（安全技术及工程专业论文）纳米氧化锌对生物体的毒理学效应研究.pdf

a b s t r a c t w i t ht h e p r o d u c t i o na n dp o p u l a r i t yo fn a n o m a t e r i a l s ，t h eo c c u p a t i o n a la n d e n v i r o n m e n t a le x p o s u r ei sg r e a ti n c r e a s i n g n a n o m a t e r i a l sc a l le n t e ri n t ow a t e r d u r i n g l i f ec y c l e ( p r o d u c t i o n ，s t o r e ，t r a n s p o r t a t i o n ，c o n s u m p t i o n , t r e a t m e n to rr e c y c l e ) ，c a u s e w a t e ra n ds e d i m e n t sp o l l u t i o n ，e n d a n g e ra q u a t i ce c o s y s t e m s ，a n de v e nb r i n ga p o t e n t i a lh a z a r do nh u m a nh e a l t ht h r o u g hf o o dc h a i n s o ，i ti sn e e df o rt o x i c i t ys t u d i e s o nn a n o m a t e r i a l s z i n co x i d eu s e da sas u n s c r e e na n df o o da d d i t i v e sw a sc h o s e ni nt h i ss t u d y a c u t e t o x i c i t yo fz i n co x i d eo nr o d e n t sa n di t si n h i b i t o r yt od m a n g aw e r es t u d i e di nt h e p a p e r 1 1 1 er e s u l ts h o w e da sf o l l o w ： ( 1 ) n a n o m a t e r i a l sc a na g g r e g a t ew i t hd i f f e r e n td e g r e ei ns o l v e n t t e mi m a g e s s h o w e dt h ea g g r e g a t e10 - a ：ln n lz n of o r m e di np h y s i o l o g i c a ls a l i n ew a st h el a r g e s t ， a b o u t0 5 l “m t h es i z eo fa g g r e g a t e2 5 士5 n mz n of o r m e dw a st h es m a l l e s t ，a b o u t 0 2 “m i ti sa b o u t0 5 - - - 1p mf o r9 0 - a ：10 n mz n o ( 2 ) t p ，a l b ，l d ha n db u n ，c rs h o w e d2 5 士5m na n dl0 - a ：ln mz n om a y i n d u c el i v e rd a m a g ea n dr e n a ld y s f u n c t i o na tt h ed o s eo fo 5 9 k gb w s o da n d g s h - p xa r ea n t i o x i d a n ti n d i c a t o r sa n di m p o r t a n te n z y m e st oc l e a rf r e er a d i c a l t h e m i c ee x p o s e d0 5 9 k gb wd o s eo flo 士ln mz n oh a dt h el o w e s ta b i l i t yt oc l e a rf r e e r a d i c a l ，t h a ti s ，s m a l l e rs i z e dz n op a r t i c l e sl e dm o r es e r i o u so x i d a t i v ed a m a g ea t 0 5 9 k gb w d o s e ( 3 ) t i s s u ed i s t r i b u t i o no f z ns h o w e dz n on a n o p a r t i c l e sc a l le n t e ri n t oc i r c u l a t o r y s y s t e mo fo r g a n i s m ( 4 ) s t a t i s t i c a la n a l y s i si n d i c a t e dt h ei m p a c to fi n t e r a c t i o no fd o s ea n ds i z eo n z i n cc o n t e n ti nb o n e ，s p l e e na n dk i d n e yw a sn o to b v i o u s ，b u ti tw a ss i g n i f i c a n ti nl u n g a n dp a n c r e a s ( p o 0 5 ) w h e nt h ed o s ew a s 0 5 9 k gb w , z n on a n o p a r t i c l e s a c c u m u l a t e di n l u n g ，s p l e e n ( e x c e p tf o r lo 士ln m ) ，k i d n e y ( 9 0 士l o n m ) ，p a n c r e a s ( 9 0 - j ：lo n m ) a n db o n e ，t od i f f e r e n td e g r e e a tl o wd o s e ，z i n cc o n t e n tg r e a td e c r e a s e di n 9 0 士10 n ma n d10 - a ：ln mz n op a r t i c l e st r e a t m e n t s ( 5 ) 做ed a p h n & m a g n a 豳m o d eb i o l o l g yt os t u d yt h et o x i c i t ya f f e c to fn a n o z n oa tt h e t i m eo fi t sl e a k t h er e s u l ts h o w e dt h ed e a t hr e a s o nw a sd i f f e r e n c ea ti t sd i f f e r e n ts t a t e s w h e n l l a n o z n ow a si ns u s p e n d i n gs t a t e ，d a p h n i am a g n aw a sd i e db e c a u s eo f e a t i n gt o om u c hn a n o - z n oo ra s p h y x i a 雏t h el o wo x y g e nc o n t e n l k e yw o r d s ：n a n o - z n o ；t o x i c o l o g i c a le f f e c t s ；e n z y m e ；z i n c ；m o u s e ；d m a n g a 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取 得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津理工大堂或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 il 学位论文作者签名：喀l 物签字日期：j y 年 上月上6 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 墨盗墨墨盘望有关保留、使用学位论文 的规定。特授权叁盗墨兰盘鲎 可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编， 以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复本和电子 文件。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 匆f 籼 i 签字日期： o 夕年之月彭日 白t 扇” 名 期 签 日 师 字 导 签 第一章前言 1 1 纳米材料的毒性效应 1 1 1 人工纳米材料简介 第一章前言 纳米材料是指在一维空间上耋1 0 0 n m 的材料，其被大规模生产并应用于涂 料、化妆品、催化剂、新型材料、医学等领域的近千种消费品中，用于提高功能 或获得崭新的新功能川。自2 0 世纪7 0 年代问世以来，其已迅速成为全世界关注的 热点前沿科技领域，作为一种新型材料，是一类具有重要理论价值和广阔应用前 景的新型功能材料。纳米技术被认为是下一次的工业革命i l - 2 j ，已引起全球范围 内的科技、工业和农业等发生革命性变革。但由于其独特的理化性质，可能会对 人体及生态环境造成污染，从而危及人类健康。同时，纳米材料的生物安全性研 究还牵涉到环境保护、社会安全、伦理道德等许多方面。因此，科学家们逐渐认 识和重视纳米材料可能带来的生物安全性方面的影响以及相关研究，纳米材料、 纳米颗粒的毒性己成为专家的共识。 1 1 2 纳米材料的侵入途径 纳米材料可以通过多种途径进入环境而成为纳米污染物。研究、生产、运输、 使用及废物处理等过程中的问接和直接释放是纳米材料进入环境的主要途径，工 厂和实验室的废物排放成为当前纳米材料进入环境的重要途径。 纳米材料不仅通过接触直接进入人体而且还可能以多种方式在环境中传播 进入大气、水或土壤，或通过环境、食物链进入人体。或通过其它生物( 如细菌 和原生生物) 进入食物链，最后进入人体。生物体接触纳米材料的途径主要有以 下三种：通过呼吸系统：国际放射线防护委员会( i c r p ) 1 9 9 4 年的研究指出， 不同粒径的纳米颗粒在人类呼吸道各部沉积的比率不同。粒径为l n m 的颗粒， 9 0 左右沉积在鼻咽部，其余1 0 沉积在气管支气管区，肺泡中几乎无沉积；粒 径为5 1 0 n m 的颗粒，上述3 个区域的沉积均为2 0 - - 3 0 ，粒径为1 0 - 1 0 0 n m 的颗粒在肺泡中沉积量最大，气管、支气管次之，鼻咽部最少，粒径为2 0 r i m 的 颗粒，有5 0 左右沉积在肺泡内。近来的多项研究都发现了纳米颗粒可以在动物 的呼吸道各段和肺泡内沉积【3 】。通过皮肤接触：通过皮肤接触的这些纳米材料 可能会穿过多层细胞进入真皮，随后进入毛细血管、淋巴管或被神经末梢摄取。 近年来纳米材料在化妆品中的应用逐渐增多，如防晒剂中含有的纳米物质在光照 下能产生自由基物质不仅破坏防晒剂的配方，这些过程也能破坏生物分子，从而 给消费者带来风险【4 ，5 】。通过食用和注射：食物中的纳米颗粒能渗入到消化道 淋巴管中，并且与其他大颗粒物相比，能更容易地在其他组织和器官分布1 6 】。出 于诊断或者医疗、实验的目的可以被设计并直接引入人体【7 驯。 第一章前言 1 1 3 纳米材料的毒性效应 纳米材料是超微细物质，当材料被制成纳米级颗粒时其理化性质会发生变 化，其毒性可能与微米粒径材料有所差别【1 0 】。已有研究显示纳米材料可以在细 胞水平、亚细胞水平、基因、蛋白水平及整体动物水平对生物体产生影响，其生 态学影响不可忽视。 1 1 3 1 整体器官水平的毒性效应 在纳米颗粒的整体生物效应方面，目前已经取得了一些初步的研究结果。 w a r h e i t 、l a m 、刘子宏等对小鼠的研究表明纳米颗粒可致肺脏损伤，引发肺肉芽 肿，o b e r d 6 r s t e r t 8 】等对于c 6 0 的研究报道首次提出纳米材料可能引起脑损伤，大 量的纳米粒子还可能对生物体的神经细胞造成损伤。刘子宏等通过气管滴注纳米 氧化锌对小鼠的急性毒性实验说明，纳米氧化锌对各剂量染毒组小鼠的肝脏和肾 脏均有一定的毒性效应。 1 1 3 2 细胞水平的毒性效应 纳米颗粒在体内和体外条件下都容易渗入细胞膜和线粒体，影响细胞的功能 1 l , 1 2 】。纳米颗粒能够进入细胞并与细胞发生作用，主要是对跨膜过程和细胞分裂、 增殖、凋亡等基本生命过程的影响和相关信号传导通路的调控，从而在细胞水平 上产生的生物效应。碳纳米管的细胞毒性研究相对于动物实验来说开展较多，并 且在多种细胞系中均发现碳纳米管有显著的细胞毒性。 1 1 3 3 分子水平的毒性效应 重点研究在纳米材料与生物分子的相互作用及其对生物分子结构和功能的 影响等，如蛋白质、d n a 。研究表明市面上销售的防晒霜中所含有的t i 0 2 纳米 颗粒是经过化学修饰的，它可以诱导产生羟基自由基并且能够使d n a 发生氧化 损伤。而且t i 0 2 在经阳光照射后可以催化损伤人细胞中的d n a 1 3 1 。陆兴熠【1 4 】 等研究了纳米抗菌材料z n o 对小鼠骨髓细胞微核发生率的影响，发现纳米抗菌 材料会对机体产生遗传毒性作用。 1 2 纳米氧化锌的性质和应用 1 2 1 纳米氧化锌的性质 纳米氧化锌是一种多功能性的新型无机材料，别名为纳米锌e t ( z i n cw h i t e n a n o m e t e r ) ，其粒径介于l l o o n m 之间，为白色或微黄色的超细粉体，密度为 5 4 7 9 c m 3 ，比表面积大于1 2 m 2 g ，加压下熔点约为1 8 0 0 ( 2 ，常压下1 7 2 0 升华， 呈针结晶状或球状，是一种新型高功能精细无机产品f 1 0 1 。 1 2 1 1 表面效应 2 第一章前言 表面效应是指纳米粒子表面原子与总原子数之比随粒径的变小而急剧增大 后所引起的性质上的变化。随着粒径减小，表面原子数迅速增加【l l 】。另外，随着 粒径的减小，表面原子数的迅速增加，纳米粒子的表面积、表面能都迅速增大。 伴随着粒径的减小，表面原子周围缺少相邻的原子，有许多悬空键，具有不饱和 性质，易与其它原子相结合而稳定下来，故具有很大的化学活性【i2 1 。伴随表面 能的增加，其颗粒的表面原子数增多，表面原子数与颗粒的总原子数的比值增大， 使其表面与内部的晶格振动产生了显著变化，于是便产生了“表面效应”【1 3 1 ，导致 纳米材料具有许多奇特的性能。 - 1 2 1 2 体积效应 所谓体积效应，是指当物质体积减少时，会出现两种情形：一是物质本身的 性质不发生变化，仅电子的自由程、磁体的磁区等与体积( 尺寸) 密切相关的性质 发生变化；二是物质本身性质也发生变化。在后种情况下，物质的性质由原来的 无数个原子或分子组成的集合体的属性变成有限个原子或分子结合的属性。一般 说来，半径小于l o n m 的金属粒子，在低温下就能观察到这种分立的现象【l 引。所 以，当纳米粒子的尺寸与传导电子的德布罗意波长相当或更小时，周期性的边界 条件将被破坏，磁性、内压、光吸收、热阻、化学活性、催化剂及熔点等都较普 通粒子发生了很大的变化，这就是纳米粒子的体积效应，这种体积效应为实际应 用开拓了广阔的新领域【l6 ，1 7 】。 1 2 2 纳米氧化锌的应用 由于纳米氧化锌( z n o ) 粒径介于1 1 0 0 n m 之间， 表现出许多特殊的性质， 如非迁移性、荧光性、压电性、吸收和散射紫外线能力等，利用其在光、电、磁、 敏感等方面的奇妙性能，可制造气体传感器、荧光体、变阻器、紫外线遮蔽材料、 图像记录材料、压电材料、压敏电阻、高效催化剂、磁性材料和塑料薄膜等【1 8 。2 5 1 ， 这些都是普通的氧化锌所无法比拟的。正是由于纳米氧化锌所具有的优异性和十 分诱人的应用前景，因此研发纳米氧化锌已成为许多科技人员关注的焦点。 1 2 2 1 光催化剂 水中的有害有机物质，用目前的水处理技术充分去除比较困难，往往可以检 测出比较微量的残留物质，如有机氯化物、农药、界面活性剂、色素等。近年， 广泛进行了把这些物质用光催化剂分解处理的尝实，活跃地开展了被称为 a d v a n d e do x i d a t i o nt e c h n o l o g i e s ”的研究，已经召开了几届有关这方面的国际会 议。其中重要的光催化剂为纳米z n o 材料等。氧化锌作为光催化剂可以使有机 物分解【2 9 1 ，研究表明，纳米z n o 粒子的反应速度是普通氧化锌粒子的1 0 1 0 0 0 倍，而且与普通粒子相比，它几乎不引起光的散射，且具有大的表面积和宽的能 带，因此被认为是极具应用前景的高活性光催化剂之一【l6 1 。 1 2 2 2 化妆品行业 第一章前言 为了抵御过量紫外线照射对人体皮肤的伤害，人们开发了防晒剂来保护皮肤， 原有的有机防晒剂活性较高，对皮肤产生刺激，于是就产生了以氧化锌为代表的 无机防晒剂。氧化锌对紫外线u v a 和u v b 均有良好的防护效果1 2 引，并且在日 用化妆品中添加纳米级z n o 有很好的护肤美容作用【2 9 1 ，因此纳米氧化锌在化妆 品领域的应用得到了迅速的发展目前日本现已开发出了化妆品用树脂包覆薄片 状的z n o 紫外线屏蔽剂、树脂包覆单分散2 0 n m 的超细z n o 紫外线屏蔽剂等，该 产品要求有较好的分散性，目前大多采用表面包覆有机膜的方法解决【2 引。 1 2 2 3 杀菌剂 纳米氧化锌可用于医药行业消毒、杀菌、除臭。纳米氧化锌无毒、无味，对 皮肤无刺激性，是皮肤的外用药物，能起消炎、防皱和保护等功能。纳米氧化锌 在阳光尤其是紫外线照射下，于水和空气中能自行分解出自由移动的带负电荷的 电子，同时留下带正电荷的空穴，这种空穴可以激活空气中的氧，活性氧有极强 的化学活性，能与大多数有机物发生反应，包括细菌内的有机物，从而把大多数 的病菌和病毒杀死【2 9 】。纳米氧化锌的定量杀菌实验表明【3 0 】，在5 分钟内当纳米 氧化锌的质量分数为1 时，对金黄色葡萄球菌的杀菌率为9 8 8 对大肠杆菌的 杀菌率为9 9 9 3 。 1 2 2 4 饲料添加剂 纳米氧化锌作为一种纳米材料，具有高效的生物学活性、吸收率高、抗氧化 能力强、安全稳定等特性，是目前最理想的锌源。在饲料中用纳米氧化锌替代高 锌，既可以解决动物体对锌的需求量，也减少了对环境的污染。并且纳米氧化锌 具有极强的化学活性，能与多种有机物发生氧化反应( 包括细菌内的有机物) ， 从而把大部分细菌、病毒杀死。在乳仔猪饲料中使用纳米氧化锌既可补充微量元 素，又可起到替代抗生素等药物的作用，不致产生耐药性和药物残留。同时，纳 米氧化锌还可强烈吸附胃肠道中霉菌毒素和肠道病原菌产生的毒素，使乳仔猪免 受毒害、控制肠道疾病的发生【3 。 1 2 2 5 陶瓷行业 纳米氧化锌又可以应用于陶瓷制造行业，因为纳米氧化锌可不经磨碎直接使 用，并使陶瓷制品的烧结温度降( 氐4 0 0 6 0 0 ，烧成品光亮如镜，有很好的“成 像效应”，所以可减少工序，降低能耗，极大地提高产品的质量和产量。加有纳 米氧化锌的陶瓷制品具有抗菌除臭和分解有机物的自洁作用，经处理后的产品可 制浴缸、地板砖、墙壁、卫生间及桌石。 1 2 2 6 隐身技术雷达波吸收材料 雷达波吸收材料( 简称吸波材料) 系指能有效地吸收入射雷达波并使其散射 衰减的一类功能材料。吸波材料的研究在国防上具有重大的意义，这种“隐身材 料 的发展和应用，是提高武器系统生存和突防能力的有效手段。纳米微粉是一 4 第一章前言 种非常有发展前途的新型军用雷达波吸收剂。纳米氧化锌等金属氧化物由于质量 轻、厚度薄、吸波能力强等优点，而成为吸波材料研究的热点之一【3 2 l 。 1 3 纳米氧化锌的生物效应及安全性 纳米物质的生物活性依赖于其小尺寸效应和高比表面积【3 3 】。当物质的物理 尺寸下降到纳米级时，虽然没有发生化学反应，但是物质性质却发生了根本性的 改变，其电子能级由准连续变为离散能级，纳米粒子表面原子与总原子数之比随 粒径的变小而急剧增大并引起性质上的变化，键态严重失配，空间悬键多，出现 许多活性中心，并能自行分解出自由移动的电子，并产生带正电的空穴，具有极 强的电子得失能力和氧化还原性，与同组分的晶态或非晶态的物质相比，纳米材 料具有极高的表面能和扩散率，表现出很高的化学活性和催化活性，是从物理尺 寸大小的量变到理化特性的质变1 3 引。生物体内的许多反应都是氧化还原反应， 也涉及电子的得失和传递。因此，纳米氧化锌具备一般氧化锌无法比拟的性能， 有极强的化学活性，能与多种有机物发生氧化反应( 包括细菌内的有机物) ，从 而把大部分病菌和病毒杀死。但另一方面，由于其极强的反应活性，纳米氧化锌 也可能破坏生物分子的结构，从而导致其功能损伤。 1 3 1 纳米氧化锌的营养作用 研究表明，饲料中添加纳米氧化锌，比一般氧化锌的药效大幅度提高，并具 有吸收率高、剂量小的特点，还可利用纳米氧化锌的强渗透性，避开胃肠吸收时 体液环境与药物反应引起的不良反应或造成的吸收不稳定，提高吸收率，3 0 0 4 0 0m g k g 纳米氧化锌可替代15 0 0 - - 一3 0 0 0 m g k g 普通氧化锌【3 6 1 。另外，王之盛等 p 7 j 研究显示，纳米氧化锌对仔猪生长的影响与其物理尺寸大小密切相关，物理 尺寸小于5 0 n m 的纳米氧化锌，在高锌和低锌水平下均能显著提高仔猪生长。并 分析纳米氧化锌的吸收可能包括一下几种方式： ( 1 ) 直接被吞噬1 3 8 ：s z e n t k u t i 3 9 j 观察到纳米尺寸的乳胶粒子粒径越小越能 快速到达结肠内吞细胞，1 4 n m 的粒子能在2 分钟内渗透通过，4 1 5 n m 的粒子需 要3 0 分钟，1 0 0 0 n m 的粒子不能通过粘膜屏障。o b e r d 6 r s t e r l 4 0 】纳米粒子可被嗅觉 神经传输，认为纳米粒子可通过积极扩散和细胞吞噬穿越血脑屏障，b e h r e n s 4 l 】 用小肠细胞培养和鼠体内实验研究认为聚苯乙烯纳米粒子的吸收可能是非吸附 的内吞作用。 ( 2 ) 细胞膜的微孔、通道及受体对锌的转运没有较高的选择性 4 2 , 4 3 】，纳米氧 化锌利用表面互作与表面活性通过扩散、渗透途径提高纳米氧化锌的吸收效率。 纳米粒子在肠道传输的动力学依赖于在粘膜的扩散、亲合性。纳米粒子由于具有 小尺寸效应和高表面活性使其易于粘附于肠壁上，增加与肠壁的接触面积和接触 时间，同时造成在胃肠道上皮细胞内外纳米物质的浓度差有利于渗透扩散进入循 环系统【4 4 , 4 5 l 。肺部细胞和肺泡的研究也表明：纳米粒子可以从细胞间隙扩散渗透 第一章前言 进入循环系统【4 6 l ，甚至渗透进入细胞核1 47 1 ，其表面张力和表面化学影响纳米粒 子渗透扩散的效果1 4 引。 ( 3 ) 通过离子通道途径吸收。离子通道是金属离子被吸收的常规途径，离 子化的金属粒子通过此离子通道吸收途径进入循环系统，带电荷的纳米药物通过 离子通道进入血液循环，纳米粒子由于粒径很小和自身表面电位空穴效应，它可 通过离子通道吸收。 ( 4 ) 胶体化作用提高纳米氧化锌的吸收效率，许多胶体粒子的大小在纳米 级，纳米粒子具有很强的吸附性和电荷效应，容易在消化道内形成胶体化。对胶 体微乳液( 小于1 0 0 n m ) 的研究表明：它与普通乳液有着本质的区别，它为热力 学和动力学稳定的胶体分散体系，而乳液只是动力学稳定体系，微乳液的表面结 构特征及其水相和油相特性不同于普通乳液，提高了纳米物质的吸收效率。纳米 氧化锌在消化道中通过胶体化作用可形成胶体粒子，可改变其亲脂特性和电荷效 应，使其更有利于被吸收。 ( 5 ) 通过肠道免疫系统吸收途径。纳米粒子能高效被肠道派伊尔集结吸收 4 9 , 5 0 】。d e s a i 等【5 1 1 发现被派伊尔氏淋巴结集所捕获的1 0 0 n m 粒子的数量明显高于 其它大粒径的粒子( 约为1 0 - 2 5 0 倍) 。其他学者的研究也表明纳米粒子可以比常 规大尺寸粒子以更高的效率通过派伊尔集结和其它肠系淋巴组织进入血液循环。 因此纳米氧化锌的吸收途径可能包括直接渗透或扩散吸收，被吞噬进入细胞，被 肠道上皮细胞摄取至细胞内，经免疫系统摄取吸收等多种方式和途径，从而显著 提高了纳米氧化锌的吸收效率。 纳米氧化锌通过含锌酶、核酸、金属硫蛋白、激素等方式途径发挥其营养生 理作用，纳米氧化锌吸收后在组织或细胞中的转运沉积依赖于其生物活性和组织 兼容性。吸收后的纳米氧化锌通过淋巴和血液进入循环系统，进入各种组织器官， 显著提高了组织器官中的锌含量，具有极显著的剂量效应关系，肝、肾、十二指 肠是纳米氧化锌沉积的主要部位p7 。 1 3 2 纳米氧化锌的毒性效应 随着纳米材料的毒性效应研究的深入，发现大量的纳米材料都表现出不同程 度的毒性作用，如纳米二氧化钛、碳纳米管、纳米二氧化硅等。关于纳米氧化锌 效应的研究相对少些，但目前的研究已经发现纳米氧化锌可对小鼠的脏器造成损 伤，能引起血栓，并能导致细胞坏死等。 在许多不同的职业环境中，工人每天暴露于多种吸入的毒物。很多个体可能 被暴露于焊接过程产生的氧化锌尘雾1 5 。吸入暴露氧化锌显示对人类产生大量 负面健康影响，包括金属烟雾病( m f f ) 1 5 2 j ，其主要特征是肺部炎症、寒冷、 发烧、不舒服和肌痛。在实验室动物和人身上显示，导致负面的肺部反应，包括 多形核白细胞( p m n s ) 的炎症细胞的流入，以及呼吸困难1 5 引。频繁和重复暴露 与吸入毒物的结果是，个体可能发展为暴露忍耐或表现出症状降低，忍耐被定义 为重复暴露后抵抗毒物副作用的能力。忍耐对人类健康风险的意义非常大，根据 6 第一章前言 有害健康作用的发展，忍耐有优点和缺点。d r i n k e r 和助手是第一个报道重复暴 露氧化锌的肺部忍耐的发生【5 4 l 。在一个锌铸造工人的金属烟雾病调查中【5 5 1 ，重 复暴露氧化锌产生的忍耐能潜在的解释被观察的病理中没有出现m f f ，但目前 很少确切知道吸入毒物忍耐的分子机制。已有用氧化锌作模式实剂，研究其发病 机理和肺部忍耐的潜在机制。早期的实验表明暴露2 5 m g m 3 氧化锌3 h 后，大鼠 肺部金属硫因( m t ) 基因的表达比对照组高8 倍，暴露1 0 m g m 3 氧化锌后提高 3 5 倍【5 6 j ，细胞因子和肾上腺皮质激素也显示诱导m t 蛋白合成 5 7 , 5 8 】。m t 可能 是维持必要金属如锌的生理水平的部分因素，在清除吸入金属烟尘导致的多余金 属中也其重要作用。因而，m t 可能在吸入有毒金属的忍耐产生中起重要作用。 氧化锌暴露忍耐发生可能是通过锌限制m t 基因的感应，m t 是低分子蛋白，与 金属有很强的结合力，锌暴露引起m t 基因感应是大多数动物和人类组织共同的 细胞反应，已被认可的是m t 蛋白通过扣押机制和自由基请粗来保护细胞免受金 属毒性。s c o t tc 等【5 圳的进一步用n i h s w i s s 小鼠重复暴露于1 0 m g m 3z n o 气溶 胶( 平均动力学直径3 0 0 n m ) 1 、3 或5 天，测定肺部灌洗液中多形核白细胞( p m n ) 和蛋白水平，结果发现小鼠经单次和重复暴露后，肺部均观察到m t 感应，推测 m t 在肺部忍耐的分子机制中可能起重要作用。另外，s c o t tc 等1 6 0 j 的研究还发现 遗传背景对小鼠吸入氧化锌产生的肺部忍耐中也起重要作用。在健康成人暴露超 细和细颗粒氧化的比较研究中发现，在休息状态下经1 2 1 暴露于5 0 0 9 9 m 3 氧化锌 颗粒2 h 没有引起急性系统性反应【6 。 w a n gb i n g 等1 6 2 l 通过一次性经1 ：3 注射染毒研究2 0 n m 和12 0 n m 氧化锌颗粒对 小鼠的急性毒性，其染毒剂量分别为l 、2 、3 、4 、5 9 k gb t ，结果发现2 0 n m 和 1 2 0 n m 经口处理的靶器官是肝、心、脾、胰腺和骨；并且2 0 n m 和1 2 0 n m 氧化锌 颗粒的毒性作用有差异，低中剂量的2 0 n m 氧化锌和高剂量的1 2 0 n m 氧化锌引起 血粘性；在所有2 0 n m 处理组均出现肝细胞水肿和恶化、胰腺炎症，并且随剂量 升高，肝、脾和胰腺损伤减弱，其原因可能是由于高剂量2 0 n m 氧化锌在体内更 容易团聚；但在1 2 0 n m 处理组，胃、肝、心、脾和胰腺病理损伤随剂量升高而 恶化，因此，应更多的关注低剂量2 0 n m 氧化锌经口暴露的潜在毒性。 另外，纳米氧化锌广泛被用于化妆品中，关于纳米氧化锌通过皮肤对机体产 生的毒性效应目前还没有完全确定。大量的体内和体外研究显示纳米氧化锌颗粒 几乎不能渗透皮肤1 6 3 ，州，但由于实验暴露的时间相对较短，如长期低剂量暴露， 是否会产生负面效应还不确定。 关于纳米氧化锌对细胞的毒性研究目前还较少。c h r i s t i em 等【6 5 】通过体外培 养研究纳米和微米氧化锌及晶体和无定形二氧化硅对肺部巨噬细胞和上皮细胞 的毒性发现，暴露纳米和微米氧化锌4 或2 4 h 比晶体和无定形二氧化硅有更强的细 胞毒性。g o j o v a , a 掣6 6 】研究了不同浓度( o 0 0 1 5 0 i t g r n l ) 的金属氧化物纳米颗 粒( f e 2 0 3 、y 2 0 3 和z n o ) 对人主动脉内皮细胞的毒性效应，发现三种纳米颗粒 都被内在化进入细胞，并进入细胞内小泡，但f e 2 0 3 纳米颗粒在任何浓度下都没 有引起炎症反应，但y 2 0 3 和z n o 纳米颗粒在浓度为1 0 9 9 m l 以上时引起显著的炎 7 第一章前言 症反应。在最高浓度时，z n o 纳米颗粒有细胞毒性，并导致相当多的细胞死亡。 但关于z n o 纳米颗粒导致细胞死亡的机理上不清楚，需要进一步研究。 1 3 3 纳米氧化锌的生态安全性 水环境可能受来自消费品生产、运输、消费和处置过程中溢出的纳米材料污 染，废弃的m n m s 或污染事故也可能导致纳米材料泄漏进入水环境中1 2 2 2 3 1 。 o b e r d 6 r s t e r s l 首次报道t o 5m g l 的富勒烯水悬浮液( n c 6 0 t h f ，采用t h f 作助 溶剂) 暴露4 8h 后能使大嘴黑鲈( l a r g e m o u t hb a s s ，m i c r o p t e l u ss a l m o i d e s ) 幼鱼脑组 织产生严重的脂质过氧化。随后关于纳米材料对水生生态系统的安全性的研究陆 续展开。有关金属或金属氧化物纳米材料的生态毒理学研究的报道较少，a d a m s 等人【67 j 首次报道了3 种光敏性纳米颗粒( t i 0 2 ，s i 0 2 和z n o ) 水悬浮液对枯草杆菌 ( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 和大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 的生态毒性。发现，s i 0 2 、t i 0 2 至i j z n o 水悬浮液具有不同的毒性，z n o 水悬浮液的毒性最强。h e i n l a a nm 掣6 8 j 研 究z n o 、c u o 和t i 0 2 对细菌( v i b r i o f i s c h e r i ) 和甲壳类大型蚤( d a p h n i am a g n a ) 毒性，发现三种金属氧化纳米颗粒对甲壳类毒性趋势为：t i o ： a 1 2 0 3 。由目前的研究可见，纳米氧化锌对水生生物有较大的毒性。但不同粒径 的纳米氧化锌的毒性可能存在较大的差异，需进一步进行系统性研究。 1 4 课题研究内容、目的和意义 由于纳米材料的特殊性质，表现出与常规物质不同的毒性作用，而且目前的 研究已经证明了不同的纳米材料导致不同的毒性效应。然而，关于纳米氧化锌对 生物体和环境的毒性效应的研究还不充分，如通过支气管染毒研究纳米氧化锌对 小鼠各器官的损伤及在体内的分布目前少见报道。因此，本研究为进一步认识纳 米氧化锌对生物体的毒性作用和对对水生生物的安全性提供实验依据。具体内容 分为以下两部分： ( 1 ) 以昆明属雄性小鼠为实验动物，采用非暴露式支气管注射法暴露于不 同粒径和剂量的纳米氧化锌，按照o e c d 4 2 0 的实验要求，研究纳米氧化锌对小 鼠的急性毒性，以及其在小鼠体内的蓄积情况。 ( 2 ) 以大型蚤为模式生物，研究不同粒径的纳米氧化锌对水生生物的的急 性毒性，初步评价其安全性。 8 第二章纳米氧化锌对小鼠的急性毒性效应研究 第二章纳米氧化锌对小鼠的急性毒性效应研究 纳米氧化锌是目前在生产工艺和检测方法最为成熟的纳米材料之一，也是商 业化应用最早的纳米材料之一。目前应用方面的研究主要集中于化妆品，服装、 食品保鲜等高附加值行业，从化妆品应用的安全性评估结果表明纳米氧化锌是安 全的。但由于纳米科技发展时间短，许多研究尚处于实验研究阶段，因此纳米氧 化锌与其它纳米产品一样其应用理论研究滞后于生产应用，缺乏在对生物体健康 效应的研究和对生态环境效应影响的研究。随着纳米材料的广泛应用，其进入环 境和人体的可能性也日益增加，纳米材料的生物安全性越来越受到人们的关注。 因此，研究纳米氧化锌的毒理学效应就显得尤为重要。 本文以不同粒径纳米氧化锌为研究对象，采用非暴露式支气管注射一次性染 毒，研究不同粒径的纳米氧化锌材料对小鼠的急性毒性效应及其在体内的分布情 况，以期为进一步探讨纳米氧化锌材料的毒性提供基础数据。 2 1 材料与方法 2 1 1 材料来源及粉体悬液制备 纳米氧化锌颗粒粒径分别为1 0 - a ：l n m 、2 0 - a ：5 n m 和9 0 - a ：1 0 n m ，其晶型为六角纤 维结构，质量分数 9 9 9 ，纳米氧化锌颗粒购自北京纳辰科技发展有限责任公 司。实验时将三种颗粒配成不同浓度的生理盐水悬浮液，于高温下灭菌。注射前 用超声波分散3 0 m i n 。 2 1 2 主要仪器 i c p a e s ：v a r i a n ，美国； 手提式不锈钢蒸汽消毒锅：y x 2 8 0 b ，上海智城分析仪器制造有限公司； 漩涡振荡器：m s l ，广州仪科实验室技术有限公司； 电子天平：y p l 0 2 n ，广州仪科实验室技术有限公司 电子分析天平：a l l 0 4 ，梅特勒托利多集团； 高速台式离心机：t g l 1 6 c ，上海安亭科学仪器厂； 冷藏陈列柜：b d 6 2 ，青岛海尔冷柜总公司； 海尔冰柜：l c 2 0 0 ，江苏阪神电器股份有限公司； 可见分光光度计：v i s 7 2 2 0 ，上海瑞利分析仪器公司； 恒温水浴锅：x m t b ，余姚市东方电工仪器厂： 电热鼓风干燥箱：d g x 9 1 4 3 b 2 ，上海福玛实验仪器有限公司； 低温冷冻离心机：3 k 3 0 型，德国s i g m a 公司。 9 第二章纳米氧化锌对小鼠的急性毒性效应研究 2 1 3 实验动物 。 实验选用健康的雄性k m 小鼠为模式生物，体 1 8 - 2 2g ，购自中国医学研究 院放射医学研究所实验动物中心。在聚乙烯塑料笼中饲养，用小鼠全价颗粒饲料 和蒸馏水喂养，自由进食与饮水，室温保持在2 0 - a ：2 ，相对湿度6 0 d ：1 0 。染毒 前饲养5 天以适应环境。实验前2 4 h 停止喂食。 2 1 4 染毒方法与剂量 实验小鼠被自由分成7 组，每组1 2 只。三种粒径( 1 0 - 士l n m 、2 5 a ：5 n m 和9 0 + 1 0 n m ) 分别设两个然毒剂量( 0 0 5 9 k gb w 、o 5 9 k gb w ) ，共6 个处理组，同时用生理盐 水做对照组。染毒前禁食2 4 h ，具体染毒步骤如下： ( 1 ) 乙醚麻醉小鼠至四肢松弛，咽反应消失； ( 2 ) 用手的拇指和食指抓住小白鼠的颈背部，使小鼠躺在掌中，腹部朝上， 然后以无名指和小指夹住鼠尾； ( 3 ) 将磨掉尖部的1 2 号穿刺针轻轻插入气管，在插入时针头略向上插，当 遇有隔膜阻力时，先将针向下再向上挑，握针的手即z 日匕l - , 感觉触到气管环状软骨， 此时能看到小鼠眼睛突出，听到呼吸音增粗，说明插入成功； ( 4 ) 将己套上注射器的5 号穿刺针轻轻插入到1 2 号穿刺针内，慢慢注入一定 体积的灌注液，最后将两根穿刺针同时取出； ( 5 ) 将小鼠身体直立，晃动几下，轻轻放下，小鼠常伴有呛咳反应，有时 会有气泡从鼻腔冒出，说明注射成功。 染毒后两小时喂食和水。1 4 天后，小鼠用乙醚麻醉处死。 2 1 5 测定指标及方法 2 1 5 1 体重和脏器系数测定 ( 1 ) 体重 分别在染毒之前、染毒后2 d ，7 d ，1 4 d 分别用同一电子天平称重； ( 2 ) 组织重量 无菌生理盐水冲洗组织表面血迹后用无菌滤纸将表面水份吸干，置于电子天 平上称重； ( 3 ) 组织系数 组织系数= ( 小鼠组织重d 鼠体重) 1 0 0 0 2 1 5 2 血清生化指标的测定 小鼠处死后，立即经眼静脉采集血样，用低温离心机在3 5 0 0 r p m 时离心 1 0 r a i n ，分离血清。测定血清生化指标：总蛋白( t o t a lp r o t e i n ，t p ) 、白蛋白( a l b u m i n p r o t e i n ，a l b ) 、碱性磷酸酶( a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，a l p ) 、乳酸脱氢酶( l a c t a t e 1 0 第二章纳米氧化锌对小鼠的急性毒性效应研究 d e h y d r o g e n a s e ，l d h ) 、血尿氮( b u n ) 、肌酐( c r e a t i n i n e ，c r ) 、超氧化物歧化 酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 、谷胱甘肽过氧化物酶( g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e ， g s h p x ) 。实剂盒均购自南京建成生物有限公司，实验操作按照实剂盒要求进行。 各血清生化指标测定原理如下： t p ( 考马斯亮兰比色法) 测定原理：蛋白质分子具有- n h 3 + 基团，当棕红色 的考马斯亮兰显色剂加入蛋白标准液或样品中时，考马斯亮兰染料上的阴离子与 蛋白n h 3 + 结合，使溶液变为蓝色，通过测定吸光度可计算出蛋白含量。 a l b 含量的测定( 溴甲酚绿比色法) 原理：白蛋白具有与阴离子染料结合 的特性，在p h 4 0 左右，溴甲酚绿与白蛋白结合后，由黄色变成绿色，绿色的深浅 与白蛋白浓度成正比。 a l p 测定原理：酸性磷酸酶分解磷酸苯二钠，产生游离酚和磷酸，酚在碱 性溶液中与4 氨基安替吡啉作用经氰化钾氧化生成红色醌衍生物，根据红色深浅 可以测定酶活力的高低。 l d h 测定原理：l d h 能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸与2 ，4 二硝基苯肼 反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色，通过比色可求出酶活力。 b u n 测定原理：在加热和强酸条件下，尿素氮与二乙酰缩合成红色的联吖 嗪称之f e a r o n 反应。根据色泽的深浅可以计算出尿素氮的含量。 c r 测定原理：血浆( 血清) 除蛋白的上清液中的肌酐与苦味酸产生j a 毹 反应，生成桔红色的加成物。 s o d 活性的测定原理为：通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生0 2 。， 后者能氧化羟胺生成亚硝酸盐，在显色剂的作用下得到稳定的粉红色偶氮染料， 用可见分光光度计测其吸光度。如样品中含有s o d 时，s o d 能清除o 玉，使形 成的亚硝酸盐减少。因此，可通过比色测定对照和样品的吸光度值，再经公式计 算即可求出被测样品中的s o d 活力。s o d 酶活力单位定义为：每毫克组织蛋 白在l m l 反应液中s o d 抑制率达5 0 时所对应的s o d 量为一个酶活力单 位( u ) 。 g s h p x 测定原理：g s h p x 可以促进氧化氢( h 2 0 2 ) 和还原型谷胱甘肽 ( g s h ) 反应生成水及氧化型谷胱甘肽( g s s g ) ，谷胱甘肽过氧化物酶的活力可 用其酶促反应的速度来表示，测定此酶促反应中还原型谷胱甘肽的消耗，则可求 出酶的活力。 t t 2 0 2 + 2 g s h - - - 92 h 2 0 + g s s g ( 2 1 ) g s h p x 的活力以催化g s h 的反应速度来表示，由于这两个底物在没有酶 的条件下，也能进行氧化还原反应( 称非酶促反应) ，所以最后计算此酶活力时 必须扣除非酶促反应引起的g s h 减少的部分。 g s h 量的测定：g s h 和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5 硫代二硝基甲苯酸 阴离子呈现较稳定的黄色，在4 1 2a m 处测其吸光度即可计算出g s h 的量。 2 1 5 3 组织中锌含量的测定 第二章纳米氧化锌对小鼠的急性毒性敬应研究 每组随机取三只小鼠，解剖取肺、脾、肾、胰腺和腿骨，并称重。加 3 m l 分析纯硝酸放置过夜，再加入l m l h