（等离子体物理专业论文）脂肪酶和脂肪氧化酶影响稻谷储藏的作用机制研究.pdf

摘要 脂肪酶和脂肪氧化酶影响稻谷储藏的作用机制研究 摘要 稻谷是不耐储藏的粮食品种。影响稻谷储藏的主要因素有陈化变质、储藏害虫以 及霉变等。本文从研究影响稻谷耐储藏特性的脂肪代谢关键酶的作用入手，利用离子 束诱变创建脂肪酶( l i p a s e ) 和脂肪氧化酶同功酶( l o x ) 活性低的耐储藏材料的近 等位基因系和开发脂肪酶、脂肪氧化酶同功酶检测技术，并利用生化技术和蛋白组学 分析方法，研究导致稻谷陈化变质的脂肪代谢的启动机制、分析稻谷寄主抗虫性的生 化基础。其主要结果如下： 1 利用作物脂肪氧化酶同功酶的检测专利技术筛选出不同的l o x 种质，通过4 2 个月自然老化和人工加速老化实验发现，脂肪氧化酶l o x l 、l o x - 2 活性低水稻品种 可以明显的延缓其稻谷的陈化变质速度。通过离子束诱变建立脂肪酶和脂肪氧化酶 l 0 卜l 、l o x - 2 活性不同的耐储藏材料的近等位基因系。 2 为揭示导致稻谷陈化变质的机制，从脂肪代谢途径的角度，对脂肪酶和脂肪 氧化酶的生理生化特性展开研究。在研究中性脂肪酶反应机理的基础上，开发了种胚 小样本精确的定量检测专利技术。不同脂肪酶活性的近等位基因系稻谷的人工加速老 化实验研究发现，中性脂肪酶活性降低可延缓稻谷陈化变质。另外，建立一种水稻种 子碱性脂肪酶平板检测方法，研究表明，碱性脂肪酶活性与稻谷老化速牢成正相关。 在研究作物脂肪氧化酶同功酶的检测专利技术的反应机制的基础卜，研究离子束诱变 的耐储藏特性差异的近等位基因系材料1 3 7 7 和1 2 9 7 表明：两个近等位基因系在种子 发育和储藏过程中脂肪氧化酶l o x - 1 活性差异显著。 3 进一步利用双向电泳和质谱技术分析近等位基因系材料1 3 7 7 和1 2 9 7 表明：两 者种子蛋白组在热激蛋白、脂肪氧化、抗氧化途径等6 个与稻谷耐储藏特性有关的酶 和蛋白上有区别，并且证实差异最大的蛋白点d 2 是水稻l o x - 1 。通过近等位基因系 材料1 3 7 7 和1 2 9 7 的l o x - 1 基因序列的差异性分析发现4 个碱基发生变化( 3 2 6 0 ： t - a ：3 2 6 7 ：g - c ：3 2 7 2 ：g a t t ) ，翻译蛋白后有3 个氨基酸发生差异( l h ：h ：r - i ) ，为 稻谷耐储藏相关的主要基因研究打卜坚实的基础。 摘要 4 通过自然储藏4 2 个月发现l o x - 3 缺失能减轻储藏害虫的危害。通过研究人工 加速老化处理l o x - 3 缺失和不缺失材料对害虫趋性的影响，并结合s u z u k ic ta l 研究 l o x - 3 缺失和不缺失的材料的储藏过程中挥发性物质的变化实验，发现陈化稻谷的小 分子挥发性物质己醛( h e x a a a l ) 、戊醛( 1 孢n t a a a l ) 、戊醇( p e n t a n 0 1 ) 与储藏害虫的 趋性之间可能存在一定的关系。 综上所述，本论文从获得耐储藏基因型材料入手，以生化方法和蛋白组学方法作 为手段，研究稻谷耐储藏机制。上述研究对延缓种子衰老，揭示稻谷耐储藏机制以增 加其耐储藏性，提高粮食储备能力，确保国家粮食安全具有重要的意义。 关键词：稻谷，储藏特性，脂肪酶，脂肪氧化酶，作用机制，陈化变质，2 - d ，蛋白 组学 a b s t r a c t s t u d yo ff u n c t i o n a lm e c h a n i s mo fl i p a s ea n dl i p o x y g e n a s eo nt h e s t o r a g ec h a r a c t e r i s t i c so fr i c eg r a i n s y m gz h a n g ( m a j o r p l a s m ap h y s i c s ) d i r e c t e db yp r o f e s s o ry u e j i nw n a b s t r a c t r i c ec a n n o tb es t o r e dv e r yl o n g d e t e r i o r a t i o n , s t o r a g e - i n s e c t , m i l d e na n dr o t , a n de t c d u r i n gs t o r a g ea 坞t h em a i nf a c t o r st h a tr e d u c et h eq u a l i t yo fs t o r e dr i c e i nt h i sp a p e r , s t a r t e dw i t ht h ee f f e c to fk e ye l l z y m eo fl i p i dm e t a b o l i s mo nr i c e 粤证璐s t o r a g e c h a r a c t e r i s t i c s ，t h r o u g hi o ni m p l a n t a t i o n , n e a ra l l e l es e r i e so f r i c ev a r i e t i e sm a t e r i a l sw i t h l o w e rl i p a s ea n dl i p o x y g e n a 舱a c t i v i t yw e r eo b t a i n e d , a n dl i p a s ea n dl i p o x y g e n a s e d e t e c t i v et e c h n i q u e sh a db e e ns e tu p ，a n db yu s i n go fb i o c h e m i c a ld e t e c t i v et e c h n i q u ea n d p m t e o m i c s m e t h o d s , w eh a ds t u d i e dt h es t a r t u p sf a c t o ro fl i p i dm e t a b o l i s mo fr i c eg r a i n s t h a tr e s u l ti nd e t e r i o r a t i o n , a n da n a l y z e dt h eb i o c h e m i c a lf o u n d a t i o no fr i c eg r a 岫r e s i s t i n g s t o r a g ei n s e i 吐d a m a g e t h er e s u l t sw e r es h o w n a sf o l l o w s ： 1 b yu s i n go fp a t e n t e dc r o pl i p o x y g e n a s ei s e n z y m e s d e t e c t i v et e c h n i q u e ，w eh a d o b t a i n e dr i c es e e d sm a t e r i a lw i t hl o w e rl i p o x y g e n a s ea c t i v i t y , a n db yt h em e t h o d so f 4 2 - m o n t h su n a r t i f i c i a la g e i n ga n da r t i f i c i a la c c e l e r a t e da g e i n g , w eh a df o u n do u tt h a tr i c e s e e d sm a t e r i a lw i t hl o w e rl i p o x y g e n a s e 一1 ；2a c t i v i t yc o u l da l l e v i a t er i c eg r a i n sd e t e r i o r a t i o n t h r o u g hi o ni m p l a n t a t i o n , n e a ra l l e l es e r i e so fr i c ev a r i e t i e sm a t e r i a l sw i t hf i n es t o r a g e c h a r a c t e r i s t i c sa n dw i t hl o w e rl i p a s ea n dl i p o x y g e n a s e - 1 ，2a c t i v i t yw e r eo b t a i n e d 2 i no r d e rt oe x p l o r et h em e c h a n i s mt h a tr e s u l ti nr i c e sd e t e r i o r a t i o n , f r o mt h e p a t h w a yo fl i p i dm e t a b o l i s m , w eh a ds t u d i e dt h ef u n c t i o n a lm e c h a n i s mo fl i p a s ea n d l i p o x y g e n a s e b a s e do nt h es t u d yo ft h er e a c t i o nm e c h a n i s mo fat a gl i p a s e , ap a t e n t e d s m a l ls a m p l er i c ee m b r y o sp r e c i s eq u a n t i t a t i v ed e t e c t i v et e c h n i q u ew a ss e tu p s t u d yo fa n a r t i f i c i a la c c e l e r a t e da g e i n ge x p e r i m e n ta b o u tt h en e a ra l l e l es e r i e so fr i c ev a r i e t i e s m a t e r i a l sw i 也d i f f e r e n tt a g l i p a s ea c t i v i t yi n d i c a t e dt h a tl o w e rt a gl i p a s ec o u l da l l e v i a t e r i c e 舢d e t e r i o r a t i o n b e s i d e s ，a na l k a 陆 i p a s e sp l a t ed e t c z 2 t i v et e c h n i q u ew a ss e tu p ， a n dt h ee f f e c to fa l k a l i n el i p a s eo nr i c ed e t e r i o r a t i o nd u r i n gs t o r a g ew a ss t u d i e da n d i n d i c a t e dt h a ta l k a l i n el i p a s ea c t i v i t yw e r cp o s i t i v ec o r r e l a t i o nw i t hr i c e 掣越珊a g e i n g m a b s t r a c t s p e e d b a s e do nt h es t u d yo ft h el e a c t i o nm e c h a n i s ma n dq u a n f i t a t i o no fp a t e n t e d l i p o x y g e n a s ei s e n z y m e sd e t e c t i v et e c h n i q u e ，n e a ra l l e l es e r i e so fr i c ev a r i e t i e sm a t e r i a l s w a n j i a n 2 0 9 0 ，13 7 7a n d12 9 7w e 坞o b t a i n e dt h r o u g hi o ni m p l a n t a t i o n , a n ds t u d i e d t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e r ew a sad i f f e r e n c ei nl i p o x y g e n a s e 。1a c t i v i t yb e t w c e l lt h et w o n e a ra l l e l es e r i e so f f i c ev a r i e t i e sm a t e r i a l sd u r i n gr i c es e e dd e v e l o p m e n ta n ds t o r a g e 3 b yu s i n gt w o - d i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i sa n dm a 路t e c h n o l o g y ，t h et w on e a ra l l e l e s e r i e s1 3 7 7a n d1 2 9 7 ，w h i c hw b 。l eo b t a i n e dt h r o u o ai o ni m p l a n t a t i o n , w e r ea l s os t u d i e d f u r t h e lt h er e s u l t si n d i c a l e x lt h a tt h e r ew e r es i xe n z y m ea n dp r o t e i nw h i c h 撇r e l a t e dt o r i c e 罂证n ss t o r a g ec h a r a c t e r i s t i c si nh e a ts h o c k , l i p i do x i d a t i o n , a n t i - o x i d a t i v ep a t h w a ye t c ， a n dc o n f i r m e dt h a tr i c el i p o x y g e n a s e - 1 ，w h i c hw a sf o u n di ns a m p l e2 ，w a st h ek e ye n z y m e t or i c e 霉_ a i 璐d e t e r i o r a t i o ni nt h o s es i xe l l z y m ea n d p r o t e i n b ya n a l 咖l o x - 1 sg e n e o r d e rv a r i a b i l i t yo ft h et w on e a ra l l e l es e r i e so ff i c ev a r i e t i e sm a t e r i a l s13 7 7a n d1 2 9 7 ，w c f o u n dt h a tt h e r ea r e4b a s i cg r o u p sc h a n g e d ( 3 2 6 0 ：b 如3 2 6 7 ：g - c ；3 2 7 2 ：g a - m ，a n d w h e nt r a n s l a t e di n t op r o t e i n , 3a m i n oa c i d sh a dc h a n g e dm h ；w - c ；r - i ) a l lt h a tw eh a d d o n em a d eas t a b l eb a s ef o rt h es t u d yo ft h em a i ng e n ew h i c hi sr e l a t e dt od c e 霉面n s s t o r a g ec h a r a c t e r i s t i c s 4 b yt h em e t h o d so f4 2 - m o n t h su n a r t i f i c i a la g e i n g w ef o u n dt h a tr i c es e e d sm a t e r i a l w i ll o w e rl i p o x y g e n a s e 3a c t i v i t yc o u l dr e s i s ts t o r a g ei n s e c td a m a g e b e s i d e s ，b yt h e m e t h o d so fa r t i f i c i a la c c e l e r a t e da g e i n g , t h ee f f e c to ff i c es e e d sm a t e r i a lw i t ha n dw i t h o u t l i p o x y g e n a s e - 30 1 1s t o r a g ei n s e c t s t a x i sw e r es t u d i e d c o m b i n e dw i t ht h es u z u k ie ta l s e x p e r i m e n ta b o u tt h ev o l a t i l e si nl a wb r o w nr i c es a x l sw i t ha n dw i t h o u tl o x - 3d u r i n g s t o r a g e ，w ei b u n d t h a tt h em a i nv o l a t i l e so fd e t e r i o r a t i v er i c eg r a i n s ，h e x a n a l ，p e n t a n a l ，a n d p e n t a n o lw e r eq u i t er e l a t e d t ot h et r o p i s mo fs t o r a g ei n s e c t sd u r i n gs t o r a g e i naw o r d , s t a r t e dw i t hr i c es e e d sm a t e r i a l sw h i c hh a v eg o o ds t o r a g es t a b i l i t y , a n db y u s i n go fb i o c h e m i c a ld e t o t i v et e c h n i q u ea n dp r o t e o m i c s m e t h o d s , t h i sp a p e rh a ds t u d i e d t h em e c h a n i s mo fr i c eg r a i ns t o r a g ec h a r a c t e r i s t i c sg r e a t l y a l la b o v es t u d ya r cs i g n i f i c a n t i n a l l e v i a t i n g , 叠e e d sa g i n g , a n de x p l o r i n g t h em e c h a n i s mo fr i c eg r a ms t o r a g e c h a r a c t e r i s t i c st os t r e n g t h e nt h es t o r a g es t a b i l i t yo fr i c e 眦a n d 8 0i m p r o v eg r e a t l yt h e r i c es t o r a g ea b i l i t yi no u rc o u n t r y k e y w o r d ：r i c e 毋面咄s t o r a g ec h a r a c t e r i s t i c s ；l i p a s e ；l i p o x y g e n a s e ；m e c h a n i s m ； d e t e r i o r a t i o n ；2 - d ；f u n c t i o n a lp r o t e o m i c s ； i v 中国科学院博士学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文，是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，所 有数据、图片资料真实可靠。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包括他人享有著作权的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其 他个人和集体，均以在文中以明确的方式标明。本学位论文的知识产权归属于培养单 位。 本人签名： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 研究背景 我国是世界第一人口大国，也是世界上主要的稻米生产国之一。水稻是我国最重 要的粮食作物，全国约有6 0 以上的人口以稻米为主食。我国稻谷产量占世界总产量 的3 7 左右，年产稻谷1 9 亿吨以上1 。稻谷是不耐储藏的粮食品种。 影响水稻种子储藏特性的因素概括起来主要有三大类即陈化变质、储藏害虫的危 害、霉变等嘲。其中又以陈化变质、储藏害虫的危害影响更为巨大嘲。 1 1 1 稻谷陈化 水稻种子是蕴藏着生命力的活体，在储藏过程中，不断进行呼吸代谢，不断地和 外界进行物质和能量交换，不断受环境影响，与此同时，其本身也不断地发生着各种 生理生化变化嘲。在一般储存条件下，稻谷第二年就丌始陈化变质，在高温高湿地区 稻谷储藏发生陈化时间则更短。稻谷的陈化，导致了稻谷营养价值、食用品质、种用 品质的降低，导致稻谷及其加工的副产品的综合利用价值降低，严重影响了经济效益 和社会效益。 1 1 2 储藏害虫的危害 种子储藏害虫种类很多，我国有近2 0 0 种，尤其以米象( s i t o p h i l u so r y z a e l i n n a e u s ) 、玉米象( s it o p h i l u sz e a 啄a i sm o t s c h u l s k y ) 、谷蠢( g h i z o p e r t h ad o m i n i c a f b r i c i u s ) 、赤拟谷盗( t r i b o l i u mc o n f u s u mh e r b s t ) 危害较严重，它们不但蛀食种 子使其丧失生活力，而且还会引起种堆发热，加速稻谷的陈化，严重威胁种子储藏的 安全性瓯刀。根据世界粮农组织一项调查表明：在5 0 个被调查的国家中，大部分每年 稻米储藏损失大约6 1 0 ，一些国家甚至达到3 0 的损失量，而在他们当中，虫害损 失就占了4 0 5 0 。 在中国，对国储粮库，化学防治是减少储藏害虫危害的最主要的手段。在密封的 情况下，磷化氢等一些剧毒熏蒸剂的使用获得了较好的杀虫效果。但是，熏蒸剂的长 期使用不仅能引起储藏害虫对杀虫剂的抗性增加，而且对人体和环境造成严重的伤 脂肪酶和脂肪氧化酶影响稻谷储藏的作用机制研究 害，也容易造成稻米的二次污染。因此，筛选抗储藏害虫的水稻品种，研究其抗虫机 制，才能从根本上防治储藏害虫的危害嗍。 1 2 影响稻谷耐储藏特性的机制 1 ，2 1 储藏稻谷陈化变质 关于稻谷储藏陈化的学说众说纷纭，除了种子含水量和储藏条件( 温度、气体、 微生物、储藏害虫) 等外部因素影响外，其内在因素主要有稻谷储藏过程中的淀粉、 脂肪、蛋白质和细胞壁等理化成分的变化隗埘( 图1 ) 。 底物贮藏的变化蒸煮效应感觉效应 淀粉。胶团结合力的增加- 抑制淀粉颗粒的膨胀_ 结构 上 脂肪 脂肪酸一直链淀粉结构 1 ) 水解游离脂肪酸 上氧化 脂肪酸氢过氧物自由基和陈味物质 2 ) 氧化羰基化合物挥发性羰基化合物增加 f i g u r e1s c h e m a t i cm o d e lo ft h ea g e i n gp r o c e s si nr i c e 但更多的研究表明n 1 删：不同品种之间，种子的耐储藏性存在显著的差异，而且， 脂肪代谢关键酶脂肪酶和脂肪氧化酶同功酶对稻谷储藏陈化变质可能起关键作用。 1 2 2 寄主抗虫性 关于稻谷寄主抗虫性研究，自2 0 世纪7 0 年代以来，科学家( 邓政炎等，1 9 9 3 ；李 熳萍等，1 9 9 4 ：吴洪基等，1 9 9 4 ) 瓯挣圳普遍认为裂颍率与敏感系数、稻谷受害损失率关 2 第一章绪论 系密切自然裂颖率越高，感虫性越大 研究发现，脂肪氧化酶l o x - 3 缺失材料 反之，抗性增强然而，何成芳( 2 0 0 6 ) ”1 即使裂颖率较高。也不感虫。 1 3 稻谷膳肪代谢 13 1 稻谷麝肪成分和分布 首先，从脂肪的生物学特性来看，作物种子脂肪的作用和功能可以分为两个方面 。一方面，作为膜具有防御和运输通道的作用和作为高能化合物贮能以供给种子发 芽；另一方面，稻谷贮藏脂肪撮易受储藏条件的影响，在高温、高湿等恶劣的条件下 储藏以后，脂肪极易发生化学变化，致使稻谷品质劣变。 另外，从谷物化学分析中的稻米的组成来看( 表1 ) ，水稻种子储藏营养物质以 淀粉为主，淀耪含量占6 喁以上脂肪含量仅占糙米的2 3 。但是，水稻脂肪的分布 具有特殊性，主要分布在米糠( 主要是胚和糊粉层) 中米糠脂肪含量约占稻谷总脂 肪含量的8 7 2 ( 按精米率7 7 计算) 。 从稻谷的结构来看( 图2 ) ，糊粉层分布于稻谷的表层，富含丰富的脂肪、酶类， 其磷脂双层膜上的电子传递链在整个稻粒的营养物质的传输、供给、动员中起重要作 用：稻胚是水稻种子营养物质特别是脂肪最集中部位，也是水稻种子生长发育的发源 地。种子吸涨发芽时，稻胚脂肪进行总动员以供应生长发育需要的巨大的能量。因此 稻谷脂肪对稻谷储藏和生长发育起着根重要的作用。 二：謇 脂肪酶和脂肪氧化酶影响稻谷储藏的作用机制研究 s o u r c e ：b u r e a uo fs d e n c ea n dt e c h n o l o g y ( 19 6 3 ) 1 3 2 脂肪代谢途径 关于储藏稻谷脂肪代谢过程一直是许多科学家关注的焦点。 a i b a r a 等馏玎( 1 9 8 6 ) 研究了储藏中稻谷米糠脂肪的变化，指出，脂肪主要以三 酰甘油酯形式存在，还含有少量的磷脂和游离的脂肪酸，三酰甘油酯和磷脂中的结合 脂肪酸主要为亚油酸、亚麻酸等多元不饱和脂肪酸，在稻谷米糠的储藏过程中，甘油 三酯的减少伴随着甘油二酯、甘油单酯和多元不饱和游离脂肪酸亚油酸、亚麻酸的大 量增加，并且该变化随温度增加变得更剧烈。m g s h i n 等嘲( 1 9 8 6 ) 在研究储藏过 程中的稻谷脂肪的变化时发现：中性的甘油三酯的减少和游离脂肪酸的增加呈显著的 相关性，因而推断脂肪酶在稻谷储藏中重要作用( 见表2 ) 。 s u z u k i 嘲认为脂肪氧化酶能催化多元不饱和游离脂肪酸亚油酸、亚麻酸等加氧 反应，在稻谷储藏陈化变质中起关键作用。张瑛等( 2 0 0 1 ) 侧认为在稻谷储藏过程中， 脂肪代谢主要通过脂肪水解酶、脂肪氧化酶和裂解酶系起作用( 图1 2 ) ，膜磷脂结合 的多元不饱和脂肪酸如亚油酸、亚麻酸等是膜流动性主导因素。稻谷中的脂肪氧化酶 则能直接进攻游离的和膜磷脂结合的多元不饱和脂肪酸，反应生成大量过氧化氢物和 自由基，而这些物质可以间接作用于更多的多元不饱和脂肪酸，产生一系列连锁反应， 最终加剧了膜脂过氧化的进行洲。膜脂过氧化导致膜流动性的丧失和细胞膜透性的增 加，膜完整性丧失，随之而来，液泡等膜内蛋白水解酶和有机酸因膜功能丧失而释放 4 第一章绪论 出来，进一步加快对膜的破坏，从而加速种胚细胞死亡的降临嘲。 嗍、糖腊、磷脂 i 麟酶 亚油酶和亚麻酸 l 撒懒惰 亚油酸和亚麻酸的僦氢物 l 剿酵酶等 匿、酮和其他挥发物 图3 稻谷脂肪代谢作用途径嘲 f i g u r e 3p a t h w a yo fl i p i dm e t a b o l i s mo fr i c eg r a i n 表2 储藏过程中的稻谷脂肪成分的变化( m g s h i n 等，1 9 8 6 ) 铡 t a b l e 2c h a n g e si nli p i dc o n t e n to fb r o w nr i c ed u r i n gs t o r a g e 脂肪代谢关键酶脂肪酶和脂肪氧化酶还参与种子发芽和生长发育过程中脂肪代 谢以及各种抗逆性、抗病性璐1 。衢1 。在生长发育过程中，脂肪在脂肪酶作用下分解为甘 油和脂肪酸，再通过乙醛酸循环和三羧酸循环，转化葡萄糖供种子利用啪1 。i v o f e u s s n e r 等嘲提出：在种子发芽过程中，脂肪氧化酶、磷脂酶和三酰甘油酯脂肪酶等 共同参与脂肪总动员，认为脂肪总动员是由一种日q 1 3 - 脂肪氧化酶的启动，经磷脂酶 和三酰甘油酯脂肪酶等共同完成。j y o t is h a h 则提出脂肪、脂肪酶和脂肪氧化酶对 发芽种子的抗逆性、抗病性有作用口。 5 脂肪酶和脂肪氧化酶影响稻谷储藏的作用机制研究 m i n g h u ix i a n g ( 2 0 0 1 ) 则提出脂肪酶和脂肪氧化酶在种子中的表达具有时序性 和区域异质性，在种子不同时期承担不同的功能嘲。 综上所述，脂肪代谢途径脂肪酶和脂肪氧化酶对种子作用具有两面性，是生物学 意义上的“双刃剑 嘲。一方面，脂肪酶和脂肪氧化酶的存在严重影响种子的储藏特 性踟；另一方面，脂肪酶和脂肪氧化酶的存在对种子发芽和生长发育有利踟。脂肪酶 和脂肪氧化酶在种子中的表达具有时序性和区域异质性的发现则为在稻谷储藏过程 中消除脂肪酶和脂肪氧化酶作用而不影响种子发芽和生长发育提供可能。 1 4 脂肪代谢关键酶作用机制 1 4 ，1 脂肪酶 1 4 1 1 生化特性研究 脂肪酶( e c3 。1 1 3 。) 是分解三脂酰甘油的水解酶类，被水解底物三脂酰甘油 的醇部分是丙三醇，酸部分为水不溶的1 2 碳以上的长链饱和或不饱和脂肪酸，水 解反应发生的部位是三脂酰甘油的酯键。其催化反应如下： 脂肪酶 三脂酰甘油+ 水_ 二脂酰甘油+ 脂肪酸 其中的二脂酰甘油可被进一步水解为一脂酰甘油、甘油和游离脂肪酸。脂肪酶 是脂肪分解代谢中第一个参与反应的酶( 一般被认为是限速酶) ，它对脂肪的转化速 率起着调控的作用纠幻。 脂肪酶广泛存在于动、植物及微生物中，对脂类的消化和吸收过程中起重要作用。 植物种子中，脂肪酶的专一性不强，凡是由醇及有机酸构成的酯和脂肪都能被其分解， 但作用得很不完全池。而且，各种不同来源的脂肪酶在性质和作用特性方面有很大差 别h 删。蓖麻种子含有的酸性脂肪酶存在于脂肪体中，和蛋白质结合在起，呈不溶 状态，它的最适p h 值为3 6 。而禾谷类种子和大豆种子所含的脂肪酶都是可溶性酶， 酶活性都较低，最适p h 值为8 o 。一般情况下，在干燥种子中，脂肪酶活性都较低， 随着种子吸水，活性上升罅制。干燥种子中脂肪酶具有耐热性，亚麻籽种子中的脂肪 酶经过9 0 高温后，仍具有活性，而蓖麻籽在硫酸上面经1 3 0 1 2 加热l 小时后，仍能 保持其脂肪酶的活性制4 1 。 水稻脂肪酶广泛分布于水稻种子的种皮、糊粉层和种胚中删1 。该酶的最适作用 温度约为3 5 1 2 左右，最适的p h 值为7 5 - - - 8 0 ，在温度低于4 0 ，p h 值为5 o 一9 0 6 第一章绪论 时能稳定存在，在7 0 处理6 0 r a i n 或8 0 处理3 0 r a i n 可使酶完全失活，低浓度的钙 离子溶液对脂肪酶具有激活作用嗍。 关于脂肪酶作用机制，m g s h i n 等嘲( 1 9 8 6 ) 研究认为以中性的甘油三酯为底 物的中性脂肪酶是参与糙米脂肪分解代谢关键酶，t a k a n o ，k ( 1 9 9 3 ) 啪3 提出米糠水 解过程脂肪酶作用机制，王静等( 2 0 0 0 ) 叫对米糠脂肪酶酶学特性进行研究。而且， f d g o f f m a n 和c b e r g m a n ( 2 0 0 3 ) 进一步研究表明阳一：对于具有不同中性脂 肪酶活性的稻谷米糠材料，脂肪酶活性与游离脂肪酸的增加具有极显著正相关性，而 与材料脂肪的含量高低无关。叶霞等瞄妇的研究表明；稻谷中，游离脂肪酸含量的增长 速率与脂肪酶相对活力成正相关。 然而，f a t e m e hme t ，a l ( 2 0 0 0 ) 渊研究提出：稻谷中性脂肪酶和储藏性脂肪在 空间分布上由于细胞质膜的分隔而处于不同的区域，只有在细胞破损后，l i p a s e 才 能和脂肪接触反应。脂肪酶是米糠脂肪水解氧化的关键酶。一旦稻谷中的脂肪和脂肪 酶的接触，就意味着由脂肪转化为游离脂肪酸的进程的开始溉倒。随着游离脂肪酸的 增加，亚油酸等多元不饱和脂肪酸大大的激活了脂肪氧化酶的活性，使脂肪进一步 氧化分解溉删。最近，印度科学家k a n c h a nb h a r d w a j 在米糠中发现玛刀一种小分子的 碱性脂肪酶，它是一种双功能酶，既具有脂肪酶活性又具有磷脂酶a 2 的活性，既能 进攻中性脂，也能进攻膜脂，从而有可能导致膜破裂。 1 4 1 2 基因研究 关于脂肪酶的基因研究在动物、微生物中较为广泛和深入酬，但水稻的l i p a s e 基因研究报道较少。k i my o u n g h e e ( 2 0 0 1 ) 阳3 1 从水稻包括米糠层的种皮c d n a 文库 ( o r y z as a t i v ac kd o n g j i n ) 冲分离出一种编码脂肪酶的c d n a ，该被克隆的脂肪酶 c d n a 长1 4 6 9 b p ，编码3 6 1 个氨基酸残基。该序列与哺乳动物和微生物的l i p a s e 序列 没有广泛的同源性，但一些包括水稻和拟南芥l i p a s e 基因在内的植物l i p a s e 被发现 与该基因相关，所推导的核苷酸序列水稻和拟南芥分别表现7 8 和5 2 的同源性。 s o u t h e r n 杂交结果表明：米糠脂肪酶基因为一单拷贝基因。通过s d s - p a g e 电泳表明： 米糠脂肪酶d n a 分子量为4 1k d 。王玉娟等( 2 0 0 6 ) 洲对水稻种子脂肪酶与储藏特性 及相关基因s c a r 标记开展研究。 在型塑：! ig ! ：q ! g 网站中，我们可以通过植物基因的水稻基因数据库搜索到水稻 全基因组中与水稻脂肪酶基因家族有关的序列约有1 2 0 个左右，其中，与水稻种子有 7 脂肪酶和脂肪氧化酶影响稻谷储藏的作用机制研究 关的能正常表达的脂肪酶基因如表3 所示，共2 1 个，分布于水稻的1 、2 、3 、4 、5 ， 6 、7 、8 、9 、1 1 、1 2 染色体上。在这2 1 个基因中，那几个与耐储藏相关至今尚不明 确。 表3 水稻l i p a s e 基因家族 t a b l e 3 r i c eli p a s eg e n ef a m il y c h r l o c _ o s 0 19 4 3 1 4 0 、 l o co s o l 9 7 1 0 f o 2l o c _ o s 0 2 9 4 3 7 0 0 、 3l o c _ o s 0 3 9 6 1 5 4 0 4l o c _ o s 0 4 9 4 1 2 0 0 、l o c _ o s 0 4 9 4 3 0 3 0 、l o c _ o s 0 4 9 5 6 2 4 0 l o c _ o = 0 5 9 0 6 1 4 0 、l o c _ o s o s 9 3 0 0 0 0 、l o co = o s 9 4 9 o 、 l o co s o s 9 4 9 8 4 0 6l o c o s 0 6 9 1 0 8 5 0 7l o c o s 0 7 9 4 7 2 5 0 8 l o c _ o s 0 8 9 0 4 8 0 0 9l o cp s 0 9 9 2 2 4 1 1l o c _ o s l l 9 0 9 0 1 0 、l o c _ o s l l 9 4 3 5 1 0 1 2l o co s l2 9 3 6 7 7 0 l j p a s ef a m , yp r o t e i n e x p r e s s e d u p a s ef a m i l yp r o t e i n 。e x p r e s s e d u p a s e 佃m n yp r o t e i n 。e x p r e s s e d u p a s ef a m i l yp r o t e i n 。e x p r e s s e d u p a s ef a r n j i yp r o t l 耐n ，e x p r e s s e d u p a s ef a m i l yp r o t e i n 。e x p r e s s e d u p a s e 协m i i yp r o t e i n ，翻币阳s s 酣 l i l l ef a m i l yp r o t e i n e x p r e s s e d ii p a s ef a m 讯ji x o t 翻n 。翻币怕s s 甜 u p a s ef a m i l yp l l o 懒n 。e x p r e s s e d u p a s ef a m i l yp r o t e i n e x p r e s s e d i 4 2 脂肪氧化酶 1 ，4 、幺i 生化特性研究 脂肪氧化酶( l i p o x y g e n a s e l o x e c l 1 3 1 1 1 2 ) 系统命名为l i n o l e a t e = o x y g e no x i d e r e d u c t a s e ，即亚油酸氧化还原酶。l o x 广泛存在于植物特别是高等植物 体内，其活力直接影响食品原料如大豆、小麦、水稻等种子的贮藏和加工品质蹶铡。 脂肪氧化酶是一种含非血红素铁的加氧酶( o x y g e n a s e ) ，分子量范围一般在 9 0 - 1 0 0 k d c = 。5 7 鼬1 ，能专一催化具有双顺1 ，4 一戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸，如亚油 酸和亚麻酸的加氧反应。其加氧部位主要集中在c 9 和c 1 3 上，主要初级产物为过氧 氢型( h y d r o p e r o x i d e ) 脂肪酸。根据l o x 的手性和加氧部位的不同嘲，可把脂肪氧化 酶分为9 一l o x 和1 3 一l o x 。当亚油酸作底物时，9 一l o x 全部产生9 - h p o d ，如豌豆、土 豆和马铃薯中的l o x 和稻谷的l 0 卜3 ；1 3 - l o x 产生等量的d - h p o d 和1 3 - h p o d ，如大 豆和稻谷的l o x - 1 ，l o x 一2 删。f 。l e e n h a r d t ( 2 0 0 6 ) 等研究嗍发现小麦种子中的l o x 酶活性与p 胡萝卜素浓度呈显著负相关。v i j e n d r ak ( 2 0 0 6 ) 在大麦中第一次通过 第一章绪论 1 3 一li p o x y g e n a s e 转基因发现l o x 酶活性与种子衰老相关联眦1 。 水稻中，稻米糊粉层、胚和米糠中有三种脂肪氧化酶同功酶，按照通过柱层析的 先后次序，分别称为l o x - 1 ，l o x - 2 和l o x - 3 魄叫。在成熟的水稻种子中最主要的是 l o x - 3 ，l o x 一3 在胚成熟过程中大量表达，占未萌发水稻种子l o x 总活性的8 0 9 0 ， 而l o x - 2 则是种子萌发过程中的主要成分啪嘲。分子量为8 9 - 9 3k d 的每分子l o x - 3 含0 7 3f e 原子。在氨基酸顺序方面，稻谷l o x - 3 、大豆l o x - 1 和豌豆l o x 一1 、l o x - 2 有很高的同源性咖。但是与大豆l o x 相比，水稻l o x 在纯化过程中不太稳定，在3 - 5 可保存1 5 天左右侧。l o x - 1 和l o x - 2 的最适p h 分别为4 5 和5 5 ，l o x - 3 的最适 p h 为7 0 嘟，嘲。 至于l o x - 3 催化反应的机理，张瑛( 2 0 0 3 ) 嘲在t a p p e l 的作用机制和o h t a 的实验 基础上以亚油酸为底物，进一步提出脂肪氧化酶作用机制的巯基假说。该假说的核心 为巯基，即l o x - 3 活性中心可能含有- s h 的极性基团，- s h 专一进攻双顺l ，4 一戊二烯 键形成自由基。其反应步骤为：弧油酸与氧及l o x 结合形成复合体；l o 卜一卜的 一s h 解离为s 一和h + ；这时 盯和0 2 在酶的表面形成0 0 i h + ；一s 一进攻双顺l ，4 _ 戊二烯 键；0 0 盯与弧油酸结合形成亚油酸过氧化物；距油酸过氧化物与酶分离和一s h 重 新生成。 关于l o x l 、l o x 一2 的作用机制，大豆上的研究表明，大豆l o x _ 1 ，2 的底物不 仅为游离脂肪酸，它们甚至可以直接进攻膜磷脂( 主要进攻第2 位碳原子的脂肪酸多 为不饱和脂肪酸) ，产生膜磷脂弧油酸