（动物学专业论文）蛋白酶体活性抑制地微管相关蛋白tau的磷酸化调节及机制研究.pdf

华中师范大学学位论文原创性声明和使周授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者始旆君雨 日期：矽1 1 年6 月 日 学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解华中师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：研 究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华中师范大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅； 学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手 段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后遵守此规定) 保密论文注释：本学位论文属于保密，在年解密后适用本授权书。 非保喜篙皂筹做褊张黼匦翻黧雪糠渺 作者签名：驾君丽 导师签名：! 灞u 日期：1 1 年6 月1 日 日期：函l 阵 阴1 日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库 中全文发布，并可按“章程 中的 规定享受相关权益。园壹途塞握童蜃澄卮；旦圭生i 旦二玺；旦三生发查! 作者签名：梯君雨导师签名：陪滞帕 日期：1 1 年石月1 日日期：j 刁i , g - 易月日 摘要 由过度磷酸化t a u 蛋白聚集形成的神经原纤维缠结( n e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e s ， n f t s ) 是阿尔茨海默病( a l z h e i m e r sd i s e a s e ，a d ) 和与1 7 号染色体相关的额颞叶 痴呆与帕金森病( p a r k i n s o n sd i s e a s e ，p d ) 等t a u 相关疾病的主要神经病理学特征 之一。但是到目前为止，导致t a u 蛋白过度磷酸化及形成n f t s 的机制尚未完全阐 明。不仅t a u 蛋白的磷酸化，而且其泛素化也可促进n f t s 的形成。泛素一蛋白酶体 系统( u b i q u i t i n p r o t e a s o m es y s t e m ，u p s ) 通过e 3 泛素连接酶可将磷酸化的t a u 蛋 白泛素化，同时蛋白酶体活性在t a u 相关疾病中降低，表明u p s 可能影响t a u 蛋白 的过度磷酸化。此外，糖原合酶激酶一3 p ( g l y c o g e ns y n t h a s ek i n a s e - 3 p ，g s k - 3 1 3 ) 和 蛋白激酶b ( p r o t e i nk i n a s eb ，p k b a k t ) 也在t a u 蛋白的异常磷酸化中起关键作用， a k t 是g s k 3 d 的上游激酶，且热休克蛋白9 0 ( h e a ts h o c kp r o t e i n9 0 ，h s p 9 0 ) 与 a k t 两者之间结合程度的变化可以调节a k t 蛋白含量和活性改变。因此本文用稳定 表达人t a u 4 4 1 异构体的人肾母瘤细胞株( h u m a ne m b r y o m ck i d n e y2 9 3c e l l s ， h e k 2 9 3 t a u 4 41 ) 为基本材料，用2 0 sp r o t e a s o m e 特异性抑制剂l a c t a c y s t i n 和蛋白质 合成抑制剂放线茵酮( c y c l o h e x i m i d e ，c h x ) 共同处理细胞2 4h ，通过免疫印迹、 免疫荧光和免疫共沉淀技术检测蛋白酶体活性抑制对t a u 蛋白相关位点磷酸化、蛋 白激酶g s k 3 b 、a k t 和热休克蛋白的影响以及蛋白酶体与g s k 3 p 和蛋白酶体与 a k t 之间的相互作用关系，以探讨蛋白酶体活性抑制导致t a u 蛋白过度磷酸化的可 能机制，结果如下： ( 1 ) 蛋白酶体活性抑制对t a u 蛋白总量和磷酸化程度的影响 蛋白酶体活性抑制可诱导t a n 蛋白总量增加，t a u - t h r 2 31 ，s e r 3 9 6 ，t h r 2 0 5 和 s e r l9 5 19 8 19 9 2 0 2 位点磷酸化程度增加，提示t a u 蛋白和磷酸化t a u 蛋白可能都是 蛋白酶体的降解底物。但蛋白酶体活性抑制后t a u - s e r 2 1 4 位点磷酸化程度下降。 ( 2 ) 蛋白酶体与g s k - 3 1 b 之间的关系 g s k 3 d 是调节t a u 蛋白磷酸化的主要激酶之一，而蛋白酶体活性抑制后引起的 t a u 蛋白过度磷酸化修饰的位点( 1 1 2 3 1 ，s e r 3 9 6 ，m 2 0 5 和s e r l 9 5 1 9 8 1 9 9 2 0 2 ) 均是g s k 3 b 的调节位点，因此为了阐述蛋白酶体活性抑制引起的t a u 蛋白磷酸化 程度增加的机制，本实验检测了该体系中g s k 3 p 含量和活性的改变。结果发现蛋 白酶体活性抑制导致g s k 3 p s e r 9 位点磷酸化程度降低，由于此位点磷酸化程度与 g s k - 3 p 活性呈负相关关系，因此该结果表明蛋白酶体活性抑制使g s k 3 p 活性升 高，这与蛋白酶体活性抑制使t a u - t h r 2 3 l ，s e r 3 9 6 ，t h r 2 0 5 和s e r l 9 5 1 9 8 1 9 9 2 0 2 位点过度磷酸化保持一致，表明蛋白酶体可通过调节g s k 3 p 活性间接调节t a u 蛋 白磷酸化。同时也检测到蛋白酶体活性抑制使g s k 3 p 蛋白含量升高，且免疫荧光 和免疫共沉淀技术检测发现，细胞内2 0 sp r o t e a s o m e 和g s k 一3 d 两者之间有共定位 和共沉淀关系，提示细胞内g s k 3 p 可能是蛋白酶体的降解底物。 ( 3 ) 蛋白酶体与a k t 之间的关系 a k t 既是g s k 3 d 的上游激酶也是t a u s e r 2 1 4 位点磷酸化的主要调节激酶，因 此本研究中进一步检测了蛋白酶体活性抑制对a k t 蛋白激酶含量和活性的影响。结 果发现蛋白酶体活性被抑制时，a k t 的s e r 4 7 3 和t h r 3 0 8 位点磷酸化程度随着 l a c t a c y s t i n 浓度的升高而降低，a k t 的s e r 4 7 3 和t h r 3 0 8 是a k t 的活性调节位点，这 两个位点的磷酸化程度降低表明a k t 的活性下调，这与抑制蛋白酶体活性使 g s k 3 d s e r 9 和t a u s e r 2 1 4 位点磷酸化程度降低保持一致，提示蛋白酶体活性抑制 可通过调节a k t 的活性间接调节t a u 蛋白磷酸化。研究还发现当蛋白酶体活性受到 抑制时，细胞内a k t 蛋白含量升高，同时免疫荧光和免疫共沉淀技术显示2 0 s p r o t e a s o m e 和a k t 两者在细胞内有共定位和共沉淀关系，该结果说明a k t 也可能是 蛋白酶体的降解底物。 ( 4 ) 蛋白酶体活性抑制对热休克蛋白的影响 h s p 9 0 与a k t 两者结合程度的改变可以调节a k t 活性，因此为了进一步探测蛋 白酶体活性抑制引起a k t 活性下调的机制，本实验检测了细胞内蛋白酶体活性抑制 对h s p 9 0 和h s p 7 0 含量的影响。结果发现，抑制蛋白酶体活性使细胞内热休克蛋白 家族成员h s p 9 0 和h s p 7 0 含量升高。因此推测当蛋白酶体降解系统被阻碍时，异常 聚集的蛋白会刺激细胞应激系统导致细胞内热休克蛋白迅速产生，恢复这些聚集蛋 白的正常功能。但蛋白酶体活性抑制诱导的含量增加的h s p 9 0 与a k t 结合程度如何 改变，还需进一实验研究。 综上所述，蛋白酶体活性抑制对t a u 蛋白磷酸化的调节可通过下列途径进行： 蛋白酶体可直接降解t a u 蛋白和磷酸化t a u 蛋白； 蛋白酶体可通过调节g s k - 3 1 3 和a k t 活性间接调节t a u 蛋白磷酸化； 蛋白酶体活性抑制可诱导h s p 9 0 和h s p 7 0 含量增加。蛋白酶体活性抑制导 致的h s p 9 0 含量增加可能参与调节a k t 活性，但如何调节需进一步实验研究。 关键词：蛋白酶体；t a u ；g s k 3 d ；触；h s p 9 0 a b s t r a c t n e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e s ( n e t s ) m a i n l yc o m p o s e do fa b n o r m a lh y p e r p h o s p h o r y l a t e d t a up r o t e i n si so n eo ft h em a j o rh a l l m a r k so ft h et a u o p a t h i e s ，s u c ha sa l z h e i m e r sd i s e a s e o ) ，f r o n t o t e m p o r a ld e m e n t i aa n dp a r k i n s o n i s ml i n k e dt oc h r o m o s o m e17 t h ep r e c i s e m e c h a n i s mo ft a uh y p e r p h o s p h o r y l a t i o na n dn f t sf o r m a t i o ni sn o tc l e a ry e t p r e v i o u s s t u d i e ss u g g e s t e dt h a tt a nu b i q u i t i n a t i o nw a sm e d i a t e db yu b i q u i t i n - p r o t e a s o m es y s t e m ( u p s ) ，a sw e l la st a up h o s p h o r y l a t i o n ，c o c o n t r i b u t et ot h ef o r m a t i o no fn f t s i tw a s r e p o r t e dt h a tp h o s p h o r y l a t e dt a ue o u l d eb eu b i q u i t i n a t e dt h r o u g he 3u b i q u i f i nl i g a s ea n d t h eg o t e a s o m ea c t i v i t yw a sd e c r e a s e di nt a u o p a t h i e sb r a i n s ，s ow et h o u g h tu p sm i g h t p l a ya l li m p o r t a n tr o l ei nt h ea b n o r m a lh y p e r p h o s p h o r y l a t i o no ft a u g l y c o g e ns y n t h a s e l 【i n a s e - 3p ( g s k - 31 3 ) a n di t su p s t r e a mr e g u l a t o r , p r o t e i nk i n a s eb ( p o o h k b ) ，h a v ea d i r e c tl i n k 、i mt a up h o s p h o r y l a t i o n ，a n dt h e yc a l lp h o s p h o r y l a t et a ua tm a n ys i t e s r e c e n ts t u d yh a dd e m o n s t r a t e dt h a tt h ec o m b i n a t i o nb e t w e e nh e a ts h o c kp r o t e i n9 0 ( h s p 9 0 ) a n da k tc o u l dr e g u l a t ea k tl e v e la n da c t i v i t y i np r e s e ms t u d y , w et r e a t e dt h e h e k 2 9 3c e l l ss t a b l yt r a n s f e c t e dw i t ht h el o n g e s th u m a nt a u ( t a u4 41 ) w i t hl a c t a c y s t i n ( a r e c o g n i z e di r r e v e r s i b l e2 0 sp r o t e a s o m ei n h i b i t o r ) a n dc y c l o h e x i m i d e p r o t e a s ei n h i b i t o r ( c h x ) f o r2 41 1 t h e nt h el e v e lo ft o t a lo rp h o s p h o r y l a t e dt a ua tv a r i o u se p i t o p e sw a s d e t e c t e db yw e s t e r nb l o t t h eu n d e r l y i n gm e c h a n i s mi n v o l v e di nh s p 9 0 a k t g s k - 3 d s i g n a lp a t h w a yw a sa l s oi n v e s t i g a t e db y i m m u n o f l u o r e s c e n c ea n dc o i m m u n o - p r e c i p i t a t i o n r e s u l t sa r el i s t e da sf o l l o w i n g ： ( 1 ) e f f e c t so fp r o t e a s o m ei n h i b i t i o no nt o t a la n dp h o s p h o r y l a t e dt a u p r o t e a s o m ei n h i b i t i o nc o u l di n c r e a s et o t a lt a ua n dp h o s p h o r y l a t e dt a ua tt h r 2 31 ， s e r 3 9 6 ，t h r 2 0 5a n ds e r l 9 5 1 9 8 1 9 9 2 0 2s i t e s ，w h i l et a up h o s p h o r y l a t i o nd e c r e a s e da t s e r 214 e p i t o p e ，w h i c h i n d i c a t e d p r o t e a s o m e c a n d e g r a d a t e n o r m a lt a ua n d p h o s p h o r y l a t e d t a u ( 2 ) t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e np r o t e a s o m ea n dg s k - 3p g s k 3dw a st h em a i nk i n a s et h a tr e g u l a t e dt a up h o s p h o r y l a t i o na ta b o v e - m e n t i o n e d e p i t o p e s ，s ow ed e t e c t e dt h ec h a n g eo fg s k - 31 3 t or e v e a lt h em e c h i n i s a mo ft a u p h o s p h o r y l a t i o na f t e rp r o t e a s o m ei n h i b i t i o n p h o s p h o r y l a t i o no fg s k 一3ba ts e r 9e p i t o p e c o u l dl e a dt oi t si n a c t i v a t i o n t h el e v e l so ft o t a la n dp h o s p h o r y l a t e dg s k - 3 1 3w e r e l i i a s s a y e db yw e s t e r nb l o ta n di m m u n o f l u o r e s c e n c e q u a n t i t a t i v ed a t as h o w e dt h a t p r o t e a s o m ei n h i b i t i o nc o u l de n h a n c et h eg s k - 3 pa c t i v i t y , w h i c hw a sc o n s i s t e n t 谢mt a u h y p e r p h o s p h o r y l a t i o n t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dp r o t e a s o m ec o u l di n d i r e c t l yr e g u l a t et a u p h o s p h o r y l a t i o nt h r o u g hu p r e g u l a t i n gg s k 一3da c t i v i t y s i m u l t a n e i t y , t h ei n h i b i t i o no f p r o t e a s o m e c a ne n h a n c et h et o t a ll e v e lo fg s k - 3 p t h e c o - l o c a l i z a t i o na n d c o p r e c i p i t a t i o nb e t w e e n2 0 sp r o t e a s o m ea n dg s k - 31 3 i nt h ec e l l ss h o w e dg s k - 3 pw a s t h ec l i e n to f p r o t e a s o m e ( 3 ) t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e np r o t e a s o m ea n da k t a k tw a st h eu p s t r e a ml 【i n a s eo fg s k - 3 1 ba n di tr e g u l a t e dt h ep h o s p h o r y l a t i o no ft a u p r o t e i na ts e r 214e p i t o p e ，s ow ed e t e c t e dt h ee f f e c to fp r o t e a s o m ei n h i b i t i o no na k t w e f o u n dt h a ta k t p h o s p h o r y l a t i o na ts e r 4 7 3a n dt h r 3 0 8e p i t o p e s ( t h ea c t i v a t e df o r mo f a k t ) w e r ed e c r e a s e dw h e np r o t e a s o m ei n h i b i t i o n ，w h i c hi m p l i e dd o w n r e g u l a t i o no fa k t a c t i v i t y a n dt h e r ew a sac o n s i s t e n c yb e t w e e nd e c r e a s e da k ta c t i v i t ya n di n c r e a s e d g s k 一3p a c t i v i t y d e c r e a s e dl e v e lo ft a up h o s p h o r y l a t i o na t s e r 214e p i t o p ew a s c o r r e l a t e d 、航n 1t h e i rc o e f f e c t t h e s er e s u l t ss u g g e s t e d p r o t e a s o m ei n h i b i t i o nb y l a c t a c y s t i na c t i v a t e dg s k 3pt h r o u g hd o w n r e g u l a t i n gt h ea k ta c t i v i t ya n dc a u s e dt a u p h o s p h o r y l a t i o ni n t h ec e l l s a n di n h i b i t i o no fp r o t e a s o m e 谢t hd i f f e r e n td o s eo f l a c t a c y s t i ni n c r e a s e dt o t a la k ta tt h es a l t l et i m e w ea l s od e t e c t e dt h ec o - l o c a l i z a t i o na n d c o p r e c i p i t a t i o nb e t w e e n2 0 sp r o t e a s o m ea n da k ti nc e l l s ，s u g g e s t e dp r o t e a s o m ec o u l d a l s od e g r a d a t ea k t ( 4 ) e f f e c t so fp r o t e a s o m ei n h i b i t i o no nh e a ts h o c kp r o t e i n h s p 9 0c o u l dr e g u l a t ea k ta c t i v i t y , a n dt h er e s u l ts h o w e dt h a tp r o t e a s o m ei n h i b i t i o n i n d u c e dt h ei n c r e a s eo fh s p 9 0a n dh s p 7 0t o t a ll e v e l w et h o u g h tt h a tu p si n h i b i t i o nb y l a c t a c y s t i ni n c r e a s e da g g r e g a t i o np r o t e i n s ，a n dt h e s ea g g r e g a t i o np r o t e i n se n h a n c e dt h e l e v e lo fh s p 9 0a n dh s p 7 0t or e s t o r et h en o r m a lf u n c t i o no ft h e s em i s f o l d e dp r o t e i n s b u t t h i sh y p o t h e s i st h a th s p 9 0c o u l dr e g u l a t ea k ta c t i v i t ys h o u l db ec o n f o r m e db yf u r t h e r s t u d y , s u c ha sd e t e c t i n gt h ec o m b i n a t i o nb e t w e e nh s p 9 0a n da k tw h e nt h ep r o t e a s o m e w a si n h i b i t e d i n c o n c l u s i o n , t h em e c h a n i s mi nw h i c hp r o t e a s o m ei n h i b i t i o nr e g u l a t e dt a u p h o s p h o r y l a t i o ns h o u l db ea sf o l l o w s ： p r o t e a s o m ec o u l dd i r e c t l yd e g r a d a t et a ua n dp h o s p h o r y l a t e dt a up r o t e i n ； p r o t e a s o m ec o u l di n d i r e c t l yr e g u l a t et a up h o s p h o r y l a t i o nt h r o u g hr e g u l a t i o no f i v g s k - 3 pa n da k t ； p r o t e a s o m ei n h i b i t i o nc o u l di n c r e a s e t h el e v e l so fh s p 7 0a n dh s p 9 0 t h e i n c r e a s eo fh s p 9 0b yp r o t e a s o m ei n h i b i t i o nm i g h tp a r t i c i p a t ei na k ta c t i v i t yr e g u l a t i o n , b u tt h ep r e c i s em e c h n i s mn e e dt h ef u r t h e rs t u d yt od e f i n e k e y w o r d s ：p r o t e a s o m e ；t a u ；g s k - 3 3 ；a k t ；h s p 9 0 v 摘要 a b s t r a c t 1 引言 目录 i i i i 2 实验材料与方法 l 5 2 1 主要试剂一5 2 2 主要仪器5 2 3 细胞培养方法6 2 4 药物处理6 2 5w e s t e r nb l o t 步骤”6 2 5 1w e s t e r nb l o t 样品制备6 2 5 2b c a 法测蛋白浓度7 2 5 3s d s p a g e 电泳7 2 5 4 转膜8 2 5 5w e s t e r nb l o t 显色“8 2 6 免疫荧光技术9 2 7 免疫共沉淀技术1o 2 8 统计学分析“1 1 3 结果 3 1 蛋白酶体活性抑制对t a u 蛋白总量和磷酸化程度的影响1 2 3 2 蛋白酶体活性抑制对g s k 一3 p 蛋白含量和活性影响1 4 3 - 3 蛋白酶体活性抑制对a k t p k b 蛋白含量和活性影响1 6 3 4 蛋白酶体活性抑制对h s p 9 0 和h s p 7 0 含量的影响”1 8 4 讨论 2 0 4 1 蛋白酶体与t a u 蛋白及磷酸化t a u 蛋白之间的关系一2 0 4 1 1 蛋白酶体活性抑制对t a u 蛋白总量的影响“2 0 4 1 2 蛋白酶体活性抑制对t a u 蛋白各位点磷酸化的影响”2 0 4 2 蛋白酶体与g s k - 3 3 之间的关系。2 1 4 3 蛋白酶体与a k t 之间的关系2 2 4 4 蛋白酶体与h s p 9 0 之间关系2 3 5 小结 参考文献 附录 致谢 2 5 3 2 3 3 1 引言 以神经原纤维缠结( n e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e s ，n f t s ) 为主要病理学特征的t a u 相关 疾病，包括阿尔茨海默病( a l z h e i m e r sd i s e a s e ，a d ) 和与1 7 号染色体相关的额颞 叶痴呆与帕金森病( p a r k i n s o n sd i s e a s e ，p d ) 等【l 】，它们的共同特征之一是认知能 力的损伤。如a d 的临床症状，早期是短时记忆和方向感的障碍，随后长时记忆也 受到损伤，直至近亲也不认识；生理症状表现为脑部萎缩，具体是颞叶、前额叶、 顶叶皮层、海马和杏仁核区突触和神经元的缺失，由神经元缺失所致的大脑体积的 明显减小【2 1 。目前t a u 相关疾病的患病人数正以越来越快的速度发展，目前为止患a d 的病人数大约占总神经退行性疾病的6 0 。据统计2 0 0 8 年全世界大约有3 0 0 0 万人患 有a d ，至u 2 0 4 0 年患病人数将增加到8 0 0 0 万【3 】。因此阐明n f t s 的形成机制对揭示t a u 相关疾病发病过程有重要意义，同时也将为制定t a u 相关疾病的治疗策略提供相应的 实验依据。 研究表明，n f t s 主要由过度磷酸化t a u 蛋白组成【4 叫。t a u 蛋白是神经元中广泛存 在的微管相关蛋白之一，其主要生物学功能是促进微管组装，维持微管的稳定1 7 岗j ， 调节细胞骨架的结构和功能，以保持神经元的正常轴浆运输和突触的可塑性。当t a u 蛋白结构发生异常时，如过度磷酸化后可导致t a u 蛋白从微管上解离，进而使微管稳 定性下降和促使微管解聚，过度磷酸化的t a u 蛋白则聚集形成双螺旋细丝( p a i r e d h e l i c a lf i l a m e n t ，p h f ) 的结构，引起t a u 蛋白的纤维化【9 1 0 j ，在神经元内积聚形成n f t s ， 影响神经元轴浆运输、突触的可塑性及细胞形态稳定，最后导致神经元死亡和痴呆 的形成。但是现有的研究发现仅有t a u 蛋白过度磷酸化修饰并不足以引起n f t s 的形 成【l l 】。有研究指出，t a u 蛋白的翻译后修饰方式除了磷酸化外，还有泛素化和糖基化， 且t a u 蛋白的泛素化也可促进p h f 的形成与聚集【惦1 3 】。热休克蛋白7 0c 末端结合蛋白 ( c a r b o x yt e r m i n u so f h e ms h o c kp r o t e i n7 0 i n t e r a c t i n gp r o t e i n ，c h i p ) 作为一种特殊 的e 3 连接酶，可以介导热休克蛋白和蛋白酶体降解系统间的连接，调节细胞内蛋白 质去折叠和降解之间的平衡。c h i p 具有与热休克蛋白9 0 ( h e a ts h o c kp r o t e i n9 0 ， h s p 9 0 ) 和热休克蛋8 7 0 ( h e a ts h o c kp r o t e i n 7 0 ，h s p 7 0 ) 共同结合的能力，其主要 通过抑制热休克蛋白a t p a s e 活性，抑制a t p 水解，减弱h s p s 与底物结合能力，从而 抑制热休克蛋白对底物的去折叠和重新折叠过程，促进c h i p 对底物蛋白的泛素化和 降解。c h i p 可以将t a u 蛋白泛素化，在人体组织中检测到t a u 蛋白与c h i p 之间具有免 疫活性，且c h i p 通过t a u 蛋白微管结合区域泛素化t a u 蛋白，并将t a u 蛋白经蛋白酶体 系统降解【1 4 】。以上研究均表明，泛素一蛋白酶体系统( u b i q u i t i n p r o t e a s o m es y s t e m ， u p s ) 在t a u 蛋白的降解中有重要作用。 u p s 是细胞内选择性识别，降解错误折叠和异常聚集蛋白的主要途径之一，由 泛素( u b i q u i t i n ，u b ) 、泛素活化酶( u b i q u i t i n a c t i v a t i n ge n z y m e ，e 1 ) 、泛素结合酶 ( u b i q u i t i n - c o n j u g a t i n ge n z y m e s ，e 2 s ) 、泛素连接酶( u b i q u i t i nl i g a s e s ，e 3 s ) 、2 6 s 蛋白酶体和去泛素化酶( d e u b i q u i t i n a t i n ge n z y m e s ，d u b s ) 等组成。泛素介导的蛋 白质降解由底物蛋白的泛素化和蛋白酶体降解两个过程组成。前者即泛素与其底物 蛋白质的赖氨酸残基共价结合的过程，泛素在e l 的作用下活化，在e 2 s 的参与下将 泛素传递给e 2 s ，e 3 s 有特异性，可决定泛素结合蛋白种类，在e 3 s 的作用下将泛素 与目的蛋白结合；后者即完成泛素化的蛋白质被2 6 s 蛋白酶体识别并降解的过程。 泛素分子在细胞内含量保持平衡，被蛋白质降解底物固定的泛素分子可被d u b s 从 底物上解离下来重复利用【l 引。 u p s 功能损伤与神经元中t a u 蛋白的代谢异常和n f t s 的形成密切相关。研究表 明，在a d 病人脑中蛋白酶体活性降低【1 6 。1 3 j ，p h f 与蛋白酶体结合并抑制其活性，导 致a d 病人脑中关键区域与同龄正常人相比蛋白酶体活性下降，其中直回区域蛋白 酶体活性下降t 4 4 0 9 】，海马和海马旁回下降了5 2 ，上中颞下降了6 2 ，顶下小 叶下降了7 2 ，枕叶和小脑没有影响【2 0 1 ，且蛋白酶体活性的抑制足以诱导神经元变 性，这表明蛋白酶体功能损伤在与a d 相关的神经元损伤中起重要作用。除了t a u 蛋 白的过度磷酸化，蛋白酶体的功能损伤也在t a u 蛋白的聚集中起重要作用。j u n g 等指 出在a d 病人脑中聚集的t a u 蛋白大部分也是泛素化的，但是他们没有被u p s 系统降 解【2 】，表明高度磷酸化t a u 蛋白形成的聚集体可能抑制了细胞内蛋白酶体活性，导致 聚集体中泛素化t a u 蛋白降解障碍；在a d 病人包涵体中过度磷酸化的t a u 蛋白同时也 被泛素化【2 1 ，捌，且蛋白酶体活性抑制与n f t s 数量呈负相关【2 3 】，提示蛋白酶体活性 抑制可阻止磷酸化t a u 蛋白降解和促进n f t s 的形成。虽然蛋白酶体可以降解t a u 蛋白 2 4 - 2 6 】，但蛋白酶体介导的t a u 蛋白的降解可以被t a u 蛋白的过度磷酸化修饰所抑制， 导致不溶性t a u 蛋白聚集体的形成【2 】。当蛋白酶体活性被抑制时，可使t a u 蛋白磷酸化 程度发生改变【2 7 1 ，从而调节t a u 蛋白的降解。但是关于蛋白酶体如何调节t a u 蛋白的 磷酸化，目前机制尚未阐述清楚。 t a u 蛋白磷酸化受各种蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的调节，其中主要有糖原合酶 激酶3 p ( g l y c o g e ns y n t h a s ek i n a s e 3 p ，g s k - 3 p ) 、细胞周期素依赖性蛋白激酶一5 ( c y c l i nd e p e n d e n tk i n a s e 5 ，c d k 5 ) 、蛋白激酶a ( p r o t e i nk i n a s ea ，p k a ) 、蛋白 激酶c ( p r o t e i nk i n a s ec ，p k c ) 和蛋白磷酸酯酶2 a ( p r o t e i np h o s p h a t a s e2 a ，p p 2 a ) 【2 】。蛋白激酶活性上调和或磷酸酯酶活性下调都是导致t a u 蛋白过度磷酸化的直接原 因。但目前为止，t a u 相关疾病中导致这些激酶或酯酶活性异常的上游物质并不明确。 2 g s k 一3 d 作为一种丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，在t a u 蛋白的磷酸化和聚集导致的神 经退行性病变中起关键作用【2 3 ，2 9 1 。t a u 蛋白中s e r 3 9 6 、t h r 2 0 5 、t h r 2 3 1 和 s e t l 9 5 1 9 8 1 9 9 2 0 2 等位点都是g s k 3 d 的作用位点，这些位点在t a u 蛋白的聚集中有 重要作用。当用g s k 3 p 抑制剂n p l 2 处理细胞后，发现细胞内t a u 蛋白磷酸化程度降 低，神经元丢失的现象得到缓解【3 0 】，说明g s k 3 b 确实在神经元病变中有重要作用。 且在植物细胞中g s k 3 b 是蛋白酶体的降解底物( 3 ，因此可以推测在动物细胞内蛋 白酶体与g s k 3 b 之间可能也有一定关系。 g s k - 3 1 3 活性主要通过磷酸肌醇3 激酶蛋白激酶b ( 也称a k t ) ( p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l3 - k i n a s e s p r o t e i nk i n a s eb ，p 1 3 k a k t ) 信号通路进行调节，其 中a k t 是g s k 3 d 活性调节的关键上游激酶，a k t 可以通过调节g s k 3 b s e r 9 位点磷酸 化调控g s k 3 p 的活性。另外，w n t 信号蛋白也可调节g s k 3 p 活性，细胞f l g g s k 3 p 与a x i n ( a x i si n h i b i t i o np r o t e i n ) 、a p c ( a d e n o m a t o u sp o l y p o s i se o l i ) 和d c a t e n i n 共同 形成复合物，当细胞内w n t 蛋白缺失将抑制g s k 。3 b 活性【3 引。a k t 不但可以通过调控 g s k 3 d 的活性间接调节t a u 蛋白的磷酸化，同时也可直接调节t a u - s e r 2 1 4 位点的磷酸 化f 3 3 】，表明a k t 活性变化在t a u 蛋白的磷酸化调节中起重要作用。 a k t 活性调节主要有以下几个途径。a k t 活性主要受p 1 3 眦t 信号通路的调节， 即被生长因子( 如胰岛素，表皮生长因子) 激活的p 1 3 k 可催化磷脂酰肌醇4 ，5 二磷 酸( p i p 2 ) 的肌醇3 位磷酸化，生成磷脂酰肌醇3 ，4 ，5 三磷酸( p i p 3 ) ，后者是3 磷酸 肌醇依赖性的蛋白激酶l ( 3 - p h o s p h o i n o s i t id e d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e 一1 ，p d k l ) 的 激活剂。a k t 活性与t h r 3 0 8 和s e r 4 7 3 位点磷酸化呈正相关关系，t h r 3 0 8 位点磷酸化主 要受p d k l 调节，s e r 4 7 3 位点主要由哺乳动物累帕霉素靶蛋白( m a m m a l i a nt a r g e to f r a p a m y c i nc o m p l e x2 ，m t o r c 2 ) 调节1 3 4 。a k t 的n 末端区域与p 1 3 k 产生磷脂的区域 结合将a k t 转移到细胞膜，从而被存在于膜上的p d k l 激活【3 5 3 6 】，然后被激活的 m t o r c 2 在s e r 4 7 3 位点将a k t 完全活化【3 7 】。此外，a k t 活性也可以通过其他激酶或酯 酶进行调节，如整连蛋白连接激酶1 ( i n t e g r i n - l i n k e dk i n a s e1 ) 可通过磷酸化s e r 4 7 3 活化a k t t 3 8 1 ；碳末端调节蛋白( c a r b o x y l t e r m i n a lm o d u l a t o rp r o t