（植物学专业论文）金粟兰花发育相关基因的结构、功能和进化研究.pdf

摘要 摘要 花是被子植物区别于其它植物大类群的最重要的特征，其形态多种多样。 花的发育取决于一个复杂的涉及到多个基因和过程的调控体系，因此花的起源 和多样化过程实际上可以理解为这个调控体系的进化过程。在被子植物的不同 物种中，花发育相关基因的组成并不相同，且经历了不同的进化历史，这意味 着这些基因可能以不同的方式调控花的发育。相对于核心真双子叶植物相对稳 定的花形态结构而言，基部被子植物的花具有丰富的多样性。因此，对基部被 子植物花发育相关基因的研究对于我们理解被子植物花的进化非常重要。 金粟兰科( c h l o r a n t h a c e a e ) 是基部被子植物的代表类群之一。与研究得比 较深入的模式植物相比，花被、雄蕊或雌蕊的缺失，使得该科植物的花比较简 单。因此对该科植物中花发育基因的研究不仅有助于揭示花的起源以及花多样 性分化的分子机制，还将为认识花部构造简单化的机制提供资料。本文以金粟 兰( c h l o r a n t h u ss p i c a t u s ) 为实验材料，取得了以下研究结果： 1 花发育相关基因的克隆 应用5 3 r a c e 的方法，我们从金粟兰不同发育阶段的混合花芽中克隆到 了与花发育相关的m a d s b o x 基因：c s p i 、c s a g l 和c s a g 2 。 2 两个a 类m a d s b o x 基因表达式样的对比分析 在营养分生组织向生殖分生组织的转变中，花原基的形成，以及随后雄蕊、 心皮、花粉、胚珠和胚囊的发育中，c 叫p j j 和c s a p l 2 基因均表达。唯一不 同之处在于，在花发育成熟期，c s a p l 一j 在外珠被也有表达，而c s a p i 2 在外珠 被处没有表达，而只在内珠被处表达。这一结果反映了基因重复事件发生后， 两个基因在功能上也有了一些分化。 3 b 类基因功能的保守性和多样性 通过转基因实验和蛋白质相互作用研究对b 类基因的功能和作用方式进行 了研究，得到以下结果：1 ) 金粟兰c s a p 3 基因的c 木端的点突变所造成的 p a l e o a p 3 基元的部分缺失对该基因的功能没有决定性的影响；2 ) 金粟兰 p a l e o a p 3 型基因c s a p 3 所编码蛋白的c 末端以及p a l e o a p 3 基元，与拟南芥e u a p 3 型基因a t a p 3 所编码蛋白的c 术端以及e u a p 3 基元没有功能上的不同；3 ) 金 粟兰p a l e o a p 3 型基因c s a p 3 与拟南芥e u a p 3 型基因a t a p 3 的主要功能存在一 金粟兰花发育相关基因的结构、功能和进化研究 定差异，前者主要参与雄蕊形成，而后者既参与雄蕊的形成也参与花瓣的形成； 4 ) c s p i 基因所编码的蛋白可以与a p 3 类蛋白相互作用进而影响花瓣的形成， 因此该基因在功能上是保守的。 4 金粟兰c s a g l 基因的序列结构和功能分析 通过序列结构分析发现，c s a g l 属于c 类基因，具有保守的a gi 基元和 a gi i 基元。过量表达实验分析表明c s a g l 的功能与a 类基因的功能是相拮抗 的。 5 各类m a d s d o m a i n 蛋白间的相互作用 在前面工作的基础上，我们首次对金粟兰中各类m a d s d o m a i n 蛋白间的作 用方式进行了研究。酵母双杂交结果表明：1 ) c 末端的完整性对于m a d s d o m a i n 蛋白二聚体的形成没有影响：2 ) 去掉m 区的c s a p 3 蛋白与c s p i 蛋白都能够形 成异源二聚体，同时它们又可以各自形成同源二聚体；3 ) e 类蛋白既可以和a 类或c 类基因产物相互作用，也可以同a p 3 和p i 型蛋白相互作用，充分体现了 e 类基因产物作用式样的保守性：4 ) 金粟兰中，f u l 1 i k e 型基因所编码的蛋白 c s a p l 1 与c s s e p 3 和c s a g l 也能形成异源二聚体，这与核心真双子叶植物的 e u f u l 型蛋白在作用式样上是非常相似的。然而，金粟兰c s a p l 1 蛋白不能形 成同源二聚体。 综合以上结果发现，在无花被的金粟兰中，仍然存在着a 、b 、c d 、e 类 花发育相关的基因。这些基因的功能与核心真双子叶植物中同类基因的相比， 有些是保守的，比如c s p i 基因可以参与花被的形成；但也有一些是不同的，比 如c s a p 3 基因主要参与雄蕊形成而非花被形成过程。由此可以看出被子植物花 器官的发育是一个非常复杂的调控过程，不同植物中的调控机理及进化历程可 能是不同的。 关键词：金粟兰：基部被子植物：花被；花器官特征基因；m a d s b o x 基因；功 能与进化；蛋白间的相互作 a b s t r a c t a s t u d y o ns t r u c t u r e ，f u n c t i o na n de v o l u t i o no ft h e m a d s - b o x g e n e si n v o l v e di nf l o r a ld e v e l o p m e n t i n c h l o r a n t hu ss p i c a t u s k u n - m e is u ( b o t a n y ) d i r e c t e db yp r o f z h i - d u a nc h e n ，p r o f z h e n gm e n ga n dp r o f h o n g - z h ik o n g a bs t r a c t f l o w e ri so n eo ft h ek e yc h a r a c t e r i s t i c so ft h ea n g i o s p e r m s ，t h ea r c h i t e c t u r eo f w h i c hi sc o m p l e xa n dd i v e r s e t h ef o r m a t i o na n dd e v e l o p m e n to ff l o w e r sa r e d e t e r m i n e db yac o m p l e xr e g u l a t o r ys y s t e mo fn u m e r o u sg e n e s t h u st h ee v o l u t i o no f f l o w e rc a nb er e g a r d e da st h ee v o l u t i o no ft h i s r e g u l a t o r ys y s t e m t h eg e n e c o m p o s i t i o ni sd i f f e r e n ti nd i v e r s i f i e dg r o u p so fa n g i o s p e r m s ，w h i c hi m p l i e st h a tt h e g e n e sm i g h tr e g u l a t et h ef l o r a ld e v e l o p m e n ti nv a r i o u sp a t t e m sb e c a u s et h e yh a v e e x p e r i e n c e dd i f f e r e n te v o l u t i o n a r yh i s t o r i e s c o m p a r e dw i t ht h ef l o w e r so fc o r e e u d i c o t s ，o fw h i c ht h eo r g a n i z a t i o ni sf a i r l yc o n s t a n t , f l o w e r so fb a s a la n g i o s p e r m s a r ed i v e r s i f i e di nm o r p h o l o g y t h u s ，t h ed e t a i l e ds t u d i e so ff l o r a ld e v e l o p m e n t g e n e s f r o ms p e c i e so fb a s a la n g i o s p e r m sa r en e c e s s a r y c h l o r a n t h a c e a ei sar e p r e s e n t a t i v et a x o ni nb a s a la n g i o s p e r m s d i f f e r e n tf r o m t h ew e l l s t u d i e dm o d e lp l a n t so fc o r ee u d i c o t s ，s u c ha sa r a b i d o p s i st h a l i a n aa n d a n t i r r h i n u mm a j u $ ，t h ec h l o r a n t h a c e a eh a v em u c hr e d u c e df l o w e r sb e c a u s eo fl o s so f p e r i a n t ha sw e l la sa n d r o e c i u mo rg y n e o c i u m t h e r e f o r e ，ad e e ps t u d yo nt h ef l o r a l g e n e so ft h ec h l o r a n t h a c e a ew i l ln o to n l yi m p r o v eo u ru n d e r s t a n d i n go ft h e m e c h a n i s mb yw h i c ht h ef l o w e r sa n da n g i o s p e r m sh a do r i g i n a t e da n dd i v e r s i f i e d ，b u t a l s oh e l pu sg a i ni n s i g h ti n t ot h em e c h a n i s mb yw h i c hr e d u c e df l o w e r sh a de v o l v e d i nt h i ss t u d y , w ei n v e s t i g a t e dt h ef u n c t i o no ft h em a d s - b o xg e n e st h a tc l o n e df r o m c h l o r a n t h u ss p i c a t u s ，f l o w e r so fw h i c ha r ep e r i a n t h l e s s t h er e s u l t sa r es u m m a r i z e d a sf o l l o w s ： 、i s o l a t i o no fc s a g l c s a g 2a n dc s p i i i i 金粟兰花发育相关基冈的结构、功能和进化研究 t h r e em a d s - b o xg e n e si n v o l v e di nf l o r a ld e v e l o p m e n tw e r ei s o l a t e df r o m f l o r a lb u d so fc - s p i c a t u sw i t h5 a n d3 r a c em e t h o d s t h e yw e r ed e s i g n a t e d c s a gi ，c s a g 2a n dc s p , r e s p e c t i v e l y 2 t h ee x p r e s s i o np a t t e r no fc s a p l 一ja n dc s a p l 2w e r ea n a l y z e du s i n gi ns i t u h y b r i d i z a t i o n t h e ya r ee x p r e s s e di ni n f l o r e s c e n c em e r i s t e m s ，f l o r a lp r i m o r d i a , s t a m e na n d c a r p e lp r i m o r d i a ，a n dm a t u r ef l o w e r si n c l u d i n ga n d r o e c i a ll o b e s ，t h e c a e ，c a r p e l sa n d o v u l e s ，a n de m b r y os a c s c s a p l 一ji se x p r e s s e di nb o t ht h eo u t e r - i n t e g u m e n ta n d i n n e r - i n t e g u m e n t ，w h i l ec s a p l - 2 i se x p r e s s e do n l yi nt h ei n n e r - i n t e g u m e n t 3 c o n s e r v a t i o na n d d i v e r g e n c eo f c l a s sb g e n e sf r o mc h l o r a n t h u ss p i c a t u s o u rr e s u l t so ft r a n s g e n i c e x p e r i m e n ta n da n a l y s i s o np r o t e i ni n t e r a c t i o n i n d i c a t e dt h a t ：1 ) t h ec o d o nm u t a t i o ni nt h ep a l e o a p 3m o t i fh a sn oe f f e c to nf u n c t i o n o ft h ec s a p 3p r o t e i n ；2 ) t h ec h i m e r i cp r o t e i na t a p 3 p c m ，o fw h i c ht h ee u a p 3m o t i f w a sr e p l a c e dw i t hf u l l l e n g t hp a l e o a p 3 m o t i ff r o mc s a p 3 m ，i sc a p a b l eo f i d e n t i f y i n ga n dp r o p e r l yr e g u l a t i n gt h eg e n e sn e c e s s a r yf o rp r o p e rp e t a la n ds t a m e n d e v e l o p m e n ti nf l o w e r so fa r a b i d o p s i s ；3 ) t h ea n c e s t r a lp a l e o a p 3 一l i n e a g eg e n e c s a p 3 ，w h i c hm a i n l yf u n c t i o n so ns t a m e ni d e n t i t y ，i sd i f f e r e n tf r o me u a p 3 一l i n e a g e g e n ea t a p 3t h a tf u n c t i o n so nb o t hs t a m e na n dp e t a li d e n t i t y ；qc s p ii s a b l et o i n t e r a c tw i t ha p 3 - l i k eg e n e s ，a n dh a st h ec o n s e r v a t i v ef u n c t i o no fp e t a li d e n t i t y 4 f u n c t i o no ft h ec s ag 1g e n e c s ag 1i sac a n d i d a t ec l a s s - cg e n e ，o fw h i c ht h ec t e r m i n u sc o n t a i n sb o t ha gi m o t i fa n da gi im o t i f o u ro b s e r v a t i o n so ft h ew i l d t y p ea r a b i d o p s i sc o n t a i n 3 5 s ：c s ag 1d e m o n s t r a t e dt h a tt h eaa n dcf u n c t i o n sn e g a t i v e l yr e g u l a t ee a c ho t h e r 5 i n t e r a c t i o np a t t e r n sb e t w e e nd i f f e r e n tm a d s - d o m a i n p r o t e i n s w ee x p l o r e dt h ei n t e r a c t i o nb e h a v i o r o ft h em a d s d o m a i n p r o t e i n s i n c h l o r a n t h u ss p i c a t u su s i n gy e a s tt w o - h y b r i ds y s t e mf o rt h ef i r s tt i m e o u rr e s u l t s d e m o n s t r a t e dt h a t ：1 ) t h ec t e r m i n a lr e g i o no fc s a p 3h a sn oe f f e c to ni t sf u n c t i o n w i t ho t h e rp r o t e i n s ；2 ) m a d s d e l e t e dc s a p 3 p r o t e i n c a ni n t e r a c tw i t h m a d s d e l e t e dc s p i ，a n db o t hp r o t e i n sc a l lf o r mh o m o d i m e r s ；3 ) c s s e p 3c a nf o r m h e t e r o d i m e r sw i t hc s a p1 一l ，m a d s - d e l e t e dc s a p 3 ，m a d s d e l e t e dc s p i ，c s a gl ， s u g g e s t i n g t h a tt h es e p l i k ep r o t e i n sf r o md i f f e r e n ta n g i o s p e r ms p e c i e ss h a r e i v c o n s e e di n t e m c t i o nb e h a v i o r ；4 ) c s a p 1 1i sa b l et oi n t e r a c tw i t hc s s e p 3a 1 1 d c s a g1 ，w h i c hi s s i m i l a rt o t h ei n t e r a c t i o np a t t e r n so fe u f u lp r o t e i n s o fc o r e i nc o n c l u s i o n ，t h e r ea r eg e n e sr e l e v a n tt op e r i a n t hd e v e l o p m e n t i nc h o 阳胛缃螂 印f c 口f 淞，a l t h o u g h i t sf l o w e ri sp e r i a n t h l e s s s o m eo ft h e s eg e n e sr e m a m e dt n e c o n s e r v 撕v e劬c t i o n s u c h a sc s p lw h i c hr e m a i n e d t h ef u n c t l o no np e t a i d e v e l o p m e n t w h i l es o m eg e n e s s h o w e dd i s c r e p a n c yf u n c t i o nw i t ht h a t o t 也e h o m o l o g si nc o r ee u d i c o t s ，s u c ha s c s a p 3w h i c hm a i n l yf u n c t i o no nt h es t a m e n d e v e l o p m e n t b u tn o tp e t a ld e v e l o p m e n t o u r d a t as u g g e s t e dt h a tt h e f l o r a l d e v e l o p m e n tm a y b ed i f f e r e n ti nd i v e r s i f i e dg r o u p so fa n g i o s p e r m sb e c a u s e t h e yh a v e e x p e r i e n e e dd i f f e r e n te v o l u t i o n a r y h i s t o r i e s 1 ( e y w 。r d s ：c h l o r a 胛t h u ss p m 口t u s ；b a s a la n g i o s p e r i l l s ；p e r i a n t h ；向n c t i o n a n d e v o l u t i o n ；f l o r a lo 唱a ni d e n t i t yg e n e ；m a d s - b o xg e n e ；p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n v 金粟兰花发育相关基因的结构、功能和进化研究 主要符号说明 a m p ( a m p i c i l l i n ) a d e ( a d e n i n e ) b c i p ( 5 - b r o m o - 4 一c h l o r o 3 一i n d o l y l - p h o s p h a t e ) d e p c ( d i e t h y p y r o c a r b o n a t e ) d m f ( n d i m e t h y lf o r m a m i d e ) d n t p ( d e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e ) d t t ( d i t h i o t h r e i t 0 1 ) e d t a ( e t h y l e n e d i a m i n et e t r a c e t i ca c i d ) e s t ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ) h i s ( h i s t i n e ) i p t g ( i s o p r o p y l - 1 3 d - t h i o g a l a c t o s i d e ) l e u ( 1 e u c i n e ) n b t ( n i t r ob l u et e t r a z o l i u m ) p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) p e g ( p o l y e t h y l e n eg l y c 0 1 ) r a c e ( r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s ) q u a n t i t a t i v er e a l - t i m er t p c r s s c ( s t a n d a r ds a l i n ec i t r a t e ) t r p ( t r y p t o p h a n ) d m s o ( d i m e t h y l s u l f o x i d e ) 3 - a t ( 3 - a m i n o - 1 , 2 ，4 一t r i a z o l e ) 氨卞青霉素 腺嘌呤 5 溴一4 氯3 吲哚磷酸 焦碳酸二乙酯 二甲基甲酰胺 脱氧核苷三磷酸 二硫苏糖醇 乙二胺四乙酸 表达序列标签 组氨酸 异丙基d 硫代半乳糖苷 亮氨酸 氮蓝四唑 聚合酶链式反应 聚乙二醇 e d n a 术端的快速扩增 实时定量反转录p c r 标准柠檬酸钠盐 色氨酸 二甲基亚砜 3 氨基1 ，2 ，4 三唑 关于学位论文使用授权的说明 本人完全了解中国科学院植物研究所有关保留、使用学位论文的 规定，即：植物研究所有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅 和借阅；学校可以提供目录检索以及公布论文的全部或部分内容，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 学位论文作者签名： 谚绅7 够 如0 1 年莎月修日 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名： 苏坤7 垮 山0 年6 只l 譬e l 第一章前言 第一章前言 1 1 植物进化发育生物学 生物体既是在发育过程中自身基因相互作用以及基因与环境之问相互作用 的产物，也是在进化过程中突变与自然选择的产物。通常发育生物学家希望通 过研究性状形态的变化过程及其间基因表达和功能的改变，来揭示生物体发育 的基本规律；而进化生物学家的研究目的在于了解生物是如何进化的，以及如 何改变自身性状与形态的。生物体自身性状与形态改变的根源需要从控制个体 性状与形态的发育机制中寻找( g o o d m a na n dc o u g h l i n ，2 0 0 0 ) 。当科学家开始利 用与个体发育相关的基因的表达模式来解释一类生物是如何起源和分化的时 候，实际上进化发育生物学的研究就已经开始了，进化生物学与发育生物学的 结合也就是顺理成章的事了。生物在时间上有两种改变：单个生物体的( 个体 发育) 和生物谱系的( 系统发育) 进化历史。进化发育生物学的关键点在于其 认为第一类改变可为第二类改变提供重要的启示。新性状的进化大多源于新的 遗传突变的获得与固定( i r i s h ，2 0 0 2 ) 。此外，基因重复也可为新性状的产生提供 可能，因为通过基因重复事件产生的新基因一般会有新功能化 ( n e o f u n c t i o n i z a t i o n ) 、亚功能化( s u b f u n c t i o n i z a t i o n ) 以及假基因化 ( n o n f u n c t i o n i z a t i o n ) 这几种命运。因此，对于生物体而言，发育调控基因可能 是形态进化过程中的关键起始点，理解发育调控基因的系统发育对理解植物形 态的进化十分有益。进化发育生物学的主要目的是对生物迸化过程中的关键创 新性状和相关发育调控基因的进化进行研究，了解进化过程中新性状产生的发 育和遗传背景，分析主要相关基因的进化与发育途径改变和表型进化之间的关 系( h a l l ，2 0 0 3 ) 。 近十几年来，随着对模式植物拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 、金鱼草 ( a n t i r r h i n u mm a j u s ) 和水稻( o r y z as a t i v a ) 等的研究不断深入，人们发现了大 量与花、叶、根等植物器官发育相关的基因，并从结构、表达和功能等各个层 面对这些基因进行了研究。在模式植物中所取得的大量研究成果给植物进化发 育生物学的发展提供了良好的研究基础；而植物分子系统学的兴起，用基因序 列的系统发育关系来阐释植物类群间的亲缘关系，又为植物进化发育生物学提 金粟兰花发育相关基因的结构、功能和进化研究 供了有关进化研究的思路和方法，并使人们意识到对植物发育机制的进化研究 可以由模式植物种扩展到其他物种，可对来自不同类群的同源发育相关基因进 行进化分析，探究发育基因与植物进化的内在联系，将发育相关基因的进化与 植物本身的进化相融合，在遗传和发育的水平上解释进化问题。 1 2 花发育的调控机制及m a d s b o x 基因 从生理学角度，被子植物花的发育是一个保守的过程，包括以下几个阶段： 植物从营养生长向生殖生长的转变；花序分生组织的形成；花序分生组织分化为 花分生组织；以及花器官的形成。根据对拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 、金鱼草 ( a n t i r r h i n u mm a j u s ) 和矮牵牛( p e t u n i ah y b r i d a ) 等模式植物的分子和遗传学研 究结果表明，花的发育受多个转录因子调控，并且形成一个复杂的调控网络( 图 1 1 ) 。在该调控网络中，这些转录因子或者通过和其它转录因子共同作用或者直 接结合到靶基因的调控区，激活或抑制下游基因的表达，从而调控花的发育 ( t h e i s s e ne ta 1 ，19 9 6 ；t h e i s s e ne ta 1 ，2 0 0 0 ；d ef o l t e re ta 1 ，2 0 0 5 ) 。通过对拟南芥 花同源异型突变体及其相关基因的研究表明花器官的形成受多个基因的控制，而 且它们之间又是彼此关联的。在此基础上，c o e n 和m e y e r o w i t z ( 1 9 9 1 ) 提出了 花发育的a b c 模型。该模型认为控制花器官发育的基因按功能可以分为三大类： 即a 功能基因、b 功能基因和c 功能基因。a 功能基因单独作用控制萼片的发 育；a 和b 功能基因联合作用决定花瓣的形成；b 和c 功能基因联合作用控制 雄蕊的发育；c 功能基因独立作用调节心皮的形成，并且a 功能基因与c 功能 基因相互拮抗( c o e na n dm e y e r o w i t z ，1 9 9 1 ) 。因此，如果a 功能基因丧失会使 第一轮的萼片变成心皮，第二轮的花瓣变成雄蕊；b 功能基因丧失会使第二轮的 花瓣变成萼片，第三轮的雄蕊变成心皮；c 功能基因丧失会使第三轮的雄蕊变成 花瓣，第四轮的心皮变成萼片。在拟南芥中a 功能基因是a p e t a l aj ( a p l ) 和 a p e t a l a2 ( 彳p 2 ) ( m a n d e le ta 1 ，1 9 9 2 ；j o f u k ue ta l ，1 9 9 4 ) ，b 功能基因是 a p e t a l a3 ( a p 3 ) 和p i s t i l l a t a ( ) ( j a c ke ta 1 ，19 9 2 ；g o t oa n dm e y e r o w i t z ， 1 9 9 4 ) ，c 功能基因是a g a m o u s ( 彳g ) ( y a n o f s k ye ta 1 1 9 9 0 ) 。在另一模式植 物金鱼草中，相应的花器官特征基因( 或称为花器官实体基因，f l o r a lo r g a ni d e n t i t y g e n e ) 是s q u a m o s a ( s q u a ) ( h u i j s e r , 1 9 9 2 ) ；d e f i c i e n s ( d e f ) 和g l o b o s a ( g l o ) ( t r o b n e r e t a l 1 9 9 2 ) ；p l e n a ( p l e ) 和f a r i n e l l i ( f a r ) ( c a r p e n t e r 2 第一章前言 a n d c o e n , 1 9 9 0 ；d a v i e s “a 1 1 9 9 9 ) 。花发育的a b c 模型自提出之后不断地得到 发展。后来，在矮牵牛中，控制胚珠发育的基因f l o r a lb i n d i n g 艘d 疆肿 。酱。 删 。，禽。嗣蹋鬣& 趸瞪疆耍画 毫豳西 j 移 7 ， 图l l 拟南荠j 甩她* 哪自t h a l i a 加中花发育的调控网络。 m i k c 型m a d s b o x 基因( 方框所不) 对花的发生和发育是非常重要的。箭头表 示对下游基因具有促进作用：短直线表示对下游基因具有抑制作用。根据“花的四元 体模型”，m i k c 艰m a d s - d o m a i n 蛋白通过形成多聚体来调节花器官的形成( 0 i 自 k a u f m a a ne ta l ，2 0 0 5 ) 。 舢 = 一 一 一 鳜只公 一 一 金粟兰花发育相关基因的结构、功能和进化研究 ( 脚7 ) 和只炉j j 被分离，并将其命名为d 功能基因( a n g e n e n te ta 1 ，1 9 9 5 ； c o l o m b oe ta 1 ，1 9 9 5 ) 并提出了a b c d 模型( c o l o m b oe ta 1 ，1 9 9 5 ) 。在拟南芥 中与之对应的基因是a g a m o u 虬i k e1 1 ( 彳g l l l ) ，后来被命名为s e e d s t i c k ( s t k ) ( r o u n s l e ye ta 1 ，19 9 5 ；p i n y o p i c he ta 1 ，2 0 0 3 ) 。随着对花发育遗传学研究 的不断深入，发现拟南芥中的s e p a l l a t a1 2 3 4 ( 盟炉1 2 3 4 ) ( 即以前的a g l 2 ， 4 ，9 和3 ) 基因对于花以及花分生组织的形成不可或缺，并称它们为e 功能基因， 进而提出了a b c d e 模型( 图1 ) ( m ae ta 1 ，1 9 9 1 ；h u a n ge ta 1 ，1 9 9 5 ；m a n d e la n d y a n o f s k y , 19 9 8 ；h o n m aa n dg o t o ，2 0 01 ；t h e i s s e n ，2 0 01 ；d i t t ae ta 1 ，2 0 0 4 ) 。a b c d e 模型的提出标志着花部器官发育的充要条件被基本弄清( t h e i s s e n ，2 0 0 1 ) 。 与此同时，人们提出了关于这些基因间相互作用的分子机制的模型。著名的 “四聚体模型”认为花四轮器官的发育是由a 、b 、c 和e 类基因的蛋白质产物 所形成的四聚体决定的( t h e i s s e na n ds a e d l e r , 2 0 0 1 ) 。在拟南芥中， a p l a p l s e p s e p 四聚体使第一轮花器官发育成萼片，a p l 一a p 3 p i s e p 使第二 轮花器官发育成花瓣，a p 3 p i a g s e p 使第三轮花器官形成雄蕊， a g a g s e p s e p 使第四轮花器官形成心皮。此外，含有a 类基因产物的四聚体 会抑制含有c 类基因产物的四聚体的形成，反之亦然。这就是a 类和c 类基因 间的相互拮抗。根据“四聚体”模型，这些蛋白首先形成二聚体，这些二聚体能 与靶基因调控区的c a r ( 元件( 5 一c c a t g g 一3 ) 特异性结合。然后两个二聚体 通过蛋白的c 末端形成四聚体。最终四聚体激活或抑制靶基因的表达，从而在 特定的位置形成特定的花器官。该模型不仅是对经典的a b c 模型的进一步完善， 而且从蛋白质相互作用的角度对花发育的分子机制进行了深入的解释。 上述参与花发育遗传调控的基因中，大部分都是m a d s b o x 基因家族的成 员( s h o r ea n ds h a r r o c k s ，19 9 5 ；t h e i s s e ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。所有m a d s b o x 基因都拥 有一个高度保守的，大约长度为1 8 0 b p 的核苷酸序列，它们所编码的蛋白质序 列称为m a d s 结构域( m a d s d o m a i n ) ( s h o r ea n ds h a r r o c k s ，1 9 9 5 ) 。因此 m a d s b o x 基因所编码的蛋白质称为m a d s d o m a i n 蛋白。该基因家族的成员主 要包括两种类型：t y p ei 和t y p ei i ( a l v a r e z b u y u ae ta 1 2 0 0 0 ) 。在植物中，与花 发育相关的m a d s - b o x 基因主要是t y p ei i 基因。它们除了具有保守的m a d s 结 构域外，还拥有另外一个相对保守的k 结构域( k e r a t i n l i k ed o m a i n ) 。连接m a d s 结构域和k 结构域的是并不保守的i 区( i n t e r v e n i n gr e g i o n ) 。位于k 结构域下 游的是最不保守的c 末端区域( c a r b o x y l t e r m i n a lr e g i o n ) 。因此这类蛋白被称为 4 第一章前言 m i k c 型的m a d s d o m a i n 蛋白( t h e i s s e ne ta 1 ，1 9 9 6 ) 。m a d s 结构域通常包括 5 7 个氨基酸，它的n 末端是决定与d n a 结合的主要部位，而其c 末端负责蛋 白二聚体的形成( s h o r ea n ds h a r r o c k s ，1 9 9 5 ) 。i 区通常由3 l 3 5 个氨基酸组成， 含有较多亲水残基，使转录因子能够选择性地与靶d n a 结合( r i e c h m a n na n d m e y e r o w i t z ，1 9 9 7 ) 。k 结构域为植物m a d s b o x 基因所特有，大约由8 0 个氨基 酸组成，因其氨基酸序列和角蛋白( k e t a t i n ) 的卷曲螺旋结构类似，故得名。二 级结构分析表明k 结构域含有3 个位螺旋，即k 1 、k 2 和k 3 ，能形成两亲的螺 旋结构参与蛋白二聚体的形成( m ae ta 1 ，1 9 9 1 ；s h o r ea n ds h a r r o c k s ，1 9 9 5 ；y a n ge t a 1 ，2 0 0 3 ) 。c 末端区域的序列和长度一般变化较大，可能是m a d s d o m a i n 蛋白 的转录激活区域，并参与蛋白多聚体的形成( c h oe ta 1 ，1 9 9 9 ；e g e a c o r t i n e sa n d s a e d l e r , 1 9 9 9 ) 。除此以外，在a g 亚家族的c 类蛋白中，通常在m 区上游的还 有一段长度变化的富含碱性氨基酸的n 末端区域，形成n m i k c 型蛋白。而在d 类蛋白和裸子植物的a g 1 i k e 蛋白中都没有发现这个n 末端的延 中( k r a m e r e a 1 ， 2 0 0 4 ) 。对拟南芥a g 基因的功能研究表明该基因产物的n 末端的缺失并不影响 a g 基因行使正常的功能( m i z u k a m ie ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 植物m i k c 型m a d s b o x 基因在植物的花分生组织、花器官及各种营养器 官中有不同的时空表达式样，执行着不同的功能( r o u n s l e ye ta 1 ，1 9 9 5 ； a l v a r e z b u y l l ae ta 1 ，2 0 0 0 ) 。其结构、表达和调控模式的改变与花的起源和进化 密切相关，因此在植物进化发育生物学的研究中，m i k c 型m a d s b o x 基因倍 受关注。 1 3 研究基部被子植物中花发育相关基因的必要性 被子植物( a n g i o s p e r m s ) 是现存种子植物( s e e dp l a n t s ) 中最主要的类群之 一。化石证据表明被子植物大约起源于l 亿三千万到9 0 0 0 万年前的早白垩世 ( c r a n e ，1 9 9 5 ) ，并且在短期内快速分化，产生了丰富多彩的种类。全世界现存 被子植物大约有1 3 万属