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高活性纤维素降解菌产酶条件和 酶的性质及应用研究 细胞生物学专业 研究生李英指导教师宗浩 用以新华滤纸为唯一碳源的选择培养基从土壤、垃圾中初筛到2 4 株产纤维 素酶且生长旺盛的细菌，采用刚果红鉴别培养基作进一步识别，获得透明豳较 大的菌株6 株。在此基础上，进行液体培养，测定酶活，得到1 株酶活较高的菌株， 定名为s t - 3 。并对其进行了鉴定，归属为纤维单胞菌属( c e i u o m o n a s ) 。 对s t - 3 菌产酶条件进行研究，结果表明：3 7 是该菌产酶的最适温度，接 种培养2 4 h 的菌液于液体发酵培养基中，产酶效果最好。麸皮能够较大幅度促 进产酶，有机氮促进产酶的效果优于无机氮，最优的氮源是牛肉膏。用正交实 验对产酶条件进行了优化，确定了最优培养基的组成。在最优条件下进行发酵， c m c a s e 的最适产酶时间为2 2 h ，f p a 为1 6 h 。 s t - 3 所产生的纤维素酶，c m c a s e 作用的最适温度为5 0 。c ，最适反应p h 值为4 0 。f p a 作用的最适温度为5 5 ，最适反应p h 值为5 0 。无论是c m c a s e 还是f p a ，c o ”都能显著激活酶活性，h g ”、a 9 2 + 、m n 2 + 对酶则有显著的抑制作用。 通过s t - 3 菌分解纤维素类废弃物和降解垃圾的实验表明，s t - 3 菌能使以 玉米秸杆、小麦秸杆、水稻秸杆、麸皮、菌渣为碳源的发酵培养液中还原糖显 著增加，说明该菌能充分降解玉米秸杆、小麦秸杆、水稻秸杆、麸皮、菌渣。 其中，对玉米秸杆、麸皮的作用最为明显。对垃圾也能起到一定的降解作用。 这对于解决我国当前的环境污染和能源危机都有重要意义。因此，s t - 3 菌具有 一定的应用价值。 关键词纤维素；降解菌：分离；鉴定；正交试验；纤维素酶 s t u d i e so np r o d u c t i o n p r o p e r t i e so fc e l l u l a s ef r o m c e l l u l o s e d e c o m p o s i n gb a c t e r i aw i t hh i g hc e l l u l a s e a c t i v i t y m a j o r ：c e l l b i o l o g y g r a d u a t e ：l iy i n g s u p e r v i s o r ：z o n gh a o 2 4c e l l u l o s e 。d e c o m p o s i n gb a c t e r i aw e r ei s o l a t e df r o ms o i1a n dr u b b i s hc o m p o s tb ys e l e c t i v e1i q u i dm e d i u mw i t hx i n h u af il t e rp a p e ra st h e s o l ec a r b o ns o u r c e w eg o ts i xc o l o n i e ss u r r o u n d e db ys o m ed i s t i n e tz o n e s o fc l e a r l n gi nc e l1 u l o s e c o n g or e da g a rm e d i u m b ym e a s u r i n gt h ee n z y m e a c t i v i t yo fl i q u i dc u l t u r ef i l t r a t e s w eg o tas t r a i nw i t hh i g h e re e l l u l a s ea c t i v i t y i tw a sn a m e ds t 一3a n di d e n t i f i e da sc e 7 l o m o n a s t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n si ns h a k i n gf l a s k sw e r ei n v e s t i g a t e d t h e h i g h e s tl e v e lo f c e ll u l o s ea c t i v i t yw a si n d u c e di nt h em e n d i u mc o n t a i n i n g w h e a tb r a n t h ee f f i c i e n c yo fo r g a n i cn i t r o g e ns o u r c e sw a sb e t t e rt h a n t h a to fi n o r g a n i cn i t r o g e ns o u r c e s ，w h i l eb e e fe x t r a c tw a st h eb e s t o r g a n i cn i t r o g e ns o u r c e t h ec o m p o n e n t so ft h em e d i u m w e r eo p t i m i z e db y t h em e t h o do fo r t h o g o n a le x p e r i m e n t w h e ns t 一3w a sc u l t u r e du n d e rt h e o p t i m u mc o n d i t i o d s ，t h eo p t i m a lt i m ef o rc m c a s ea n df p a w a s2 2 ha n d1 6 h p r o p e r t i e so fc e l l u l o s ef r o ms t 一3w e r es t u i e d t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h eo p ti m u mt e m p e r a t u r ea n dp i tf o rc m c a s ew a s5 0 a n d4 0 r e s p e c t i v e l y ：f p aw a s5 5 。c a n d5 0 f o rc m c a s ea n df p a c o ”c o u l ds i g n i f i c a n t l y d r 。m o t ee n z y m ea c t i v i t y ，w h i l eh 9 2 、a g p 、 m n ，c o u l dr e s t r a i ne n z y m ea c t i v i t y t h e e x p e r i m e n t t h a td e c o m p o s i n gt h ec e l l u l o s ew a s t ea n d r u b b is h c o m d o s tb vs t 一3s h o w e dt h a tt h es o l u b l er e d u c i n gs u g a rc o u l db ei n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l yi n t h el i q u i dm e d i u mw i t hc o r ns t r a w 、w h e a ts t r a w 、r i c e s t r a w 、w h e a tb r a na n de d i b l em u s h r o o m w a s t er e s p e c t i v l ya st h es 0 1 ec a r b o n s o u r c e i tp r o v e dt h a ts t 一3c o u i dd e c o m p o s et h e m ，e s p e c i a li yf o rc o r n s t r a wa n dw h e a tb r a n t os o m ed e g r e es t 一3c o u l dd e c o m p o s er u b b i s hc o m p o s t 1 ti si m p o t a n tt os o l v et h ee n v i r o n m e n tp o i l u t i o n a n de n e r g yc r i s is t h e r e f o r e ，s t 一3h a st h eu t i l i z a t i o nv a l u e t os o m ee x t e n t k e yw o r d s ：c e l l u l o s e ：d e c o m p o s i n g b a c t e i a ： i s o l a t i o n ： i d e n t i f i c a t i o n ； o r t h o g o n a le x p e r i m e n t ：c e l l u l a s e 3 引言 随着人口的增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污 染等问题j 下日益严重地困扰着整个世界，寻找开发新能源、节省粮食、减少环境 污染的有效途径，显得越来越重要。纤维素是植物材料的主要成分，也是地球上最 丰富的可再生资源。植物通过光合作用使光能以生物能的形式固定下来，其生成 量每年高达1 0 0 0 亿t ，这些能量相当于全球人类每年能源消耗量的2 0 倍，食物中 所含的能量的2 0 0 倍。这些生物能可以年复一年通过自然界的物质循环生成， 是永远不会枯竭的可再生资源。纤维素在定条件下可以被水解成单糖，单糖再 通过微生物发酵生产各种有用的产品，如燃料、化工原料、饲料、食品、药品等， 并且可取代目前的淀粉原料发酵生产的各种产品，以及由化工燃料合成生产的 部分有机产品n “。 虽然纤维素的开发利用早已引起人们的广泛重视，但目前其利用率仅有1 左右，限制其利用的主要原因是生物转化的成本高和降解酶的催化效率低。目前， 纤维素资源中除少量的材料作为建材、织物和纸张、饲料、燃料和农业渣肥外， 绝大部分纤维素材料都作为废物未被利用，这不仅造成极大的资源浪费，甚至造 成对环境的污染。因此，如何将纤维素转化为人类可利用的能源或物质，一直是中 外学者关注的课题。 目前，可通过酸水解降解，碱降解和酶降解把纤维素转化为葡萄糖、乙醇、 单细胞蛋白质以及糠醛、苯酚等化学原料。然而在酸水解过程中，酸为一次性 使用，耗酸量大，成本较高。利用碱降解时，由于纤维素的糖苷键对碱比较稳 定，必须在高温条件下，原料经受氢氧化钠或硫酸盐法蒸煮时，纤维系才会发 生碱性降解。因此，通过酸、纤维素降解固然可以使纤维素转化成为人类可利 用的能源或物质，但是都不很经济，而酶法降解则提供了一条捷径。因为在酶 的作用下，在很低的温度便能进行化学反应，可节约大量能源。 在自然界中，有大量微生物能降解纤维素，常见的有【3 】：纤维弧菌属 ( c e l l v i b r i o ) 、纤维单孢菌属( c e l l u l o m o n a s ) 、镰状纤维菌( c e l l f a t c i c u l a ) 、噬纤 维菌( c y t o p h a g a ) 、生孢食纤维菌( s p o r o c y t o p h a g a ) ，多囊粘细菌( p o l y a n g i u m ) 4 和假单孢菌( p s e u d o m o n a s ) ：高温厌氧梭状杆菌( c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m ) 和丁 酸棱菌( c b u t y r i c u m ) ：白色瘤球菌( 尺u m i n c o s s u sa l b o u s ) 、黄色瘤球菌 ( r f l a y e 如c i e n s ) 、溶纤维丁酸弧菌( b u t y r i v i b r i o ) 、产琥珀酸拟杆菌( b a c t e r i o d e s 5 “c c i n o g p n s s1 、产纤维二糖芽孢梭菌( c l o s t i d i u mc e u o b i o p a r u m ) ；链霉菌属 f s t r e p t o m y c e s ) 和小单孢菌属( m i c r o m o n o s p o r a ) 的一些种，如弯曲高温单孢菌 ( t h e r m o m o n p o s p o r a ) 平1 褐色高温单孢菌( t f u s c a ) ；木霉( t r i c h o d e r m a ) 、青霉 ( p e n i c i l l u m ) 、漆斑霉( m y r o t h e c i u m ) 、毛壳菌( c h a e t o m i u m ) 、脉孢菌( n e u r o s p o r a ) 、 曲霉s p e r g i l l u s ) 、和根霉( r h i z o p u s ) 等。 自从1 9 0 6 年从蜗牛消化液中发现纤维素酶以来，人们在纤维素的生物转化 方面进行了大量的研究。纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称， 它往往不是单种酶，而是起协同作用的多组分酶系，大致分为三群【4 j ：( 1 ) c 1 酶，即 1 3 1 , 4 葡聚糖外切酶( e c 3 2 1 1 9 ) ；( 2 ) c x 酶，即1 3 1 , 4 一葡聚糖内切酶；( 3 ) b 1 葡萄 糖苷糖酶。w o o d 提出三类酶在发挥作用时表现出协同作用，尤其是c l + c x 的组 合，表现出很强的分解活性，单独作用则效果极差。纤维素的酶解是一个复杂的过 程，其真正的酶解机制还不完全清楚。纤维素酶的比活力一般都很低，因而产酶成 本高。据估计，纤维素水解成葡萄糖所需的酶蛋白要比淀粉相应水解所需的酶蛋 白多1 0 0 倍。这是影响纤维素酶实际应用的重要原因之一。因而，筛选纤维素酶 比活力高的菌株无疑有着重要的意义。本实验从土壤中筛选到一株高活性的纤 维素降解菌，并对其产酶条件进行了优化，探讨了该菌纤维素酶的性质以及对 不同纤维素废弃物质的降解能力。 材料和方法 1 材料 1 1 菌株 大肠杆菌( e s c h e r i c h i a c o l d 和枯草芽孢杆菌( b a c i l l u s 6 f i ，i s ) 由 四川师范大学分子生物研究所保存。降解菌株从土壤长期富含枯枝落叶的土壤、 垃圾堆肥、污泥中分离。 1 2培养基 1 2 1 初筛培养基：依姆歇涅茨基纤维素分解菌培养基【5 】 k 2 h p 0 41 9f e e l ：5 h 2 0 0 1 9m g s 0 4 7 h 2 00 3 9 c a c l 2 0 1 9 n a c l 0 1 9 n a n o 。 2 5 9 蒸馏水1 0 0 0 m lp h7 2 7 4 将培养基分装试管内，然后加入滤纸条一张( 普通滤纸剪成5 0 7 c m 或7 l c m 纸条) ，纸条贴于试管内壁，一半浸入培养液中，一半暴露于空气中，一 个大气压灭菌2 0 3 0 m in 。 1 2 2 分离培养基【6 l ( ) ： c m c n a0 5 营养盐l o o m l 琼脂2 d h 7 2 营养盐： n h 4 h 2 p 0 40 5 9k 2 h p 0 42 9 m g s o 2 9 m n s o ；h 2 02 5 m g f e s o 。7 h 2 07 5 m g n a c l0 3 9自来水1 0 0 0 m l 1 2 3 纤维素分解菌鉴别培养基：刚果红纤维素培养基【7 l k 2 h p o 一0 5 9m g s o 一0 2 5 9刚果红0 2 0 9 琼脂1 4 o o g纤维素粉1 8 8 9明胶2 o o g 土壤浸汁l o o m l蒸馏水9 0 0 m lp h7 0 配制前应对纤维素粉和琼脂进行预处理，纤维素应加l nh c l 浸泡12 h 然 后蒸馏水洗多次至p h 值中性，烘干。 1 2 4 液体发酵培养基【8 l 蛋白胨0 3 酵母膏0 0 5 k h ：p o 。0 4 m g s o 。7 h 2 00 0 3 c a c l ：2 h ：o0 0 3 c m c n a0 5 ，p h7 2 7 3 1 2 5 种子培养基【9 】 牛肉膏3 9蛋白胨l o g n a g i j g 蒸馏水i 0 0 0m l p h7 2 7 4 1 2 ，6 细菌鉴定培养基【9 r1 0 l ( 1 ) 需氧性实验培养基 酪素水解物2 0 9 n a c l5 9 巯基醋酸钠( h s c h c o o n a ) 2 9 甲醛次硫酸钠( h o s h s o n a ) l g琼脂1 5 9蒸馏水1 0 0 0 m l p h 7 2 ( 2 ) 葡萄糖氧化发酵实验培养基 蛋白胨2 9 n a c l 5 9k 2 h p o 。0 2 9 葡萄糖5 9水洗琼脂5 6 91 溴百里酚蓝水溶液3 m l 蒸馏水1 0 0 0 m l ( 3 ) 基础培养基 ( n 心) z s 0 t2 9 m g s 吼7 h z 00 2 9n a h ：p 矾h ：00 5 9 c a c l 。2h 。0 0 1 9 ，k 2 h p 0 40 5 9蒸馏水1 0 0 0 m lp h 6 5 向其中加入不同碳源，一般糖的含量为1 ，酚类、醇类为0 卜0 2 氨基 酸为0 5 。 ( 4 ) 甲基红实验( m r 实验) 和甲基乙酰甲醇实验( v p 实验) 培养基 蛋白胨5 9葡萄糖5 9 n a c i5 9 蒸馏水1 0 0 0 m lp h 7 ，0 ( 5 ) 淀粉水解实验 在肉汤蛋白胨琼脂培养基中加入0 2 的可溶性淀粉，p h 7 0 。 ( 6 ) 明胶水解实验培养基 明胶4 9牛肉膏5 9蛋白胨0 1 9 葡萄糖0 0 5 9k 2 h p o ；1 5 9i ( h ：p o ，1 5 9 ， m g s o ，7 h 。00 1 9蒸馏水1 0 0 0 m lp h 7 2 ( 7 ) 硝酸盐还原实验培养基 肉汤蛋白胨琼脂培养基1 0 0 0 m lk n o ，l g p h 7 0 ( 8 ) 吲哚实验培养基 蛋白胨l o g色氨酸l g n a c l 5 9 蒸馏水1 0 0 0 m lp h 7 5 ( 9 ) 淡薄培养基 酵母膏0 7 9蛋白胨l g葡萄糖l g ( n h t ) z s o 一0 2 9m g s o a 7 h z 00 2 9 k z h ? o al g 琼脂2 0 9蒸馏水1 0 0 0 m lp h 7 2 ( 10 ) 石蕊牛奶培养基 2 5 石蕊水溶液4 m l ，脱脂牛奶1 0 0 0 m l 。 ( 11 ) 酪氨酸水解试验培养基 l 一酪氨酸0 5 9 悬浮于l o m l 蒸馏水中8 磅z o m i n 灭菌，然后与l o o m l 无 菌营养肉汤琼脂混合，倾倒平板。 ( 1 2 ) 酪素水解试验培养基 取5 9 脱脂奶粉加入5 0 m l 蒸馏水中，另称1 5 9 琼脂溶于5 0 m l 蒸馏水中， 将两液分开灭菌。待冷至4 5 c 一5 0 c 时，将两液混匀倒平板。 ( 1 3 ) 柠檬酸盐的利用培养基 柠檬酸钠2 9 n a c l 5 9m g s o 。7 h t 00 2 9 ( n h 。) 。h p o ；l g k 2 h p o 。3 h ：0 l g 1 溴百里酚蓝水溶液l o m l 琼脂2 0 9蒸馏水1 0 0 0 m lp h 6 8 - 6 9 ( 1 4 ) 丙二酸盐的利用培养基 ( n h ) 吼2 9酵母膏1 9 k h p o 一3 h 。00 s g k h ：p o 。0 4 9葡萄糖0 2 5 9 n a c l2 9 ， 丙二酸钠3 9溴百里酚蓝0 0 2 5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h 7 o - 7 4 。 ( 1 5 ) 耐盐性试验培养基 以肉汤培养液，根据鉴定的需要配成不同浓度的n a c l 。 ( 1 6 ) 卵磷脂酶的测定培养基 胰胨1 0 9n a 。h p o ，5 9 n a c l 2 9 k h ：p 仉l gm g s o 。7 h ：00 1 9葡萄糖2 9 蒸馏水1 0 0 0 m lp h 7 6 分装三角瓶，每瓶l o o m l ，8 磅2 0 m i n 灭菌。将培养液分成2 组，一组加卵 黄另一组分装无菌试管做不加卵黄的对照。 ( 17 ) 苯丙氨酸脱氨实验培养基 酵母膏3 9n a z h p o ，lgd l 一苯丙氨酸2 9 n a c l5 9 琼脂l 5 9蒸馏水1 0 0 0 m p h 7 0 分装试管，8 磅2 0 分钟灭菌，摆成斜面。 ( 1 8 ) 脲酶的测定培养基： 蛋白胨l g n a c l 5 9葡萄糖l g k h z p 0 42 9 酚红o 0 1 2 9琼脂1 5 9 蒸馏水1 0 0 0 m l p h 6 8 - 6 9 1 3 仪器 摇床：哈尔滨东联电子技术有限公司h z s h 型 u v 7 5 5 b 分光光度计：上海分析仪器厂： p h s 一2 9 a 精密酸度计：成都方舟科技开发区： 隔水式电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂 b e c k m a nj 2 21 冷冻离心机。 2 方法 2 1 样品的采集 分别于2 0 0 3 年9 月中旬，1 0 月中旬，在四川师范大学狮子山，采集富含 枯枝落叶的土壤，垃圾堆肥，淤泥作为样品。采集时，根据不同的地势和面积 j ，采用对角线、蛇形、棋盘法采样，每种土样用干净的采样铲取5 一1 0 个点， 总共约2 k g 。将采集的样品放入灭菌的牛皮纸袋中混合均匀，迅速带会实验室， 在2 h 内将其分离培养( 由于土壤中的细菌在2 h 内才能保持1 0 0 的存活率) 。 2 2 菌种的分离和初筛 将样品稀释成l o 一1 0 。的各级浓度的稀释液，将装有“仞筛培养基”的试 管编号，用无菌移液管吸取i m l 稀释液对号接种在有“初筛培养基”的试管中， 3 7 c 培养1 0 d 左右，至滤纸条上出现溃烂斑，选择滤纸溃烂程度高的试管，从 溃烂处挑取菌落于“分离培养基平板”，多次划线分离，分离至得到纯化的单菌 落将得到的纯种单菌落点种于刚果红纤维素鉴别培养基，3 7 。c 培养4 8 h ，用 l nh c l 固定分解纤维素的透明圈，测量透明圈直径大小，进行初选。 2 3 菌种的复筛 复筛采用液体发酵培养基，在1 5 0 r m i n 摇床上进行振荡培养，于3 7 。c 培 养4 b h 后。测定发酵液的酶活。 2 4 葡萄糖标准曲线的制定【1 2 l 葡萄糖标准液的配制：准确称取1 0 0 m g 分析纯的无水葡糖糖，用少量蒸馏 水溶解后，定量转移到1 0 0 m l 容量瓶中，再定容到刻度，摇匀。浓度为i m g m l 。 取9 支2 5 m i n x2 5 0 m m 试管，分别按表1 加入试剂。 表1不同溶液的加入量 t a b i e1 c a p a c i t yo f d i f f e r e n ts o i u t i o n 项目 i23456780 将各管溶液混合均匀后，在沸水浴中加热5m n ，然后取出后立即用冷水 冷却至室温，再向每管加入2 1 5 m l 蒸馏水，摇匀。于5 2 0 n m 波长处测a 值。以 葡萄糖( m g ) 为横坐标，光吸收值为纵坐标，用软件0 r i g i r l6 0 绘制标准曲线。 l o 2 5 粗酶液的制备 将发酵液直接于3 0 0 0 r m i n ，4 。c 离心1 5m i n ，取上清液。 2 6 酶活力的测定 参照文献( 8 ) 的c m c a s e 和f p a 的测定方法。 2 6 1 总纤维素酶活( f p a ) 测定 取5 0 m g ( i c m x6 c m ) 新华滤纸，加i m l o 0 5 m 柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液p h 4 8 ， 加入适当稀释酶液0 5 m 1 ，5 0 ，反应6 0 r a i n ，加入d n s 终止反应，沸水浴5m if l ， 测还原糖。 2 6 2 羧甲基纤维素钠酶活( c m c as e ) 测定 取适当稀释酶液0 2 m l 加入0 5 m li c m c n a 溶液，溶入0 0 5 m 的柠檬酸一 柠檬酸钠缓冲液，p h 4 8 ，5 0 c ，反应3 0 m i n ，加入d n s 终止反应，沸水浴5 m i n ， 测还原糖。一个酶活单位( i n t e r n a t i o n a lu n i t ，i u ) 定义为1m jn 内转化底物 产生1 p m o l 还原糖( 以葡萄糖计) 所需的酶量。 2 7 菌株s t - 1 3 的鉴定 2 7 1 菌株s t - 1 3 培养特征与形态特征的观察 用肉眼观察细菌在肉汤蛋白胨培养基平板上的菌落特征，包括菌落的大小、 颜色、边缘是否光滑等。在显微镜下观察细菌的形态，大小等特征。 2 7 2 生理生化特征的测定 参照伯杰细菌鉴定手册( 第八版) 、张纪中微生物分类学、周德庆微 生物学实验手册来进行鉴定1 9 , 1 0 , 1 3 】。 革兰氏染色 将供试菌株和对照菌株同时接种在肉汤蛋白胨培养基上，培养1 8 2 4 h ，按 照三点品行法，在同一载玻片上滴三滴水，用接种环挑取供试菌株和分别作为 阴性对照的大肠杆菌和阳性对照的枯草杆菌的菌苔，( 对照菌涂抹于供试菌的两 侧) 于水滴边缘轻轻涂抹几下，在自然风干或微热烘干，并在火焰上通过几次， 以固定涂片。再进行比较染色，以避免由于脱色过度，使革兰氏阳性变为阴性， 或由于脱色不足使革兰氏阴性变为阳性。 芽孢染色 将供试菌株和对照菌株接种到淡薄培养基上培养2 4 h 之后染色，用饱和的 孔雀绿染色后再以蕃红复染。 鞭毛染色 将待测菌株接种于肉汤蛋白胨培养基中，连续传代至少四次以上然后取 样染色。取样时，接种环应充分冷却，在细菌弥散生长较明显的区域，沾取极 少量的菌株，静止悬浮与载玻片上的小水滴中，避免摇动，待水珠稍变浑浊。 立即移开接种环，将载玻片倾斜竖立，使菌液从载玻片的一端缓慢流至另一端， 自然干燥后染色，取菌的多少，直接关系到制片后背景的干净程度应尽量少 取，减少背景的干扰。 氧化酶的测定 在干净的培养皿中放一张滤纸，滴1 盐酸二甲基对苯撑二胺水溶液，使仅 打湿滤纸( 不宣过湿) 。用白金丝接种( 或用玻璃棒) 挑取1 8 - 2 4 h 的菌龄的菌 苔，涂抹在湿滤纸上，l o s 内，菌苔呈现红色者为阳性，6 0 s 以上出现红色者不 计，按阴性处理。 过氧化氢酶的测定 取一干净的载玻片，在上面滴一滴3 - 1 0 的h 2 0 。挑取l 环培养1 8 2 4 h 的 菌苔，在h ：0 。溶液中涂抹，若有气泡产生，则为过氧化氢酶阳性，无气泡产生， 则为过氧化氢酶阴性。 需氧性实验 用l 小环的肉汤菌液，穿刺接种到培养基中，必须穿刺到管底。3 0 c 培养， 分别在3 至7 d 观察结果。如细菌在琼脂柱表面上生长者为好氧菌，如沿着斜线 生长者为厌氧或兼性厌氧。 明胶液化 采用f r a z i e r 氏的明胶平板法。将待测菌株点种在平板上，适温培养，待 菌落生长丰厚，滴加酸性贡试剂在菌落周围，避免摇动，使菌落浮动，影响透 明圈的测定。 葡萄糖的氧化发酵实验 以1 8 2 4 小时的幼龄菌种，穿刺接种到培养基中，每株菌接四管，其中2 1 2 管用油封盖( h l 士林：液体石蜡= l ：l 混合后灭菌) 约加o 5 一t c m 厚，以隔绝 空气为闭管。同时还要有不接种的闭管做对照。适温培养l 、2 、4 、7 d 观察结 果。 淀粉水解 将待测菌株接种在平板上，待菌落形成后，滴加卢哥氏碘液，以铺满菌落 周围为度，平板呈兰色，以上应避免摇动培养皿，引起菌落的浮动，干扰透明 圈的测定。 硝酸盐还原实验 将待测菌株接种在硝酸盐液体培养基中，同时以不接种的培养基为对照， 适温培养5 d 和l o d 做显色反应。 m r 和v p 实验 两实验采用同一菌株培养物，分成两份，一份加甲基红试剂，一份加乙酰 甲基甲醇实验显色试剂，若两者均为阳性，就应培养更长的时间，以确定生成 的酸是否转变。 吲哚实验 将待测菌株接种于蛋白胨水培养基中，适温培养2 、4 、7 d 后，取显色剂数 滴，沿试管壁缓缓加入，观察在界面处是否出现红色晕圈，切勿摇动试管，否 则无法形成光圈。 含碳化合物的利用 采用不同碳源的基础培养基，添加不同的含碳化合物接种待测菌株，观察 是否生长。 卵磷脂酶的测定 将测试菌株的菌液，环接在有卵黄和不加卵黄的对照管中适温培养l ，3 或5 d 观察。假若与对照管相比较，在卵黄胰胨中或表面，形成白色沉淀者，为 阳性反应，表示卵磷脂被分解，生成脂肪和水溶性的磷酸胆碱，说明有卵磷脂 酶存在。 柠檬酸盐的利用 取幼龄菌种接种于斜面上，适温培养3 7 d ，培养基呈碱性( 蓝色) 者为阳 性，不变者为阴性。 利用丙二酸盐试验 用幼龄菌接种测定培养基和空白培养基，于适温培养卜2 d ，观察培养基变 色情况。如测定培养基生长并变蓝色，表示可利用丙二酸盐，为阳性结果。反 之，如测定培养基未变色，而空白培养基生长，则为阴性，即不利用丙二酸盐。 石蕊牛奶 接种待测菌株，适温培养3 、5 、7 或1 4 d ，观察和记录牛奶产酸、产碱、 凝固或胨化等反应。 酪素水解试验 将待测菌株点种到平板上，适温培养l 、3 、5 d ，记录菌落周围和下面酪素 是否已被水解。 酪氨酸水解 将待测菌接种于平板上，培养7 到1 4 d ，观察酪氨酸结晶是否被水解而同 透明。 苯丙氨酸脱氨实验 将菌种接种于培养基斜面上，适温培养3 - 7 d ，取1 0 的f e c ，水溶液4 5 滴，滴加在生长菌台的斜面上，当斜面和试剂液面处呈蓝绿色时为阳性反应， 表示从苯丙氨酸形成苯丙酮酸。 脲酶的测定 加入酚红指示剂后，使培养基呈橙黄色( 或橘红色) ，分装三角瓶，每瓶 1 0 0 m ，8 磅2 0 m i n 灭菌，待培养基冷至5 0 。c 左右，加入预先过滤灭菌的2 0 脲 水溶液，使其在培养基中的最终浓度为2 ，摇匀后立即分装无菌试管，并摆成 斜面备用。接入待溺菌株，适温培养1 - 4 d ，培养基变红色者为阳性反应。 2 8 纤维素降解菌降解纤维素类废弃物及处理垃圾的研究 2 8 1 对纤维素类废弃物及垃圾的降解方法 ( i ) 将菌渣、玉米秸杆、小麦秸杆、水稻秸杆、麦麸干燥后粉碎，分别称 取l g 菌渣、玉米秸杆、小麦秸杆、水稻秸杆、麦麸于9 9 m l 液体发酵培养基( 除 去碳源c m c n a ) 中。将垃圾除去玻璃和石块，筛选0 ，5 一1 o c m 的颗粒。在好氧 条件f3 54 c 预保温6 0 d 后作为堆肥接种物【1 4 t 。称取i g 垃圾堆肥于9 9 m l 水溶液 1 4 中，配制成l o 。的悬液。各溶液均1 5 磅灭菌2 0 m i n 。 ( 2 ) 将纤维素降解菌接种到上述各溶液中，3 7 。c ，1 5 0 r m i n 摇床上进行振 荡培养2 4 h ( 以不接种的作为对照) 。于3 0 0 0 r m i n ，4 。c 离心1 5m i n ，取上清 液，测出溶液中还原糖含量的变化。 2 8 2 还原糖含量的测定州 还原糖含量采用d n s ( 3 5 一二硝基水杨酸) 法测定。在2 5m l 刻度试管中 盛有纤维素酶活力测定溶液0 5m l ，再加1 吨乙酸一乙酸钠溶液，加入3m l d n s 试剂，在沸水中煮沸5m i n 进行显色然后在流水中急速冷却。用蒸馏水 定容至2 5m l 。一小时之内在5 2 0n m 处比色测定。在葡萄糖标准曲线上查出 还原糖的含量。 结果与讨论 1 。 结果 1 1 菌种的分离初筛 从采集到的样品中，用初筛培养基和分离培养基分离出能产生纤维素酶的 2 4 个菌株，点种到纤维素分解菌鉴别培养基，培养2 d 后测量出水解圈的直径， 初选出酶活较高且生长旺盛的6 株菌。其结果如下： 表2 不同菌株的透明圈大小 t a b i e2t h es i z eo ft r a n s d a r e n tc ir g i eo fb a c t e r i a 1 2 葡萄糖标准曲线 根据表1 加入不同的溶液，将各管于5 2 0 n m 波长处测a 值。以葡萄糖( m g ) 为横坐标，光吸收值为纵坐标，用软件o r i g i n6 0 绘制标准曲线，结果见图l 。 s ： t 。 冀 z o o 0 00 20 40 60 81 01 21 41 61 82 0 葡萄糖x 图l 葡萄糖标准曲线 f i g u r e1 t h es t a n d a r dc u r v eo fg l u c o s e y = 一0 1 7 2 7 5 + 1 0 0 3 0 8 x r - - o 9 9 9 8 8 1 6 1 3 菌种的复筛 将所分离得到的6 株菌接种于液体发酵培养基，在1 5 0 r m i n 摇床上进行 振荡培养，于3 7 培养4 8 h 后，测定发酵液的酶活。经过复筛，4 8 h 获得酶活 最高，并且生长旺盛的菌株为菌株3 ，编号为s t 一3 。 为了证明产透明圈菌株确实为纤维素酶产生菌，点种不产纤维素酶的大肠 杆菌于刚果红纤维素平板作阴性对照。结果证明产透明圈菌株确实为纤维素酶 产生菌。液体发酵测定纤维素相对酶活力( 以反应产生的还原糖表示) 的结果更 证实了这一点。( 表3 ) 表3 不同菌株酶活力大小 t a b i e 3t h ee n z y m ea c t i v i t yo fb a c t e r i a 1 4s 卜3 菌株的鉴定 1 4 1 形态特征 s t - 3 在光学显微镜下观察，细胞呈直杆状，革兰氏染色呈阳性，无芽孢 没有鞭毛( 图2 ) 。 图2s t 一3 的形态 f i g u r e2 t h ec o n f i g u r a t i o no fs t 一3 1 4 2 培养特征 用肉眼观察待测菌株s t 一3 在肉汤蛋白胨琼脂培平板上形成的菌落为圆形， 淡黄色，稍突起，湿润光亮，边缘光滑，不透明，生长迅速，2 4 可达1 5 m m ，在 c m c n a 平板上菌落则呈乳白色，生长迅速。在以滤纸条为唯一碳源的培养基中， 3 7 培养3 d 后，在气液界面上滤纸崩溃或软化，经摇动，滤纸断裂。肉汤蛋白 胨液体培养基中一天出现浑浊，未见沉淀物。石蕊牛奶3 d 后变澄清，一周未见 凝固( 表4 ) 。 表4s t 一3 菌培养特征 t a b j e4t h ec o l t u r ef e a t u r eo fs t 一3 培养特征s t - 3 肉汤蛋白胨琼脂平扳 肉汤蛋白胨液体培养基 石蕊牛奶 羧甲基纤维素钠琼脂平板 滤纸条培养 圆形，淡黄色，稍突起，湿润光亮，边缘光 滑，不透明生长迅速。2 4 h 可达1 5 m m 浑浊， 胨化 圆形 3 d 后 未见沉淀物 光滑，湿润，有光泽，乳白色 在汽液界面上滤纸断裂 1 4 3 生理生化特征 对待测菌株进行了生理生化特征的测定。该菌株过氧化氢酶阳性，氧化酶 阴性，脲酶阴性，v p 和m r 反应均为阴性，能氧化葡萄糖产酸，水解淀粉、 酪素、明胶、酪氨酸，能利用丙二酸盐和柠檬酸盐，能水解卵磷脂，能形成吲 哚，能还原硝酸箍，不能使苯丙氨酸脱氨( 表5 ) 。 1 8 表5待测菌株s t - 3 生理生化特征 t a b i e5b i o c h e m i c a ic h a r a c t e r so fs t 一3 对待测菌株糖醇的利用也进行了测定，该菌株能充分利用葡萄糖、麦芽糖、 蔗糖、d 一木糖、乳糖、甘露醇、淀粉、d 一山梨醇( 表6 ) 。 表6s t 一3 菌对糖醇的利用结果 t a b l e6t h er e s u i t s0 5u s i n gc a r b o h y d r a t eb ys t 一3 菌株 s t 一3且s u b t i l i sec o l i 葡萄糖 + 十 + t 麦芽糖 + 十 + 蔗糖 十+ d 一术糖 + 十 + 乳糖 + 甘露醇 +十十 淀粉 +t d 一山梨醇 + 氮源同化：能利用有机氮源，如蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素、水解 酪素等，也能利用n o n o 。、( n h 。) ：s o 。n h 。n o , ( n h 。) 。h p o 。n h 。1 4 ：p o 。等无机氮。 耐盐性试验：在3 n a c i 的牛肉汁培养基中可以生长，菌苔略薄。 对氧的要求：用1 小环的肉汤菌液，穿刺接种到需氧性培养基中，经3 0 培养3 d 后，琼脂柱表面和斜线上均有生长，为兼性厌氧菌。 按照b e r g y 手册，本实验所分离到的s t - 3 菌株形态和生理生化特征大部 分与纤维单胞菌属相符，因此把s t 一3 归属为纤维单胞菌属( c e j u j o m o n a s ) 。 1 5 产酶条件的研究 l5 1 培养温度对产酶影响 将菌株s t - 3 接种于液体发酵培养基中，分别在2 8 、3 7 、4 5 和5 5 4 个不同温度下，n = 1 5 0 r m i n 培养4 8 h ，测酶活。结果见图3 。从图中可看出3 7 是该菌产酶的最适温度。 34 温度 围3 不同培养温度对产酶的影响 f i g u r e3 e f f e c to ft h et e m p e r a t u r eo ne n z y m ea c t j v i t y 说明；1 - 4 分别代表培养温度为2 8 、3 7 、4 5 、5 5 i 5 2 种龄对产酶的影响 接种s t 一3 于种子培养基中，每1 2 h 接种菌液于液体发酵培养基中，于3 7 ，n = 1 5 0 r m i n 摇床培养4 8 h ，分别测c m c 酶活和f p a 。结果见图4 。结果表明， 接种培养2 4 h 的菌液于液体发酵培养基中，酶活最高。 4 _ o 县3 5 馨3 i o 2 , 5 2 o 1 占 1 - 0 o 5 0 0 种龄h 图4 种龄对产酶的影响 f i g u r e4 e f f e c to ff e e da g eo ne n z y m ea c t i v i t y 说明：卜4 分别代表种龄为1 2 h 、2 4 h 、3 6 h 、4 8 h 2 1 4 3 2 ， o flh挈溢 1 5 3 碳源对产酶的影响 除去碳源( c m c n a ) 的发酵培养基作为基础培养基，加入1 的不同碳源， 在5 0 m l 三角瓶中加入l o m l ，p h 7 0 的发酵培养基，于3 7 ，n = l s o r m i n 摇床 培养4 8 h ，分别测c m c 酶活和f p a 。结果见图5 。碳源对菌株产酶能力有较大影 响，麸皮可以明显促进纤维素酶的生成，葡萄糖在一定程度上阻遏s t - 3 纤维素 酶的产生。 3 0 昌 囊2 5 篷 2o 15 1o 0 5 o o 1234 56 7 8 碳源 图5 不同碳源对产酶的影响 f ig u r e5e f f e c to fc a r b o ns o u r c e so ne n z y m ea c t iv i t y 说明：1 代表c m c n a ；2 代表脱脂棉；3 代表滤纸；4 代表玉米秸杆： 5 代表小麦秸杆；6 代表水稻秸杆：7 代表麸皮；8 代表葡萄糖 1 5 4 氮源对产酶的影响 除去氮源后的发酵培养基作为基础培养基，加入0 5 的不同氮源，在5 0 m e 三角瓶中加入l o m l ，d h 7 0 的发酵培养基，于3 7 ，n = 1 5 0 r m i n 摇床培养4 8 h ， 分别测c m c 酶活和f p a 。结果见图6 。无机氮源和有机氮源都可以使菌株产酶， 但总体说来，有机氮源促进产酶的效果优于无机氮源。其中，以牛肉膏做氮源 时酶活最高，n h 。h ：p o ，和( n h 。) 。h p 0 4 能够缓冲发酵过程中p h 的变化，促进产酶 效果也较好。 3 5 一 。3 0 甚2 5 鞋 2 0 15 10 0 5 00 1234567891 01 1 氯源 图6 不同氮源对产酶的影响 f i g u r e6 e f f e c to fn i i c r o g e ns o u r c e so ne n z y m ea c t i v i i c y 说明：1 代表酵母霄：2 代表蛋白胨；3 代表牛肉膏；4 代表胰蛋白胨；5 代表黄豆粉：6 代表尿素 7 代表硝酸钠；8 代表硫酸氨；9 代表硝酸氨：1 0 代表n i 扎p o 。：1 1 代表( n 1 ) ：h p o , 。 1 5 5 正交实验优化培养基的组成 根据文献 1 6 的方法进行正交实验设计和分析，实验因子和水平见表7 ， 正交实验结果见表8 。 表7 实验因子和实验水平表 t a b i e7e x p e r i e n