这一过程可能 发生在哺乳类与鸟类分化前。已经有证据表明r a n b p 6 是r a n b p 5 的功能性逆 转录物( r e 仃o c o p y ) 【3 引，这正好支持了我们的推论。通过同源分析我们还发现了 r a n b p 6 的同源基因具有多个外显子，比如家犬( c a n & f a m i l i a r i s ) 3 个外显子家 兔( o r y c t o l a g u sc u n i c u l u s ) 6 个外显子，购鼯( s o r e xa r a n e u s ) 12 个外显子。由于除 了哺乳动物在其他物种中没发现r a n b p 6 的同源基因，所以我们有理由断定此 逆转录转座事件发生在哺乳类的物种形成中。逆转录转座事件发生后，r a n b p 6 基因在哺乳类中进一步分化：内含子物种特异地插入到这一仅有的外显子中。这 或许能够解释r a n b p 6 的同源基因为何含有多个外显子。此前已有类似的现象 报道【3 9 柏】。 2 0 窆 z 望叠 坠 昏 国； 凼曼 衅 6 圣 拐垂 。m嘣隶牛1妞回毯七b磁罢粼 0 2 ) ，小于均值( s p m 0 2 ) 。 p 核转运蛋白基因被认为是“管家基因( h o u s ek e e p i n gg e n e s ) ”，表3 显示 了该家族基因虽是普遍表达的，但并不是在所有人类组织中都均匀地表达。2 0 个人类p 核转运蛋白成员基因中有1 2 个成员( c s e l l ，i p 0 4 ，i p 0 7 ，i p 0 9 ，k p n b l ， r a n b p 5 ，t n p 0 1 ，t n p 0 3 ，x p 0 1 ，x p 0 4 ，x p 0 5 和x p o t ) 在积极增殖的组织，比 如淋巴细胞、肿瘤、睾丸和干细胞中显示出了相对的高表达。这些基因的高表达 可能是由于它们负责运送细胞增殖所需的大量货物，诸如组蛋白、糖皮质激素受 体和r n a 等等【4 】。例如，转运i m p o r t i n a 的c s e l l 基因在结肠癌细胞系、乳癌 细胞和肝肿瘤中过量表达【4 ，过多的c s e l l 可能减少了i m p o r t i n 彬b 依赖性底 物的运输。肿瘤细胞中c s e l l 基因的高表达可能反映了核质转运过程的失常。 结果与讨论 在过量表达的基因中，k p n b l ，r a n b p 5 ，c s e l l ，x p 0 1 ，x p 0 5 和t n p 0 3 在淋巴 母细胞中比在其他快速增殖型组织中表达水平更高。第二组1 3 核转运蛋白基因 ( 口o l l ，i p 0 1 3 ，r a n b p 6 ，t n p 0 2 和x p 0 6 ) 在脑和脊索中比在其他组织中更强 烈地表达。1 3 核转运蛋白基因在多种组织中不同的表达模式同样也能在