（海洋生物学专业论文）文昌鱼（branchiostoma+belcheri）体内细菌清除机制及免疫致敏作用研究.pdf

中国海洋大学博士学位论文 文昌鱼( b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i ) 体内细菌清除机制 及免疫致敏作用研究 捅要 文昌鱼属于脊索动物门，头索动物亚门，是与脊椎动物亲缘关系最接近的无 脊椎动物，一直被认为是研究脊椎动物起源和进化的模式生物。近年来，人们开 始在文昌鱼中探索免疫系统的起源和进化。本文通过细菌感染文昌鱼，研究了文 昌鱼清除体内细菌的免疫机制，并通过荧光实时定量p c r 技术对文昌鱼的补体关 键基因表达模式以及是否存在免疫致敏作用作了研究。 首先，通过用绿色荧光蛋白标记的大肠杆菌感染文昌鱼，将文昌鱼切成小段 把体液涂抹于载玻片上，在荧光显微镜下观察体液中细菌，证明文昌鱼能有效清 除入侵的异源微生物。这是在头索动物中关于体内细菌清除的首次报道。血细胞 的吞噬作用被认为是无脊椎动物清除细菌的最重要途径。我们通过组织切片法在 文昌鱼体内寻找包含大肠杆菌的细胞，至少在20 0 0 条文昌鱼中都没有发现任何 吞噬有大肠杆菌的细胞，表明文昌鱼既使具有自由循环的巨噬细胞，也不是其清 除入侵大肠杆菌的主要因素。而体液可能是清除细菌的主要成分，为了确定文昌 鱼体液中哪些成分参与了细菌清除作用，我们通过体外杀菌来分析。提取文昌鱼 体液，把细菌加入其中，然后于不同时间取样涂布平板，进行菌落计数。发现体 液对大肠杆菌具有较强的杀灭活性。通过特异性抗体抑制发现补体和溶菌酶是参 与文昌鱼体液杀菌作用的重要体液因子。相比之下，补体较溶茵酶作用更强。为 进一步确定哪些补体激活途径参与了文昌鱼体液的杀菌作用，通过分别抑制特定 的补体途径，进而比较体液杀菌活性变化的方法，发现主要是通过替代途径激活 参与细菌清除作用。w e s t e r nb l o t 结果显示大肠杆菌感染后，文昌鱼体液中c 3 和溶菌酶水平均有明显升高，进一步证明，补体和溶菌酶确实是参与文昌鱼体内 细菌清除的主要因子。 其次，用大肠杆菌和鳗弧菌持续感染文昌鱼，在感染后的不同时间段取材， 分别提取去肠鱼和肠组织的r n a ，运用荧光实时定量p c r 技术研究补体系统关 键基因的表达模式。研究发现文昌鱼对大肠杆菌和弧菌两种革兰氏阴性菌的反应 性基本一致，补体基因的表达规律非常类似。两种细菌感染文昌鱼后，与正常对 中国海洋大学博士学位论文 照组相比，b f , c 3 及c 6 三基因都存在不同程度的上调。大肠杆菌感染后，肠中 的表达在3h 就达到最高值，而去肠鱼中的表达在感染后的6h 达到峰值。鳗弧 菌感染后，肠中的表达在6h 时上调最为显著，而去肠鱼中的表达在感染后的1 2 h 达到最高。这表示这些基因在文昌鱼感染的急性阶段可能发挥重要作用。有趣 的是，m a s p 在感染后表达降低，这可能是细菌逃避机体补体系统杀伤，维护自 身的一种机制。b f , c 3 及c 6 三基因在肠中的总体表达水平，均高于在去肠鱼中 的表达，达到峰值的时间均比在去肠鱼中的提前。m a s p 在感染后，肠中表达的 下调倍数也比在去肠鱼中的高。这说明文昌鱼的消化系统可能是参与免疫的重要 的器官，在清除外来微生物的免疫应答中起着重要作用。 最后，分别用大肠杆菌和鳗弧菌对文昌鱼进行二次感染或交叉感染，运用r e a l t i m er t - p c r 技术对补体四个基因的表达模式进行分析，以研究文昌鱼的免疫系 统是否具有免疫致敏作用。发现用同一种细菌二次感染后补体基因b f 、c 3 和c 6 的表达上调均比首次感染后显著，达到峰值的时间都明显提前，而且表达水平能 较长时间维持在一个较高的水平。同样，在两种细菌交叉感染实验中，二次感染 后基因表达上调明显，但与同种细菌感染两次相比，基因的上调倍数还是略低。 所有这些特点与脊椎动物的免疫致敏作用类似，证明文昌鱼免疫系统可能存在免 疫致敏作用。 总之，本实验表明缺乏自由循环的血细胞的文昌鱼能够有效清除入侵的大肠 杆菌。补体和溶菌酶是参与体内细菌清除的主要因子，但补体的作用较溶菌酶更 强。这是关于文昌鱼清除体内细菌机制及其相关因子的首次报道。通过荧光实时 定量p c r 技术证明文昌鱼存在免疫致敏作用，这在头索动物中亦属首次报道。 关键词：文昌鱼；体液；补体；溶菌酶；抗菌活性：免疫致敏 中国海洋大学博士学位论文 s t u d yo fb a c t e r i a lc l e a r a n c ea n di m m u n o l o g i c a lp r i m i n gi n a m p h i o x u s b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i a b s t r a c t a m p h i o x u so rl a n c e l e t ，ac e p h a l o c h o r d a t e ，h a sl o n gb e e nr e g a r d e da st h el i v i n g i n v e r t e b r a t em o s tc l o s e l yr e l a t e dt ot h ep r o x i m a t ei n v e r t e b r a t ea n c e s t o ro fv e r t e b r a t e s p r e v i o u s l y , a r n p h i o x u si sw i d e l yu s e da st h em o d e lo r g a n i s mf o rs t u d y i n ge v o l u t i o n a n dd e v e l o p m e n t r e c e n t l ni th a sb e e nu s e dt oe x p l o r et h eo r i g i na n de v o l u t i o no f i m m u n es y s t e m t h i sp a p e r , d e a l sw i t ht h eb a c t e r i a lc l e a r a n c ea n di m m u n o l o g i c a l p r i m i n gi na m p h i o x u sb r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i f i r s t , a m p h i o x u sw a sc h a l l e n g e dw i t he c o l iw i t ht r a n s g e n i cg r e e nf l u o r e s c e n t p r o t e i n ( g f p ) g e n e ，a n dt h en u m b e r so fec o l ii nt h eh u m o r a lf l u i d sw e r ec o u n t e d u n d e raf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e r e s u l t si n d i c a t e dt h a ta m p h i o x u sb b e l c h e r iw a s a b l et oe f f i c i e n t l yc l e a rt h ei n v a d i n gb a c t e r i al i k eec o l if r o mi t sh u m o r a lf l u i d s p h a g o c y t o s i sb yb l o o dc e i l si sr e g a r d e da sa l li m p o r t a n tw a yt or e m o v eb a c t e r i ai n i n v e r t e b r a t e s t of i n do u tt h em a j o re l e m e n t sr e s p o n s i b l ef o rt h ec l e a r a n c eo fi n f e c t e d i n v a d e r s ，t i s s u es e c t i o n sw e r et e s t e dt os e a r c hf o rt h ec e l l sw h i c hm a ye n g u l f e c o l ii n a m p h i o x u s n o tas i n g l eh a e m o c y t e l i k ec e l lh a se v e rb e e ns e e na m o n ga tl e a s t20 0 0 s a m p l e se x a m i n e d ，s u g g e s t i n gt h a tf r e ec i r c u l a t i n gm a c r o p h a g e sn o tt h em a i n e l e m e n t sf o rt h ee l i m i n a t i o no fi n v a d i n gb a c t e r i u mec o l ii na m p h i o x u s t h e nt h e h u m o r a lf l u i d sw e r et e s t e df o rs c r e e n i n gt h ef a c t o r sa t t r i b u t a b l et ot h er e m o v a lo f i n v a d e r si na m p h i o x u s t h ef i n d i n g ss u g g e s tt h a tt h eh u m o r a lf l u i d sc a nr e a d i l yl y s e t h eb a c t e r i u me c o l ii nv i t r o t h ec o m p l e m e n ta n dl y s o z y m ea r eb o t hi n v o l v e di nt h e e l i m i n a t i o ni nv i v oo ft h e i n v a d i n gb a c t e r i u mi n a m p h i o x u s ，b u tt h ec o m p l e m e n t a p p e a r sp l a y i n gas t r o n g e rr o l et h a nt h el y s o z y m e p r e - i n c u b a t i o no fa m p h i o x u s h u m o r a lf l u i d sw i t ht h es p e c i f i ca n t i b o d i e sa n di n h i b i t o r , r e s u l t ss h o w e dt h a t t h e c o m p l e m e n to p e r a t i n gv i at h ea l t e r n a t i v ep a t h w a y w e s t e r nb l o ts h o w e dt h a tb o t hc 3 a a n dl y s o z y m el e v e l si n c r e a s ew i t ht h ec h a l l e n g ew i t he c o l i t i f f sw a sf u r t h e rs h o w e d t h ec o m p l e m e n ta n dl y s o z y m ew e r eb o t hi n v o l v e di nt h ee l i m i n a t i o ni nv i v oo ft h e i n v a d i n gb a c t e r i u mi na m p h i o x u s i i i 中国海洋大学博士学位论文 q u a n t i t a t i v er e a l t i m ep c rw a se m p l o y e dt oq u a n t i f yt h ec o m p l e m e n tk e yg e n e e x p r e s s i o ni nt h eg u ta n dg u t f r e eb o d yo fb b e l c h e r ic h a l l e n g e 、析t l le c o l ia n d v a n g u i l l a r u m r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep a t t e r n so ft h eg e n ee x p r e s s i o nw e r es i m i l a r a f t e rc h a l l e n g e 谢血t h eb o n lb a c t e r i a c o m p a r e d 谢t l lt h ec o n t r o l s ，b f , c 3a n dc 6 g e n e ss h o w e das i m i l a ru p r e g u l a t i o np r o f i l ea f t e ri n f e c t i o n t h e i re x p r e s s i o ni nt h e g u tp e a k e da t3h w h i l et h ee x p r e s s i o ni nt h eg u t - f r e eb o d yr e a c h e dt h eh i g h e s tl e v e l s a t6ha f t e re c o l ic h a l l e n g e s i m i l a r l y ，t h ee x p r e s s i o no ft h e g e n e si nt h eg u t m a x i m i z e da t6kw h i l et h e i re x p r e s s i o ni nt h eg u t f r e eb o d yr e a c h e dm a x i m u ma t12 ha f t e rk a n g u i l l a r u mc h a l l e n g e t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e c o m p l e m e n t c o m p o n e n t sp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h ea c u t ep h a s eo fi n f e c t i o n i nc o n t r a s t , m a s p e x p r e s s i o nd e c r e a s e dm a r k e d l ya f t e ri n f e c t i o n t h i sm a yb ed u et ot h eb a c t e r i a l e o u n t e r - m e a s u r et oa v o i dt h ea c t i v a t i o no ft h ec o m p l m e n t a l lt h e s ei n d i c a t et h a t a m p h i o x u sd i g e s t i v es y s t e mr i c hi nm u c o s am a yb et h em a j o ri n l n l u n et i s s u e r e s p o n d i n gt ob a c t e r i a lc h a l l e n g ea n dp l a ya l li m p o r t a n tr o l ei nt h ei n l l t l u n er e s p o n s e f i n a l l y , a m p h i o x u sw a sr e i n f e c t e d 、析n 1e c o l ia n dv a n g u i l l a r u mi nd i f f e r e n tw a y s a n dq u a n t i t a t i v er e a l - t i m ep c rw a se m p l o y e dt os t u d yi ft h e r ei si m m u n o l o g i c a l m e m o r yo rp r i m i n gi na m p h i o x u sb r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e e x p r e s s i o no fb f , c 3a n dc 6g e n e sw e r es i g n i f i c a n t l yu p - r e g u l a t e da n dp e a k e de a r l i e r a f t e rs e c o n d a r yi n f e c t i o n 诵t 1 1t h es a m eb a c t e r i a w h a t sm o r e ，t h eg e n ee x p r e s s i o n k e p ta th i g hl e v e l sf o ral o n g e rt i m ec o m p a r e dw i t ht h ep r i m a r yi n f e c t i o n i nc o n t r a s t ， t h ee x p r e s s i o nl e v e l so ft h eg e n e si nt h ea n i m a l si n f e c t e d 、析t ht h ed i f f e r e n tb a c t e r i u m w e r el o w e rt h a nt h o s ei nt h ea n i m a l si n f e c t e dw i t ht h es a m eb a c t e r i u m t h e s e p r o p e r t i e sa p p e a rb e a r i n gr e s e m b l a n c et ot h ei m m u n o l o g i c a lp r i m i n gi nv e r t e b r a t e ， s u g g e s t i n gt h ep r e s e n c eo fs o m ei m m u n o l o g i c a lp r i m i n gi na m p h i o x u s i ns u m m a r y , t h i ss t u d yd e m o n s t r a t e st h a tt h ec i r c u l a t i n gh a e m o c y t e f r e ea m p h i o x u s i sa b l et oe l i m i n a t ei n v a d i n gb a c t e r i al i k ee c o l ie f f i c i e n t l y , b o t ht h ec o m p l e m e n ta n d l y s o z y m ea r et h em a i nf a c t o r sa c t i n gi nc o n c e r tt oe l i m i n a t et h ei n v a d e r si nv i v o a l s o ， a m p h i o x u sa p p e a r st oh a v ei m m u n o l o g i c a lp r i m e da b i l i t y ，t h ef i r s ts u c hd a t ai nt h e p r o t o c h o r d a t e s w 中国海洋大学博士学位论文 k e yw o r d s ：a m p h i o x u s ；h u m o r a lf l u i d s ；c o m p l e m e n t ；i y s o z y m e ；a n t i - b a c t e r i a l a c t i v i t y ；i m m u n o l o g i c a lp r i m i n g v 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 洼；翅遗直基丝盖 壅挂墨直明的：奎栏亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国 家有关部门或机构( 如中国科学技术信息研究所等) 送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位 论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：王形黔 剔擀嘞 乙 。l7 签字日期：；印g 年莎月伫日签字日期：2 椰年占月扬日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编 文昌鱼( b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i ) 体内细菌清除机制及免疫致敏作用的研究 第一章文献综述 1 无脊椎动物免疫系统概况 免疫是机体识别和排除异己的一种重要的生命现象，是生命存在和延续的基 础。不管低等生物还是高等生物，都存在着宿主对外来入侵者的防御和修复自身 组织损伤的机制。免疫系统是极其复杂的，动物免疫由先天性免疫和获得性免疫 系统组成。先天性免疫存在于各种生物体中，以非特异性的“非己”识别为特征， 而获得性( 特异性) 免疫是一种高级的、复杂的免疫反应，以特异性的“非己” 识别为特征，是生命进化到高级阶段的体现。 由于无脊椎动物体内缺乏免疫球蛋白，缺乏抗体介导的免疫反应，因而一般 认为无脊椎动物只存在非特异性免疫。无脊椎动物以不同的方式抵御病原体的侵 袭并能识别异已物质，其免疫反应具有不同于脊椎动物的一些独特的性质，主要 包括血细胞的吞噬、包囊以及血淋巴中的一些酶或因子的杀菌、抗菌作用等，这 些反应机制传统上被分为细胞免疫和体液免疫。实际上在无脊椎动物中两者密切 相关，如体液因子可在血细胞中合成并释放出来，细胞反应又受体液因子的介导 和影响等。所以，其体液免疫是依靠血清中的一些非特异性的酶或因子来完成的， 如体液中的类补体因子、溶菌酶、凝集素、抗氧化酶系统、溶血素及0 【2 巨球蛋 白等，这一点不同于高等动物。 1 1 免疫细胞及其防御 无脊椎动物没有单独的免疫系统，只有非特异性的细胞吞噬和炎症反应能 力，为原始的准免疫性的防御功能。吞噬作用是生物体最原始的非特异性抵抗力， 原始的单细胞生物利用吞噬作用摄取养料，在比较高级的一些单细胞生物，吞噬 作用则同时演化为防御手段。原始多细胞生物就分化成了专司吞噬作用的吞噬细 胞。原生动物能消化食物，销毁入侵的微生物，而不损及自身的细胞成分，这表 明原生动物已能区分自身和非己。原生动物的吞噬功能在多细胞动物的一部分细 胞中得到了保存和发展，成为免疫活动的重要环节之一。 1 1 1 免疫细胞的分类 无脊椎动物中从低等到较高等的动物都有多种多样的具有免疫功能的细胞。 文昌鱼( b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i ) 体内细菌清除机制及免疫致敏作用的研究 在无体腔动物中有原始的吞噬作用的阿米巴细胞；在较高等的软体动物和节肢动 物中的血细胞；在环节动物棘皮动物中有体腔细胞：在被囊动物( 原索动物) 中 有白血细胞。 对于无脊椎动物免疫细胞的分类，目前仍无统一的标准。目前，分类比较明 确的主要是软体动物的血细胞以及棘皮动物的体腔细胞。对于软体动物血细胞的 研究，主要集中于双壳类。m o o r e 等( 1 9 7 7 ) 根据血细胞超微结构和对染色反应 的不同，将贻贝血细胞分成两大类：嗜碱性细胞( b a s o p h i l i ch e m o c y t e s ) ，无颗 粒；嗜酸性细胞( e o s i n o p h i l i cg r a n u l a rh e m o c y t e s ) ，有颗粒( g r a n u l i c y t e s ) 。他们 将嗜碱性细胞迸一步分为小淋巴细胞( s m a l ll y m p h o c y t e s ) 和大的吞噬性的巨噬 细胞。他们认为，巨噬细胞是主要参与清除外来异物的细胞类型。颗粒细胞也表 现出某些吞噬活性，而且由于在颗粒细胞和小淋巴细胞中发现有丝分裂，据此认 为这些细胞是嗜碱性细胞系的干细胞。b a y n e 等( 1 9 7 9 ) 将加州贻贝的血细胞分 成三种类型：小的嗜碱性细胞、大的嗜碱性细胞和大的颗粒嗜酸性细胞。h u f f m a n 等( 1 9 8 2 ) 根据染色反应的不同，将软皮蛤的血细胞分成两类：颗粒细胞，占 7 6 5 ：非颗粒细胞占2 3 5 。f o l e y 等( 1 9 7 2 ) 和c h e n g ( 1 9 7 4 ) ，将c r a s s o s t r e a v i r g i n i c a 和m e r c e n a r i a 的血细胞分为三类：透明细胞( h y a l i n o c y t e s ) 、纤维细胞 ( f i b r o c y t e s ) 和颗粒细胞( g r a n u l o c y t e s ) 。他们认为，这三类细胞参与不同的反 应。从对双壳类血细胞的分类可以看出，尽管在不同的种，用不同的标准，将血 细胞分成不同的类型，但其主要依据是血细胞中颗粒的有无及对染色的反应。在 腹足纲中，对血细胞的研究较少。李太武等( 1 9 9 5 ) 据染色结果，将皱纹盘鲍 ( h a l i o t i s d i s c u s h a n a i ) 血淋巴中的细胞分成三类：第一种细胞大，圆球状，核 较小，细胞质中颗粒多：第二种细胞较大，卵圆形，核较大，细胞质中颗粒少， 较透明；第三种细胞较小，圆形，核圆形，染色深，胞质少，较透明。其中，前 两种具有吞噬能力。 体腔细胞是棘皮动物参与免疫反应的效应细胞，是棘皮动物抵抗外来微生物 和受伤后防御的第一道防线。这些细胞能对刺激产生反应，合成和分泌多种特异 性因子，如凝集素、穿孔素( p e f f o r i n s ) 、多种溶酶体酶、血清蛋白以及抑制蛋白 ( p r o f i l i n s ) 等。在棘皮动物的体腔液、血液和水管血管系统中都有体腔细胞。 棘皮动物的体腔液内一般存在形态不同的6 种类型细胞：祖原细胞、吞噬变形细 2 文昌鱼( b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i ) 体内细菌清除机制及免疫致敏作用的研究 胞、有色和无色球形细胞、振颤细胞、血细胞和晶体细胞( r a t c l l f f ea n dr o w l e y ， 1 9 8 1 ) ，但并不是所有棘皮动物都存在这6 种细胞( m u l l e r a n dr i n k e v i c h ，1 9 9 6 ) 。 例如，e l i s e i k i n a 等( 2 0 0 2 ) 在研究仿刺海参和瓜参时发现，体腔细胞可以分成 祖原细胞、变形细胞、有空泡细胞、小( 或幼) 桑椹细胞、桑椹细胞( i 、i i 和 i 型) 、晶体细胞和震颤细胞；李霞等( 2 0 0 3 ) 在研究虾夷马粪海胆 ( s t r o n g y l o c e n t y o t u si n t e r n ei u s ) 时发现，体腔液内有两种细胞，即变形吞噬细胞 和色素细胞，变形吞噬细胞具有吞噬酵母的功能，色素细胞通过释放色素颗粒参 与体液免疫反应。 1 1 2 免疫细胞的功能 ( 1 ) 吞噬作用 免疫细胞具有多种免疫功能，最重要的免疫防御机能是吞噬作用。其吞噬过 程包括：异物的识别、粘连、聚集、摄入、清除等。对异物的识别可能是由该物 质的表面性质和血细胞膜上的受体共同决定的。粘连则可能是由血细胞分泌的一 种血细胞附着因子介导的。血细胞与异物粘连后相互聚集而形成细胞团，随即对 异物进行摄入和清除。s o d e r h a u 等( 1 9 8 6 ) 的研究表明，甲壳动物无颗粒细胞具 有较强的吞噬能力，它不受外来溶解物的影响，但在体外活化的酚氧化酶原系统 组分可以激活这种细胞的吞噬能力：小颗粒细胞富含线粒体使其在防御反应中具 有活跃的胞吐作用和识别异物的能力，是防御反应的关键细胞；大颗粒细胞无吞 噬能力，附着和扩散能力也较弱，经l p s 处理不发生胞吐作用，但用活化的酚 氧化酶原系统组分处理可以迅速发生胞吐作用，释放大量有活性的酚氧化酶。在 棘皮动物的体腔中，吞噬变形细胞在启动体内和体外创伤愈合反应过程中起着重 要作用，包括聚集、细胞残骸的吞噬作用和受伤部位新细胞层的形成。s i l v a 等 ( 2 0 0 3 ) 研究了南极海星体腔细胞的体外吞噬功能，发现体腔内的吞噬变形细胞 能够激活吞噬酵母细胞。大多数免疫反应都是由具有吞噬作用的变形细胞介导 的。在这些反应中，变形细胞在形态学上明显显示出两个不同的时期：一是形成 花瓣状态时期，此时具有活跃的吞噬活性；二是形成伪足阶段，该阶段似乎与凝 血作用有关。棘皮动物组织受伤后，花瓣形变形细胞迁移到受伤部位，变换形状， 伸出伪足，同其它体腔细胞一起完成凝血反应( s m i t h 等，2 0 0 1 ) 。 已证实所有无脊椎动物门的动物都具有变形细胞，这些细胞能够识别寄生物 文昌鱼( b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i ) 体内细菌清除机制及免疫致敏作用的研究 和其它外来物体，并且通过吞噬作用或形成包囊做出相应反应。上述两种反应是 无脊椎动物对抗异物入侵的基本细胞防御机制。 ( 2 ) 包囊作用 包囊作用是指当异物大于吞噬细胞时，许多吞噬细胞联合将异物包围起来， 形成类似于包囊的结构，从而将异物隔离的现象。通常入侵的细菌和病毒都会被 吞噬，但如果是寄生虫卵、寄生虫幼虫或寄生虫侵入体腔内，由于这些入侵物 太大，无法被单个细胞吞噬或消化，只有通过包囊作用来抑制入侵。目前，在甲 壳动物中已发现在促包囊作用中起重要作用的物质为存在于颗粒细胞中的一种 7 6 k d a 蛋白，该因子伴随酚氧化酶原系统的激活而激活( 孟凡伦等，1 9 9 9 ) 。最 新研究表明，海胆的内脏体腔细胞是清除海胆体内入侵微生物的主要细胞，并且 能够产生多种体液免疫因子( b o r g e s 等，2 0 0 5 ) 。有吞噬作用的变形细胞和球形 细胞参与了对寄生物的包囊形成和之后的消化过程。球形细胞能释放杀菌物质， 如脂肪酶、过氧化物酶和丝氨酸蛋白酶等，裂解被吞噬的物质( j o h a n s o n ，1 9 6 9 ) 。 ( 3 ) 分泌细胞因子 细胞因子是由被激活的血细胞释放的一种多肽，通常释放程度取决于动物体 被感染或炎症的程度以及诱导免疫效应细胞的增殖程度。在北方球海胆、虚班海 星和刺瓜参的多处组织和细胞中发现有抗菌活性物质，但含有抗菌活性物质最高 的是体腔细胞和体壁组织提取物( h a u g 等，2 0 0 2 ) 。棘皮动物具有能够产生溶血 素的变形细胞，这些细胞个体较大，形态多变，运动能力强。在这些细胞中，能 够检测到酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、脂酶的活性。另外，这些细胞中含有的酚氧 化酶具有吞噬细胞和细胞毒细胞的功能以及细胞聚集和包囊功能。x i n g 等( 2 0 0 0 ) 发现，玉足海参体腔液内有调理素样蛋白，该蛋白能够明显增强海参体腔吞噬细 胞的吞噬作用。虚班海星的体腔细胞吞噬革兰氏阳性细菌藤黄微球菌后，能够产 生活性氧( r o s ) 杀菌，体腔细胞同细菌或细菌细胞壁接触即可诱导产生活性氧 ( c o t e u r 等，2 0 0 2 ) 。在蜗牛的血细胞中也发现了过氧化物酶和各种活性氧产生。 这些物质也可能对被细胞包围的物体( 包括寄生物) 起杀伤作用。然而，这类过 氧化物酶类型的物质在节肢动物中并没有发现。在其他门类中的证据也不够充 分，所以尚难解释更多的通过细胞聚集杀伤的机制。所有研究结果表明，无脊椎 动物的防御机制可能类似于脊椎动物的防御机制，即通过细胞因子进行调控。 4 文昌鱼( b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i ) 体内细菌清除机制及免疫致敏作用的研究 1 2 体液中各种可溶性免疫因子的作用 无脊椎动物没有免疫球蛋白，但存在着许多类补体因子、溶菌酶以及凝集素 ( 1 e c t i n ) 和抗菌因子，并有一定程度的特异性。有一些不是免疫细胞产生的， 而是其他细胞产生的。有一些抗菌的因子可以在低浓度下持续存在，当受到各种 刺激之后会增加抗菌物质的浓度。除了广泛存在的溶菌酶之外，其他分子似乎没 有明显的进化特征。 1 2 1 无脊椎动物补体系统研究 补体( c o m p l e m e m ) 是免疫学研究中最古老的领域之一。到了高等哺乳动 物，补体系统已进化成为一个由补体成分、血浆补体调节蛋白、膜补体调节蛋白 及补体受体等3 0 多种糖蛋白组成的，有着精密调控机制的复杂的蛋白质反应系 统。多种病原微生物及抗原抗体复合物等可通过经典途径、替代途径或称旁路途 径和凝集素激活途径等3 条既独立又交叉的途径激活补体，产生的活性物质引 起调理吞噬、杀伤细胞、介导炎症、调节免疫应答和溶解清除免疫复合物等一系 列重要的生物学效应( 于善谦等，1 9 9 8 ) 。 最早发现的是由抗原抗体复合物激活的，从c l q c l r 2 c l s 2 开始的经典途 径，它的激活需要c a 2 + 、m 9 2 + 参与；可被角叉藻聚糖、l 一赖氨酸抑制，它的作 用具有特异性。后来发现了不依赖抗体的从c 3 开始的替代途径，它的激活只需 要m 9 2 十参与，可被酵母聚糖、脂多糖、菊粉、甲胺、肼及硫氰酸钾特异性抑制， 反应过程中还需要p 、b 和d 因子。直到1 9 9 5 年，又鉴定明确了通过甘露糖 结合蛋白( m a n n o s eb i n d i n gp r o t e i n ，m b p ) 糖基识别的凝集素激活途径，它的激 活只需要c a 2 + 。替代和凝集素两种激活途径作用效应无特异性。上述三条途径还 共享一条终末途径，由对c 5 补体成分活化开始，并进而完成c 6 c 9 成分的活 化连锁反应( 王长发等，2 0 0 4 ) 。 免疫系统中出现补体成分是免疫系统免疫力进化上次质的飞跃。近年来， 从海胆( a 1 s h a r i f 等，1 9 9 7 ) 、海鞘( n o n a k a 等，1 9 9 9 ) 、七鳃鳗( n o n a k a 和 t a k a h a s h i ，1 9 9 2 ；n o n a k a 等，1 9 9 4 ) 和文昌鱼( s u z u k i 等，2 0 0 2 ) 中克隆到c 3 和b 因子样的基因，从尾索动物体内分离出c 3 、m b p 和m a s p s 分子，进一步 证明补体作为一种相对独立的天然免疫防御机制，早在无脊椎动物体内就己存 在。并且提示最早进化出现的补体是替代途径和凝集素途径。但是，二者之中谁 文昌鱼( b r a c h i o s t o m ab e l c h e r i ) 体内细菌清除机制及免疫致敏作用的研究 是最早出现者? 新近，发现海葵中存在c 3 和b f , 这表明替代途径是最早形成的 补体系统( n o n a k aa n dk i m u r a ，2 0 0 6 ) 。从被囊动物海鞘体内获得的部分c 型凝 集素一级结构推知，它们也是补体系统的激活和效应因子。无脊椎动物补体系统 仅有少数几个成分，包括c 3 、d 因子、b 因子、m a s p 和m b p ，没有终末补体 成分和c 1 分子，这说明其有限的功能仅能涉及补体的调理作用和吞噬作用。在 以后的进化过程中，经基因复制、外显子移位，加上或缺失一些其他蛋白的结构 模块，形成新的补体成分，并且产生补体分子结构和功能方面的多样性和复杂性。 凝集素途径对补体的经典途径和替代途径活化都有交叉促进作用。 ( 1 ) 补体因子c 3 c 3 是补体系统的中心成分，补体激活三条途径中都需要c 3 的参与。在动物 的基因组中出现c 3 基因是证明出现补体系统的主要标志。构成无脊椎动物c 3 和脊椎动物c 3 核苷酸和氨基酸序列分析比较显示：二者都具有激活蛋白水解酶 的能力，都有硫酯键和b 一0 l 作用位点( p 0 【p r o c e s s i n gs i t e ) 。c 3 a 结构区在海鞘和 海胆体内是变化的，从七鳃鳗开始一直到高等脊椎动物体内都是保守的，该结果 表明：c 3 a 片段中过敏毒素( a n a p h y l a t o x i n ) 活性可能在脊椎动物体内才出现。 从获得的c 3 基因全序列进化分析可知：海鞘、文昌鱼和海胆体内的c 3 基 因是由共同祖先c 3 c 4 c 5 基因直接进化而来( s o t t r u p j e n s e n 等，1 9 8 5 ) ，然而 在七鳃鳗体内的c 3 基因形成了类似于高等脊椎动物体内的c 3 基因簇( n o n a k a 和t a k a h a s h i ，1 9 9 2 ) 。c 3 和c 4 、c 5 在结构上是同源的，都是由系统发生上共 同祖先血清蛋白水解酶抑制因子0 【2 巨球蛋白( 啦一m a c r o g l u b i n ) 进化而来 ( s o t t r u p j e n s e n 等，1 9 8 5 ) ，它们都包含一个能和靶分子共价结合或作用的硫酯键 位点。从原口动物( 两侧对称的多细胞非后口动物) 体内就发现存在以巨球蛋 白( 1 w a k i 等，1 9 9 6 ) 。o r 2 巨球蛋白基因在线虫( c e l e g a n s ) 基因组中以单拷贝形 式存在，而在果蝇( d r o s o p h i l ag e n o m e ) 基因组却以多拷贝形式存在( a d a m s 等， 2 0 0 0 ) 。在线虫和果蝇基因组内却无c 3 c 4 c 5 基因存在，在海胆、海鞘、文昌鱼、 七鳃鳗体内发现存在单个的类似的c 3 c 4 c 5 基因，明显和砣巨球蛋白基因部 分序列相似。z h a n gs c 等( 2 0 0 3 ) 运用绵羊抗人c 3 抗血清通过免疫比浊法首次 测定了文昌鱼体液中的c 3 浓度，同时还提出人的c 3 和文昌鱼体液c 3 具有部分 抗原相似性。y o n gz h u 等( 2 0 0 5 ) 采用细菌吸附蛋白方法发现在马蹄蟹的血浆 6 文吕鱼( b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i ) 体内细菌清除机制及免疫致敏作用的研究 中存在c 3 基因，与文昌鱼中c 3 存在3 5 的同源性，进一步验证了补体系统的 古老起源。 ( 2 ) 补体因子b 哺乳动物补体系统的b 因子是构成补体替代途径的必需成分，它与c 3 在结 构和组成上有同源性。b 因子是表面束缚分子，能保护c 3 b ，也称c 3 保护活化 因子；在m 9 2 + 存在时能与c 3 b 或者c 3 ( h 2 0 ) 成分结合为c 3 b b ( 在固相上) 或者c 3 ( h 2 0 ) b ( 在液相中) ，同时b 因子还是酶原，位于分子的c 端肽段具 有酶活性。在无颌类脊椎动物和无脊椎动物体内分离出b 因子的e d n a 显示出 相关蛋白的结构区的变异性。例如，七鳃鳗体内b 因子和有颌类脊椎动物的b 因子及c 2 具有同样的结构区域( n o n a k a 等，1 9 9 4 ) ，而海胆体内的b 因子( s m i t h 等，1 9 9 8 ) 有两个额外的短序列重复结构( s h o r tc o n s e n s u sr e p e a t s ，s c r ) ，海鞘 体内的b 因子( j i 等，2 0 0 0 ) 也有两个额外短序列重复结构区域，同时还具有3 个低密度脂蛋白受体区域，而且其b 因子的丝氨酸蛋白酶区是a g y 一类型 ( y o s h i z a k i 等，2 0 0 5 ) 。在人的补体系统中，低密度脂蛋白区域只出现在补体末 端成分和因子i 之中。而文昌鱼体内的b 因子在c c p l 和c c p 2 结构域间有一个 e g f 结构域，这个结构域在其它的物种中均不存在( h e 等，2 0 0 8 ) 。 上述结果表明：在补体系统进化的早期发生广泛的外显子基因漂移。海鞘和 海胆体内的b 因子存在额外重复区域，它具有什么功能还不清楚。在这些生物 体内的b 因子和c 3 一样，是高等脊椎动物b 因子和c 2 的共同祖先的直接进化 产物。在海葵、海胆和海鞘和文昌鱼体内出现b 因子提供了强有力的证据证明 在这些动物体内存在补体的替代激活途径，因为b 因子能通过反馈环有效地和 c 3 结合。“等4 2 0 0 8 ) 通过补体替代途径特异的激活剂和抑制剂方法证实文昌 鱼体液中确实存在补体替代激活的途径。 4 3 ) m a