（动物学专业论文）几种野生鼠45s基因的克隆和序列分析.pdf

了4 5 s 反转座予与增强予之间在结构和功能上的联系。这些事实表明，4 。5 s 反转座子具有重要的生物学功能。但是，至今对它的研究还仅限于少数物种， 鼠类中哭有大鬣、小鼠、仓鼠，对其他鬣种4 5 s 啪及其基因的研究未见 报道。 本课题研究中是通过肼p c r ，将大仓鼠( c ，记e m 觑s 州幻抖d ew i n t o n ) 、 黑线姬鼠翻4 譬m 砌s ) 、黑线仓鼠( c 6 n 旭6 哪妇) 等野生鼠类4 5 sr n a 反 转录扩增为c d n a ，并进行克隆和测序。然詹，利用d 帕峪i s 软传进行多个 物种4 5 s 序列的分橱比较。研究发现，这几种野生鼠4 5 s 反转座子序列， 在结梅上豹突出特点是具有较高的g c 含量，约占6 0 。分予内包含两个重 复序列，一个楚g c c g g _ t a g ，位于第l 8 位和第2 0 2 7 位；另一个 是g - a g g c a g - a g g ，位予第4 0 4 9 位和4 6 5 5 位。比较发现，4 5 s 反转座予的保守性极强，在8 8 b 口的4 5 s 反转座予中，仅有极少数的核营酸 替换，且替换碱基对其二级结构没有显著影响。这种结构上的保守性说明了 其功能的重要性，所以在长期进化过稷中得以保窘。 另外，4 5 s 反转座子序列在鼠类串比较多见，雨在其它动物中罕有发现， 这或许正是鬣类特异性的一个表现。4 5 s 反转座子在鬣类中是否酱遍存在? 它的存在，对于鼠类有什么意义? 4 5 s 反转座子究竟执行何种生物学功能? 它在纂因组中的活动对于鼠类基因组进化有什么作用? 这些问题，只有在对 鼠类4 5 s 反转座子的结构与功能进行进一步研究后，才能得到答案。 关键饲：反转座子4 5 s 甜渔基因r t p 僳克隆 2 稻髓dt 酝 4 5 sd 夺b 蠢赫客搿灌堵s e q h e 珏c e 纛i 醣l y 酶搬o l 。g 。h s 弼氆壤e 罾瞄尊 s e q u 撼c e s o f 7 s r n b 1a 砖烈n i t m a yb eo n e0 f t l l e m 锄b e r so f b l 啪虹弘 s e 凇h e s 斌t o d 矗y 热o w 氇a t 俄m p o s o n sl 珏瞎器王，越h ，p e 商蕊m a 拄y 确p o 矗翘l ：e i l n c t i o n s ，f b r 甑a m p l e ，r e g u l a t i n gg 蹦ee x p r e s s i o n0 rp a r t i d p a t i l l gi ng e n o m i c 群0 1 1 l 颤o n 趣1 1 o 氇猷批p o 豳酶g w 氆e f e 螽强a b 鞠d 铋ls m 鑫珏瓣啦c 舔站d4 5 s l t n a w h i c hh 鹪ag 麟es e q u 蹦谢h o m o lo _ g o u s 训斑| h a t 硝7 s 甜妣、o f 蹦b 猡o | 黯。 s o 越ee x p 舔辩e 箍鼍s 赡o _ ww 氧镰t 精龟5 sr n a 瓠如s c 毪渤阻鲢矗l 主。矗a 硅疰s e c 辩 豫 s e c t e d 强e 懈e a 池m a d e _ b yp m f e s s o rx ul a - x i a i i g ( 2 ( k 脚幽懈t l i er e l a t i o n 馘w e e 娃磕e4 5 s 嗽确p o s 。n 鞘de 睦基矗e 嚣扭s 粕酿鼬a 瓣量珏嚣西汨s + 强姆ef 聚掩 t e l lu st h e4 5 sr e t p o s o nd o e sc a r r yo u ts o m ei m p o r t 趣n tb i 0 1 0 9 i c a lf l l n c t i o n s 。 彗啦l 酶f 懿e a 棘啪呔弹韬l 醚巍y i s 蛾l | l i 氆_ 醛遮a 懈警酾i 嚣s 诚毫s f 鸦 m o u s ea l l dc h i n e s eh a m s t e f t h e4 5 s 黼t r o p o s o no fo t k rs p e d e sh a v e 舳tb e e 撞 r e 醚a 黼h e 鑫弦l 。 歉绷s p 婶氇e 蝴o f 4 5 s 鼢弧w a s 黼p 差i 最蹦姆r c v e 辐e t r 粕s 蒯p t i o n 卿粥凇拣斑戳c 耄殛鼬p e 釉w 壕把滋麟ae x 翘黯d 纛雌酬搬幽g t 砌抖d ew i n t 蝴，彳嘴懈胁船蚴dc 钿m 扫蹦s 括i i v e r 虹s 驯e s 勰t l i et e 】：n 孽目睡鐾v 薹享蘸 x 几种野生鼠4 5 s 对蚣基因的 克隆与序列分析 一、引言 4 5 s 鼢叭是存在于啮齿类细胞质中的一类含量丰富的小心慵分子，由 妣聚合酶转录露来。墨前，对大鼠、小鼠细胞中的4 5 s 础a 有舨了解， 对于野生鼠细胞中的该类分予及其基因刹缺乏了鳃。墨翦知道，4 5 s 融叮a 序 列与啮齿类b l 家族、舢u 等潮家族等反转窿予具有较高的褥源性，也是一种 重要的反转座予。 1 1 反转座子研究概况 2 0 世纪5 0 年代初，b a r b a 强m c c l i n t o c k 首次发现了转座因子，邸玉米的 a c - d s 转座予。这项发现说明，生物基因组中的基因，不是固定不变地排列 在染色体上的，而是可以移动的，这就突破了经典的“基因”概念。以看， 反转录现象的发现，不但修改了分子遗传学中的“中心法则”，而且说明慕 因还可以水平转移( h 0 i i z 衄t a lg e n en 锄s f e r ) ，即从一个物种，转移到另一个 物种。转靡因子的这一特性，揭示了其在生物个体发育和进化上可能扮演饕 重要的角色，也预示羞其在分子生物学和分子遗传学的研究及应用方恧，一 定会扮演重要的焦磊。 转座因子是原核生物与宾核生物基因组中，广泛存在的可移动位置的遗 传园子，包括两种类型。一种类霆l 涉及d n a 的宣接转座，即供体( 转座予) 为d 】暇，受体( 宿主) 也是d n a ，如原核生物中的插入顺序( i 璐喇i o n s e q u e n c c ，i s ) 、果蝇的p 因子和玉米的a c d s 等。另一种类型以鼢叮a 为中介 进行转座，又称反转座困予( t c 拄o e l e m e m s ) ，包括反转录转座子 ( f c t r o t 瑚s s o n ) 租反转录癃毒( r c t 州i m s ) 。 转座因子的第一类，即d n a 转座因子，在真核生物中不多见。第二类， 即r n a 转座子和反转瘫因子，却是真核生物所特有的。 为r n a 聚台酶i i i 内部启动子的主要成分，末端三个碱基通常是c c a 。阂此， 该区段可能是来源于成熟的t r n a 。t r n a 无关区有认为源彝浆穆r n a 基因， 也有认为直接来源予相关的l 膝匿。属于这一家族裁员的，如存在于人及哺 乳动物的m i r ( m a m m a l i 8 i i 州d ei n t e r s p e f s e df e p e a t ) 。t r n a 起源的s i n e 不 只分布于哺乳类，也广泛分布于鸟类、爬行类、鱼类以及软体动物等不同类 群中。 创u 重复序列家族是灵长类基因组s 玳e 家族中特有的含量丰富的一员， 在单倍体基因缎中约有5 0 万份拷贝，相当于每4 6 k b 中就有一个拷贝。由 予脚毽重复序列中含有限制性核酸杰切酶甜毽i 的识别序列a g c t ，所阻称 为a j l l 家族。典型的人基因组越u 序剜长2 8 2 b p ，由两个丽源但有差剐的皱 基构成。亚基来源于有缺失突变和点突变的7 s l 础叮a 基因。两个甄基间由 腺嘌呤核苷酸密集的序列连接。右边的亚基中有无关的3 l b p 插入片段，称 为i h 。烈u 序列两端各有一个正向重复序列，末端有一个p o l y ( a ) 尾。 与铷u 序列亚基有很高囿源性的7 s lr n a 是7 s 黜姨的一部分，是将 蛋白质运送到内质网以便分泌至i 胞外的信号识别颗粒( s i 黔a l - f 。c o g n 溢o n p a m c l e ，s r p ) 的维成都分。7 s lr n a 与脚u 序列豹左边亚基相对应，并且 中间含一个插入序列。因此7 s l 砒呵a 的5 末端的9 0 个碱纂与舢u 的左侧 同源，7 s l r n a 中间的1 6 0 个碱基与a l u 没有同源性，7 s l r n a 3 末端的 4 0 个碱基与砧u 的右侧同源。编码7 s lr n a 的基因被r n a 聚合酶i i i 活跃 地转录。有可能非活性的烈u 序列产生予这些基因( 或其相关的基因) 。 _ 图l 一1a l n 序列的结构及与7 s l r n a 的关系旧 甜u 家族中各成员之闻是相关豹倦不完全一样，a l u 家族每个成员与原 型序猁的平均一致性离达8 7 。 鼠的a l u 相关序列家族称为b 1 簇，在小鼠基因组中约有5 万份拷贝。 b 1 重复序列的长度为1 3 0 b p ，与a l l l 盼一个亚纂眈同源性达到7 0 8 0 。 中国仓鼠的处驻糕关序列被称为a l 等圈家族( 驻e q l | i v a l e 难f a m i l y ) i “。 砧1 l 序列含有一个 翡p 的区域，它与位于乳多空病毒( p a p o v a v i n l s ) 鲡s v 4 0 和乙型肝炎病毒复带0 起始点的一段序列几乎完全一致。这说明舢u 序列可 能与真核生物基因组的复锖4 起始有某种关联，但舢u 序列的拷贝数比复制起 始点的预期数多出几十倍。此外还发现，至少a l u 家族中的一些成员可以被 转录成独立的r n a 。例如，中屋仓鼠的a l u 等同家族的一些成员，当位于 其他转录单位附近对，熊在体内被转蒙成单独的r n a 分子。 假基因也是一种 自主的反转录转座元件。因为它来源子戳呵a 聚合酶i 的 转录产物，其基因组中的痔列必然是无转录活性的。宦们缺少位于转录起始 点上游的启动子序列i 酎。因为它们通常具有成熟转录物的特性，所以称为加 工过的假基因( p m o c s s e d p s c u d o g c n e s ) 。假基因的起始点相当于鼢t a 的5 末 端，只有在d n a 来源于鼢4 a 的情况下，这种蜷况才能发生。几个假基因包 含壤确棚连的外显子序列，我们知道没鸯什么机制可以识别位于d n a 中的 内含予，这季申特性表明可能存在一个r n a 中阔体的除段。假基因末端有很 短的一段a t 碱綦对，这有可能来源于甜a 的p o l y ( a ) 末端结构。在假 基因的两侧各含一小段正向藿复序列l ；9 j 这有可能产生于和转座类似的过程。 剪接过的假基因在染色体上的位置与其原先所在位置无关。这些结构特征都 支持假基因的反转录转座起源假说。m a t h i a s 等认为有自主返座能力的长散 布重复序列u 产生的蛋自质能够作用予烈u 转座予及细胞的m r n a f 如返座 假基因1 并 跫进其返座【1 0 】。 z h 鞠g 等鉴定了入类基因组上兵有较高可信度的7 8 1 9 个已加工假基因， 加上复制假基因和不完整的假基因片段，人类基因组上的假基因数目约为2 0 0 0 0 个或更多i n 】。据估算，人类染色体上的假基因数目和染色体长度成正比。 目前认为假基因在染色体上的这种分布特征是逆转录转座随机发生的结果。 人类染色体上已加工假基因的分布随g c 含量聪变化。已加工假基因在g c 含量4 1 4 6 的染色体区域密度最高。这与砧u 的分柱特征类似，然露与功 能基因和l l 重复序列的分布特征正好相反。与人类基因组及其假蒸西相比 较，小鼠基因缀比人类小一些，假基阂数量像较少，这可能是由于它们的逆 6 转录转座活性不同产生的结果。g r a 馘等指出，与人类相比，小鼠基因组有 更离的核萤骏转变和缺失率，这使得系统地识别其中的假基因序列更为困 难。与入类相似之处是，夺鼠染色体上的假蒸因数目和染色体长度星正相关， 小鼠基因组中的假基因和其中i 心难l 元件具有相同的逆转录转座历史。 这里把上面提到的各类反转录转座子图示如下： 图1 2 反转录转庄子的结构0 1 ( 箭头表示正向重复序列) 1 1 3 反转录转靡予的生物学意义 1 1 3 。1 反转录转座子参与基阂调控 由于爱转录转座子上具有增强子( e i l l l 姐c e i ) 或沉默予( s i l c n o e r ) ，它的转 座对生物发育过程中的基因表达有很大的影响，这种影响与整合部位有关。如 果插入到基因的37 和5 非翻译区或内含子时，可能会影响到基因的转录、 转录后的加工及翻译；如果插入在基因上游的调控区，其启动子和增强子可能 使邻近沉默的基因得以表达；当其插入到基因的编码序列或启动予序列中时 可能会造成基因失活、基因活化及基因鬟捧等现象。铡如，越u 元件作为增 强予可与褫黄醛受体、锌指转录因子s p l 和雌激素受体n 结合：在、t 1 基因 中忿u 元件又越沉默子作用。 朋u 元件还参与了转录后加工过稷，尤其是选择性剪切。在朋u 序列中5 ， 端剪切位点的形成使得内元序列外显化，同时5 端剪切位点与u 1s n r n a 之 间碱基配对的延伸决定了内元序列剪切保留的比例。3 端剪切点的选择决 定了内元性的a l u 序列是否能保蟹下来外显化，也就决定了u 元件是否能存 在于成熟的m r n a 中。a l u 参与的选择性剪切是蛋白屡多态魅形成的机制之 1 1 3 1 2 反转录转座子弓l 起基因重组 包括以下几秘机制；第一，染色体上有某一反转录转座子的，己份拷炎， 于是在同一染色体或不同染色体上有着相同反转录转座予序列的部位之间 发生同源薰组。傍j 如，大约3 5 0 0 万年前，一对l i n e j 序列之间的重组，引起 了b 珠蛋白基因的扩增，结果产生了这个基因家族里的gy 和ay 基因。第 二，反转录转座予的转靡作用可以引起非编码序列d n a 的重排。当基因组的 一段怕序列在r n a 聚合酶作用下产生其r n & 哮贝，然后在反转录酶的作 用下，会成d n a 拷贝，插入到基嚣组其他部位。第三，l 1 作为哺乳动物基因 维中重要豹反转渌转座予，当l 1 本身的转录终止信号较弱而3 侧序率有很 强的转录终止信号时旒会发生“通读”( r e a d t b m u 曲) ，而将l 1 和3 侧序一 起转录，这叫做3 端转导作用1 1 2 】( 37 t r a n s d u c t i o n ) 其结果是包含l 1 和3 侧序的嵌合片段一起插入染色体新的位置，造成宿主基因组中原先不连锁的 两个d n a 片段排列在一起。 1 1 3 3 反转录转座予促进生物进化 生物进化本质上就是基因组豹进亿，一方面是非编确序列的进化，勇一 方面是编码序列的进化，就是新基因的获得。新基因的获得主要有两条途径， 一条途径楚基困缀中现有基因的全部或一部分实现倍增( d u 口l i c a t i o n ) ，另一 条途径则是从其他物种那里获得。 分散在真核生物基因组中的大量反转录转庭子构成了基因缌的不稳定 因素，可引起基因组序列的删除、扩增、倒位、移位、断裂、同源序列璧组等 现象。从遮期效应看，及转录转座子插入编码岿到往经会弓l 起鏊因失活，对 予生物的生存是有害的，所以反转录转座予通常是被甲基化的，使其所含的 转窿酶基因的转录受棉商不发生转座行为。可怒，从进化的角度看，反转录 转座子通过上述两条途径，对于基因组的进化则有潜在的有利效应。 a n l h r o p o i d ( 包括长臂猿、罗猴和蛛猴) 的珠蛋白基因有两个拷贝。序歹4 分 析揭示出，这两个基因位点两侧鑫 x 在a m t l l r o p o i d 进化的早期，发生在l l a 和l 1 b 之间的不等交换导致了基因的重 复，同时也产生了l 1 曲杂合体。 1 1 。3 4 反转录转座子弓| 发遗传往疾病 反转录转座孑在发挥积极的遗传学效应的同时，也难以避免地产生不良 作用一导致遗传性疾病的发生。 研究表明，a 1 u 序列插入可日l 起1 6 种基因突变瘸，占人类遗传病的 o 。l 1 1 3 j 。c l a v e r i 廿m a n i n 等首次报道在c l ( = n s 基因编码区的6 5 0 位密码子， 一段年轻的蹦贬家族的越u 序列重新摇人会导致d c n t s 疾病x 染色体连 锁的肾小管功能紊乱。已经发现3 3 例菌株遗传病和1 6 例恶性瘸由越u 重复 序列之间的不等同源重组引起的，这种方式大概占了人类遗传病的o 3 ，所 以比起越u 插入来说，u 重组引起的疾病更多。 1 1 4 反转录转座予的应用 反转录转座子的存在是形成生物遗传多样性的重要阂素【1 4 1 ，它在生物学 中最突出的应用在于作为分子标记用于生物多样性及遗传连镂分析。这楚因 为反转录转座子作为高度弊源种群以多拷贝韵形式广泛分布在染色体上，并 且在物种阆或物种肉表现出插入位点的多态性；而且活跃的反转录转庶予可 ；工农基因组中制造新的插入位点，用来在谱系中建立系统发生关系。但是转座 子标签在动物中用得较少，主要应用于禾本科植物中。 序列特异性扩增多态( s e q u e n c e s p e c i f i ca m 球i 矗c a t i o np o l y m o r 盐i s m ， s s a p ) 是一种以反转录转座子为纂础的多态性标记技术，它与a f 标记技术 类似。如果单令反转录转座子在基因缨豹某个位点插入，凝胶电泳对就表现为 条带，因为s s a p 标记中所用的一条弓l 物是徽据反转录转座予的碱基序列设计 的，所以在估计动物系统发生关系时，s & 谨比传统的a f l p 标记更为有利。 反转录转座予与微卫鬃标记一同进行分析，可以得到反转录转座一微卫 星扩增多态性( r e t m t r a n s p o s o n m i c m s a t e l 】i t ea m p l i f i e dp o l v m o r p h i s 甄 r e m a p ) ，此法可用于不同品种或对固一属中不同物种之闻擒建指纹图。 另钋，越u 序列仅在人类鏊爨组中存在，因丽基于a l u 序列的技术，例如 筋 x 核质运输、降解，核糖体的结构功能，蛋自质的翻译、转位等有关。 1 。2 。34 。5 sr 基阂与反转麇子 4 。5 sr n a 基因与7 sr n a 、b 1 、b 2 和越n 基因序列具有同源 生。4 5 s 鼬适a 与7 sr n a 的5 端有6 0 的同源性l 现；7 s lr n a 的5 末端的9 0 个碱基 与砧u 的左侧同源，7 s lr n a3 末端的4 0 个碱基与趟u 的右侧同源；b 1 与u 的第二个亚基的同源性达到7 0 8 0 。 7 s l 孙渔是7 s 鼢姨的一部分，是将蛋白质运送到内质网以便分泌到胞 ”的信号识别颗粒( s i 嚣a l - f e g l l i 曲np a f t i d o ，s r p ) 的组成都分；b l 、b 2 家族是存在于啮嚣类中的类越l | 反转座予，以擎体的形式存在；越u 家族是 灵长类基因组中最重要的反转瘫子，在人类基瞬维中以二聚体( 或四聚体) 存在，在其他灵长类中以单体( 或二聚体) 存在。 4 5 sr n a 与哺乳动物基因组中的反转座予的这种同源性，说明它本身 也是一类重要的反转座子，预期它会具有同其他反转座子类似的特性和功 能。 1 3 研究目标 分散在真核生物基因组中的大量反转录转座予构成了纂因组的不稳定 因素，可引起基因组序列的删除、扩增、倒位、移位、断裂、同源重组等现象， 从而在基因表达调控和生物进化中发挥着重要的作用。对于反转座子的深入 研究，有助于揭示真核生物基因表达调控和生物进化的真正机制，有蓑重要 的现实意义。 4 。5 sr n a 是鬣类细胞中一类羹要的核小甜q a ( s n r n a ) 分子，其序列 与毓类基因组中b l 家族高度同源，而后者同时又是一种重要的反转廉子。 因而，研究4 5 sr n a 基因在野生鼠类细胞中的存在情况，揭示其结构特性 和生物功能，也就有着极其重要的意义。 本实验拟用大仓鼠、黑线仓鼠、黑线姬鼠等野生鼠肝脏作为实验材料， 从中提取组织总r n a ，并用合成的一对弓l 物，采取r t p c r 的方法，从慧 r n a 扩蠼褥到4 5 s r n a 的d n a 序列。然后以质粒p u c l 9 作为载体，对所 得d n a 序列进行克隧，之后双酶切鉴定，测序。得到序列盾，再用相关软 2 2 5 载体与基因片段连接 取酶切p u c 质粒1 耻l ( 会2 韭g d n a ) ，加磷骏他4 5 s r n 缸基因片段 l p l ( 含棚i n a 0 1 p 窑) ，1 驻1 1 0 连接酶缓冲液，l p l k 连接酶( 鲥，p 1 ) ， 加灭菌双蒸水至总体积为1 0 pl 。1 6 水浴过夜( 6 - 1 6 小时) 。 2 2 6 盛受态细胞制备与转化 ( 1 ) 用氯化钙法制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞d h 5o ，每5 0 p1 细 胞悬液分装成小份，刀o 冻存。 ( 2 ) 在无蓥状态下，取5 p l 连接液加入5 0 韭l 感受态细胞d 壬5 娃中进 行转化，涂到含有l | l 咖l 氨苄青霉索的i b 平板主，3 7 培养1 6 2 0 小 时。 2 2 7 重组质粒的摄取与熏绾子筛选 用无菌牙签随机挑取单克隆培养，碱法小量提取质粒，用胎d ri 胴锄d 双酶切鉴定。5 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。 2 2 。84 5 sr 黻基毁测序 将已鉴定的单克隆培养物编号，送往上海豢康生物技术有限公磊】进行测 序。 兰、结果与分析 3 1 鼠肝细胞总r 黻的提取与鉴定 月断头法将禁食一天的大会鼠、黑线仓鬣和黑线姬鬣处死，立韶从体内 取出肝脏，采用前瑟提到豹异硫氰酸胍法提取出总r n a 。用1 琼月旨糖交性 胶电泳检测结果如图3 1 ： 1 6 图3 一l 鼠肝总r n a 电泳 l 和2 为黑线仓鼠。3 为太仓鼠，4 和5 为黑绕姬鼠 图中l 、2 为黑线仓鼠两个不同个体的总r n a ，3 为大仓鼠总r n a ，4 、5 为黑线姬鼠两个个体的总r n a 。可以看出，3 的总r n a 完整性较好，2 8 s 条带 的亮度和宽度与1 8 s 条带相比，约为2 ：l 。5 的2 8 s 条带亮度帮宽度都不够， 说明r n a 有所降解。 用紫外分光光度记检溺纯度，2 6 0 2 8 0 的值l 为1 9 1 ；2 为1 8 7 ；3 为1 9 8 ；4 为1 9 5 ；5 为1 8 3 。全部符合要求。 3 。24 。5 sr n a 的r _ r p c r 产物的鉴定 65哇32l鞋 图3 24 5 sr n a 豹r t p e r 产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳 臻： d n a h i n d h l 分子量标准l 、2 ：大仓鼠4 5 sd n a3 、4 ：黑绫仓鬣4 5 sd n a 5 、6 ；黑线姬鼠4 ，5 sd n a 在m m l 反转录酶的作用下，有4 5 sr n a 分子的3 端引物和模扳 存在，先反转录形成4 5 sc d n a ，再r c r 锝到大量的4 。5 sd n a 。r t p c r 产物用5 聚蔼烯酰胺凝胶电泳( 揩矗e ) 检测，缩果知图3 2 所示。由于 引物序捌不包括4 5 sr n a 分子3 末端的o l i g o ( u ) ，所以4 5 sd n a 大小 为8 8 b p ，闺上条带位置大体符合。 3 3 r t p c r 产物的回收、末端补平和磷酸化 与在琼月鹭糖凝胶上不尉，r t p c r 产物在5 聚丙烯酰胺凝胶上的回收， 采用的是压碎浸滤法，回收效率较高。 p c r 产物的分子两端遢常含有一个游离的a ，而载体口u c l 9 用s m ai 酶切时，形成的是平末端。为了使二者的末端匹配，可用e n o w 酶。并加 入a r p 、d m 隙等，将回收的p c r 产物的末端补平。 e n o w 酶通常在补平底物末端的同时，又将底物末端的57 磷酸除去， 这又会影响下一步魄连接反应。于是，还器将补平产物的末端磷酸化，就是在 t 4 多聚核萤酸激酶豹作用下，雎p 的一个磷酸基戮转移至1 4 5 sd n a 的5 + 末端。 3 44 5 sd n a 基因的克隧 s m ai 酶切质粒p u c l 9 ，得到平末端载体，4 5 sd n a 经补平后，二者 可进行平末端连接。 4 5 sd n a 插入载体的方向是随机的，傻这不会影响綦因的竟隆与测序。 用重组质粒转化感受态d 1 5a ，培养后质粒大量扩增，将震粒提取缝化 压，l 琼脂糖检测，维果如图3 3 所示： 虢】23 图3 3 萱组顼粒p 毗1 9 45 sd n a 的l 黼i 脂糖电泳 m ：xd n h i n d 1 分子景标准 1 8 g a t c c t c t a ga g t c g a c c t ge a g g e a t g c aa g c t t g g c g t a t a g c t g t 丁tc c t 甜g t g a a 艚t t a t c cg c t c a c a a t t t a c g a g c c g ga a g c a t a a a gt g t 从a g c c tg g g g t g c c t a t a a c t c a c 雕t a a t t g c g t tg e g c l c a c t gc c c g c t t k e a g t c g g g a a ac e t g t e g t g ec a g c ，r g c a t ta a t g a a t c g gc c a a c g c g 3 5 l g g g a g a g g c gg t t t g c g t a t t g g g c g c t c tt c c g c t t c c tc g c t c a c t g a 4 0 l c t c g c t g c g ct c g g t c g t t cg g c t g c g g c ga g c g g t a t c ag c t c a c t e a a 4 5 l a g g c g g t a a ta c g g t t a 羊c ea c a g a a t c a gg o g a t a a c g ca g g a a a g a a c 图3 5 大仓鼠4 5 sd n a 序列 注；划线部分为4 5 sd n a 序列 l c t c g g t a c c et g t g t a g c c ca g g 研g g c c tc g a a c t c g a t c c l c c t g c 照 e t c t g c c t c ct t c a g c a a a tc c t a c c g g c gt g c g c c a c c ac t a c c g g c g g 1 0 1 g g a t c c t c t ag a g t c g a c c tg c a g g c a t g c 从g c t t g g c gt a a t c a t g g t 1 5 1 c a t a g c t g t tt c c t g t g t g aa a t t g t t a t cc g c t c a c a a tt c c a e a c a a e 2 0 l a 聪c g a ( ；c e gg a a g c a t a a ag t g t a a a g c et g g g g t g e c ta a t g a g t g a g 始 一 w 烈 翳 嘲 栅 m撇吼黼觚吼姗船姒 4 0 l c g c t c g g l c gt t c g g c t g e gg a g c g g t at e a g c t c a 鼹c a a a g g c g g t 4 6 l a a t a c g g t t at c c a c a g a a tc a g g g g a t a ac g c a g g a a a ga a c a t g t g a g 图3 7 黑线姬鼠4 5 sd n a 序列 注：划线部分为4 5 sd k a 序列 透过序列分析软件d n a s i s 的分析，可发现大仓鼠、黑线仓鼠、黑线姬 鼠4 5 sd n a 守列上的差剐见图3 - 8 。犬仓鼠与黑线仓鼠之间的差异在于上游 ( 5 端) 第7 位，大仓鼠为a ，黑线仓鼠为t ；第5 3 、5 4 位，大仓鼠为1 ， 黑线仓鼠为c t 。黑线仓鼠与黑线姬鼠相比，上游第7 位，前者是t ，威者为a ； 第8 4 位，前者为t ，厩者为a ；第8 6 位，也是前者为t ，最者为a 。通过比较 可以发现，不越鼠秘之间4 5 sd 法序列的同源性极高，个别核苷酸的差别对 其结构改变并不明显，嗣样，对其功能影响也不会很显著。 大仓鼠 t g t g t a g c c ca g g c t g g c c tc g a a c t c g t ga t c c c t c t g cc t c t g c c t c c 黑线仓鬣卓料丰丰术木木f 木木堆术术术术书水术木术水术木术木丰牵木拳术率术丰t c 冰料半年术爿c 术丰枣木术冰木 黑；线姬鼠牢水a 冰a 术牢术术半木半料木4 ：木半木术术芈术木凇冲c 术枣术半丰术术丰t c 丰术木皋木枣枣木术冰木术冲：术 大仓鬣 t t c a g c a a 脯e e 丁a c e g g e gt g c g c c a c c ac a a c c g g c 黑线仓鬣木牢4 肆术牢枣木料肆料半半半宰丰术半术木术牵料牵球术术t 料冲：术木：| ： 黑垒皂姬鼠术年料术半= l ：丰半：# 4 肆半木水水术牵水术木术半肆术母木 x 能得到一个完整的序列，这里选取补平的方法。幸! 蹙嗵；筮罗耙囊攀黎劫飘 铲剥藏茂汪饼穗；溶撰坪趁馥尚甜酬。# 髂些刿霄秘鞲誊写照； 零= ! 蠹曩雾溪鬻薹鍪 辨羹箍鞴诏嘏鹭羹鎏絮溢继塑鏊g ；群嚣l i 拍錾 塞鬻i 耋羹一瑟潮编凛嘲 翰到j 燃明港噶诣氇坦耋磐i 妻赢。￥垂矗；冀固醪! l 歹强饕秽烈裂再；奏菇誊 圆癌葵匿雌恳瀚毽，塞罄堂孽羹l 交喳隆誉凌霖警霸矮粒缒j 5 sd n a 序列的8 8 b p ，片 段总大夺为1 3 9 b 势。对照电泳结果，基本相符。图3 4 ： 32jm 图3 4 重组质粒的e c o ri + h i n d m 酶切 m ：dn a 分子量标准1 ：大仓鼠酶切图谱2 ：煞线仓鼠酶切图谱3 ：黑线仓鼠酶切图谱 3 5测序与分析 将鉴定过的含重组子的d 王差5d 菌液编上号，送往上海基康生物技术有限 公司测序，使用t 7 宿动子弓f 物，结果见图3 5 ，图3 6 ，图3 7 所示。 从测序结果可以看到，4 5 sd n a 序列共有8 8 b p ，与预期结果一致。大仓鼠、 黑线姬鼠、黑线仓鼠的4 5 sd n a 序列差异很小，只是少数核苷酸上的差别。 l g aa t t e g a g ct c g g i a c c c 羔鱼! 鱼羔垒鱼鱼壁至壁堡! 昼盎曼王篓垒羔曼垒 5 l 王c c 胡t g e c 代t g c c l e tt c a g e a a a 罩cc t a c c g g c g tg e g c c a ( a c x ( 二) 4 5 sr n a 及其基因的功能与其结构上的如下特点有关：很高的 g c 含量( 约占6 0 ) ；嚣个重复序列( 8 8 b p 中真3 6 b p 参与到重复序列中) ： 3 末端的霹变的u 个数( 一般2 6 个) 。 ( 三) 4 5 s 心认及其基因目前主要在啮齿类中发现，但楚在其他物种 中也发现了很多同源