（海洋生物学专业论文）中国沿海蛾螺科5属10种的系统学分析.pdf

中国沿海蛾螺科5 属1 0 种的系统学分析 摘要 蛾螺科属于软体动物门( m o l l u s c a ) ，腹足纲( g a s t r o p o d a ) ，在全世界 有数百种。目前已报道在我国分布的蛾螺科种类有1 3 个属，约3 1 个种，但 其系统学和一些种类的分类地位仍存在较大的争议。本研究利用核糖体小亚 基1 8 sr r n a 基因、核糖体大亚基2 8 sr r n a 基因及线粒体c o i 基因的部分序 列对我国辽宁、山东、福建沿海蛾螺科内5 个属l o 个种的系统发生进行了分 析。通过p c r 分别获得了大约1 8 0 0 b p 、1 4 0 0 b p 和7 0 0 b p 的片段，测序之后， 通过遗传分析软件对序列进行了比对分析，利用n e i g h b o r j o i n i n g ( n j ) 法、 m i n i m u me v o l u t i o n ( m e ) 法和m a x i m u mp a r s i m o n y ( m p ) 法建立了系统树。结 果显示，所研究的蛾螺科5 属1 0 种可以被分为5 个亚群：第一大分支为香螺 亚群，包括n e p t u n e a 属的香螺、新英格兰蛾螺、n e p t u n e ae u l i m a t ad a l l 、 和一个未知种以及s i p h o n a l i a 属的略胀管蛾螺；第二个分支为侧平肩螺亚群； 第三个分支为水泡蛾螺和黄海蛾螺亚群；第四个分支为褐管蛾螺亚群；第五 个分支为方斑东风螺亚群。由系统学分析可知，香螺是蛾螺科中较为进化的 种；未知种为香螺属内的种；略胀管蛾螺与n e p t u n e a 属的种类亲缘关系较近， 建议将略胀管蛾螺归为n e p t u n e a 属。 关键词：蛾螺科，系统学，1 8 sr r n a ，2 8 sr r n a ，0 0i 中国沿海蛾螺科5 属1 0 种的系统学分析 a b s t r a c t b u c c i n i d a eb e l o n g st op h y l u mm o l l u s c a ，c l a s sg a s t r o p o d a ，t h e r ea r eh u n d r e d so f b u c c i n i d a es p e i c e sd i s t r i b u t i n ga l lo v e rt h ew o r l d t h e r ea r em o r et h a n3 1s p e c i e s i n1 3g e n u so fb u c c i n i d a ed i s t r i b u t i n ga l o n gt h ec h i n e s ec o a s t ，b u ti t i sl e s s k n o w no nt h e i rt a x o n o m i cs t a t u sa n dp h y l o g e n e t i c s p h y l o g e n e t i ca n a l y s i sw a s c a r r i e do u tb yu s i n gp a r t i a ls e g m e n to fs m a l lr i b o s o m es u b u n i t ( 18 sr r n a ) g e n e ， l a r g er i b o s o m es u b u n i t ( 2 8 sr r n a ) g e n ea n dm i t o c h o n d r i o nc o lg e n e ，t o e l u c i d a t et h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p sa m o n gt e ns p e c i e si n f i v e g e n u so f b u c c i n i d a ef r o mt h el i a o n i n g ，s h a n d o n ga n df u j i a nc o a s t a p p r o x i m a t e l y18 0 0 b p ， 14 0 0 b pa n d7 0 0 b pf r a g m e n t sw e r eo b t a i n e db yp e r a f t e rs e q u e n c e d ，t h e s e q u e n c ev a r i a t i o n sw e r ea n a l y z e da n dt h ep h y l o g e n e t i ct r e e sw e r ec o n s t r u c t e db y n e i g h b o r - j o i n i n g ( n j ) ，m i n i m u me v o l u t i o n ( m e ) a n dm a x i m u mp a r s i m o n y ( m p ) m e t h o d s t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h e yc o u l db ed i v i d e di n t of i v eg r o u p s ：t h e f i r s tb r a n c hw a sn e p t u n e ag r o u p ，c o n t a i n e dn e p t u n e ac u m i n g ic r o s s e ，n e p t u n e a l y r a t ad e c e m c o s t a t as a y , n e p t u n e ae u l i m a t ad a i l ，s i p h o n a l i as u b d i l a t a t ay e na n d a nu n c e r t a i ns p e c i e s ；t h es e c o n db r a n c hw a sj a p e l i o nl a t u sd a l l ；t h et h i r db r a n c h w a sb u c c i n u mp e m p h i g u md a l la n db u c c i n i u my o k o m a r u a ey a m a s h i t ae th a b e ； t h ef o u r t hb r a n c hw a ss i p h o n a l i as p a d i c e ar e e v e ；t h ef i f t hb r a n c hw a sb a b y l o n i a a r e o l a t al i n k t h a ts h o w sn e p t u n e ac u m i n g ic r o s s ei s t h eh i g h e s td e g r e eo f e v o l u t i o n a ls p e c i e si nb u c c i n i d a e t h eu n n a m e ds p e c i e si sb e l o n gt on e p t u n e a g e n u s s i p h o n a l i as u b d i l a t a t a y e nh a sc l o s er e l a t i o n s h i pw i t ht h es p e c i e so f n e p t u n e ag e n u s s ow es u g g e s ti ts h o u l db e l o n gt on e p t u n e ag e n u s k e yw o r d s ：b u c c i n i d a e ，s y s t e m a t i c ，1 8 sr r n a ，2 8 sr r n a ，c o l 中国沿海蛾螺科5 属1 0 种的系统学分析 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。 论文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或 发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均 已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名： 瓠产 f i 飘：瑚8l 孓曙 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 及学校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名： 芍髟# l 5 9 指导教师签名：以炙嘭卜 只期：矽谚f ，彦 中国沿海蛾螺科5 属1 0 种的系统学分析 1 前言 1 1 腹足纲动物的分类情况 腹足纲栖息于海洋、淡水以及陆地等各种环境中，约有十万种以上，约 占软体动物种类的8 0 ，是软体动物门最大的一个纲。从林奈、拉马克时代， 人们就已经开始对腹足纲的分类进行了研究，大多数现代软体动物学家都继 承了m i n e - e d w a r d s ( 1 8 4 8 ) n 1 的理论，m i n e - e d w a r d s 依据呼吸器官的特征， 将腹足纲分为前鳃亚纲( p r o s o b r a n c h i a ) 、后鳃亚纲( o p i s t h o b r a n c h i a ) 和 肺螺亚纲( p u l m o n a t a ) 。其中前鳃亚纲是腹足纲中最大的亚纲，分三个目； 后鳃亚纲分为八个目，肺螺亚纲分为两个目。而s p e n g e l ( 1 8 8 1 ) 乜1 依据神经 系统的特征将腹足纲划为扭神经类( s t r e p t o n e u r a ) 和直神经类 ( e u t h y n e u r a ) ，扭神经类对应前鳃亚纲，直神经类包括后鳃亚纲和肺螺亚纲。 这两种分类方法具有很大的争议口1 ，尤其是在形态学分类中争议更大。在种 和属水平上，腹足纲的分类也显得非常混乱，比如许多腹足纲有些种同时拥 有几个名字，一些物种甚至还有几百个同物异名，给腹足纲系统学的研究造成 很大的麻烦。 1 2 腹足纲系统学研究概况 1 2 1 形态学研究 形态学标记是与目标性状紧密连锁，表形上可识别的等位基因突变体。 1 9 世纪6 0 年代，孟德尔( g j m e n d e l ) 以豌豆为材料，利用外部形 态差异明显、容易识别的相对性状详细的研究了豌豆的遗传规律，提出了 “遗传因子( in h e r it e df a c t o r ) 的假说，并发现了著名的孟德尔遗传 定律，从而奠定了遗传学标记的基础，这也是m e n d e l 遗传学的重要基础。 目前，生物物种的形态学特征、杂交实验、生态地理分布特点以及生理性 状等特征仍然是进行生物分类的有力依据。在生物起源进化和系统学方面 的许多认识也都是基于上述生物特征研究得到的。但是，形态学标记具有 数量稀少、缺乏遗传基础、易受环境影响、经常需要借助杂交实验、检测 到的结果往往变异不明显等缺点，因而很难在全球范围内得到广泛的应用。 中国沿海蛾螺科5 属1 0 种的系统学分析 形态学标记的特点有以下几点：( 1 ) 形念标记数量少，不能随机代表生物 体遗传组成；( 2 ) 形态标记变异小，通常只有两种变异类型；( 3 ) 无法确定哪 些性状更为重要，更符合研究目的；( 4 ) 观测方便易行。 目前，已建立了许多作物的形态标记遗传图谱，如：水稻、棉花等，也 有利用形态学标记对作物进行聚类分析，如菜豆等啼3 。但是生物表型是遗传因 素与环境因素相互作用的结果，并不能完全或真实的反映生物的遗传变异， 得到的统计结果往往不够完善，也很难获得全球范围内广泛分布的生物遗传 多样性。 在林奈时代，对腹足纲动物的系统学研究主要依靠贝壳形状、刻纹、颜色 等。到了1 9 世纪晚期，腹足纲的比较解剖学和组织学的研究达到了高峰。随着 现代生物技术的不断发展，尤其是电子显微镜和超微切片技术的紧密结合，腹 足纲种类的比较解剖学研究进入了鼎盛时期。国内外的贝类学家们常应用不同 的研究方法对腹足纲动物的嗅检器、栉鳃、齿舌、排泄系统以及精子超微结构 等进行系统的比较研究，并且已经获得了很多新的数据阳刮。在前鳃亚纲中， 原始腹足目仅存在少数种类，绝大多数的种还是属于中腹足目，以及新腹足目。 原始腹足目以其所具有的双栉鳃，双心耳以及双。肾等原始的形态学特征口1 明显 区别于前鳃亚纲的其它类群。另外，在形态学研究中，由于新近腹足类和直神 经类所具有的共源性状，使离腹足类与一个单系发生的自螺亚纲的二大类群， 即柄眼目和基眼目形成平行支，构成单系群，使得后鳃亚纲的裸鳃目成为它们 的姐妹群，位于直神经类类群的基部。 近年来，齿舌作为软体动物重要的摄食器官，也被用来作为分类的重要特 征之一。齿舌的形状会因为摄食生态的不同而不同阳1 ，不同种类具有不同形式 的齿舌。巫文隆( 1 9 9 2 ) 们详细比较了台湾十八种新腹足目种类齿舌的细微构 造，还利用壳长与齿舌长的比值及齿舌的形态结构来讨论各科齿舌的发达程度 及类缘关系。吴小平等( 2 0 0 0 ) 1 对三种环棱螺贝壳的壳高、壳宽、壳口长、 壳口宽、体螺层高、倒数第2 螺层高和宽、后三螺层高8 个形念参数进行了分析， 并对其齿舌的形态作了比较。周峥桢等( 2 0 0 7 ) 2 1 采集了中国沿海不同区域的 方斑东风螺、泥东风螺标本，通过分析提出了一些利用齿舌鉴别东风螺属内各 种的方法。 中国沿海蛾螺科5 属1 0 种的系统学分析 1 2 2 细胞学研究 细胞学标记是指能明确反映遗传多态性的细胞学特征。生物学研究进入 细胞学水平后，染色体组型分析( 染色体多态性研究) 成为重要研究工具。 这种方法通过比较细胞分裂时期染色体的形态参数，如相对长度、着丝点指 数、臂比等将每条染色体按各自特征区分开，从而得到一定的染色体组型； 同时染色体显带技术可以利用差异染色，借助特殊处理，使染色体显示特定 的带纹以便进行更细致的染色体带型分析。根据带型和常规组型的分析指标 识别染色体的异同，这是细胞水平上分类的主要标准。染色体多态性对于生 物遗传多样性的认识是非常重要的。 以染色体数目讨论动物间的演化关系，已有不少报道。随着人们对多种 贝类染色体数目的了解，逐渐形成以染色体数目探讨分类系统的贝类细胞分 类学。稻叶明彦( 1 9 6 7 ) 副统计了腹足纲某些目的一些种类的染色体数并对 田螺科的染色体数作了分析，提出了染色体数越多种类越进化的观点，这表 明进化与染色体数的增加有关联性。王先志等( 1 9 9 0 ) 1 曾观察到香螺、水 泡蛾螺和p l i c i f u s u ss c i s s u r a t u s 的染色体数，其中香螺的染色体数6 0 是 较多的，仅从染色体数目看香螺可能较另两种进化，水泡蛾螺在三种中染色 体数最少，可能较为原始，这与形态分类相符，即螺类没有水管的为原始种 类，三种中只有水泡蛾螺无水管。 通过染色体数目的比较，显示贝类中染色体数的增加与进化相关。但也 有相反的观点，在整个动物类群中也不完全如此。王先志等还认为染色体数 相近的种类，或染色体数较少的种类可能较为进化，也就是说染色体减少也 可能形成新种，即由染色体结构变异或减数分裂不正常造成1 。 由此我们可以看出，腹足纲染色体的数目与进化有关。染色体数目及核 型可做为分类的一种手段，与外部形态和内部结构结合起来，参考化学分类等 方法，能够较确切地探讨各类群种问的分类地位及演化关系。特别是对形态 结构相近，在分类上又有争议的种，参考其核型及分带技术的应用，或将有 助于争议的解决。 细胞学标记克服了形态标记易受环境影响的特点，但是对于染色体数 目相等，形态相似的物种或类群，或同一居群的不同个体来说，单纯j j 染 3 中国并 海蛾螺科5 属l o 种的系统学分析 色体的多态性来研究遗传多样性是不够的。而且，染色体的研究经常需要 耗费大量的人力和物力。同时，有些物种对染色体变异的耐受性较差，增 加了获得相应标记材料的难度。这些都在一定程度上制约了细胞学标记在 遗传标记方面的应用。 1 2 3 分子标记研究 由于分子生物学的不断发展，遗传标记发展成为核酸分子水平的等位基 因变异。它们广泛存在于高等生物d n a 编码区及非编码区，因此被称为d n a 分子标记n 引。与前两种标记不同，分子标记是d n a 水平上遗传变异的直接反 应。近1 0 年来，分子标记的研究和应用飞速发展，一系列分子标记系统相 继形成。与其它遗传标记相比，分子标记具有下列优越性：( 1 ) 直接以d n a 形 式表现，不受发育时期、季节、环境限制；( 2 ) 数量多，遍及整个基因组；( 3 ) 多态性高，自然界存在许多等位变异：( 4 ) 样品需求量少；( 5 ) 很多分子标记 表现为共显性，能鉴别出纯合和杂合基因型，能提供完整的遗传信息副。 d n a 分子标记是基于研究d n a 分子由于缺失、插入、易位、倒位、重 排或由于存在长短与排列不一的重复序列等机制而产生的多态性。与前2 种标记( 形态学标记、细胞学标记) 不同，d n a 分子标记是d n a 水平上遗 传变异的直接反映。近年来，分子标记的内容逐渐丰富，涉及的范围也越 来越广泛，应用的领域也逐渐加深，已经有越来越多的标记应用于遗传连 锁作图、数量性状遗传等。 近年来，随着分子生物学技术的进一步发展，新的系统分类分析方法的 应用，尤其是分子系统学理论和技术的不断深入，使得腹足纲的系统发生和 分类学研究取得了很大进步n ”。d n a 测序技术的发展将软体动物分子系统学 研究带到了一个新的高度。在腹足纲系统学分析中，应用d n a 序列进行系统 发育分析的研究还较少，用于分析的d n a 片段大部分都是线粒体d n a 片段或者 核糖体大小亚基片段。分子生物学研究手段的应用表明了这些基因片段在种、 属、科乃至目的系统分类应用是有效的。w i n n e p e n n i n c k x ，e ta l ( 1 9 9 8 ) ， t h o l l e s s o n ，e ta l ( 1 9 9 9 ) ，d a y r a t 。e ta l ( 2 0 0 1 ) n p 圳基于核糖体基因以及 线粒体基冈进行的系统学研究衷明了原始腹足目比其它腹足纲动物原始。这 个结果也与b r u s c a 1 的比较形态学的研究结果相符。近几年，豳内外学者纷 4 中国沿海蛾螺科5 属1 0 种的系统学分析 纷利用分子标记技术深入研究了腹足纲内属、科、目级的种类问的系统学发 生关系。 1 2 4 分子系统学研究在分类学和进化研究中的局限性与分歧 分子系统学是研究腹足纲系统进化的很好方法，然而，分子系统学的方 法还没有达到成熟，在某些方面还存在较大的缺陷。腹足类较长的进化历史、 快速辐射演化、趋同进化、趋异进化等因素使腹足纲的系统分类学仍然具有 很大的争议。首先，由于多数分子数据或者因为分类群数目少乜1 1 或者因为研 究的基因不同导致结果不同。例如，1 8 sr r n a 序列数据显示腹足纲为单系群， 但却得不到2 8 sr r n a 序列数据的支持心引。其次，腹足纲动物各谱系进化速率 的不同也能导致分析结果的不稳定。例如，软体动物1 8 sr r n a 基因研究腹足 纲是单系还是多系发生以及腹足纲各亚纲的关系还需要进行综合分析、比对。 到目i j 为止，国内外的大多数研究者主要局限于利用分子数据构建局部的分 子系统树，基于序列分析的地理起源与系统发生关系方面还存在许多疑问。 w i n n e p e n n i n c k x 等( 1 9 9 8 ) n 胡基于核糖体1 8 sr r n a 以及t h o l l e s s o n ( 1 9 9 9 ) n 引基于线粒体基因1 6 sr r n a 都认为原始腹足目为并系群。但由于他们在研究 中的两种构树方法所得到的结果存在分歧，原始腹足目单系发生与否未能给 出明确结论。另外，分子系统学方法得到的结果与传统的分类方法也有所差 异。例如王莹等( 2 0 0 7 ) 乜3 1 在分析宝贝科主要类群的系统发生关系中发现疹 贝属在系统树中的位置特殊。原本属于鼻贝亚科的疹贝却位于鼻贝亚科这一 类群之外，而处于除龟甲贝和林希那贝外的卵宝贝亚科和宝贝亚科构成的聚 类簇内，将其归于宝贝亚科。 1 3 展望 综上所述，国内外的软体动物分类学工作者已经对腹足纲的系统学做了多 方面的研究并取得了巨大的成果。其中形态学、细胞学方面的研究已经比较成 熟，但分子系统学方面的研究还较少，采用的分子标记还比较局限，还需要将 更多的分子标记及分子系统学方法应用到腹足纲的研究中。此外，由于腹足纲 种类生活环境特殊，目前绝大部分种类尚未实现人工培养，分析研究中取材较 困难，存在材料匮乏的问题。今后，应加强对腹足纲伴生物种和环境闪子方面 5 中国沿海蛾螺科5 属l o 种的系统学分析 的研究，以期在人工培养方面有所突破。随着基因组序列更深层次的研究，将 会使腹足纲的分子系统学研究进入一个崭新的平台。 海洋动物的起源、分类与系统进化关系，在整个生物界起源与进化的研究 中占据非常重要的地位，而分子系统学是高度综合分子生物学和遗传学等多门 学科，从分子水平上研究生物起源与系统进化关系的新学科，它在海洋动物中 的潜在作用已经得到了海洋研究者的关注。随着应用于分子系统学研究中的分 子遗传标记不断涌现，核糖体r n a 基因、线粒体基因等以其特殊的组成结构和 演化方式在分子系统学的研究中起着重要的作用，并已经广泛地应用于海洋动 物的分类、系统进化和遗传多样性等方面的研究中，而且在解决长期存在的分 类学及系统发生等问题的研究上取得了令人满意的结果。但从目前来看，尽管 核糖体r n a 基因在海洋动物分子系统学的研究中较为广泛，但多是以核糖体r n a 基因的一级结构为分子标记工具，而关于核糖体r n a 基因高级结构在海洋动物 的分子系统学研究中应用的报道甚少幢4 1 ，这势必使核糖体r n a 基因在用于海洋 动物的分子系统学研究过程中存在一定的局限性，这些问题的解决就要求研究 人员在利用核糖体r n a 基因对海洋动物作分子系统学研究时，应该对核糖体r n a 基因的各级结构作综合分析。 1 4 蛾螺科的概况 蛾螺科属于软体动物门( m o ll u s c a ) ，腹足纲( g a s t r o p o d a ) ，前鳃亚纲， 新腹足目，蛾螺超科( b u c c i n o i d e a ) ，在全世界有数百种，在寒带、温带、 热带的海区均有所分布，我国沿海也有蛾螺科种类的分布。目l j 在中国沿海 发现的蛾螺科种类有13 个属，3 1 个种( 表1 ) ，其中仅5 属1 0 余种为常见种。 蛾螺科大部分种类是肉食性的，多以软体动物和腐烂食物为食。蛾螺科的种 类具有重要的商业价值，如香螺、略胀管蛾螺，新英格兰蛾螺由于其个体较 大，肉质鲜美，可作为重要的海洋食品。泥东风螺、方斑东风螺在福建、台 湾和海南等地已进行人工养殖，一些种类的贝壳也可用于观赏。但也有些种 类种群数量较少，个体较小，经济价值不甚很高。近年来，由于环境恶化， 加之人为的无限制捕捞，一些物种数量大大减少。 蛾螺科种类贝壳近长卵圆形或纺锤形，壳质l 骚实而厚。壳塔短，体螺层 膨大。壳表面具外皮，或光滑，或有肋，或有结节状及织纹状的突起。壳口 6 中国沿海蛾螺科5 属1 0 种的系统学分析 有或长或短的水管沟，外唇简单或加厚；内唇或薄或厚。通常具厣，厣角质， 多为长卵形，核小，位置随种类不同而异。足宽大，前端呈截形。眼位于触 角基部外侧。水管长。肉食性，吻长。齿舌带狭长，齿式1 1 1 ，中央齿具 3 7 个齿尖，侧齿通常有2 - - 3 个齿尖。无缘齿心5 1 。 一些学者对蛾螺科种类的形态、分类等进行了较为深入的分析托扣2 引。在确 定软体动物的分类地位时主要依靠其形态特征和生活方式训，而蛾螺科的分类 也主要是靠区别外壳的形态及内部解剖学特征拈卜3 羽。但是蛾螺科种类的亲缘关 系复杂，其分类地位仍具有很大争议。蔡英亚等( 1 9 7 9 ) n 3 1 把蛾螺科 ( b u c c i n i d a e ) 、盔螺科( g a l e o d i a d e ) 、织纹螺科( n a s s id a e ) 、细带螺科 ( f a s c i o l a r i i d a e ) 和牙螺科( c o l u m b e l l i d a e ) 归为蛾螺超科( b u c c i n o i d e a ) ， 但随后的研究都不再使用超科。另外有些种类的亲缘关系和分类地位需要进一 步深入研究，如褐管蛾螺( s i p h o n a l i as p a d i c e a ) 和纺锤管蛾螺( s i p h o n a l i a t u s o i d e s ) ；黄海蛾螺( b u c c i n i u my o k o m a r u a e ) 等，还有一些种类在我国有 分布但至今没有文献报道。 近年来，根据d n a 和r n a 序列的不同，越来越多的分子标记技术被广泛应用 于确定软体动物腹足纲的亲缘关系中阳卜3 6 1 。研究结果证明，利用分子遗传学的 方法可以更加准确地分析软体动物腹足纲种类的系统学及分类关系b 7 嵋引。在蛾 螺科的系统发生研究中，a k i r ai g u c h ie ta l ( 2 0 0 7 ) 口刚曾利用线粒体1 6 sr r n a 基因分析了蛾螺科b u c c i n u m 属8 个种的系统学关系，但是利用核糖体小亚基1 8 s r r n a 基因、核糖体大亚基2 8 sr r n a 基因以及线粒体c o i 基因等分析蛾螺科种类 甚至腹足纲种类的系统发生关系以及有关中国沿海蛾螺科种类的系统学分析 目前未见报道。 1 5 本研究进行系统学分析所用的基因特点及应用 1 5 1 核糖体基因 核糖体基因在海洋动物的系统学分析中应用很多，r d n a 是一类中度重复的 d n a i f y u ，以串联多拷贝形式存在于染色体d n a 中，每个重复单位由包括3 种 r n a ( 1 8 s 、5 8 s 、2 8 s ) 的基因编码区、转录i 日j 隔区( i n t e r n a lt r a n s c r i b e d s p a c e r ，i t s ) 和非转录间隔区( n o n t r a n s c r i b e ds p a c e r ，n t s ) 组成。真核生物 7 中国沿海蛾螺科5 属1 0 种的系统学分析 细胞核的核糖体r n a 基因簇中的串联重复序列在进化上表现出相当的一致 性，并且在种内的独特性序列的同质性相对较高，但其他非独特性序列仍 有一定的差异性h 引。核糖体r n a 基因是生物界普遍存在的基因，在个体及群 体内有较好的均一性，是生物系统进化研究中一个非常有用的分子标记h 。 核糖体大小亚基在系统学分析中应用的非常普遍h 2 _ 7 1 ， w i n n e p e n n i n c k x ，e ta l ( 1 9 9 8 ) h 8 1 利用1 8 s 核糖体小亚基全序列研究了 c a e n o g a s t r o p o d a 中l i t t o r i n i d 的系统发生，k a n o ，e ta l ( 2 0 0 2 ) h 引利用核 糖体大亚基2 8 s 序列和化石记录分析了腹足纲n e r i t o p s i n e 种类的系统学关 系，他们都证明了核糖体小亚基1 8 sr r n a 或核糖体大亚基2 8 sr r n a 是很好 的研究属间的系统学关系的分子标记。 1 5 2 线粒体基因 线粒体基因组进化速度快且自身缺乏修补机制，复制过程中易产生序列取 代的变异，从而线粒体基因组的替换率比核d n a 高5 1 0 倍。线粒体基因组不含 间隔区和内含子，无重复序列，很少发生不等交换，在遗传过程中不易发生基 因重组、倒位及易位等突变。因此，特别有较低阶元研究方面的优势，是核d n a 无法比拟的。通过对包含有不同遗传信息的d n a 序列的研究，可以对形态分类 不能解决的类群间亲缘关系进行分析和探讨，也可对传统的分类系统进行验证 旧1 。在对不同类群进行分子系统发育分析时，进化快的基因和碱基位点适于亲 缘关系较近类群的系统学研究，进化慢的则适于远缘类群的系统学研究晦。对 于探讨深度分化的分类单元之间的亲缘关系时，高保守的r r n a 和t r n a 由于多重 替代极少发生而很有价值啼羽。c o i 基因应用于系统发育分析的频率非常高，几 乎在昆虫纲的所有目中都获得了它的同源序列( h o m o l o g o u ss e q u e n c e ) 哺引。 由于m t d n a 结构和进化上的特点，m t d n a 多被作为研究物种进化的重要分子 标记阳4 。5 6 i 。c o l 基因是小蜂总科中研究得最多的线粒体基因口7 1 。c o l 基因已被应 用于轮虫、钉螺等水产动物的种系发生和多态性研究阳铲5 9 1 。如孔晓瑜( 2 0 0 4 ) 旧1 对太平洋牡蛎的c o i 基因片段进行扩增并利用其遗传变异对各地区牡蛎的分 类与系统关系进行了探讨。郭凯文( 2 0 0 3 ) 阳对中国不同自然隔离区的闩本血 吸虫的c o l 基因片段进行研究，获得了中国h 本血吸虫m t d n a 的多态性差异资 料。a n ，e ta l ( 2 0 0 5 ) 旧引利用线粒体1 6 sr r n a 和c o i 基冈研究了六种太平洋鲍鱼 8 中国沿海蛾螺科5 属1 0 种的系统学分析 的系统发生关系。关飞等( 2 0 0 7 ) 利用c o l 基因序列对中国不同种拟钉螺进 行了差异分析并对其系统学进行初步探究。王莹等( 2 0 0 7 ) 乜们基于线粒体c o i 基因序列分析宝贝科主要类群的系统发生关系，指出了宝贝亚科为多系发生。 1 6 本研究的目的和意义 分子标记技术在海洋动物研究中得到了广泛的应用：如遗传变异水平 的检测；系统学研究；遗传改良，包括遗传图谱的建立和分析、选育鉴定 等；保护生物学，濒危种群结构变化的监控等以及生理学、医学、病害与 环境科学等领域。目前，一些重要的海洋养殖生物的遗传连锁图已经建立 起来；一批重要经济性状的基因已被定位和克隆。相信在不久的将来，海 洋生物多样性的研究和保护将是海洋生物资源丌发和利用的关键和基础， 对海洋生物资源的保护和开发并永续利用都是十分重要的。 本研究利用1 8 sr r n a 、2 8 sr r n a 及c o i 基因分析了中国沿海常见的蛾螺 科5 属l o 个种的系统学发生，为蛾螺科的分类地位研究、弄清种间的进化关 系和分类地位，建立系统发生树，进一步明确其亲缘关系具有非常重要的意 义，并为软体动物的系统学研究提供重要的参考资料。 9 中国沿海蛾螺科5 属1 0 种的系统学分析 表l中国沿海蛾螺科种类及分布情况 t a b l el s p e c i e sa n dd i s t r i b u t i o no ff a m i l yb u c c i n i d a ei nc h i n a 牟等属名f g e n u s ) 种名( s p e c i e s ) 分布( d i s l l r i b n t i o a ) 文献 1 平肩螺属j a p e l i o n 侧平肩螺( j a p e l i o nl a t u $ ) 黄海北部、朝鲜、日本齐钟彦等1 9 8 3 2 香螺属( n e p t u n e a )香螺( n e p t u n e ac u m i n g i ) 黄海北部、朝鲜、日本齐钟彦等- 1 9 8 3 管蛾螺属 ( $ i p h o n a l i a ) 6 7 蛾螺属( b u c c i n i u m ) b 9涡蜀螺属 1 0 甲虫螺属 ( c a n t h a r u sj 褐管峨螺( s i p h o n a l i as p a d i c e a ) 黄海北部，朝鲜、日奉齐钟彦等，1 9 8 3 纺锤管蛾螺( s i p h o n a l i am s o i d e s ) 黄海北部、朝鲜、日本齐钟彦等1 9 8 3 黄海蛾螺( b u c c i n i u m 尖角蛾螺( b u c c i n i u mu n d a t u m 水泡蛾螺( b u c c i n i u m p e m p h i g u m ) 皮氏蛾螺( v o l u t h a r p aa m p u l l a c e a 甲虫螺( c a n t h a r u sc e c i l l e i ) 波纹甲虫螺( c a n t h a r u su n d o s u $ ) 烟甲虫曩( c a n t h a r u sc e c i l l e i ) 黄海朝鲜 黄海，朝鲜 齐钟彦等1 9 8 9 齐钟彦等1 9 8 9 黄海北部日本齐钟彦等1 9 8 9 黄海北部、日本齐钟彦等1 9 8 9 黄海北部、口本齐钟彦等1 9 8 9 黄海，朝鲜口奉 东海、南海、海南、印度 南海、口本、菲律寅 齐钟彦等1 9 8 9 齐钟彦等1 9 8 3 李风兰、林民玉 精于甲虫螺( c a n t h a r u se 童i m i u s )南海、印度，两太平洋热带海域 李风兰、林民玉， 褶纺锤螺属褶纺锤螺( p l i c 伽j ，职) 东风螺属方斑东风蠕( b a b y i o n i aa r e o l a t a ) ( 砌6 p 加缸， 泥东照螺( b a b y l o n i 口l u t o s a ) 2 1 2 2 唇氏螺属( e n g i n a ) 南海 黄海北部 东海、南海、日本 东海、南海、r 本 李风兰、林民玉， 齐钟彦等1 9 8 9 齐钟彦等1 9 8 3 齐钟彦等。1 9 8 3 东海、南海，东、西沙群岛李风兰、林民玉 礼风唇凼螺( e n g i n am e n d i c a r i a ) 东海，南海、东、两沙群岛、印李凤兰，林民玉 线纹唇齿螺( e n 咖al i n e a t a ) 环思炎螺( a g i n aa r m i l l a t a ) 海南，西沙群岛李凤兰、林民玉 东海( 台湾) 、海南、日本、菲 李凤兰、林民玉， 西沙群岛、印度、西太平= 萍车风兰、辏民玉， 2 3短波唇齿螺( e n g i n ac u r t i s i a n a )南海、印度、西太平洋热带海域 李风兰林民玉- 2 4 2 s 2 6 2 7 斜肋唇齿螺海南、印度，两太平洋热带海域李风兰，林民玉 东海、日本、菲律宾 李风兰、林民玉 收缩唇幽螺( e n g i n ac o n o a c t a ) 海南、印度、西太平洋热带海域 季风兰，韩民玉 亮螺斌( p h o s )亮螺( p h o s $ e m i c o s u s ) 彖海、南海、日奉李强鼍、棘健五， 2 8上产螺属( p i s a n i a )火红上产螺( p i s a n i ai g n e a )台湾、海南、西沙群岛、印度两 李风兰、林氏卞 2 9 加 3 l 海斟嫖疆( h i n d s i a ) 缝合海洲螺( h i n d s i as u t u r a l i s ) 中华海州螺( h i n d s i as i n e n s i s ) 南海、南沙群岛 东海，南海 蔡英亚陈i 司站 齐钟彦等1 9 8 9 c l e a 属海伦闭嫘( c l e ah e l e n a )南海、7 来两亚印度尼两眶 刘，j 英等1 9 8 0 为常见种。 1 0 n 心 口 “ 巧 拍 蛆 一 加 ，1 - l 一 z 中国沿海蛾螺科5 属1 0 种的系统学分析 2 材料与方法 2 1 实验材料及仪器试剂 2 1 1 材料采集 2 0 0 6 年1 0 月至2 0 0 7 年3 月在大连老虎滩石槽村、金石滩、东港、庄河、 皮口、旅顺及厦门等地采集蛾螺科l o 个种类的活体标本每种5 个。所有物种 的分类地位、拉丁名、分布地点以及采集地均在表2 中列出。 表2 本研究用的材料 t a b l e2s p e c i e su s e di nt h i ss t u d y 属名种名 分布地点采集地木序号 g e n u s s p e c i e sn a m e d i s t r i b u t i o n c o l l e c tl o c a t i o nn u m 新英格兰蛾螺 东港d o n g g a n g ，朝鲜n o r t hk o r e a东港d o n g g a n g a j l 、】= l y r a t ad e c e m c o s t a t a n e p t u n e a香螺n c u m i n g i 大连d a l i a n ，烟台y a n t a i e u l i m a t a 未知种n s p 略胀管蛾螺s s u b d i l a t a t a s i p h o n a l i a 褐管蛾螺s j p a d i c e a b u c c i n t m 大连d a l i a n 烟台 d y a n t a i 东港d o n g g a n g ，朝鲜n o r t hk o r e a东港d o n g g a n g 庄河z h u a n g h e 序河z h u a n g h e 庄河z h u a n g h e ，朝鲜n o r t hk o r e a 庄河z h u a n g h e 大连d a l i a n 水泡蛾螺b p e m p h i g u m 人连d a l i a a 黄海蛾螺b y o k o m a r u a e 人连d a l i a j a p e l i o n 侧乎肩螺j 1 a t u s 旅顺l i i s h u n 大连d a l i a n 人连d a l i a n 大连d a l i a n 旅顺l f i s h u n b a b y l o n i a 方斑东风螺b a r e o l a t a厦门x i a m e n ，广东g u a n g d o n g ，海南h a i n a n 厦门x i a m e n l o 个种类照片见彩图 2 1 。2 主要试剂 2 1 2 1 总d n a 提取试剂 t e ：取t r is - h c l0 1 5 8 9 ，e d q a0 0 3 7 9 溶于8 0 m 灭菌水中，调节p h 至 7 0 ，定容至1 0 0 m l 。高温灭菌后4 贮存。 2 0 m g m 蛋白酶k ：耿2 0 0 m g 蛋白酶k 溶于9 5 m l 灭菌水中，溶解后定容 至10 m 1 ，一2 0 贮存。 b f c f g h e j 中因沿海蛾螺科5 属1 0 种的系统学分析 1 0 s d s 取i o g s d s 溶于8 0 m l 双蒸水中，定容至l o o m l 。 t r i s 饱和酚( 分析纯) 氯仿( 分析纯) 异戊醇( 分析纯) 无水乙醇( 分析纯) 7 5 乙醇：取l o m l 无水乙醇加入3 0 m l 双蒸水。 3 mn a a c ：n a a c4 0 8 1 9 ，双蒸水1 0 m l ，冰醋酸7 0 m l ，调节p h 至5 2 。 2 1 2 2p c r 相关试剂 1 0 l ap c rb u f f e r ( 宝生物工程大连有限公司) l at a q 酶( 宝生物工程大连有限公司) 1 0 x p c rb u f f e r( 宝生物工程大连有限公司) r t a q 酶 ( 宝生物工程大连有限公司) 引物：( 宝生物工程大连有限公司) 灭菌水 2 1 2 3 核酸电泳试剂 2 1 2 3 15 0xt a eb u f f e r tris 碱24 2g ( 大连博瑞得生物工程有限公司h m reseo 分装) e d t a 3 7 2 2 4 9 冰醋酸5 7 1 m l d d h ：0定容至l l 2 1 2 3 2 上样缓冲液 6 x l o a d i n gb u f f e r 称取4 4 9e d t a 。b r o m o p h e n o lb 1 u e2 5 0 m g ，x y l e n ec y a n o lf f2 5 0 m g 溶于2 0 0 m l 的去离子水中，加热搅拌使之充分溶解，加入18 0 m l 的甘油 ( g 1 y c e r 0 1 ) 后，使用2 mn a o h 调节p h 值至7 0 。用去离子水定容至5 0 0 m l 后， 室温保存。 1 0 l o a d i n gb u f f e r ( 宝生物工程人连有限公司) 1 2 中国沿海蛾螺科5 属1 0 种的系统学分析 2 1 2 3 3d n a 标准分子量标记 d l 2 0 0 0 ( 宝生物工程大连有限公司) 入- e c o li1 4 ( 宝生物工程大连有限公司) 2 1 2 3 40 5 u g m i 溴化乙锭( 印) 称取2 0 0 m g 溴化乙锭至棕色试剂瓶中，加入2 0 0 m l 双蒸水，配制成l o m g m l 的贮液，4 c 保存备用。使用时吸取5 9 l 溴化乙锭加入l o o m l 双蒸水中，配成 0 。5 m g m l 的工作液。