动物细胞工程PPT课件.ppt

,动物细胞工程,世界生物医药发展概况,自上世纪90年代以来，生物医药市场增速一直都维持在全球药品市场增速的2-3倍。以2007年为例，全球生物技术药物年销售额同比增长12.5%，总额突破750亿美元，这一增速是2007年全球药品市场增速（6.4%）的两倍。抗体药物是近年来增长率最快的生物技术药物，全球年销售额从1997年的3.1亿美元上升到2007年的270亿美元，十年内增长了87倍。抗体药物在生物药物产业中所占份额也从2000年的1/5上升到2007年的1/3，且年均增长12.4%，远远高于全球制药行业6%的增长水平。经济学家们预计20072012年的抗体药物年平均销售额增长率将保持在14%左右，实际超过预计。,Epogen(EPO,促红细胞生成素)Humulin（胰岛素）Intron-A(-IFN,-干优素)Engreix-B(乙肝疫苗)Cerezyme(葡萄脑苷脂酶)Activase(t-PA,组织纤维蛋白溶酶原激活剂)Humatrope(hGH,生长激素)Reopro(抗Gpllb/IIIa抗体)Avonex(IFN-la,-la干扰素)Protropin/Nutropi(somatrem/somatropin)Pulmozyme(-链球菌DNA酶)Proleukin(IL-2,白介素-2)Leukine(GM-CSF,粒细胞巨噬细胞集落刺激因子),早期上市的主要生物技术产品,由培养动物细胞产生的部分药品产品临床用途产生细胞干扰素癌症、病毒感染Namalwa干扰素癌症、病毒感染CHOEPO贫血CHOtPA溶血栓CHOVIII因子血友病CHO乙肝表面抗原疫苗CHO人生长激素侏儒症CHOGCSF化疗解救CHO单抗OKT3肾移植杂交瘤,当前的生物技术研究前沿,生物医药学科综合,治疗性抗体,组织工程技术,生物药递送技术,RNAi药物,基因治疗,天然药物合成生物学,干细胞治疗,新型疫苗,.,2010年全球生物医药产业结构,IMSHealthMarketprognosis,生物医药在全球前十大药品中的排名,GlobalPharmaceuticalMarketReview&WorldTopTen/TwentyDrugs2008,美国FDA已经批准或即将批准的治疗性抗体药物,在我国批准上市的国外单抗药物,.,在中国批准上市的国产单抗药物,动物细胞工程基本概念应用细胞生物学和分子生物学原理和方法（细胞融合或基因转导等），通过某种工程学手段（遗传操作等），在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品（特定的蛋白制品）的一门综合科学技术。,单克隆抗体,细胞融合,细胞培养,胚胎移植(提高产仔率),核移植(克隆牛、羊等),动物细胞工程,一、动物细胞生物反应器生物反应器是利用酶或生物体（如微生物、细胞）所具有的生物功能，在体外进行生化反应的装置系统，是一种生物功能模拟机，如发酵罐、固定化酶或细胞反应器等。动物细胞生物反应器近年来得到迅速的发展，利用动物细胞可以准确、有效地生产医药生物技术制品，如活性肽、单抗、细胞因子、生长因子等。,利用动物细胞生物反应器产生蛋白的必要性1细菌和酵母系统产生哺乳动物蛋白并不另人满意，主要原因是该系统不一定能产生完全正确的哺乳动物蛋白。2动物细胞产生的蛋白质往往经过一系列翻译后修饰，才能成为成熟蛋白，而微生物系统不一定能实现翻译后修饰。3翻译后修饰因不同的蛋白而有差异，其中以糖基化最为常见，尤其对于分泌的蛋白更是如此，其他修饰也可发生。4翻译后修饰对某些蛋白的活性是不可缺少的。修饰也将影响蛋白在体内的稳定性、清除率，以及组织分布等。,蛋白翻译后修饰的原因,蛋白活性调节的需要蛋白相互作用的需要亚细胞水平定位的需要等,哺乳动物蛋白常见的翻译后修饰糖基化(glycosylation)谷氨酸的g-羧化(g-carboxylation)门冬氨酸的b-羟化(b-hydroxylation)磷酸化与硫酸化(phosphorylation&sulphatation)蛋白水解加工(proteolyticprocessing)酰胺化(amidation),还有：甲基化、乙酰化、甲酰化、十四烷基化、异戊二烯基化、氨基化去氨基化、二硫键形成、硝化等共两百多种类型。,蛋白质翻译后修饰,主要内容:泛素化糖基化磷酸化乙酰化甲基化,泛素化在生命过程中的作用,泛素化是泛素与其他蛋白结合，并进一步降解蛋白的过程。对于细胞分化、细胞器的合成、细胞凋亡、DNA修复、新蛋白的合成、调控细胞增殖和蛋白质运输等生理过程都起到很重要的作用。,蛋白糖基化的作用,糖基化在生物过程中起着重要作用，如免疫保护、病毒复制、细胞生长、细胞之间黏附、炎症的产生等。,糖基化在内质网和高尔基体中形成内质网中形成的大部分蛋白是糖蛋白,蛋白磷酸化的作用,可逆的磷酸化过程几乎涉及所有的生理及病理过程，如细胞信号转导、肿瘤的发生、新陈代谢、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等作用。,蛋白的乙酰化作用,组蛋白的乙酰化和去乙酰化是基因表达过程中重要的调控方式，是转录过程中的关键修饰。组蛋白去乙酰化酶通过去除组蛋白的乙酰基和其他转录调控参与肿瘤发生和进展。,组蛋白的乙酰化乙酰化增强转录去乙酰化抑制转录,蛋白甲基化的作用,组蛋白上的甲基化，不仅在真核细胞染色质的遗传外修饰中占有中心地位，对细胞分化、发育、基因表达、基因组稳定性及癌症研究均有深远的影响。其他类型的甲基化的异常或甲基化酶的突变常会导致疾病的发生。,动物细胞生物反应器的基本特征1需要用基因转导或细胞融合等方法建立必要的生产细胞系；2需要大量、高密度培养细胞的培养液与培养设备；3需要控制细胞的生长与蛋白的表达；4在产品的生产过程中，出现一些可能影响安全性的副产品，包括细胞碎片蛋白、DNA、病毒等，需要在产品的纯化过程中加以清除；5在细胞培养中，可出现对细胞有害的副产品，如氨离子、乳酸等，应在培养液的组成以及培育条件等方面考虑限制这些毒性产物的释放。,动物细胞技术产业化的问题1产量低与微生物系统比较，动物细胞重组蛋白的产量较低；2生产设备与技术复杂细胞生长慢，工艺条件要求高，易染菌；3控制生产过程较困难细胞生长速度与产物表达量的控制要求高；4细胞在培养过程中易受损伤动物细胞比微生物脆弱，培养条件要求苛刻；5产品纯化困难培养液中含有大量外源性蛋白，原材料的质量不好控制，如血请等；6成本较高所用仪器设备、培养基等材料价格贵。,细胞工程在优化细胞株过程中的应用1防止细胞凋亡凋亡抑制方法，培养基补充，基因策略(bcl-2等)；2代谢工程通过代谢调控抑制乳酸盐和氨水等毒性代谢产物产生；3分子伴侣工程增加内质网中与蛋白分泌有关的分子伴侣蛋白数量；4转译后加工工程(糖基化工程)通过合适的糖基转移酶过表达达到此目的。,生物反应器,生物反应器在生物过程中起中心作用，是实现产品产业化的关键设备，是连接原料和产物的桥梁。,细胞或酶等生物催化剂（游离或固定化）,生物反应器,空气,CO2等,冷却水,原材料,培养基,灭菌,底物,产物,废物,除菌,检测和控制,产物预处理,产品提取或液化,副产物,生物反应器中复杂的相互关系,生物反应器1搅拌式经典的动物细胞反应器；2气升式有氧传递速度大、传热效果及混合性能好；3中空纤维管细胞密度大、血清用量小、细胞不易受损；4流化床式比表面积大、适合培养各种细胞。,1搅拌式（笼式搅拌器）,2气升式（气腔式反应器）悬浮培养或微载体培养用,中空纤维反应器：左右两箭头为无菌空气进出口。细胞生长在由半透性的多孔膜制成的中空纤维管外表面。,3中空纤维管中空纤维贴壁反应器,培养基出口,细胞,培养基入口,4流化床式流化床反应器,基本原理是使支持细胞生长的微粒呈流态化。由胶原制成的微粒，具有像海绵一样的多孔性，用非毒性物质增加其比重，使之达到1.6或更高，以便它在高速向上流动的培养波中里流态化。细胞接种于微粒中，通过反应器垂直向上循环流动的培养液使之成为流化床，不断提供给细胞必要的营养成分，细胞得以在微粒中生长。同时新鲜培养液不断地被加入，培养产物或代谢产物又不断地被排除。,流化床、搅拌式、微载休培养细胞密度的对比,培养类型细胞类型细胞密度(cell/mL)流化床贴壁依赖性1.3108流化床杂交瘤0.3108微载体搅拌釜贴壁依赖性0.2-2107恒化床杂交瘤2.0106,二、动物细胞培养细胞培养原代培养：10代以内的组织培养细胞；正常细胞：1050代未经转化的培养细胞；转化细胞：重组DNA进入受体的过程叫“转化”,得到重组DNA的细胞叫“转化细胞”；细胞系:特定基因背景的无限传代细胞，BHK-21,CHO-K1,MDCK,MRC-5,Namalwa,Vero,WI-38。,动物细胞培养过程,除单细胞原生动物外，细胞培养过程具有以下特性：细胞生长缓慢，易受微生物污染，培养时需用抗生素；动物细胞较微生物大得多无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差；培养过程需氧量少，且不耐受强力通风与搅拌形成的较大流体剪切力：在培养中，细胞相互粘连以集群形式存在，培养过程具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性及功能全能性：培养过程产物分布于细胞内外，反应过程成本较高，但产品价格昂贵；大规模培养时，不可照用微生物反应的经验；原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡。,动物细胞培养特性,用于细胞培养的部分细胞系细胞来源用途COS非洲绿猴肾细胞小规模量单抗CHO中国仓鼠卵巢细胞表达重组蛋白BHK仓鼠肾细胞生产畜用疫苗MDCK狗肾细胞生产畜用疫苗MRC-5人胚肺组织细胞产生人用疫苗Namalwa淋巴母细胞样细胞生产a-干扰素Vero猴肾脏成纤维细胞生产人用制品WI-38胚肺组织细胞生产人用疫苗,细胞培养过程的放大1筛选细胞系2确定培养条件3产物表达的优化4中试放大5放大生产,细胞培养的环境1培养用品的无菌处理器材、培养基、试剂等；2培养条件水质、pH、渗透压、温度、空气、搅拌速度。,细胞培养基1天然培养基：血浆凝块、血清淋巴液、胚胎浸液及羊水、腹水等。2合成培养基：DMEM、RPMI1640、HamsF12、IMDM等。包含氨基酸（氮源）、糖（碳源）、盐类、维生素、激素、生长因子、微量元素、脂等；10%血清。,无血清悬浮培养1无血清培养基可替代血清功能的生物材料配制细胞培养基，如牛血清白蛋白、转铁蛋白、胰岛素等；2无动物来源培养基需要的蛋白来源于重组蛋白或者蛋白水解物；3无动物蛋白培养基部分添加物是来源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物；4化学组分限定培养基最安全、最理想的培养基，可保证培养基批次间一致性，少量动物来源蛋白水解物、蛋白都是成分明确。,常用培养方法1悬浮培养2贴壁培养3微载体培养（葡聚糖）4包埋和微囊培养（琼脂糖、海藻酸钙凝胶）,1.贴壁培养分散的细胞悬浮液在培养器中往往要贴附在壁上，这叫细胞贴壁。原来是圆形的细胞一经贴壁就迅速铺展呈多种形态。此后细胞就开始有丝分裂并很快进入对数生长期。一般在数天后就铺满生长表面，形成致密的细胞单层，叫做单层细胞，这种培养的方法又叫单层细胞培养。细胞培养中有一个非常有趣的现象是细胞的接触抑制。当贴壁生长的细胞生长到表面相互接触时，就停止分裂增殖，长成单层的细胞经过一段时间，一定须在重新分散后分瓶继续培养，使其继续分裂增殖，这叫传代。2.悬浮培养是指细胞在培养器中自由悬浮生长过程，主要用于悬浮生长的细胞培养，如杂交瘤细胞等。动物细胞悬浮培养是在微生物发酵的基础上发展起来的。由于动物细胞的特点，如没有细胞壁保护，不能耐受剧烈的搅拌和通气，因此在许多方面又与经典的发酵有所不同。对于小规程培养多采用转瓶和滚瓶培养，大规模培养多采用发酵罐式的细胞培养反应器。悬浮培养，设备结构简单，有成熟的理论计算，可以借鉴微生物发酵的部分经验，放大效应小。但是悬浮培养的细胞密度较低，转化细胞悬浮培养有潜在致癌危险。此外，有许多动物细胞属于贴壁依赖性的，不能悬浮培养。悬浮培养的关键是要选择适当的搅拌和通气装置。,3.微载体培养系统微载体是直径为60250m的微珠。采用微裁体系统培养动物细胞，细胞易壁于微载体上，微载体（和细胞）悬浮于培养基中，细胞在微载体表面逐渐生长成单层。这种模式把单层培养和悬浮培养的优点融汇在一起，具有两种培养方法的优点。1)表面积/体积比大；2)由于微裁体悬浮于培养基中，是均匀悬浮培养，简化了细胞生长各种环境因素的监测和控制，细胞生长环境亦均匀；3)培养基利用率高；4)采样重演性好；5）收获过程不复杂；6)放大较容易；7)劳动强度小，占用空间小。4.包埋培养对悬浮生长和贴壁依赖生长的细胞都适用，细胞生长的密度高，抗剪切力和抗污染能力强。对悬浮生长的细胞用海藻酸钙包埋，对贴壁依赖生长细胞用胶原包埋。由于动物细胞培养慢而费用高，且对剪切力敏感，经包埋后可有效的保护细胞。,5.微囊化培养在动物细胞微囊化制备中，主要是应用海藻酸聚氨基酸方法，简单过程是动物细胞与海藻酸溶液混合搅拌，经过微囊发生器将微球滴入氯化钙溶液中，形成凝胶，然后再用聚氨基酸处理，使微球表面成膜，最后用柠檬酸处理去除微球内的钙离子，以便球内的海藻酸成液态，动物细胞得以悬浮在其中。动物细胞的微囊化中海藻酸和聚氨基酸是关键材料。微囊化方法能使细胞处于相对稳定、受剪切力小的环境中，而养分和氧又可以从微囊外的培养液扩散进入。,1000L气升式细胞反应器系统,细胞培养的操作方式1分批式操作2半连续式操作（反复分批式或换液培养）3流加式操作（分批培养过程中间歇或连续地补加新鲜培养基）4连续罐流式操作（连续添加新鲜培养基）,分批、连续、流加操作方式的比较,4.因经常灭菌会降低仪器使用寿命,大规模生产的操作1培养基的配制2种子细胞的制备3杂交瘤细胞的大规模培养4产品的分离纯化5产品的冷冻干燥,单批细胞培养及反应时间,3.125ml,62.5ml,1.25L,10kL,500L,25L,day1620,day2125,day1115,day2832,day15,day812,day610,day1317,day1822,day1519,day2024,day2327,day2529,day2125,day3034,day2630,储槽10kL,day32,day25,day26,day33,母细胞库,生物产品生产工艺开发要素,动物细胞培养的应用1获得细胞产物，如蛋白质生物制品，包括病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等；2制备烧伤病人植皮所需的皮肤细胞；3获得检测用细胞，检测有毒物质的毒性。,三、动物细胞的基因工程基因工程基本概念在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。,高表达细胞株的建立基因转染选择瞬时或稳定转染的方法，既取决于实验的要求，同时经济和技术因素也可考虑在内。1基因瞬时转染常见于实验室研究，瞬时转染跳过了通过细胞的鉴定与选择来判断质粒整合至细胞基因组这一步，速度快。2基因稳定转染用于临床或商业目的，一个稳定转染能将目的基因DNA整合到宿主细胞染色体组中。,动物细胞的核酸转移方法1磷酸钙沉淀法；2DEAE右旋糖酐法；3脂质体包被法；4微量注射法；5电脉冲法；6基因枪；7逆转录病毒感染。,1、化学法,磷酸钙沉淀法：目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。方法简单，但转化效率低。Ca2(PO4)2+DNA混合微细颗粒（Ca离子浓度125mmol，DNA离子浓度50ug/ml，PH7.0）沉淀反应2030min细胞在沉淀物中暴露524h,2、物理方法,电穿孔法（electroporotion）将细胞置于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中的DNA可渗进细胞，进而表达。瞬间细胞细胞膜核摸通透性增加高压脉冲DNA渗入细胞,3、显微注射法（microinjection）利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核中,ClonesheepDolly体细胞提取核重组细胞回植Dolly卵细胞去核细胞,外源基因在细胞中的表达1降解2游离状态3整合到宿主细胞的染色体,病毒表达载体1SV40病毒载体2逆转录病毒载体3牛痘病毒载体4牛乳头瘤病毒载体5腺病毒载体6多瘤病毒7Epstein-Barrvirus,Sinbisvirus8重组病毒载体等,细胞转基因遗传标记的选择系统1二氢叶酸还原酶基因选择系统(dhfr)2胸苷激酶基因选择系统(tk)3新霉素磷酸转移酶基因(neo)4氯霉素乙酰转移酶基因(cat)5绿色荧光蛋白基因(gfp)特定的遗传标志（基因）和相应的选择培养剂:MTX(dhfr),HAT(tk),四环素(tetr),卡那霉素(kanr)和新霉素(neo)基因。,细胞株筛选1传统筛选方法最常用的方法是有限稀释克隆（LDC）；2流式细胞术和细胞分选膜标记技术，优势在于筛选数目大幅增加；3基于细胞分泌率的高表达细胞的筛选凝胶微液滴技术检测，基于基质的分泌检测；4细胞筛选的自动化系统激光激活分析和处理系统，自动挑选克隆，Cello系统。,四、杂交瘤技术杂交瘤与单克隆抗体单克隆抗体与多克隆抗体比较的优点1）高度特异性；2）同质性；3）可工业化生产；4）高度可重复性；5）免疫原不一定要高度纯化；6）可制备人源抗体。,动物细胞的融合方法,杂交瘤的制备方法免疫（immunization）细胞融合（cellfusion）PEG选择（selection）HAT培养基筛选（screening）细胞克隆（cloning）有限稀释法抗体特征鉴定（characterization）细胞保存（storage）,BioTechniques2010,选择12个初筛