（草业科学专业论文）多浆旱生植物霸王液泡膜NaltgtHltgt逆向转运蛋白基因的克隆及表达分析.pdf

兰州人学坝卜学位论义多浆早刍i 植物霸i 液泡】膜n a + 川+ 逆向转运生 j 壮| 大i 的克降及表达分丰斤 摘要 盐胁迫是影响作物生长和产量的主要非生物因素之一。土壤中过高的n a + 浓度引 起离子毒害、渗透胁迫和k + n a + 比率失调使植物新陈代谢紊乱，从而对植物造成伤 害。植物抵御盐胁迫的有效策略之一是通过液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白将细胞质中 过多的n a + 区域化在液泡内，以减轻过量n a + 对细胞质的伤害，同时维持细胞的渗透 势，从而提高植物的耐盐抗旱性。从极端干旱环境中生存的荒漠植物中克隆和鉴定液 泡膜n a + h + 逆向转运蛋白基因，对农作物和优良牧草耐盐抗旱性的遗传改良具有重 要意义。 本研究以多浆早生植物霸王( z y g o p h y l l u mx a n t h o x y l u m ) 为实验材料，克隆到液 泡膜n a + h + 逆向转运蛋白基因z x n h x 和a c t i n 片段，并以a c t i n 为内参对z x n h x 在 盐处理下的表达进行了研究。主要结果如下： 1 根据已知的液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白基因的保守区设计简并性引物，采用 r t - p c r 及r a c e 方法，从霸王中克隆到液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白基因的全长 e d n a ，将其命名为z x n h x 。该c d n a 全长2 1 2 7b p ，包括15 9 9b p 的开放阅读框( o r f ) 、 2 1 3b p 的5 非翻译区( 5 u t r ) 、3 1 5b p 的3 非翻译区( 3 u t r ) 和2 5b p 的p o l y ( a ) 尾巴。此e d n a 编码一个5 3 2 个氨基酸的多肽，推测分子量为5 8 8k d a ，等电点为 7 2 3 。霸王z x n h x 的氨基酸序列与己报道的胡杨p e n h x 2 、拟南芥a t n h x l 、毛白杨 p t n h x l 、北滨藜a g n h x l 、盐地碱蓬s s n h x l 和水稻o s n h x l 的同源性较高，分别 为8 l 、8 0 、7 9 、7 8 、7 4 和7 3 。z x n h x 蛋白含有1 2 个跨膜区，其中t m 3 具有高度保守的氨氯吡嗪脒结合位点( 7 s l f f y l l p p l 8 7 ) 。此外，z x n h x 含有2 个糖 基化位点，分别为a s n 4 4 、a s n 2 8 7 ，表明此蛋白是己糖基化的蛋白。z x n h x 已在g e n b a n k 注册，登录号为e u l 0 3 6 2 4 。 2 根据已知的a c t i n 基因的保守区设计简并性引物，利用r t - p c r 方法从霸王中 克隆到a e t i n 基因片段，将其命名为z x a c t 。该片段大小为5 9 8b p ，编码1 9 8 个氨基 酸。序列分析表明，z x a c t 与其他植物的a c t i n 基因核苷酸序列的同源性在8 2 以上； 而与氨基酸序列的同源性达9 1 以上。z x a c t 已在g e n b a n k 注册，登录号为 e u 0 19 5 5 0 。 3 半定量r t - p c r 分析结果显示，z x n h x 在叶和根中均表达，但叶中的表达量 明显高于根：在高浓度盐处理下( 1 5 0 、2 0 0m m o l l 1n a c i ) ，z x n h x 转录水平明显上 调，在处理3 、1 2h 后达到最大值。由此表明，z x n h x 表达受盐胁迫的诱导和调节。 关键词：多浆旱生植物；霸王( z y g o p h y l l u mx a n t h o x y l u m ) ；液泡膜n a + h + 逆向转运 蛋白；及慨耐盐抗旱性；表达分析 兰州人学坝f j 学位论义 多浆旱生植物霸i ：液泡噤n a h 。逆向转运生【，埔i 六i 的觅降发表达分析 a b s t r a c t s a l i n i t yi so n eo ft h em a j o ra b i o t i cs t r e s sf a c t o r st h a ta d v e r s e l ye f f e c tt h ec r o pp l a n t g r o w t ha n dy i e l d t h ee x c e s s i v es o d i u mi o n si ns o i lc a u s ei o n st o x i c i t y , o s m o t i cs t r e s s e s ， a n dt h ed a m a g ei nk 1 n 吞h o m e o s t a s i s o n eo ft h ee f f e c t i v es t r a t e g i e st h a te n a b l ep l a n t st o r e s i s ts a l ts t r e s si st oc o m p a r t m e n t a l i z en a + i n t ot h ev a c u o l eb yt h ev a c u o l a r n a + h + a n t i p o r t e r t h i sp r o c e s sc a na v e r tt h ed e l e t e r i o u se f f e c t so fn a + i nt h ec y t o s o la n dm a i n t a i n o s m o t i cb a l a n c eb yu s i n gn a + a c c u m u l a t e di nt h ev a c u o l et od r i v ew a t e ri n t ot h ec e l l s ，a n d i m p r o v es a l t - a n dd r o u g h t t o l e r a n c eo fp l a n t s t h e r e f o r e ，i ti si m p o r t a n tm e a n i n gf o r g e n e t i ci m p r o v e m e n to fs a l t a n dd r o u g h t t o l e r a n c eo ft h ec r o p sa n dh e r b a g e st oi s o l a t e a n dc h a r a c t e r i z et h ev a c u o l a rn a + h + a n t i p o r t e rf r o mt h ed e s e r tp l a n t sl i v e di ne x t r e m e l y a r i de n v i r o n m e n t i nt h i ss t u d y , t h ev a c u o l a rn a + h + a n t i p o r t e rg e n e ，z x n h x , a n dt h ef r a g m e n to fa c t i n g e n ew e r ec l o n e df r o mt h es u c c u l e n tx e r o p h y t ez y g o p h y l l u mx a n t h o x y l u m ；a n de x p r e s s i o n o fz x n h xw a sa n a l y z e du s i n ga c t i na si n t e r n a lc o n t r o lu n d e rs a l ts t r e s s t h em a i nr e s u l t s w e r ea sf o l l o w i n g ： 1 d e g e n e r a t ep r i m e r sw e r ed e s i g n e db a s e do nt h ec o n s e r v e ds e q u e n c e so ft h ev a c u o l a r n a + h + a n t i p o r t e rg e n e sf r o mo t h e rp l a n t s an o v e lv a c u o l a rn a + h + a n t i p o r t e rg e n ew a s i s o l a t e df r o mz x a n t h o x y l u mu s i n gr t - p c ra n dr a c e a n dn a m e da sz x n h x t h ee d n a i s2 1 2 7b pi nl e n g t hi n c l u d i n ga no p e nr e a d i n gf l a m e ( o r f ) o f15 5 8b p ，a5 u n t r a n s l a t e d r e g i o n ( 5 u r t ) o f2 13b pa n da3 u n t r a n s l a t e dr e g i o n ( 3 u r t ) o f315b pw i t hap l o y ( a ) t a i l t h ez x n h xe d n ae n c o d e sap r o t e i no f5 3 2a m i n oa c i d sw i t had e d u c e dm o l e c u l a r m a s so f5 8 8k d aa n dap io f7 2 3 t h ez x n h x p r o t e i ns h a r e s81 ，8 0 ，7 9 ，7 8 ，7 4 a n d7 3 h o m o l o g yw i t ht h es i xr e p o r t e do t h e rn h x s ，n a m e l yp e n h x 2 ( d q 414 512 ) ， a t n h x l ( a y 6 8 5 l8 3 ) ，p t n h x l ( a y 6 6 0 7 4 9 ) ，a g n h x l ( a b 0 3 8 4 9 2 ) ，s s n h x i ( a f 3 7 0 3 5 8 ) a n do s n h x l ( a y 3 2 4 8 7 7 ) ，r e s p e c t i v e l y z x n h xh a st w e l v ep u t a t i v et r a n s m e m b r a n e ( t m ) d o m a i n s ，t h et m 3o fw h i c hc o n t a i n s t h ec o n s e r v e d a m i l o r i d e - b i n d i n g s i t e s ( 7 s l f f y l l p p l 8 7 ) i na d d i t i o n ，t w op o t e n t i a ln g l y c o s y l a t i o ns i t e sw e r ef o u n dw i t h i nt h e z x n h x p r o t e i n ，a ta s n 4 4a n da s n 2 8 7 ，r e s p e c t i v e l y t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h ez x n - x p r o t e i ni sg l y c o s y l a t e d t h eg e n eh a sb e e ns u b m i t t e dt og e n b a n kd a t a b a s e ，t h ea c c e s s i o n n u m b e ri se u10 3 6 2 4 2 d e g e n e r a t ep r i m e r sw e r ed e s i g n e db a s e do nt h ec o n s e r v e ds e q u e n c e so ft h ea c t i n g e n e sf r o mo t h e rp l a n t s t h ef r a g m e n to fa c t i ng e n ew a si s o l a t e df r o mzx a n t h o x y l u mb y r t - p c r ，a n dn a m e da sz x ac t t h es e q u e n c i n gr e s u l tr e v e a l e dt h a tt h ea c t i ng e n e 兰州人学坝i j 学化论文多浆旱生植物霸卜液泡膜n a t l + 逆向转运负l ，j 桀l 大l 的克降殷表达分析 j , m i ii i ii_ i i 曼寰曼曼曼璺 f r a g m e n tf r o mzx a n t h o x y l u mi s5 9 8b pi nl e n g t h 。e n c o d i n gap r o t e i no f19 8a m i n oa c i d s h o m o l o g yc o m p a r i s o nw i t ho t h e rp l a n t sa c t i ng e n es e q u e n c e si nt h eg e n b a n ks h o w st h a t i ts h a r e so v e r8 2 n u c l e o t i d es e q u e n c eh o m o l o g ya n d91 a m i n oa c i ds e q u e n c e h o m o l o g yw i t ho t h e rp l a n t sa c t i n s t h eg e n eh a sb e e ns u b m i t t e dt og e n b a n kd a t a b a s e ，t h e a c c e s s i o nn u m b e ri se u 019 5 5 0 3 s e m i q u a n t i t m i v er t p c ra n a l y s i sr e s u l t ss h o w e dz x n h x w a se x p r e s s e ds t r o n g l y i nl e a v e sw h i l ew e a k l yi nr o o t s t h et r a n s c r i p tl e v e lo fz x n h xi nt h el e a v e sw a s u p r e g u l a t e db y15 0o r2 0 0m m o l l n a c i ，a n dh i g h e s ta t3o r 12h t h e s er e s u l t s s u g g e s t e dt h ee x p r e s s i o no fz x n h xw a s i n d u c e da n dr e g u l a t e db ys a l ts t r e s s s u c c u l e n tx e r o p h y t e ，z y g o p h y l l u mx a n t h o x y l u m ，v a c u o l a rn a + h + a n t i p o r t e r , z x n h x , s a l t a n dd r o u g h t - t o l e r a n c e ，e x p r e s s i o na n a l y s i s v l i 缩写词表 l i s to fa b b r e v i a t i o n s 缩写英文名称 a b a a b i 迮 a m p a p b p c a m c d s c d n a c i p d d h 2 0 d e p c d n t p d t t e b e d t a e c o l i h + a t p 旷p p a s e h k t i p g t k d a l b m l n m o p c m p a m i 州a n h x n p a b s c i s i ca c i d a b a r e s p o n s i v ee l e m e n t a m p i c i l l i n a c t i np r i m e r b a s ep a i r c a l m o d u l i n c o d i n gs e q u e n c e c o m p l e m e n t a r yd n a c a l fi n t e s t i n a lp h o s p h a t a s e d i s t i l l e da n dd e i o n i z e dw a t e r d i e t h y p y r o c a r b o n a t e d e o x y 曲o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t d i t h i o t h r e i t o e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d e s c h e r i c h i ac o l f h + - t r a n s l o c a t i n ga d e n o s i n et r i p h o s p h a t a s e h + - t r a n s l o c a t i n gi n o r g a n i cp y r o p h o s p h a t a s e h i g h a f f i n i t yk 十t r a n s p o r t e r i s o p r o p y l p d t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e k i l o d a l t o n l u r i a b e r t a n im e d i u m m i n u t e m o r p h o l i h op r o p a n e s u l f o n i ca c i d m e g a p a s c a l m e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i d v a c u o l a rn a + r r 。a n t i p o r t e r n e s t e dp r i m e r i i i 中文名称 脱落酸 a b a 应答元件 氨苄青霉素 肌动蛋白的引物 碱基对 钙调素 编码序列 互补d n a 小牛肠磷酸酶 重蒸水 焦碳酸二乙酯 脱氧核糖核苷三磷酸 二硫苏糖醇 溴化乙啶 乙二胺四乙酸 大肠杆菌 质子转运三磷酸腺苷酶 质子转运无机焦磷酸化酶 高亲和性钾通道 异丙基硫代p d 半乳糖 苷 千道尔顿 l b 培养基 分钟 吗啉代丙烷磺酸 兆帕 信使r n a 液泡膜n a + h + 逆向转运蛋 白 巢式引物 兰州人学r i ! i ! i j 学化论文多浆旱生十r f 物霸i i 液泡膜n a + 川4 逆向转运生1 i 壮i 大l 的兜降及表达分析 o d o r f p c r p e g p i p m p v p r o s r m p r n a r r n a r n a g e r t s d s t a p t m t r i s u l 订 x - g a l o p t i c a ld e n s i t y o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o l y e t h y l e n eg l y c o l i s o e l e c t r i cp o i n t p l a s m am e m b r a n e p o l y v i n y l p y r r o l i d o n r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s r o u n dp e rm i n u t e r i b o n u c l e i ca c i d r i b o s o m a lr i b o n u c l e i ca c i d r i b o n u c l e a g e r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n s o d i u md o d e c y ls u l p h a t e t o b a c c oa c i dp y r o p h o s p h a t a s e t r a n s m e m b r a n e t r i s - ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e u n t r a n s l a t e dr e g i o n 5 - b r o m o 4 c h l o r o - 3 一i n d o l y l - p d - g a l a c t o s i d e 光密度 开放阅读框 聚合酶链式反应 聚乙二醇 等电点 质膜 聚乙烯毗咯烷酮 活性氧 辕| 食镄 核糖核酸 核糖体r n a 核糖核酸酶 反转录 十二烷基硫酸钠 烟酸磷酸酶 跨膜区 三( 羟甲基) 胺基甲烷 非翻译区 5 一溴4 氯3 吲哚p d 半 乳糖苷 原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立进 行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成 果、数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内容 外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文 的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：堑多国墨垦日期：三丛 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属 兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定，同 意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许 论文被查阅和借阅；本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和汇编本学 位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相关的学术论 文或成果时，第一署名单位仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：塑导师签名 兰州1 人学顺i j 学位论文多浆甲尘植物霸i i 液泡膜n a + h 逆们转运生由堆的克降发表达分析 第一章前言 盐胁迫是导致农作物减产的主要非生物因素之一( b o y e r ，1 9 8 2 ；q u e s a d ae ta 1 ， 2 0 0 0 ) 。土壤中过高浓度的n a + 会扰乱植物细胞离子平衡，导致膜功能失调和代谢活动 的减弱，从而抑制生长并最终导致细胞死亡( h a s e g a w ae ta 1 ，2 0 0 0 ) 。植物抵御n a + 毒害 的主要策略是要么将n a + 从细胞中外排，要么将其区域化到液泡( f r o m m e re ta 1 ， 1 9 9 9 ) 。前者可能是通过质膜n a + h + 逆向转运蛋白完成的；而后者是通过液泡膜n a + m 十 逆向转运蛋白完成的( b l u m w a l d ，1 9 8 7 ) 。研究表明，液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白在 液泡膜h + - a t p a s e 币i i h + - p p a s e 的驱动下，将细胞质中过多的n a + 区域化在液泡内，以减 轻过量n a + 对细胞质的伤害，同时维持细胞的渗透势，从而提高植物的抗旱性和耐盐 性( b l u m w a l da n dp o o l e ，1 9 8 5 ；1 9 8 7 ；b l u m w a l d ，1 9 8 7 ) 。 液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白的活性首次是在甜菜根中检测到的( b l u m w a l da n d p o o l e ，1 9 8 5 ) ，此后在盐生植物和甜土植物中均有发现。a p s e 等( 1 9 9 9 ) 在拟南芥中 鉴定出第一个高等植物的液泡膜n a 十h + 逆向转运蛋白基因a t n h x l ，随后在其他高等 植物上克隆到了编码该蛋白的基因，如盐生植物北滨藜a g n h x l ( h a m a d a e la 1 ，2 0 0 1 ) 、 獐毛a l n h x ( z h a n g e ta 1 ，2 0 0 8 ) ，以及甜土植物玉米z m n h x l ( z 6 r be la 1 ，2 0 0 5 ) 、小 麦t a n h x 2 ( y ue la 1 ，2 0 0 7 ) 等。a p s e 等( 1 9 9 9 ) 研究表明，过量表达a t n h x i 的转基因 拟南芥植株在2 0 0m m o l l 。1n a c i 中能正常生长发育。x u e 等( 2 0 0 4 ) 将a t n h x l 转入小 麦，使生长在盐碱地上的小麦产量有所提高。r a j a g o p a l 等( 2 0 0 7 ) 将珍珠栗( p e n n i s e t u m g l a u c u m ) p g n h x l 在油菜( b r a s s i c a u n c e a ) 中过量表达，转基因植株能够在 2 0 0 m m o l l jn a c i 下能够f 常生长、开花和结实。这些结果有力地证明了液泡膜 n a + h + 逆向转运蛋白基因在植物耐盐性方面的重要作用，但有关其在荒漠多浆旱生植 物适应干旱逆境中的作用还未见报道。 霸t _ ( z y g o p h y l l u mx a n t h o x y l u m ) 属蒺藜科，强旱生肉质灌木，属亚洲特有属( 赵 一之和朱宗元，2 0 0 3 ) ，广泛分布于我国西北地区干旱荒漠草地，为内蒙古西部荒漠 草地的优势植物种，多生长于干旱的砂地、多石砾地及覆沙地上。霸王的枝叶均可饲 用，不仅是天然草场的优良牧草之一，而且也是优良的栽培牧草。本实验室的前期研 究表明，霸王根系能够从含盐量很低的干旱土壤中吸收大量n a + ，将其储存于液泡中 作为一种有益的渗透调节剂来适应干旱环境( w a n ge la 1 ，2 0 0 4 ) ；在不同强度的渗 透胁迫( 一0 5 、1 0 和1 5m p a ) 下，5 0m m o l l 。1 n a c i 能显著提高霸王的抗旱能力， 减轻渗透胁迫对细胞膜系统的伤害( 李三相，2 0 0 6 ) 。然而，有关霸王液泡n a + 区域 化功能蛋白n a 十h + 逆向转运蛋白的研究尚未见报道。鉴于此，本研究从多浆旱生植 物霸王中分离、鉴定液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白基因，以期进一步揭示霸王的耐盐 抗旱机制，从而为农作物和优良牧草耐盐抗旱性的遗传改良奠定基础。 兰州1 人字坝i ：学位论义多浆旱生机物锅i 液泡膜n a + 1 t 逆向转运生 j 坫l 大i 的兜降及表达分析 第二章国内外研究进展 盐胁迫是全世界范围内造成作物减产的主要非生物因素之一( b o y e r 1 9 8 2 ； q u e s a d ae ta 1 ，2 0 0 0 ) 。土壤中过高的n a + 对大多数植物，特别是农作物的伤害主要表 现在3 个方面：( 1 ) 土壤中较高的盐浓度导致水分亏缺；( 2 ) 植物吸收水分的同时 吸收了过多盐离子带来的离子毒害，特别是n a + ：( 3 ) 过多摄入n a 十引起k + 烈a + 失衡。 无论是甜土植物( g l y c o p h y t e ) 、还是盐生植物( h a l o p h y t e ) ，其细胞质酶对过高的n a + 浓度都十分敏感( f l o w e re la 1 ，1 9 7 7 ；g l e n ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 。过高的n a + 使植物新陈代谢异 常、扰乱植物对k + 和其它矿质营养元素的吸收、产生渗透胁迫并诱发诸如氧化胁迫等 次生胁迫作用( h a s e g a w ae ta 1 ，2 0 0 0 ) ，从而使植物的生长受到抑制、甚至导致植物的 死亡，对农业生产构成严重的威胁( z h u ，2 0 0 1 ) 。大量研究表明，植物抵御盐胁迫的 有效策略之一是通过液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白将细胞质中过多的n a + 区域化在液 泡，一方面降低过多n a + 对细胞质的毒害，另一方面又可将n a + 作为一种有益的渗透调 节剂来降低细胞的渗透势( b l u m w a l da n dp o o l e ，1 9 8 5 ；a p s ee ta 1 ，1 9 9 9 ) ，并促进k + 的吸 收( w ue ta 1 ，1 9 9 6 ；g a x i o l ae ta 1 ，2 0 0 1 ) ，使植物能更好地适应盐渍生境。因此，液泡 膜n a + h + 逆向转运蛋白是一种重要的耐盐决定因子，在植物耐盐性的遗传改良中具有 重要应用价值( m o f f a t ，2 0 0 2 ；s h ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 。近年来，有关液泡膜n a + h + 逆向转运蛋 白的研究受到学术界的广泛关注，现将该领域的研究进展概述如下。 1 液泡膜n a + 小+ 逆向转运蛋白的发现 n a + 的跨液泡膜转运及其在液泡的区域化是植物耐盐性的重要机理( n i u 甜讲， 1 9 9 5 ) ，盐生植物以及较耐盐的甜土植物的这个生化过程是由液泡膜n a + h + 逆向转运 蛋白完成的，它主要依靠于液泡膜上的2 个质子泵h + - a t p a s e 和h + - p p a s e 所产生的 质子梯度( b l u m w a l d ，1 9 8 7 ；d u p o n t ，1 9 9 2 ) 。b l u m w a r d 和p 0 0 1 ( 1 9 8 5 ) 首次在甜菜( b e t a v u l g a r i u s ) 根中发现了液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白的活性。随后，人们相继在盐生植 物如北滨藜似t r i p l e xg m e l i n i i ) ( m a t o he ta 1 ，1 9 8 7 ) 、盐生车f i t i ( p l a n a g om a r i t i m a ) ( s t a a l e ta 1 ，1 9 9 1 ) 、冰叶同中花( m e s e m b r y a n t h e m u mc r y s t a l l i n u m ) ( b a r k l ae ta 1 。1 9 9 5 ) 、 盐地碱蓬( s u a e d as a l s a ) ( m ae ta 1 ，2 0 0 4 ) 以及较耐盐的甜土植物如大麦( h o r d e u m v a l g a r o ) ( g a r b a r i n oa n dd u p o n t ，19 8 8 ；19 8 9 ) 、长春花( c a h a r a n t h ur o s e u s ) ( g u r e ne ta 1 ， 19 8 9 ) 、棉花( g o s s y p t u mh i r s u t u m ) ( h a s s i d i me ta 1 ，19 9 0 ) 、向同葵( h e l i a n h u s a n n v v s ) ( b a l l e s t e r o se ta 1 ，19 9 7 ) 、拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) ( a p s ee ta 1 ，19 9 9 ) 等中 检测到了这种蛋白。但这类蛋白在植物细胞中并不是普遍存在的，如在陆地棉 ( g o s s i p i u mb i r s u t u m ) 中就不存在( m e r m e ne ta 1 ，19 9 0 ；b a l l e s t e r o se ta 1 ，19 9 7 ) 。 2 兰州人学坝i j 学位论艾多浆早生情物霸i i j ( 泡膜n a + h 逆n 转运生【，j 壮w 的克降及衣丛分析 2 液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白的分子克隆 液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白的分子克隆始于酵母( s a c c h a r o m y c e s ce r e v i s i a e ) 。n a s s 等( 1 9 9 7 ) 通过对酵母质膜h + - a t p a s e 功能缺失突变体( p m a l ) 的研究，发现该突变体 具有较高的耐盐性和低的胞质n a + 浓度，发现酵母除了通过质膜h + - a t p a s e 提供的能 量将n a + 外排这一机制外，还存在细胞内的n a + 区隔化机制。随后，n a s s 等( 1 9 9 7 ) 克 隆到一个编码n a + h + 逆向转运蛋白的基因s c n h x l ，研究发现该基因的突变体对盐极 为敏感，且s c n h x l 与g f p 的融合表达显示s c n h x l 蛋白定位于前液泡区。由此表明， 该蛋白属于液泡膜上的n a + h + 逆向转运蛋白。 a p s e 等( 1 9 9 9 ) 在拟南芥中克隆出第一个高等植物的液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白 基因a t n h x l 。此后，人们相继在其它高等植物中克隆出编码液泡膜n a + h + 逆向转运 蛋白的基因( 表2 1 ) ，但绝大多数来自甜土植物或盐生植物。 在克隆液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白基因的过程中，许多研究者还发现有些高等植 物的液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白拥有数个同功酶( i s o f o r m ) ，并且在很多植物中也克隆 出了编码该蛋白的同源基因( h o m o l o g o u sg e n e ) 。例如，编码水稻液泡膜n a + h + 逆向转 运蛋白的同源基因至少有5 个( o s n h x l 5 ) ( p a r d oe ta 1 ，2 0 0 6 ) ，拟南芥中至少有6 个 ( 彳t n h x l 6 ) ( y o k o ie ta 1 2 0 0 2 ；a h a r o ne ta 1 ，2 0 0 3 ) ，玉米中也有6 个( z m n h x l 6 ) ( z 6 r be ta 1 ，2 0 0 5 ) ，大麦中至少有2 个( h v n h x l 2 ) ( f u k u d ae ta 1 ，2 0 0 4 ) ，同本牵 牛中也有2 个( i n n h x i 2 ) ( y a m a g u c h ie t a l ，2 0 0 1 ；o h n i s h ie t a l ，2 0 0 5 ) 。研究发现， 这些同源基因的编码区保守性较高，但其非编码区的保守性却很低。因此，液泡膜 n a + h + 逆向转运蛋白是一个多基因家族。 大量研究表明，大多数液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白基因含有1 4 1 0 1 6 8 0 个核苷酸 的开放阅读框( o i 讧) ，编码大约4 7 0 5 6 0 个氨基酸残基( 表2 1 ) ，推测分子量从4 7k d a 到1 7 9k d a 不等。例如拟南芥a t n h x l 分子量为4 7k d a ( a p s ee ta 1 ，1 9 9 9 ) ，葡萄 v v n h x l 则为6 0k d a ( h a n a n ae ta 1 ，2 0 0 7 ) ，北美海蓬子s b n h x l 为6 2k d a ( 肖前谷等， 2 0 0 7 ) ，而菊芋h t n h x l 高达1 7 8 5k d a ( 严一诺等，2 0 0 7 ) 。由此可见，不同植物液泡 膜n a + 脚逆向转运蛋白的多肽大小变化较大，分子量具有一定差异性。说明液泡膜 n a + h + 逆向转运蛋白在进化上可能具有多样性。 序列分析表明，液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白在不同种类植物间的同源性有所不同 ( h a m a d ae ta 1 ，2 0 0 1 ；z 6 r be la 1 ，2 0 0 5 ；严一诺等，2 0 0 7 ) 。如盐生植物番杏t t n h x l 和盐角草s s n h x l 与北滨藜a g n h x l 的同源性很高，而与甜土植物水稻o s n h x l 的同 源性很低( 吕慧颖等，2 0 0 4 ) 。此外，同一种植物的液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白家族 成员间的同源性也有所差异。如在拟南芥n h x 家族中，根据同源性将其成员分为i 型和i i 型( b r e t t ，2 0 0 5 ) ，i 型( a t n h x l 4 ) 成员问的同源性为5 4 8 7 ，i i 型 兰州人学坝卜学位论文 多浆日生植物霸i i 液泡膜n a i + 逆向转运生fj 埭l 太i 的兜降及表达分析 ( a t n h x 5 6 ) 为7 9 ，而i 型与i i 型之i 日j 的同源性仅为2 1 2 3 ( 表2 2 ) ( y o k o ie ta 1 ， 2 0 0 2 ) 。由此说明液泡膜n a + ，h + 逆向转运蛋白是一个高度异源的蛋白质群体，它们可 能是由不同祖先蛋白经趋同进化而来。 表2 1 高等植物液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白 ! 苎坐：! ! 生：兰1 21 兰! 型! ：坚! 里! 坐璺! ：! 1 2 竺：兰! 1 2 兰：坐! ! 121 竺坚 物种幕冈名称 基| 大l 库弩录。j 氩挂睃残堆数 参考文献 物种 幕冈名称 参考义献 g e n b a n ka c c e s s i o na m i n oa c i dr e s i d u e s p e c i e s g e n en a m e s r e f e r e n c e s n o n u m h e r s 水稻o r ) c _ as a t i v a o s n h x ia b 0 218 7 85 3 5 f u k u d ae ta 1 ，1 9 9 9 北滨藜a 帅l e xg m e l i n i a g n h x i a b 0 3 8 4 9 25 5 5h a m a d ae la 1 2 0 0 1 耐f 菜b e t av u l g a r i s 柑橘c i t r u s p a r a d i s i 番茄l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m 油菜b r a s s i c an a p u s 棉仡g o s s y p i u mh i r s u t u m 盐地碱蓬s u a e d as a l s a 番杏t e t r a g o n i at e t r a g o n i o i d e s 玉米z e a m a y s 月季r o s ah y b r i d a 人麦h o r d e u mv u l g a r e l j 奉牵牛l p o m o e an i l 大豆g l y c m em a x 刺槐r o b i n i ap s e u d o a c a c i a 胡杨p o p u l u se u p h r a t i c a 杨树p o p u l u st o m e n t o s a 长穗假麦草a g r o p y r o ne l o n g a t u m 菊芋h e l i a n t h u st u b e r o s u s 珍珠栗p e n n i s e t u mg l a u c u m 小麦t r i t i c u ma e s t i v u m b v n h x l c n h x l l e n h x l b n n h x | g h n h x i s s n h x l n n h x | z m n h x l z m n h x 2 z m n h x 3 z m n h x 4 z m n h x 5 z m n h x 6 r h n h x l l v n h x 2 f n n h x 2 g m n h x l r p n h x i p e n h x 2 p t n h x i p t n h x 6 a e n h x l h t n h x t p g n h x i t n n h x 2 a y1 8 9 6 7 6 a y 0 2 8 41 6 a j 3 0 6 6 3 0 a y l 8 9 6 7 6 a f 5 1 5 6 3 2 a f 3 7 0 3 5 8 a f 5