（植物学专业论文）蚕豆保卫细胞和表皮细胞液泡内含颗粒物性质比较与分析.pdf

摘要 片j 醋酸铀负染的蚕豆叶片保卫细胞及表皮细胞液泡液，经透射电镜观测发现：液泡中仔扯人 罩颗粒状物质，且这两种细胞液泡中的颗粒物住形状、人小及分布密度等方面均存祚显并芳舁。 我们实验纲发现在气扎运动过稗中保细胞液泡p h 发生了约0 5 学位的变化( 气孔开放时发生 酸化，芙刚时发生碱化，p h 在5 8 和5 3 之问变动) 。为进。步验证保卫细胞液泡p h 是其中颗粒 物的形态及分布变化的诱发因素，我们_ l _ jf h 5 3 利p h 5 _ 8 的m e s t r i s 缓冲液调控液泡液，然后 进行负染与电镜观测，发现：表皮细胞液泡中颗粒物列p h 调控无明显响应，而外放态保p 细胞 液泡中颗粒物经p h 5 8 的缓冲液调控后线度明显增人，分布密度显并f 降。p h5 3 处理的丌放态 气孔保卫细胞液泡内含颗粒物的线度及分布密度与调控前无显并变化。h jm 特异性蚩r 1 酶 ( p r o t e i n a s e k p r o n a s e ) 对液泡液进行处理( 3 7 ，35 h ) 基本全部消除了液泡r f 一的颗粒状物 质。因而初步证明保卫细胞和表皮细胞液泡所含颗粒状物质是蚩白质。c o n f o c a l 结合p h - 荧光探 针b c e c f 测定a b a 诱导的气孔芙c j ：| 过程中保细胞及表皮细胞液泡p h 的变化，结果表f j 月：保 卫细胞液泡p h 发生了约0 5 单位碱化( 5 2 5 7 ) ，与之相邻的表皮细胞液泡p h 发巾】0 3 荦化 酸化( 5 6 5 3 ) 。两种细胞液泡p h 值住a b a 处理 j 发_ ：了趋势相反的变化，可能“jj | h 由保 卫细胞向相邻表皮细胞发生了迁移。 关键词：气孔运动，p h ，保p 细胞，表皮细胞液泡内含颗粒物 a b s t r a c t w ee x t r a c t e dv a c u o l e ss a po fg u a r dc e l la n de p i d e r m a lc e l lu n d e ram i c r o s c o p ea n do b s e r v e dt h e d i s t r i b u t i o no f t h ep a r t i c l e si nv a c f l o e ss a pf r o mp h o t o st a k e nu n d e rae l e c t r o nm i c r o s c o p e ，w ef o u n d e d g r e a td i f f e r e n c ei ns h a p e ，d i m e n t i o na n dd e n s i t yo fp a r t i c l e si ng u a r dc e l lv a c u o l e sa n de p i d e r m a lc e l l v a c u o l e sa n dw h a t sm o r e ，t h e s et w ok i n d so fp a r t i c l e sr e s p o n s eq u i t ed i f f e r e n t l yt op hc o n t r o l ：t h e r e w a sa l m o s tn oe f f e c to fp h5 3a n dp h5 8t ot h ed i m e n s i o na n dd i s t r i b u t i o nd e n s i t yo ft h ep a r t i c l e s f r o me p i d e r m a lc e l lv a c u o l e s ；h o w e v e r , p h5 8i n d u c e do b v i o u si n c r e a s e si nt h ed i m e n s i o na n dd i s t i n c t d e c r e a s e si nt h ed i s t r i b u t i o nd e n s i t yo ft h ep a r t i c l e sf r o mg u a r dc e l lv a c u o l e s ，a n dn oo b v i o u sc h a n g e s h a dt a k e np l a c et ot h ep a r t i c l e sf r o mg u a r dc e l lv a c u o l e sa f t e rp hc o n t r o lo f5 3 t h en o n - s p e c i f i c p r o t e i n a s e ( p r o t e i n a s ek & p r o n a s e ) c u o l dm a k ead i s a p p e r a n c eo f t h ep a r t i c l e sf r o mb o t hg u a r dc e l l v a c u o l e sa n de p i d e r m a lc e l lv a c u o l e s s ot h ep a r t i c l e si nv a c u o l e so fg u a r dc e l la n de p i d e r m a lc e l l p r o v e dt o b ep r o t e i n w eu s e dt h er a t i om e t h o do fd u a lf l u o r e s c e n te m i s s i o no fc h e m i c a lp hp r o b e b c e c fw i t hs i n g l ee x c i t e m e n t u n d e rl a s e rc o n f o c a lm i c r o s c o p ya n d f o u n d e dt h a tt h e r ew a sa b a s i f i c a t i o na b o u t0 5f 5 2 5 7 ) u n i t so f p hi ng u a r dc e l lv a c u o l e sa n daa c i d i f i c a t i o no f a b o u t0 3 ( 5 6 5 3 1u n i t so fp hi nv a c u o l e so fe p i d e r m a lc e l lw h i c hi sc l o s et oas t o m a t ad u r i n gs t o m a t a lc l o s u r e i n d u c e db ya b a t h i sr e s u l tm a yd u et o h a dm o v e df r o mg u a r dc e l lt oe p i d e r m a lc e l l k e yw o r d s ：s t o m a t a lm o v e m e n t ，p h ，g u a r dc e l l s ，e p i d e r m a lc e l l ，p a r t i c l e si nv a c u o l e s i i 图表目录 在1 i 不同类型植物的气孔数目和大小( 引自于宝山，2 0 0 4 ) 1 幽1 1 两种类型气孔，示辐射状微纤柬( 引自李合生，2 0 0 2 ) 2 图1 2 气孔开张、关闭时，气孔复合体细胞中钾离子浓度和p h ( 引自曹仪植，1 9 9 8 ) 一4 图1 3 气孔运动机制图解( 引自王宝山，2 0 0 4 ) 5 图1 4 液泡中颗粒物的亚基化与气孔开放渗透调节的模型( 叶清，2 0 0 1 ) 7 图1 5 保卫细胞a b a 信号转导模式( 张骁等，2 0 0 1 ) j 7 图2 i 蚕豆( e f a b a ) 开放态气孔保卫细胞( a ) 和表皮细胞( b ) 液泡内禽颗粒物分布幽2 0 例2 2 保卫细胞液泡内含颗粒物对p h 5 3 和5 8 调控的响应2 1 图2 3 表皮细胞液泡液( a ) 与p h5 _ 3 ( b ) 、p h5 8 ( c ) 调控的表皮细胞液泡液2 2 图3 1p r o t e i n a s e k 处理保卫细胞液泡液内含物的结果2 6 图3 2 p r o t e i n a s ek 处理表皮细胞液泡液内含物的结果2 6 图3 3p r o n a s e 处理保卫细胞液泡液内含物的结果2 7 图3 4p r o n a s e 处理表皮细胞液泡液内含物的结果：2 8 表4 - 1 外界刺激下保卫细胞中的p h 变化( 引自孙鹏，2 0 0 3 ) 2 9 例4 14 8 8 n m 波长下b c e c f 的发射荧光强度图谱( r i n k 等，1 9 8 2 ) 3 0 图4 2 细胞外标定b c e c f 的标准曲线3 l 图4 3a b a 处理后保卫细胞液泡内的荧光强度比值变化曲线3 2 图4 4a b a 处理后保卫细胞图像3 3 图4 5a b a 处理后保卫细胞液泡d h 变化3 3 图4 6a b a 处理后与保卫细胞相邻的表皮细胞液泡内的荧光强度比值变化曲线3 4 图4 7a b a 处理后与保卫细胞相邻的表皮细胞图像3 4 图4 8a b a 处理后与保卫细胞相邻的表皮细胞液泡内p h 变化3 5 v 独创性声明 y7 7 3 9 6 4 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导卜进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也，f i 包含为获得中幽农、i k 人学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的况明并表示了谢意。 研究生签名： 拳艳霞 时间：如d f 年6 月如日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农、大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校自权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅年u 借i 、蒯，可以采用影印、缩印或扫捕等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在4 i 嗣媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议1 研究生签名 导师签名 套犯霰 糊 、， h , j 问：z o o j - 年6 月如同 蝴。：咖、；辱。c 日彬p 中国农业大学坝卜学位论文第一章文献综述 第一章文献综述 i 1气子l 运动机理研究进展 通过控制影响植物生活的两个基本过程：蒸腾作用和光合作用，气孔运动影响着植物生命运 动的基本功能。气孔是植物叶表皮组织上由一对保卫细胞( g u a r dc e l l ) 及其间的气孔口组成的一 种特殊的用丁控制水分蒸腾和气体( 0 2 和c 0 2 ) 交换的结构。在藓类和苔类孢子体世代水平以上 的所有植物都具有气孔。裸子植物和被子植物的气孔运动高度灵活，受着外部环境与体内代谢反 应的综合控制。气孔最常见于叶片上，大部分植物叶片上下表面都有气孔。一般单子叶植物上下 表皮气孔数接近，双子叶植物气孔主要分布在下表皮。气孔的大小、数目及分布，随植物种类不 同而相异( 表1 ，1 ) ，也因环境不同而相异。保下细胞的形态有两种基本类型：一种为大多数禾本 科植物所特有的哑铃形保卫细胞。另一种存在于双子叶及大部分单子叶植物中，由一对肾形保甲 细胞构成。 表11 不同类型植物的气孔数目和大小( 引自王宝山，2 0 0 4 ) 气孔运动与保卫细胞结构特点密切相关。与表皮细胞( e p i d e r m a lc e l l ) 相比，保卫细胞具有 以下特点：1 ) 保卫细胞体积很小，仅为表皮细胞的1 1 3 左右：细胞壁具有独特结构：胞晕不均 等的加厚，且有相当的弹性。哑铃形保卫细胞两端膨大部分壁薄，中间壁厚；肾形保卫细胞外肇 薄，内壁( 靠近气孔口侧) 厚。这些结构特征使得保卫细胞的运动十分灵敏，有利丁保卫细胞膨 压及体积迅速而显著的变化，调节气孔开度。表皮细胞比保卫细胞大很多，且无特殊形状。2 ) 保卫细胞壁的纤维素微纤丝有特殊的排列( 图1 1 ) ：肾形保卫细胞细胞壁的微纤丝以气孔口为中 心辐射状径向排列，由于这些微纤丝难以伸长，限制了保卫细胞沿短轴方向直径增人。细胞吸水 膨胀时，胞壁受到细胞内部与胞壁垂直的指向外部的压力。由于保卫细胞外壁薄，在此压力作川 下沿纵轴方向伸展，表面积增大，同时有向外扩展的趋势。但由丁微纤丝的限制使扩展趋势受限， 微纤丝牵引内壁向外运动，气孔即张开：哑铃形保卫细胞也有径向排列的微纤丝，它限制了细胞 中国农业大学钡十学位论文 第章文献综述 在吸水时的纵向延伸，使细胞通过两端的薄譬横向膨火，将两个保卫细胞从中间推开，气孔开放。 3 ) 多数植物每个保卫细胞中有1 0 1 5 个叶绿体，约占整个细胞体积的8 ( h u m b l ea n dr a s c h k e ， 1 9 7 1 ) 。一般表皮细胞缺乏有功能的叶绿体。_ l s n | 肉细胞叶绿体相比，保卫细胞叶绿体体积较小， 数目较少，片层结构发育不良。保卫细胞叶绿体中含有丰富的淀粉体，淀粉含鼍存在毯夜变化： 黑暗时淀粉积累白天气孔张开时，淀粉含量减少，与止常光合组纵恰恰相反。淀粉降解为合成 有机阴离子提供碳骨架，参与渗透调节( w i l l m e ra n df r i c k er ，1 9 9 6 ) 。4 ) 保卫细胞含有异常丰富 的线粒体，通常为叶肉细胞的5 】o 倍。保卫细胞的呼吸速率也较叶肉细胞高( v a n ia n d r a g h a v e n d r a ，1 9 9 4 ) 。5 ) 成熟的保卫细胞与副卫细胞或临近细胞间没有胞间连丝。细胞间代日 物 的出入必须经细胞壁才能间接发生，保卫细胞的相对独立更有利于其渗透势的调节。6 ) 保p 细 胞液泡的人小和形状在气孔运动过程中发生变化：气孔关闭时含有许多小液泡，气孔开放时小液 泡变大或台并为一个大液泡( w i l l m e ra n df r i k e r , 1 9 9 6 ) 。 慑卫蛔囊 田1 1 两种类型气孔，示辐射状微纤束( 引自李台生2 0 0 2 ) 左为双子叶植物气孔右为单子叶植物气孔 气孔虽然仅占叶面积的1 左右，却是植物体水分散失和0 2 及c 0 2 交换的主要通道，它控制 着植物体与大气之间9 5 以上的的气体和水分交换( s e h l o d e re t a l ，2 0 0 1 ) 。气孔运动是植物重要 生命运动之一，它涉及到水分代谢，离子运输，光合作用，呼吸作用等一系列过程。对气孔运动 机理的研究一直是植物生理学研究的热点。二十世纪一些关于气孔运动机理的假说相继提出，人 们普遍赞同保卫细胞的膨压变化是引起气孔运动的原因。研究显示：气孔关闭时保卫细胞的溶质 势较高，而开放时溶质势降低，如：蚕豆叶保卫细胞的溶质势在气孔关闭时仅为一1 9 m p a ，而开 放时为一3 5 m p a ，表明气孔开放时保卫细胞液泡液浓度提高近一倍。再考虑到气孔开放时保细 胞体积增加4 0 1 0 0 ，则气孔开放时保卫细胞溶质的量有更夫增加。那么保卫细胞的溶质势是通 过什么机制下降的呢? 目前主要提出了以f 几个假说。 1 1 1 光台作用假说 光( 红光、蓝光) 引起气孔张开，低c 0 2 浓度也促进气孔张开a 保卫细胞中含有叫绿体， 而表皮细胞中没有，这使有些人提出：保卫细胞内进行的光合作用直接与气孔运动有关，光合作 2 t l d 农q k 几1 7 。坝卜? f t 论殳筑v正l 弘? * 墟 曼曼! 曼皇曼! 毫曼曼鼻曼鼍! ! 蔓量曼曼曼蔓曼皇日曼皇! 曼鼍蔓暑曼曼曼曼曼! 詈曼量! 皇皇i i m i n 川r j 物址f zi j 细胞渗透渊1 0 物j j 。圳( w i l l m e r , 1 9 8 3 ，训j f 役脱：保fj 细胞 纠祟禽砒仪乃i j j i j _ f i l l s g t 1 93 这样删符倮ij f l t l j j 世 j j t 做n 椰j 染“会j 丑城纠i 求的似象：懈ij f l t lj j m d ：j l i l 一刈c o ，- 敞惑：庄桀口机物像f j 细胞巾没仃i f f 球体i 光沦n 川，“7 l f f j 潲质j ：l i ，使7 ( 孔，k j ff p i 胆的2 ： 保i 细i j ( g i - 光介1 1 ：川述书低卜峨i f 啦的过年：僳ij a l l 恺一l 缺乏c o 二i 州化过w - ，j 晰返“j 虬燃押： 小芷”光台n 川r c 接咎。j 76 a l 运动、j 魁 ? 十地接受的州 址昧f j 细胞巾禽h - i - d 化c o 、的解竹汁 7 孔k 川听：岳溶埙的2 4 5 求r j 兕龠碳琏心选i 料f 0 oj ；j 隧很小，f i 川jj f _ ：i _ _ f l t t 胞胞质似 私! 较小刈降低j e 渗透辨l l r 能起剑- l i ：婴作川， 1 12 淀粉一糖转化学说( s t a r c h s u g a rc o n v e r s i o nt h e o r y ) 【幺似酏城训| | 1 _ f i 【物q - f i t 学京f el l o y dt1 9 0 8 提，假说认为：c 孔近功址| | i 胤ij f l t l 胞z 1 1 柑 和淀粉m f l ；1 十1 0 化r j l 起渗造势的战：竖州造他的。保l j f lm t 咆i i i 绿体1 1 吖刑】 i i ! i l , j i 2 粉人钡 i ，“l 张 i i q 淀粉禽 i r 阶7 ( 4 l 灭1 4 l l , j 淀粉岔 1 歼侏p c 1 l l l l ，光f 进f ，光介f 1 i 川_ = i l i i c o ! 他 胞质口h 增晰剑7 ，淀粉磷酸化孵侨化i 椰u 厶三鹰，水解淀粉为铺萄新一i - 磷酸健f 装l 细忸f 甜墒 糖沐j 坐抛“引起渗透拂l j 降，水坍降低，从川l i j l f l l l 胞啦取水分，侏 i 细胞膨帐。可7c 扎l l ： m 矧即1 - 侏1 j 细胞光f 件俘f l ：f j 1 吁吸f 1 川仍i 挂 j ，l j “i i l t , i c o ! 秘粜他侏l j 纳啦p hf 降 刘5 九i ，淀粉磷酸化 拄i t l h z 逆l 反j 越，使枇j ： 化成淀粉湃质颗粒做减少， - 1m tj j ( ! i 渗透坍m ： 水务 。，侏i j f l l l 胞太水。膨n j 艇：k 2 ( a l 天1 4 j 。 垃一；酏u 以删释光平i ic 0 2 时7e i l f l 9 彬1 帆叱= ；：f 合淀粉1 1 川潲火，晚 ：脱的现象。然| | j 蛳? r f i j | = 究的深入，z z 现1 1 e ? 说杯化止j l “u r l j ：1 ) 7 ( - i l 迅z 印i l t 淀粉补的转化地比较眦n 玑小址以 消址坟心迅造的7 ( 4 l 运动：2 ) 柴j b 机物的保1 _ j f lm l 胞i i i o i 禽i i i 绿体如洋葱，此九谜粉f 1 j 租! 嫩 oj 代谢，然i f i j e 孔过动仍l 州 。3 ) l 证l 蝴2 g r l 运动小依赖1 ：光台t 1 ；i j ，f i n j i c o j 佝l i l l l j t 几天 4 ) 保1 i 细胞 ，1 j i j 含城嵌j 见为r l 火i b ，投晚低n ! 激伐转为广1 人戏一人转为熙役! 汁。t l 运动m 先州；龠 ， 变 l l lj , i 。5 ) 法似雠汝f j 将激汛f j 胞赝k 分j n 町址笼统地称之为侏i i hm l 。典阻 e f l 的也棚i 鉴取决j 液池水坍| 1 j 芝化。破近d i 究纶求是i u 城：舢九倮j 圳胞渗透叫。i l 的浆o 阶 段越? 眶篮l f l 9 渗透溶胍r l g f i 9 t j ，e 扎的灭和腿撕浓膻p 阡仃k ( t a i z z e i g e r , 1 9 9 8 ) 。保甲细 胞r ir 起渗透洲作川的蔗舢i j 能米】4 - ：代啡选陋淀粉水斛j 。乍f | j 脏靓奸：侏rj f l + l 咆圯弁f 1 i - 广的d i ：靴；从_ ! 珏外体i n 收n 川肉n l ij l i g i - 1 0 4 n 船。 1 i 3 气孔运动的化学渗透模型( t h ec h c m i o s m o t i cm o d e lo f s t o m a t a lm o v e m e n t s ) 1 9 6 8 卟以柴 1 = 多实骑证刚。7e 扎 f 放。，缫l ! 细胞手j 祟k 仃鬻功的天系。将附拊i 啦叶“挺 j 皇；禁i j + k c i 符液1 j ( 光| j t 保。ij 自l u m 内k4 浓j 业井j f 加i ，i lq i , j - 7 , ：- f l j r 放，j 做坡冉p m u 插入f r i 细盱也成1 1 ：1 1 近f l l l l l i j r i f 接测f i jk 。浓度蹙化绌粜 l _ ：探ij f l l l 胞i 邻近川胞川仃九f l 大的k 浓j 堑梯! ： ：( i 划1 2 ) 。) 匕j ! f f l l 、r f 艇i ( f l i lj j 也i | lk f 农j 蔓吐：6 i i i 仙：1 j 爿| | 胞f h 外j 、0 托j 芝卸i | 世k 浓 望敞汉降低：黑岍列，价玎川爻这f ；_ = w ；t tj ( ( 1 ；, ，k 扶删荆胞进入陈fj 剐胞 f zf j 圳啦r f ： d 祟l 州农j 业的k ，仕f i ：p 自l l 胞涪透协阱低，细恺i 歧水，7l 扎外放。川么k 址如f l j 入侏ij a 川m 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 的呢? 从图1 2 可以看出气孔开放时保卫细胞p h 升高。研究表明，保卫细胞质膜上存在h + a t p 酶，它可被蓝光和红光激活，利用水解保i i 细胞中光合磷酸化利氧化磷酸化产生的a t p 的能量将 h + 分泌到胞壁，产生跨质膜的超极化电位驱动k4 通过保卫细胞质膜上的内向k 十通道( i n w a r d l y r e c t i f y i n gk + c h a n n e l ) 进入保：p 细胞，保卫细胞k + 浓度增加，水势降低，保甲细胞吸水，气孔 张开。 围1 2 气孔开张、关闭时，气孔复合体细胞中钾离子浓度和p h ( 引自仪植，1 9 9 8 ) 圈中“m ”代表m o l l 保卫细胞与其周围细胞的k + 浓度和p h 值变化趋贽相反 k + 在保卫细胞中大量积累必然产生大量的分离电荷。因而必须有某种物质平衡这些电荷。 研究发现气孔开放时在保卫细胞液泡中积累c r 和苹果酸根离子。在k + 进入的同时，c r 也通 过c 1 - h + 共向转运或c i 一o h 一反向转运进入保卫细胞。苹果酸是在保卫细胞的细胞质中合成的。 保卫细胞叶绿体中含有许多淀粉。光照r ，胞内一部分c 0 2 被利用，p h 上升至8 肛8 5 剩余的 c 0 2 在此p h 条件f 转变成h c 0 3 一。同时p h 的升高激活了磷酸烯醇式丙酮酸( p e p ) 羧化酶，催 化淀粉降解产生的p e p 与h c 0 1 一结合形成草酰乙酸，并进一步被n a d p h 还原为苹果酸。 p e p + h c 0 3 一壁趁丝醒草酰乙酸+ 磷酸 ( 1 - i ) 草酰乙酸+ n a d p h ( 或n a d p ) 茔星馥逐厘酶苹果酸+ n a d p ( 或n a d ) ( 1 - 2 ) 苹果酸解离为苹果酸根离子和2 个h + ，一通过 r ，k + 转运体与胞外的k + 交换，苹果酸 根进入液泡与c l _ 和k + 共同保持保卫细胞的电中性，且k 和c r 两者都可作为渗透物质进一步 降低水势，促进保卫细胞吸水，气孔开放。 概括起来讲，糖、苹果酸、k + 、 c l - 等物质均进入液泡，参与保卫细胞的渗透调符，使保 卫细胞水势f 降，吸水膨胀，气孔开放( 图1 3 ) 。 4 中国农业大学硕士学位论文第一毒 史献综述 光照 靛卫细0 水势下降l 1 r ”+靛卫细穗水势下降捧出 一 向周越纲稳嚷承嚣监升龋 气孔张井 围13 气孔运动机制图解( 引自王宝山，2 0 0 4 ) 在黑暗中，k + 等渗透物质从保卫细胞中扩散山去( 扩散是个极缓慢的过程，该过程的动力 学主要取决于扩散物质的浓度梯度分布及该物质的扩散系数的大小) ，细胞水势提高，失去水分， 气孔关 j j 。淀粉糖及化学渗透假说不适于解释气孔关闭过程。因淀粉糖的转换速率远不及观测 到的气孔运动的速率。化学渗透假说解释气孔关闭过程面临的主要困难之一是：有实验说明气孔 的关闭是一个比“化学渗透假说”估计的开放过程快得多的过程，不能用该假说的原理建立的气 孔开放过程的逆过程来解释。目前对气孔关闭的机制还多处于猜测，没有完整的模型。化学渗透 假说解释的气孔关闭过程涉及单独的离子运输体系，即c 等离子的跨质膜运输，及“等离子 在保r 细胞液泡和质外体( 胞壁) 中豹扩散运输。目前认为气孔关闭过程中保卫细胞质膜去极化， 保卫细胞胞质中的c a 2 + 升高。胞质中的c a 2 十升高能够抑制保卫细胞质膜上的质子泵和内向k + 通 道，而激活两种类型的( r - t y p e ，s - t y p e ) 阴离子通道，向细胞外释放出阴离子；同时外向的k + 通 道被激活，使k + 流出保卫细胞，而保卫细胞质膜的去极化可能与该阴离子通道的激活有关。此 外在气孔关闭过程中保卫细胞重新将糖酵解，有机渗透物质苹果酸等重新台成淀粉( a s s m a n n ， 1 9 9 3 ) 。a b a 、外源高c a ”、h 2 0 2 和黑暗是诱导气孔关闭的重要因子。 化学渗透假说目前已被普遍接受，但仍存在不完善之处。 ( 一) l ( + 库的问题：由丁胞壁中不足以存放能够 f 起气孔运动的保卫细胞渗透调坩所需的 大量k + ，因而该0 库被认为主要是与气孔相邻的表皮细胞的液泡。在诱导气孔开放的冈子作_ f ，保甲细胞向胞外泵出h + 使胞壁酸化，这不仅使保卫细胞质膜超极化，同时也导致相邻表皮细 中国农业人学硕士学位论文 第一章殳献综述 胞的质膜处干超极化状态。刚k 在超极化膜电位的推动p 趋向于同时由质外体进入保下细胞和 相邻表皮细胞，而不是从相邻表皮细胞流向保p 细胞。 ( 二) k + 等主要渗透调节物质积累_ 丁保卫细胞液泡的实验证据方面：迄今为l e 并无k + 等 主要渗透调节物质在气孔运动过程中积累于保卫细胞液泡( 保卫细胞液泡) 的直接、确切的证据， 其中经常例举的实验有1 ) h u m b l e r a s c h k e 1 9 7 1 用显微x 射线分析法测定在气孔开放前后保 卫细胞液泡中c 含量的变化，但其估计的是包括胞壁、胞质、液泡在内的整个细胞的k _ 含鼙， 并不是保卫细胞液泡中k + 的含量。2 ) 用k + 一敏感电极测定气孔开放前后保卫细胞液泡k + 含量 的变化此法测的是离子活度而不是浓度，即该法不能测知处于结合( 螯台) 态的k + 离子。3 ) 剧膜片钳( p a t c hc l a m p ) 测定保卫细胞渗透调节时跨细胞质膜的电位及该膜上某种离子通道电导 的变化来推测无机离子( 如k + ) 的跨膜运动。由r 植物细胞有液泡，膜片钳测到的关于质膜的 数据能说明某种离子有跨过质膜进入胞质的可能性但不能同时涉及该离子跨过液泡膜进入液泡 的各项参数，丽推动气孔运动的渗透调节恰好是发生在保卫细胞的液泡中。4 ) 在研究气孔的运 动时往往采用气孔开度的统计学处理或用气孔计测定气体交换来推测气孔运动，该方法不能用r 确定单个气孔运动中渗透调节过程的精确动力学而该过程的动力学是对气孔运动机理进行深入 研究的重要数据。 ( 三) 在没有外源渗透调节物( i f 等) 积累的情况下的气孔开放：有证据表明保。h 细胞原 生质体在无k ? 介质中也可被诱导发生膨胀( h u a n ge ta l ，2 0 0 0 ) 。研究发现气孔开放时k + 、c l 、苹 果酸含量与气孔开度成线形关系，但均有个4 5 岬的截距。m a c r o b b i e ( 1 9 8 1 ) 认为这个截 距说明气孔开放的初始阶段不需要外源钾的参与，气孔进一步开放才需要k + 的积累，气孔开放 初始阶段可能还有其他因子起作用。 综上所述，用传统的“化学渗透”假说来解释保卫细胞液泡的渗透调节尚存在一些问题。 1 1 ，4 保卫细胞液泡渗透调节的高聚物可逆解聚模型 我们研究组发现在气孔运动前后蚕豆( 矿f a b al ) 保卫细胞液泡中的颗粒状内含物的线度及 分布密度发生了显著的变化，该变化与保卫细胞液泡中的p h 的变化有关( h ee la i ，2 0 0 3 ；s u n ， 2 0 0 3 ) ，并推测这种颗粒为大分子蛋白质，并且这些蛋白质的亚基之间可能挟持着无机离子( k + ， c r 等) 。该蛋白颗粒的解聚同时释放亚基间挟持的k + ，c 1 - 等离子。颗粒状物的解聚使其分布 密度显著增加使保卫细胞液泡中的渗透势f 降，挟持在蛋白亚基之间的k + ，c i 一等离子的释放 使液泡的渗透势进一步下降，保卫细胞吸水膨胀，使气孔开放( y ee ta l ，2 0 0 3 ；s u n ，2 0 0 3 ) 。这是 我组提出的气孔开放的保卫细胞液泡渗透调节的高聚物可逆解聚聚合模型( 图1 ，4 ) 。 6 中国农业大学硕上学位论文 第一常且：献综述 d i s 毒g 口r e g a 旗0 n a 幽 8 u b u n i t s + r e l e a s e di o t i s p 坻一p h ： 围1 4 液泡中颗粒物的亚基化与气孔开放渗透调节的模型( 叶清，2 0 0 1 ) 该模犁包括了与p h 指导的保卫细胞液泡渗透调节有关的两个主要过程：当保卫细胞液泡的 p h 由p h l ( 约5 | 8 ) 调节为p h 2 ( 约5 3 ) 时，诱发1 ) 保卫细胞液泡内含的某些高聚物的可逆亚 基化( 解体) 造成该高聚物亚基的分布密度的显著上升，引起保卫细胞液沲渗透压增加一2 ) 该 高聚物可逆亚基亿可能伴随有保卫细胞液泡内无机离子的可逆释放，进一步放大高聚物解聚造成 的渗透压上升的效应。该模型可能避免传统“化学渗透”假说解释的气孔开放时所依赖的耗能巨 大的逆浓度梯度的离子( k + 等) 和一些有机小分子( 苹果酸、蔗糖等) 的跨膜运输，提山了一 种e h 保卫细胞液泡内p h 指导的节能的，且有效提高气孔运动对诱导因子的反应速度的模型，是 对推动气孔运动的多元调控假说的补充，同时也为植物中其它快速运动机理的研究拓宽了思路。 与淀粉一糖以及化学渗透模型显著不同的是本模型既适合于解释气孔开放叉适于解释其关闭过 群。 1 1 5 细胞骨架( 微管和微丝) 与气孔运动 细胞骨架与细胞运动、能量转换、细胞分裂和分化等重要生命活动密切相关。细胞骨架在保 卫细胞发育和分化中起震要作用，微管的排列方向与保卫细胞壁纤维素微纤丝的走向有关。微纤 丝的轴向排列使保卫细胞膨胀时，只能向背壁处突出而拉歼中间的孔。保卫细胞微丝骨架能迅速 响应各种刺激发生聚合和解聚的动态变化，微丝拮抗剂能影响气孔的运动，说明保口细胞微丝骨 架可能参与了气孔运动的调控。目前认为微丝骨架的解聚促进气孔运动，而聚合态的微丝则能抑 制气孔运动。微丝骨架动态变化位于气孔运动的上游，是气孔快速应答各种刺激的一个调节因子 ( 肖玉梅等，2 0 0 3 ) 。微管和微丝的破坏或解聚可以僵化膨压引起的气孔运动。当微管和微丝解 聚屙，c 矿或a b a 诱导的气孔运动受到影响，意味着微管和微丝参与了c 矿和a b a 引起的气 i l 运动( 黄荣峰，1 9 9 6 1 。气孔开放初期微管、微丝可能直接调控并引起保卫细胞原生质体的膨 胀( 黄荣峰，1 9 9 7 ) 。电镜观察表明，保卫细胞的细胞骨架的排列随气孔的启闭而变化，并发现 在a b a 和暗诱导的气孔关闭及光诱导的气孔开放中，保卫细胞周质微管的排列发生了明显变化， 说明细胞骨架排列变化直接影响到气孔运动( 张蜀秋，2 0 0 0 ；黄荣峰，1 9 9 7 ；需繁霞2 0 0 0 ) 。 7 1 1 6 保卫细胞离子通道与气孔运动 1 1 6 1 质膜k 通道 保卫细胞瘊膜上存在两种重要的k + 通道：内向k + 通道和外向k + 通道。内向k + 通道在超 极化电化学势的推动f 负责气孔开放过程中k + 的吸收。内向k + 通道对k + 的吸收具有选择性， 其激活具有电压fj 控性质并依赖外界k + 浓度( s c h r o e d e r f a n g ，1 9 9 1 ) ，而且a b a 和胞质中游 离c r 升高能够抑制内向k + 的通导率。研究表明，远轴的保卫细胞山向k + 通道受胞质c a 2 4 和 a b a 抑制，而近轴的保卫细胞内向k t 通道对胞质c a ：+ 和胞外a b a 不敏感。a b a 抑制内向k + 通道存在钙依赖和非钙依赖的信号途径( r o m a n ol a ，2 0 0 0 ) 。a b a 诱导的气孔关闭信号过程有 h 2 0 2 产生，h 2 0 2 通过调节k 十电流而诱导气孔关闭。总之，内向k + 通道开放有利丁气孔开放 抑制气孔关闭；内向k + 通道受抑制气孔开放就受抑制。保卫细胞质膜上的外向k + 通道则主要 负责气孔关闭过程中k + 的流出。外向k + 通道的开放也受膜电位和外部k + 浓度的控制 ( s e h r o e d e r ，1 9 8 8 ) 。外向c 通道对胞质中自由c a 2 - 的井高不敏感。a b a 诱导的胞质口h 升高 后外向c 电流即增强，而胞质酸化抑制外向k + 电流( b l a t t & a r m s t r o n g ，1 9 9 3 ) 。 l _ 1 6 2 质膜c a ”通道 c a 2 + 通道有较强的电压依赖性，在一1 0 0 m v 时被激活，对b a ”也有通透性( k o h l e re ta l ， 2 0 0 3 ) ，胞外b a 2 + 使c a 2 + 通道更容易激活，且增加c a 2 + 通道对超极化电压的敏感性( h a m i l t o n e ta l ，2 0 0 1 ) 。a b a 和h 徊2 可激活c a 2 + 通道电流，胞质c a 2 + 抑制c a 2 + 通道电流。a b a 可诱发 h ，0 2 的产生，如抑制h 2 0 2 的产生，则a b a 激活的c a z + 通道电流也受抑制。表明h 2 0 2 是a b a 利胞质c a 2 + 升高的中间信使。h 2 0 2 激发的c a 2 + 通道介导的c a ”跨膜内流，使胞质c 丑”升高， 这可能是气孔关闭的墓要原因( p e i e t a t ，2 0 0 0 ) 。a b a 和0 2 均可调节气孔运动，c a ”通道是 a b a 和h 2 0 2 作用的焦点。胞外c a 2 + 可引发胞内c a 2 、震荡，导致气孔关闭( a l l e ne ta l ，1 9 9 9 ；e v a n s ， 2 0 0 1 ) 。胞质c a 2 + 引发气孔关闭可能存在两种机制：一种是当胞质c 矿升高时，短期的“钙反 应活性”很快发生而引起气孔关闭 另一种长期稳态的关闭则认为是由一定频率、周 i i 、人小、 波峰数的c a 2 + 震荡形成的“钙编程”。总之，各刺激信号引发质膜c a 2 + 通道开放，引起胞质c 一+ 震荡，进一步调节胞内反应引发气孔运动。 i 1 6 3 质膜阴离子通道 保卫细胞质膜上主要存在两种类型的阴离子通道：快型( r ) 阴离子通道和慢型( s ) 阴离子 通道。阴离子通道主要通透c j - 和苹果酸根离子，通道的开放使阴离子外流，质膜进一步去极化， 激活外向钾电流，引发气孔关闭。r 型阴离子通道受激活和抑制作用迅速。它受去极化作用迅速 激活然后又被钝化。这类阴离子通道可能负责细胞膜迅速短暂的去极化( s c h r o e d e r , 1 9 9 5 ) 。胞外 c a 2 + 升高能够激活r 阴离子通道，它对离子有选择透性：n 0 3 - c i 一 m a l a t e 2 一( k e l l e re la l ，1 9 8 9 ) 。 s 型阴离子通道可被a b a 激活，激活所需膜电位范围较宽( - - 2 0 0 6 0 m v ) ，在0 m v 出现最大 电流。s 型阴离子通道对电压的反应缓慢，其激活和失活都很慢，负责保卫细胞缓慢的去极化 ( s c h r o e d e r e ta l ，1 9 9 2 ) 。这类通道被激活后可以维持长达1 小时可能与产生持续的膜极化有关。 中国农业大学硕士学位论文第一章文献练述 s 型阴离子通道在a b a 诱导的气7 l 关闭中起主要调节作用( 薛绍武等，2 0 0 4 ) 。s 型通道象r 型 离子通道一样，对c l _ 没有选择性( a s s m a n n ，1 9 9 3 ) 。质膜上还存在s a ( s t r e t c h a c t i v i t e d ) 阴离子 通道，它是对膨压高度敏感的非专性c a 2 + 垴道，同时可通透c j - 和k + ，对保卫细胞的渗透调 节也很重要( c o s g r o v e & h e d r i c h 1 9 9 1 ) 。 1 1 6 4 液泡i t t l 上的离子通道 在保卫细胞中，液泡在积累离子和产生膨压方面具有极其重要的功能。气孔关闭时释放到胞 外的k + 、阴离子等必须首先由液泡释放到胞质中。研究表明保卫细胞液泡膜上有s v ( s l o w v a c u o l a r ) 、f v ( f a s t v a c u o l a r ) 、非电压依赖型的k + 选择性( v k ) 通道和c a 2 + 通道。 1 i 6 4 1 r 通道( v kc h a n n e l ) w a r d 和s c h r o e d e r 【1 9 9 4 ) 发现液泡膜上存在高选扦性k + 通 道，负责液泡k + 释放。胞质c a 2 + 浓度较低时，检测不到v k 活性，当胞质c a 2 + 浓度上升到生 理浓度至l m o 儿之间时，v k 可迅速被激活，通道的电流受胞质酸化促进( a l l e ne ta l ，1 9 9 8 ) 。 1 1 6 4 2 快液泡离子通道( f vc h a n n e l ) f v 通道的电流是瞬时的，可被胞质c a 2 + 升高抑制， 对k + 和阴离子都能通透( w a r d s c h r o e d e r , 1 9 9 4 ) ，受胞质碱性p h 促进( a l l e ne ta l ，1 9 9 8 ) - 能 通透内向和外向离子流，生理浓度的c a 2 + 不抑制其电流，生理浓度的m 9 2 + 可增强c a 2 + 对通道 的抑制作用。推铡气孔开放时m 矿对f v 通道的抑制调节有作用( p e ie t a l ，1 9 9 9 ) 。 1 1 ，6 4 3 慢液泡离子通遵( s vc h a n n e l ) s v 是高等植物液泡膜上普遍存在的通道，该通道被 c a 2 + 和m 9 2 + 激活，是高度电压依赖性的非选择性阳离子通道，受胞质c a 2 十激活。通道对c a 2 + 有 选择性( 通透比c a 2 + ：k + = 3 ：i ) ，气孔关闭时液泡中的c a “和k 十可经该通道释放( w a r d s c h r o e d e r , 1 9 9 4 ) 。 1 1 6 4 4c a 2 + 通道a l l e n 和s a n d e r s ( 1 9 9 4 ) 在液泡膜上发现c a 2 + 通道，该通道对胞质c a 2 + 不 敏感，液泡p h 碱化能激发该通道。另外，液泡膜上还存在i p 3 和c a d p r 门控的c 矿通道。i p 3 和c a d p r 生高可檄活这两种通道，引起胞质c a 2 +